JP2022065059A - 昆虫細胞でのPCV2b ORF2タンパク質の組換え発現 - Google Patents
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Abstract
Description
には、本発明は、変異体PCV2b ORF2タンパク質を発現する異種核酸配列を含む
昆虫細胞、その変異体PCV2b ORF2タンパク質のウィルス様粒子、前記昆虫細胞
又は前記変異体PCV2b ORF2タンパク質の製造若しくは使用方法、並びにブタ用
ワクチンに関する。
部門に重大な経済的損失を生じさせるブタの病原体である。総覧については、ギレスピー
らの報告(Gillespieら,2009,J.Vet.Intern.Med.,v
ol.23,p.1151-1163)を参照する。
む、小さい(17nm)20面体非エンベロープビリオンを有する。そのゲノムは、数個
のオープン・リーディング・フレームを含み、そのうち、ORF2は、主要なウィルス中
和エピトープを含むウィルスカプシドタンパク質をコードする。
物を介して排出され、ブタの群れにおいて水平及び垂直の両方で広がり得る。PCV2感
染によって生じる主要な病変はリンパ欠乏であり、その結果生じる免疫抑制によって、感
染動物は、二次又は同時感染も受けやすくなる。結果的にPCV2は、多くのブタ疾患症
候群に関与し、それはブタサーコウィルス関連疾患(PCVAD)と総称される。最も顕
著なPCVADは、若いブタで認められる「離乳後多臓器消耗症候群」(PMWS)であ
る。PMWSの臨床徴候及び病理には、進行性の衰弱、呼吸困難、頻呼吸、そして場合に
より、黄疸(icterus)及び黄疸(jaundice)を含む。他のPCVADは
、ブタ呼吸器疾患症候群、ブタ皮膚炎及び腎症症候群、生殖障害、肉芽腫性腸炎、先天性
振戦及び滲出性表皮炎である。総覧については、the Merck Veterina
ry Manual, 11th ed.,2016,ISBN:9780911910
933;and:″Diseases of Swine″,10th ed.,201
2,ISBN:9780813822679を参照する。
の成長低下及び動作低下を除き明瞭な疾患症状を示さない場合がある。PCV2によって
引き起こされるPCVADの(潜在性)臨床症状は、通常は3若しくは4週齢以降からブ
タで観察され得るものであり、その時期は、仔ブタが離乳し母体由来の防御抗体が低下し
始める。
ンが市販されており、それらは非常に大量に世界中で使用されている。異なる種類のPC
V2ワクチンには、例えば、不活化PCV2ウィルス(Circovac(商標名)、M
erial)に基づくワクチン、又は不活化キメラPCV1/PCV2ウィルス(Suv
axyn(商標名)PCV、Fostera(商標名)PCV、Zoetis)に基づく
ワクチンがある。しかしながら、最も一般的なものは組換え発現PCV2カプシドタンパ
ク質に基づくサブユニットワクチンであり、一般に、ORF2タンパク質(Ingelv
ac(商標名)CircoFLEX、Boehringer Ingelheim;及び
:Circumvent(商標名)PCV、Porcilis(商標名)PCV、MSD
AH)と称される。ORF2タンパク質サブユニットワクチンは、一般に組換え発現系で
のPCV2 ORF2遺伝子の発現によって産生され、バキュロウィルス-昆虫細胞発現
系が最も多く使用される。発現ORF2タンパク質は自己集合して、ウィルスゲノム量を
持たない以外は天然PCV2ビリオンに似るウィルス様粒子(VLP)となることから、
非複製的である。そのようなPCV2 ORF2 VLPに基づくワクチンは、非常に安
定であり、アジュバントとともに製剤した場合に高度に免疫原性であり、そして、PCV
2抗体に対して血清陽性であるか否かを問わず、全ての動物齢のブタに安全であることを
示している。PCV2 ORF2タンパク質に基づくワクチンの代表的な総用量は、投与
体積2mL/動物中にORF2タンパク質約80μgを含む。しかしながら、これらのサ
ブユニットワクチンは、ORF2約20μg/動物の用量ですでに効力がある(EP1.
926.496を参照する。)。それらは、シングル・ショット・ワクチンとして投与す
ることができ、異なる投与経路によって、例えば筋肉投与(IM)、皮下投与(SC)、
又は皮内投与(ID)によって投与することができる。
遺伝子間の遺伝学的距離によって識別することができ、過去においては多様な命名法が用
いられてきた。しかしながら、セガールズら(Segalesら,2008,Vet.R
ec.,vol.162,p.867-868)が、PCV2遺伝子型を決定及び命名す
るために現在標準となっている方法を公開した。現在認められているPCV2の5種類の
異なる遺伝子型のうち、PCV2a、PCV2b及びPCV2dという3種類のみが、現
在当該分野において動物学的関連性があるものである。
V2b及び2dが当分野では優勢になりつつあるように思われる。総覧については、Ka
ruppannan&Opriessnig,2017,Viruses,vol.9,
p.9, doi:10.3390/v9050099を参照する。これらの著者は、こ
れらの遺伝子型間で十分なレベルの交差保護があると結論付けているが、概して、型相同
性ワクチンを用いることが好ましい。結果的に、やはりPCV2a以外のPCV2遺伝子
型についても、安全、安価及び効果的なワクチンを製造することが当分野において必要と
されている。
2の抗原性若しくは病原性変異体を確認するための診断法、特にそのために有用な方法及
び抗体が記載されている。二つのPCV2b株からのORF2の核酸及びアミノ酸配列が
記載されている。モノクローナル抗体による認識のプロファイルを変えることを目的とし
て、ORF2タンパク質のいくつかの突然変異が提案されている。多くの提案された突然
変異の中で、一つは、アミノ酸位置131のトレオニンのプロリンへの変異である。しか
しながら、WO2009/000459は、PCV2aの未変異(野生型)株(Stoo
n 1010、1121)及びPCV2b(48285)の血清試験を十分に開示してい
るのみであり、昆虫細胞における野生型PCV2a株の一つ(Stoon 1010)か
らの未変異ORF2の発現のみを開示している。
,vol.93,p.1548-1555)は、特に、変異PCV2ゲノムの感染性クロ
ーンのトランスフェクションによる、PK-15細胞でのT131P突然変異があるPC
V2a ORF2タンパク質の発現を記載している。
送達によるPCV2に対するワクチン接種の方法が記載されており、それによって、「核
局在化シグナル」、即ちORF2のN末端41アミノ酸の置換又は除去によりORF2タ
ンパク質が変異している。次に、結果的に、ORF2が細胞質で発現されるようになるか
、ベクター感染細胞から分泌される。好ましいウィルスベクターは、ブタアデノウィルス
である。
CV2b ORF2コード配列に突然変異を導入することで、バキュロウィルス-昆虫細
胞でのPCV2b ORF2タンパク質及びそれのウィルス様粒子の発現レベルを上昇さ
せる方法が記載されており、開示の突然変異は、アミノ酸位置63のアルギニンの、好ま
しくはトレオニンへの置換である。PCV2b ORF2のアミノ酸位置131での突然
変異については全く言及がなく、昆虫細胞でのこのタンパク質の発現に伴う問題について
は全く情報がない。
において、PCV2b遺伝子型のORF2タンパク質が、異種遺伝子型PCV2a及びP
CV2dに対する同種保護だけでなく、良好な交差保護も提供することが認められたこと
が開示されている。この効果は、予想外に、PCV2b ORF2タンパク質20μg未
満/動物用量という非常に低量であっても得られた。結果的に、低用量のPCV2b O
RF2タンパク質でブタにワクチン接種することが、全ての現在のPCV2株に対する有
効な免疫保護を提供するのに十分であろう。
、即ち、生存昆虫で、初代昆虫細胞で又は培養液中の不死化昆虫細胞系での発現である。
最も使用される昆虫細胞は、例えばスポドプテラ(Spodoptera)属又はトリコ
プルシア(Trichoplusia)属からのような鱗翅目起源のものである。これら
の細胞の使用は、一般のバキュロウィルス-昆虫細胞発現系に関連することが多く、ここ
で、組換えバキュロウィルスを用いて、培養液中で鱗翅目細胞を感染させる。バキュロウ
ィルスは、そのウィルスが細胞培養液中で複製する場合には必要ない多くの強いプロモー
ターを含み、そしてこれらを用いて異種遺伝子の発現を駆動することができる。
る方法を提供することによって、先行技術における欠点を克服し、当分野におけるニーズ
に対応することにある。
発明者らは、昆虫細胞におけるPCV2b遺伝子型ウィルス株からのORF2タンパク質
の組換え発現が、PCV2a遺伝子型のORF2タンパク質の場合ほど簡単ではないこと
を発見した。発現PCV2b ORF2タンパク質は、それが発現される昆虫細胞の核で
蓄積する自然の傾向を有することが認められた。この形態では、PCV2b ORF2タ
ンパク質の合計発現レベルはかなり低下しており、そのタンパク質は、下流プロセシング
によって回収及び精製することが非常に困難であることが明らかになり、アグレッシブ解
離を用いた場合であってもORF2タンパク質はごく少量しか単離できなかった。さらに
、単離できた少量のタンパク質においてはVLPはごく少量であり;明らかに、核局在化
が、ORF2タンパク質が自己アセンブリしてVLPとなるのを著しい度合いで防止した
。結果的に、この発現タンパク質の免疫原性がかなり低下した。
入された場合、昆虫細胞における発現時の核蓄積が大きく防止できることが認められた。
いて天然に起こるアミノ酸のプロリンアミノ酸への変化が関与していた。位置131にプ
ロリンがあると、発現変異体PCV2b ORF2タンパク質(「ORF2b-131P
」)のほとんどが、核で蓄積するのではなく昆虫細胞の細胞質で生じた。これにより、合
計発現レベルが上昇し、並びに、これらの昆虫細胞からの変異体PCV2b ORF2タ
ンパク質の回収がかなり容易になることが認められており、この細胞質状態では、衝撃が
少ない標準的な単離手順を用いることができたことから、多量のタンパク質を容易に単離
できた。さらに、ORF2b-131Pのほとんどが、効果的にアセンブルされてブタ用
のPCV2ワクチンで非常に有効なVLPとなったことが認められた。
であり、一方、PCV2bウィルスからのORF2タンパク質では、位置131の天然ア
ミノ酸は代表的にはトレオニンであるが、PCV2aウィルスでは一部は131位にトレ
オニンを有し、一部はプロリンを有する。しかしながら、昆虫細胞で発現される場合、P
CV2a ORF2の二つの変異体のいずれも核で蓄積しない。結果的に、この特定のア
ミノ酸位置が、昆虫細胞で発現される場合に、PCV2b ORF2タンパク質について
認められた核蓄積の原因であると推測するに足るものは全く示されていない。
RF2タンパク質は、位置131のそれの天然トレオニンがプロリンに置換された後の細
胞質発現パターンに逆戻りできなかった。
伝子型ごとに特有のものである。
ク質の蓄積をどのようにして防止するかはわかっていない。本発明者らは、これらの所見
を説明する可能性がある理論やモデルに拘束されることを望むものではないが、PCV2
b遺伝子型のORF2タンパク質においてこの特定位置にプロリンアミノ酸を有すること
で、このORF2タンパク質の特性に変化が誘発されると推測される。その変化は、例え
ば、ORF2タンパク質の3次元折りたたみ又は疎水性プロファイルに影響する可能性が
あり、それが昆虫細胞内部でのそれの経路に影響し得る。
を改善することで多くの有利な用途に道を開くものである。そして、これによって、有効
なブタ用PCV2サブユニットワクチンを容易に大規模製造できるようになるが、という
のも、それを単離するのに解離性が高い化合物や複雑な技術が全く必要ないことから、そ
の発現タンパク質を安価で安全かつ効率的な方法で製造することができる。
術の1以上の欠点を克服することができる。
a.遺伝子型2bのブタサーコウィルス2(PCV2b)からのORF2タンパク質を
コードするヌクレオチド配列、及び
b.前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結されている転写制御配列
を含む異種核酸を含む昆虫細胞であって、
前記ヌクレオチド配列が、アミノ酸位置番号131にプロリンを有する変異PCV2b
ORF2タンパク質をコードすることを特徴とする昆虫細胞に関するものである。
それぞれ30、20及び10μL。
れぞれ30、20及び10μL。
レット、それぞれ30、20及び10μL。
2μg。
れぞれ30、20及び10μL。
れぞれ30、20及び10μL。
及び3μg。
に従ったIHC強度の任意のスコアを示している。
る動物についてのIHC結果を表す図である。
に従ったIHC強度の任意のスコアを示している。
ける動物についてのIHC結果を表す図である。
を有しており(即ち、複製する能力を有する)、タンパク質発現可能とするのに十分完全
性がある。その細胞は休止状態又は活動状態であることができ、細胞周期のあらゆる段階
のものであることができる。昆虫細胞は、本発明において異なる方法;昆虫全体を用い;
昆虫の抽出物又は一部を用い;昆虫由来の初代細胞を用い;昆虫の組織若しくは器官を用
い;又は不死化昆虫細胞系を用いることで、で採用される。
胞の生存能力を維持する組成物であり、例えば、緩衝溶液又は培地のような液体である。
昆虫全体の使用の文脈では、昆虫生物自体の身体が担体として機能する。
comprise)、「含む(comprises)」、及び「含んだ(compris
ed)」のような派生語)という用語は、この用語が用いられている本文、段落、特許請
求の範囲などにより保護され又は包含され、本発明に関して考え得る全ての要素及び任意
の可能な組合せを、そのような要素又は組合せが明示的に列挙されていない場合であって
も示すことを意図し、そのような要素又は組合せのいずれをも排除することを意図するも
のではない。
omprising)」(又はその派生語)なる語が「からなる(consist of
)」、「からなり(consisting of)」または「から本質的になる(con
sist essentially of)」のような語によって置換されている1以上
の実施形態に関するものであり得る。
った場合、それを含む昆虫細胞に対して「異種」である。核酸は、あらゆる種類のもので
あることができ、例えばDNA又はRNAであることができる。
の核酸のエレクトロポレーションにより、或いは、例えばウィルスのような組換え微生物
による感染によって、本発明による昆虫細胞中に導入することができる。
に、そのタンパク質を「コードしている」又は類似の表現で「コードする」。代表的には
、タンパク質をコードすることができるそのようなヌクレオチド配列は、オープン・リー
ディング・フレーム(ORF)と称され、タンパク質の翻訳を早期に終了するであろう望
ましくない終止コドンが全く存在しないことを示している。そのようなヌクレオチド配列
は、完全タンパク質をコードする遺伝子であることができるか、タンパク質の一部分を例
えば成熟又は分泌型のタンパク質のみをコードする、即ち「リーダー」、「アンカー」又
は「シグナル配列」を持たない遺伝子断片であることができる。ヌクレオチド配列は、天
然起源又は合成起源のものであることができる。
しくは成熟タンパク質、プレ若しくはプロタンパク質、又はタンパク質の一部であること
ができる。特に、ペプチド類、オリゴペプチド類及びポリペプチド類が、タンパク質の定
義に含まれる。
ング・フレーム2(ORF2)によって又はORF2の一部によってコードされるタンパ
ク質を指す。全長PCV2 ORF2タンパク質は、通常、長さ233アミノ酸であり、
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で調べると、相対分子量
約26kDaを示す。しかしながら、切断型のORF2タンパク質が公知であり、本発明
に有利に用いることができ、例えば、それのN末端側から30アミノ酸を欠く切断型のP
CV2 ORF2タンパク質である。ORF2タンパク質は、カプシドとも称され、そし
て、コードする核酸配列は、ORF2遺伝子又はカプシド遺伝子と称される。
ュータプログラムが、多様な供給者から市販されている。
なそれの分類群の特徴的特性、並びに生理的、免疫的若しくは病理的挙動のような生物学
的特徴を有する、その種のサーコウィルスを指す。
せに基づくものである。従って、本発明は、例えば亜種、株、単離物、遺伝子型、変異体
、サブタイプ若しくは下位群のようないずれかの方法で下位分類されるPCV2も含む。
がらそれは分類学的分類であって、新たな識見により新たな若しくは異なる分類群への再
分類がなされ得ることから、時間が経つと変わり得るものであることは本発明の当業者に
は明らかであろう。しかしながら、その微生物自体又はそれの抗原性レパートリーを変え
るのではなく、それの科学的名称若しくは分類を変えるだけであることから、そのような
再分類された微生物は、本発明の範囲に留まる。
(寄託)施設若しくは(獣医)大学からのフィールド単離物のような各種入手源から得る
ことができる。或いは、それのゲノム核酸を合成し、それを適切な細胞にトランスフェク
ションすることで、PCV2をデジタル配列データから再構築することができる。
、「遺伝子型2bのPCV2」又は「PCV2b」は、セガールズの方法(Segale
sら,2008,Vet.rec.vol.162,p.867-868)を用いて遺伝
子型群bに分類されるPCV2ウィルスである。この方法は、PCV2 ORF2遺伝子
間のP-距離、即ちそれらのPCV2 ORF2遺伝子のヌクレオチドの総数当たりの二
つのPCV2 ORF2遺伝子間で異なるヌクレオチドの比に基づくPCV2遺伝子型決
定を用いる。セガールズ(Segales)らによって確認されたPCV2の異なる遺伝
子型についてのカットオフは、0.035のORF2 P-距離であることから、P差が
それより小さい場合、その二つの配列は同じ遺伝子型に属する。
れる単離物「Imp.1011」であり、それについては、ゲノム配列が、受託番号AF
055394下にGenBank(商標名)で公開されている。
285のORF2遺伝子で0.035未満のORF2遺伝子P-距離を有するPCV2ウ
ィルスが、本発明におけるPCV2bウィルスである。
円形であることから、ORF2遺伝子のコード領域は、特定の直線ヌクレオチド配列から
直接明らかになることはできず、そのヌクレオチド配列を、反転、補完及び/又は回転さ
せる必要があり得る。例えば、GenBank受託番号:AF055394でのPCV2
b株48285のゲノム配列において、ORF2遺伝子は、ヌクレオチド番号314から
nt.1まで直線状の公開された鎖上を進み、nt.1767からnt.1383(それ
を含む)まで続き;同時に、それはORF2遺伝子の699ヌクレオチド(終止コドンを
含まない)を表し、公開されている鎖のこの領域に対して相補的である鎖によってコード
されている。やはり、コード領域のそのような分析及び表示は、市販のコンピュータプロ
グラムを用いて簡便に行うことができる。
「PCV2遺伝子型2d」(PCV2d)に適用され;PCV2aについての基準ウィル
スは、単離物「Imp.1010」(「Stoon1010」とも称される)、受託番号
:AF055392であり;及びPCV2dについての基準ウィルスは、単離物「S99
-1542/3a」、受託番号:JX512856である。
定し、株48285のORF2遺伝子と比較したP-距離を計算する方法は公知であり、
本発明の当業者には容易に利用可能である。
子の結合を介して、細胞のタンパク質-発現機構を誘発して、DNAの下流コード領域の
RNAへの転写を開始及び実行する。そのような転写制御領域(TCR)は、プロモータ
ーとも称することもでき、通常は、最初の開始コドンの約30~40ヌクレオチド上流に
位置する「転写開始部位」のような多くの制御領域を含む。他の公知の保存要素は、TA
TAボックス、CAATボックス及びGCボックスである。TCRは、転写の時期、期間
、条件及びレベルに影響し得る結合制御因子に関与するいわゆるエンハンサーも含むこと
ができる。
構築物の詳細に応じて一時的性質又は永久的性質のものであることができ、即ち一時的発
現又は安定な発現であることができる。
きる必要がある。これは一般に、遺伝子に「動作可能に連結されている」TCRと称され
、それによって、その遺伝子は、TCRの「制御下」にあるか、TCR「によって駆動さ
れる」。これは一般に、TCR及びコード領域が有効な近位で同一分子上で連結されてお
り、それらの間に、効果的な転写に介入すると考えられるシグナルや配列が全くないこと
を意味している。
そのタンパク質の野生型と同一ではなく突然変異を含む、ことを示す働きをする。そのよ
うな突然変異は、イン・ビボ又はイン・ビトロ技術を用いて,異なる方法で導入すること
ができる。しかしながら、最も有効なのは、組換えDNA技術を用いて細菌プラスミドに
おけるPCV2b ORF2遺伝子をサブクローニングし、例えばポリメラーゼ連鎖反応
(PCR)及び合成プライマーを用いて所望の位置に所望の突然変異を導入するというも
のである。詳細については、後述の実施例にある。このようにして、例えば、GenBa
nk受託番号AF055394からの親PCV2b ORF2遺伝子のDNA配列を操作
することで、アミノ酸位置131:5′-aca-3′でトレオニンをコードする野生型
ヌクレオチドトリプレットを突然変異させて、プロリンをコードするトリプレット:5′
-ccc-3′とした。
はバキュロウィルスのコーディング選択とより良好に適合させることができる。例えば、
Hooft van Iddekingeら,1983,Virology,vol.1
31,p.561-565で公開されているAcMNPVバキュロウィルスからのポリへ
ドリン遺伝子のコドン選択を用いる。異種発現のための遺伝子のコドン最適化の考え方は
公知であり;典型的には、そのような突然変異は全てサイレントであり、それは、これが
コードヌクレオチド配列を変えるが、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えない
ことを意味している。詳細は実施例にある。
られた。わずかではあるが、それは、昆虫細胞で発現される場合、野生型PCV2b O
RF2タンパク質の核局在も変えた。しかしながら、昆虫細胞における核蓄積の実質的な
防止は、PCV2bからのORF2タンパク質については、位置131のアミノ酸のプロ
リンによる置換によってのみ得られると考えられる。
えば、ヒトによる介入によって変化する前の親生物の形態を指す。
及びアセンブリは、クローニング、トランスフェクション、組換え、選択及び増幅を含む
公知の分子生物学的技術によって行うことができる。これらの技術及び他の技術について
は、Sambrook&Russell:″Molecular cloning:a
laboratory manual″(2001,Cold Spring Harb
our Laboratory Press;ISBN:0879695773);Au
subelら,Current Protocols in Molecular Bi
ology(J.Wiley and Sons Inc.,NY,2003,ISBN
:047150338X);C.Dieffenbach & G.Dveksler:
″PCR primers:a laboratory manual″(CSHL P
ress,ISBN0879696540);and″PCR protocols″,
J.Bartlett and D.Stirling(Humana press,I
SBN:0896036421)のような標準的な書物にかなり詳細に説明されている。
からの全長ORF2タンパク質のアミノ酸配列におけるそのアミノ酸の番号に基づいて番
号付けされる。PCV2bの場合、基準株は48285であり、それのORF2タンパク
質の全長アミノ酸配列は、受託番号AAC35331下でGenBankで公開されてい
る。
b ORF2タンパク質(大部分)はもはや核では蓄積せず、しかし、昆虫細胞の細胞質
全体に分散される。未変異の対応物と比較した変異PCV2b ORF2タンパク質の細
胞位置におけるこの相違は、特に、免疫蛍光技術を用いる(光学)顕微鏡検査及び肉眼観
察によって容易に検出することができる。詳細は、実施例の部にある。
V2b ORF2タンパク質を発現するのに用いられる遺伝子構築物に応じて若干異なる
のが認められ:Bac-to-Bacシステムを用いて行われた組換えバキュロウィルス
を介した発現はなお、若干の核蓄積を示しており、例えば、野生型PCV2b ORF2
タンパク質について観察されるレベルの約10%であった。しかしながら、変異体タンパ
ク質をProEasyシステムを介して構築された組換えバキュロウィルスから産生させ
た場合、検出可能な核蓄積は全く認められなかった。さらに、タンパク質発現のレベルは
、Bac-to-Bac組換えバキュロウィルスによって産生されたものより高かった。
-Bac構築物から製造される組換えバキュロウィルスは、まだそれらのゲノム中のトラ
ンスファーベクターの発現カセットからの要素、例えばトランスポゾン及び抗生物質抵抗
遺伝子を有している。これらは、複製及び発現のレベルに影響し得る。しかしながら、P
roEasy組換え物は、もはやそのような別の遺伝要素を持たない。
ド配列は、コドン最適化されている。より好ましくは、AcMNPVバキュロウィルスの
ポリへドリン遺伝子のコドン選択に合致するようにコドン最適化されている。
列は配列番号1である。これは、PCV2b株48285のORF2配列を表し、ここで
、トリプレットコードアミノ酸位置番号131は、プロリンをコードする5′-ccc-
3′に変異されている。さらに、コドン使用は、AcMNPVポリへドリン遺伝子のコド
ン選択に適合するように調節されている。次に、配列番号2は、配列番号1によってコー
ドされるORF2b-131Pタンパク質配列を列記している。
ゆえに、配列番号1とAF055394の相当する領域、野生型ORF2b遺伝子との間
のヌクレオチド配列同一性は77.2%である。しかしながら、コドン最適化突然変異が
サイレントであることから、配列番号2とAAC35331(株48285からの野生型
PCV2b ORF2タンパク質のアミノ酸配列である)との間のアミノ酸配列同一性は
99.6%であり、即ち、位置131のアミノ酸における相違があるのみである。
染させることができることから、バキュロウィルス-昆虫細胞発現系の内容で使用するこ
ともできる。例えば、Chenら,2005,In vitro Cell.Dev.B
iol.Anim.,vol.41,p.43-49を参照する。
ニカ(Autographa californica)(アルファルファ・ルーパー)
、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(ツマ
ジロクサヨトウ)、スポドプテラ・エクシグア(Spodoptera exigua)
(ビートアワヨトウ)、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)(キャ
ベツルーパー)、リマントリア・ディスパー(Lymantria dispar)(マ
イマイガ)、ボムビックス・モリ(Bombyx mori)(カイコ)、アンチカルシ
ア・ゲンマタリス(Anticarsia gemmatalis)(ベルベットビーン
・キャタピラ(velvetbean caterpillar))、ヘリオチス・ビレ
センス(Heliothis virescens)(オオタバコガ)、ヘリオチス・サ
ブフレクサ(Heliothis subflexa)(サブフレクス・ストロー・モス
(Subflexus straw moth))、マメストラ・ブラシカエ(Mame
stra brassicae)(コナガ)、ヘリコベルパ・アルミゲラ(Helico
verpa armigera)(オオタバコガ幼虫(cotton bollworm
))、ヘリコベルパ・ゼア(Helicoverpa zea)(オオタバコガ幼虫(c
orn earworm))、アグロチス・イプシロン(Agrotis ipsilo
n)(タマナヤガ)、アナグラファ・ファルシフェラ(Anagrapha falci
fera)(セロリルーパー(celery looper))、ガレリア・メロネラ(
Galleria mellonella)(ハチノスツヅリガ)、ラチプルシア・オウ
(Rachiplusia ou)(クレー・ルーパー(gray looper))、
プルテラ・キシロステラ(Plutella xylostella)(コナガ)、ドロ
ソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)(ミバ
エ)、及びアエデス・アエギプチ(Aedes aegypti)(蚊)からなる群から
選択される昆虫由来である。
からの;さらにより好ましくはスポドプテラ(Spodoptera)属若しくはトリコ
プルシア(Trichoplusia)属の一つからの昆虫由来である。
doptera frugiperda)種の昆虫由来である。
lusia ni)種の昆虫由来である。
あり、そのように本発明による昆虫細胞を適用することができる。しかしながら、制御さ
れた条件下でのより柔軟な製造及び規模拡大を許容することから、不死化昆虫細胞系の形
態で昆虫細胞を利用することがより簡便であろう。次に、そのような確立された昆虫細胞
系を用いて、本明細書に記載の通常の方法によって、本発明による昆虫細胞を構築するこ
とができる。
ギペルダ(S.frugiperda)由来である);T.ニ(T.ni)由来のHig
h Five(商標名)(Hi-5);B.モリ(B.mori)由来のBm5;並びに
L.ディスパー(L.dispar)由来のLd652Y及びLdEItaである。
、Bm5、Ld652Y及びLdEItaからなる群から選択される昆虫細胞系、又はこ
れらのうちの一つに由来する細胞系の細胞から産生される。
。
えば5mLから5000リットルまでで使用することができる。特に、特殊化昆虫培地が
入手可能であり、例えばSf-900(商標名)(Thermo Fisher Sci
entific);Ex-Cell(商標名)400シリーズ(Sigma Aldri
ch);及び昆虫-XPRESS(商標名)(Lonza)である。
の添加を必要とするか、無血清で用いることができる。グルタミン、抗生物質、消泡剤な
どのさらなる添加剤を加えることができる。
いくつかあり、1例として昆虫細胞のゲノムでの安定な組み込みによるものがある。ゲノ
ム組み込みを行う方法は、例えば、トランスポゾン技術によるようなランダム挿入による
もの、又は例えば相同組み換え若しくはCRISPR-Cas技術を用いる定方向挿入に
よるものである。
的手段(例えば、エレクトロポレーション)によって、自体がプラスミドのような担体上
に存在することができる異種核酸でトランスフェクションすることができる。その異種核
酸は、昆虫細胞中で、一時的に又は安定的に発現され得る。
、組換えバキュロウィルスの使用によるものである。そのようなバキュロウィルスは、例
えば、それのウィルスゲノムに安定に組み込まれ、強いバキュロウィルスプロモーター、
例えば最晩期遺伝子p10若しくはポリへドリンのプロモーターに動作可能に連結された
対象の異種遺伝子を含むであろう。
ルスp10遺伝子プロモーター又はバキュロウィルスポリへドリン遺伝子プロモーターで
ある。
ュロウィルスのゲノムのトランスフェクションによって受動的に、又は、感染性組換えバ
キュロウィルスによる感受性昆虫細胞の感染によって能動的に行うことができる。その昆
虫細胞は、内部に組換えバキュロウィルス又はそのゲノムを含むことで、本発明における
異種核酸も含むであろう。本発明に関して、「細胞内部に」は、単純に組換えバキュロウ
ィルスゲノムの位置を指し、例えば細胞質中の昆虫細胞の細胞膜の内側にあるということ
である。
種遺伝子の発現を生じさせる。次に、異種発現生成物を、その昆虫細胞から又は細胞培地
のような細胞の環境から回収することができる。
ィルスゲノム中に含まれる。
ロウィルス属の構成員である。
異種核酸を含むようになっている場合、それは「組換え体」である。好ましくは、そのよ
うな組換えバキュロウィルスは、遺伝子操作の方法によって産生される。
よる昆虫細胞を考えると、本発明における異種核酸を実際に含む細胞の数はダイナミック
(dynamic)であろう。それは、細胞の周期状況又は感染若しくはトランスフェク
ションのレベルのような多くの生物学的理由による。異種核酸を含み発現する細胞ができ
るだけ多く有することが好ましいが、特定の時点でその群の各及び全ての個々の昆虫細胞
がその異種核酸を含む必要はない。
に、「バキュロウィルス-昆虫細胞発現系」と称される。この系についての論文、書籍又
は総覧の例は、Luckowら,1988,Bio-technology,vol.6
,p.47;Baculovirus Expression Vectors:A L
aboratory Manual by David R.O′Reilly,Oxf
ord University press,1993,ISBN:071677017
2;The Baculovirus Expression System:A la
boratory guide,ed.King&Possee,1992,ISBN:
9401050473であり、総覧はvan Oersら,2015,J.of Gen
.Virology,vol.96,p.6-23である。
きい工業的規模の製造まで用いることができる。バキュロウィルス-昆虫細胞発現系が知
られている多様な起源の異種遺伝子はこれまで30年間発現されており、この技術の適用
に関して、多くのツールが市販されている。
ベクターとして用いられてきた。バキュロウィルス-昆虫細胞発現系で使用されるバキュ
ロウィルスの例は、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa cali
fornica)(アルファルファ・ルーパー):AcMNPVの、又はボムビックス・
モリ(Bombyx mori):BmNPVの(マルチカプシド(multicaps
id))核多角体病ウィルスである。
キュロウィルスは、AcMNPV又はBmNPVである。
多くのツール及びキットが市販されている。例えば、Bac-to-Bac(商標名)(
Thermo Fisher Sci.,Waltham,MA.,USA);ProE
asy(商標名)(AB Vector,San Diego,CA.,USA);及び
flashBAC(商標名)(Oxford Expression Technolo
gies,Oxford,UK)である。
む組換えバキュロウィルスは、好ましくは、当然のことながら異種核酸の挿入及びその後
の挿入遺伝子座での破壊若しくは欠失を除いて、野生型バキュロウィルスにできるだけ近
いものである。実際のところ、それは、組換えバキュロウィルスが好ましくは、それのゲ
ノムにおける組換えプロセスからのさらなる遺伝的要素、例えばタグ、標識、マーカー遺
伝子、トランスポゾン要素、抗生物質抵抗性遺伝子のような要素を含まないことを意味す
る。
は、そのゲノムに組換えプロセスからのさらなる遺伝的要素を含まない。
の構築に用いたトランスファーベクターからの抗生物質抵抗性遺伝子を含まない。
件の1以上又は全てが適用される;
-変異体PCV2b Orf2タンパク質をコードするヌクレオチド配列が最適化され
ている、より好ましくは、AcMNPVバキュロウィルスのポリへドリン遺伝子のコドン
選択に一致するようにコドン最適化されている;
-変異PCV2b ORF2タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号1
である;
-本発明による昆虫細胞は、鱗翅目からの;より好ましくはヤガ科からの;さらにより
好ましくはスポドプテラ(Spodoptera)属若しくはトリコプルシア(Tric
hoplusia)属の一つからの昆虫由来である;
-本発明による昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera f
rugiperda)種の昆虫由来である;
-本発明による昆虫細胞は、トリコプルシア・ニ(Trichoplusia ni)
種の昆虫由来である;
-本発明による昆虫細胞は、Sf9、Sf21、Hi-5、Bm5、Ld652Y及び
LdEItaからなる群から選択される昆虫細胞系、又はこれらのうちの一つに由来する
細胞系の細胞から産生される;
-本発明による昆虫細胞は、Sf9又はSf21の昆虫細胞系から産生される;
-前記転写制御配列は、バキュロウィルスp10遺伝子プロモーター又はバキュロウィ
ルスポリへドリン遺伝子プロモーターである;
-前記異種核酸は、昆虫細胞内部にある組換えバキュロウィルスゲノム中に含まれる;
-本発明における異種核酸を含む組換えバキュロウィルスは、AcMNPV又はBmN
PVである;及び
-本発明における異種核酸を含む組換えバキュロウィルスは、そのゲノムにおける組換
えプロセスからのさらなる遺伝的要素を含まない。
突然変異によって、本発明による昆虫細胞からのORF2b-131Pタンパク質の発現
増加が可能となる。特に、それによって、この突然変異なしで可能であるよりもかなり高
い程度までのPCV2b ORF2タンパク質を含むVLPの発生が可能となる。
ミノ酸位置番号131にプロリンを有することを特徴とする、変異PCV2b ORF2
タンパク質のウィルス様粒子(VLP)に関する。
、当業界で公知である。
は、上記のようなバキュロウィルス-昆虫細胞発現系の使用によって行われる。
を用いる、本発明による昆虫細胞での変異PCV2b ORF2タンパク質の発現方法に
関する。
による昆虫細胞が昆虫細胞系の細胞である場合、それらは、標準的な細胞培養装置を用い
て簡便に培養することができ、それによって、変異PCV2b ORF2タンパク質が発
現される。適切な温度でインキュベーションキャビネットに置かれた簡単なT型培養瓶若
しくはスピナーフラスコから、最終的には温度、pH及び溶存酸素などの工程パラメータ
を自動制御された加熱マントル、攪拌機及びスパージャーを搭載した大規模工業用発酵槽
までの任意の規模で昆虫細胞培養装置を使用可能である。
を、さらなる使用のために昆虫細胞培養物から回収する。培養と同様に、そのような回収
は、当業界で公知の標準的手順を用いて行うことができる。さらに、必要な場合、培養物
を最初に、物理的(例えば、熱、放射線照射)又は化学的(例えば、ブロモ-エチレンイ
ミン(BEI))手段によって失活(即ち、滅菌)させることができる。
b ORF2タンパク質は、昆虫細胞内部又はその膜で蓄積するか、細胞から分泌される
。実際に分泌されていない場合であっても、タンパク質は、細胞が破裂する時にある程度
まで細胞の培地中に存在し得る。
後の上清として回収することができる。次に、培養物体積のバルクを、例えば濃縮を用い
て、簡便にはいずれも当業界で公知の何らかの限外濾過方法によって、所望の程度まで低
下させることができる。
さい体積で細胞ペレットを再懸濁させることで、培養体積のバルクから単離することがで
きる。次に、その細胞を、多かれ少なかれ侵襲性の技術を用いて破壊することができる。
。
る変異PCV2b ORF2タンパク質の製造方法であって、
-本発明による昆虫細胞を培養すること;及び
-当該変異PCV2b ORF2タンパク質を昆虫細胞培養物から回収すること
から選択される一方又は両方の段階を含む方法に関する。
現される昆虫細胞の核で蓄積しないという点である。それによって、総発現レベルが高く
なっただけでなく、これらの昆虫細胞からの変異PCV2b ORF2タンパク質の回収
も非常に容易になった。理由としては、この細胞質状態では、非常に衝撃が小さい標準的
な単離手順を用いることができ、比較的多量の変異PCV2b ORF2タンパク質が得
られたからである。さらに、ORF2b-131PのほとんどがVLPに効果的にアセン
ブリされたことが見出されたので、回収されたタンパク質は、優れた免疫学的品質であっ
た。
は、洗浄剤又はカオトロピック剤、例えばSDS、尿素、デオキシコール酸塩又はグアニ
ジン-HClなどのような化学剤を用いることによる抽出が必要であろう。次に、これら
を再度除去する必要があろう。そのような攻撃的な化学剤を大規模で使用することは、当
然のことながら望ましくない。
胞の超音波処理又は冷凍-解凍を行うことで、変異PCV2b ORF2タンパク質の回
収を行うことができる。
おいて、昆虫細胞培養物から変異PCV2b ORF2タンパク質を回収する段階では、
洗浄剤やカオトロピック剤は用いない。
溶解方法を用い;物理的細胞溶解方法の例は、超音波処理、冷凍-解凍及びフレンチプレ
スである。
胞をインキュベートすることを指し、その細胞が増殖及び分裂し、異種挿入物を発現でき
るようにする。
含み;いずれも当業界では公知であり、市販されている。例えば、スポドプテラ(Spo
doptera)属又はトリコプルシア(Trichoplusia)属の昆虫からの細
胞系の培養物は、通常、26~28℃で単層又は懸濁液で、好気性条件下で培養される。
ランスフェクションされる昆虫細胞の培養に用いられる装置から十分に見えるようにする
ことが便宜である。通常、昆虫細胞は、マスター細胞ストック及び作業用細胞ストックと
して準備する。このアプローチによって、医薬用途用の組換えタンパク質の製造に必要な
品質管理レベルが可能となる。
製造されたタンパク質は、VLPの形態のものである。
V2b ORF2タンパク質を、十分な量で必要とされる免疫学的効力で製造し、PCV
2又は関連する疾患徴候に対するワクチンを製造することができる。
を軽減するためのブタ用ワクチンであって、当該ワクチンが薬学的に許容される担体中に
変異PCV2b ORF2タンパク質を含み、前記変異PCV2b ORF2タンパク質
がアミノ酸位置番号131にプロリンを有することを特徴とするワクチンに関する。
のPCV2による感染の低減のためのものである。
が知られている。「免疫活性化合物」は、「抗原」の形態の場合、接種された標的の免疫
系によって認識されて、免疫応答を誘発する。その応答は、先天性免疫系から及び/又は
後天性免疫系を起源とし得るものであり、細胞型及び/又は体液型であり得る。
ば野生及び家畜のブタ、イノシシ、バビルサ又はイボイノシシを指す。これは、雌ブタ、
雄ブタ、(成体)ブタ、雌ブタ(gilt)、離乳仔、又は子ブタなどの性別若しくは動
物齢を指す任意の名称によって示されるブタも含む。
、標的動物におけるPCV2による増殖感染の確立若しくは増殖を予防若しくは低減する
ことを指す。これは、例えば、ウィルス負荷の軽減又はウィルス複製期間の短縮によって
達成される。次に、それによって、標的動物において、ウィルス感染によって生じる疾患
の病変の数、強度若しくは重度及び結果として生じる臨床徴候の低減が生じる。そのよう
なワクチンは、口語表現で、PCV2「に対する」ワクチン又は「PCV2ワクチン」と
称される。
おける補助として及び/又は感染動物によるPCV2の排出の防止における補助として作
用する。
患又は併発症として起こり得るブタサーコウィルス関連疾患(PCVAD)を指す「関連
する疾患徴候の低減」も提供することができる。PCV2の場合のように、本発明による
ワクチンは、そのようなPCVADの症状若しくは結果の重度及び/又は期間の軽減/短
縮を提供することができる。
、肺、及びリンパ組織(例えば、扁桃腺、脾臓及びリンパ節)におけるPCV2ウィルス
負荷を低減し、リンパ球枯渇、感染の蔓延に対して、そしてPCV2関連疾患に対して保
護を行う。結果的に、これによって、死亡率低下、より良好な平均1日体重増、飼料効率
向上及び繁殖歩留まりの向上というパラメータの1以上で反映されるように、ワクチン接
種されたブタの群れにおける総体的健康及び成績が回復される。
れは例えば、ワクチン接種後の免疫応答をモニタリングすることで、又は攻撃感染後の臨
床症状の出現若しくは死亡率を調べること、例えば、標的の疾患徴候、臨床スコア、血清
学パラメータをモニタリングすることで、又は、攻撃病原体の再単離、及び擬似ワクチン
接種動物で認められるワクチン接種-攻撃応答とこれらの結果を比較することで、行うこ
とができる。具体的には、ワクチン効力及び保護は、PCV2特異抗体レベルの血清学的
測定により;血清での又は動物分泌(口、鼻、糞便、尿)でのウィルス検出により;又は
PCR、(免疫)組織学、ハイブリダイゼーションを介して又は血清学的に、PCVAD
に関与する他の病原体を検出することで測定することができる。
ワクチン接種群でのPCV2感染の低減レベルを評価することによって求められ、それに
よって、そのような感染は、自然に例えば農場条件下で獲得され得るか、意図的なもの、
例えば実験条件下での負荷によって生じ得る。
免疫により大きく基づくものであり得る。誘発抗体力価は、例えば多くの市販のPCV特
異的ELISAキットのうちの一つを用いて測定することができる。
む本発明によるワクチンの1実施形態において、変異PCV2b ORF2タンパク質は
、ウィルス様粒子の形態である。
重度の)副作用を引き起こすことなく、ワクチンの製造、使用若しくは保存において役立
ち得る。そのような担体は、水溶液、例えば緩衝液又は培地であり得る。
緩衝生理食塩水(PBS)、又はこれらの組み合わせである。
剤、保存剤、界面活性剤又はアジュバントを含むことができる。詳細及び例については、
例えば、″Remington:the science and practice
of pharmacy″(2000,Lippincot,USA,ISBN:683
306472)、及び″Veterinary vaccinology″(P.Pas
toretら編,1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN0444
819681)のようなハンドブックに記載のように公知である。
なサブユニットワクチンの場合、これは、サブユニット抗原に対する標的の免疫応答を大
きく高め得るものである。
。多くの異なるアジュバントが当業界で公知である。アジュバントの例には、フロイント
の完全及び不完全アジュバント、ビタミンE若しくはα-トコフェロール、非イオン性ブ
ロックポリマー及びポリアミン類、例えば硫酸デキストラン、Carbopol(商標名
)、ピラン、サポニン、例えばQuil A(商標名)、又はQ-vac(商標名)があ
る。サポニン及びワクチン成分を、ISCOM(商標名)中で組み合わせることができる
。
アジュバントとして用いられることが多く、そして、鉱油、例えばBayol(商標名)
、Drakeol(商標名)、Klearol(商標名)、又はMarcol(商標名)
、Montanide(商標名)又は軽鉱油(パラフィン);非鉱物油、例えばスクアレ
ン、スクアラン;植物油若しくはそれの誘導体、例えばオレイン酸エチルがある。さらに
、組み合わせ製品、例えばISA(商標名)(Seppic)、又はDiluvacFo
rte(商標名)及びXsolve(商標名)(いずれも、MSD Animal He
alth)を有利に用いることができる。さらなる選択肢は、EP16206789に開
示のSVEAアジュバント(スクアラン及びビタミンE-アセテートを含む)の使用であ
る。
e Adjuvants」(Methods in molecular medici
ne,vol.42,D.O′Hagan編,2000,Humana press,N
J,ISBN:0896037355)である。
RF2タンパク質に対する免疫応答を高めることができる。例えば、アジュバントが油状
物質である場合、油相は、抗原をゆっくり放出することでワクチン接種動物で貯留効果を
提供し、それにより標的の免疫系の長期刺激を提供することができる。
きる。1実施形態において、本発明によるワクチンは水相及び油相のエマルジョンとして
製剤することができ、好ましくはそのエマルジョンは、油中水型(w/o)、水中油型(
o/w)、水中の油中水型(w/o/w)であるか、二重油-エマルジョンである。
発明によるワクチンである。そのようなワクチンは、有利に、水相からの直接免疫刺激の
特性と油相の貯留効果からの長期免疫刺激の特性の両方を示す。
ョンとして製剤される。
が市販されており、例えばSilverson、Ultra Turrax(商標名)、
Dispaxリアクター(IKA)、又はMicrofluidiser(Microf
luidics)のような装置を用いる均質化である。
は1μm以下の分散相の粒径を有し、そのようなエマルジョンは「サブミクロンエマルジ
ョン」と一般に呼ばれている。
、サブミクロンエマルジョンである。
ide、Emunade及びSVEAからなる群から選択される。
とが知られている。
、アジュバントは鉱油である。
パラフィン油であり、Marcol(商標名)(ExxonMobil)、Klearo
l(商標名)(Sonneborn)、又はDrakeol(商標名)(Penreco
)のような商標名で市販されている。
フェロール又はα-トコフェロールアセテートである。
ン油及びα-トコフェロールアセテートを含む水中油型エマルジョンを含む。より好まし
いものは、界面活性剤がポリソルベート80(Tween(商標名)80)であり、及び
/又はパラフィン油がMarcol(商標名)52であり、及び/又はビタミンEがα-
トコフェロールアセテートである製剤である。最も好ましいものは、Microsol
Diluvac Forte(商標名)、又はXsolve(商標名)(両方とも、MS
D Animal Health)を含む製剤である。
は水平方向には群れ若しくは集団内で及び地理的区域内でのブタの群れにおけるPCV2
の予防又は拡散低減である。結果的に、本発明によるワクチンを使用することで、PCV
2の有病率が低下する。
は地理的地域におけるPCV2の有病率低下を目的としたものである。
ワクチンエマルジョンの特性を改善し、分解しやすい成分を保護し、及び/又はワクチン
の貯蔵寿命を延長するのに役立ち得る。一般に、そのような安定剤は高分子量の大分子で
あり、例えば脂質、炭水化物若しくはタンパク質であり、例えば粉乳、ゼラチン、血清ア
ルブミン、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、スペルミジン、タンパク質加水分解物
、デキストラン又はポリビニルピロリドン、及び緩衝剤、例えばアルカリ金属リン酸塩で
ある。
、例えばWO2006/094974に開示のように化学的に定義される。
/又はゲンタマイシンのような保存剤を含み得る。好ましくは、保存剤を全く用いない。
ある他の添加剤を加えることは当業者の通常の能力の範囲内であることから、本発明の範
囲に含まれる。
物齢、体重、性別、免疫状況及び他のパラメータはあまり重要ではないが、健康で感染し
ていない動物にワクチン接種し、PCV2による農場での感染を予防するためにできるだ
け早期にワクチン接種することは好ましいことは明らかである。なぜなら、そのような感
染は、若年齢ですでに確立する可能性があるからである。
ブタに施し、好ましくは生後28日以内、より好ましくは生後21、14、12、10、
8、7、6、5、4、3、2以内、若しくは1日以内(その望ましい順で)とする。
初乳を介した移動によって、母体由来のPCV2特異抗体を仔ブタに提供することができ
る。
きるPCV2に対する母体由来抗体のレベルにはほとんど影響されず、「若い」とは、4
週齢以下の動物齢を指す。
を有する若いブタにワクチンを施す。
続いて、ブースターワクチン接種を行って増幅することができる。例えば、本発明による
ワクチンを約2~10日齢の仔ブタに投与し、再度約3週間後に投与することができ、各
ワクチン接種は体積約1mLで行う。
い実施形態は、例えば約3週齢からの約2mLの単回投与である。このワクチン接種によ
って、約5~6ヶ月齢までの肥育期間全体にわたってブタが保護される。
月を超えて維持されるべきである場合、例えば雌ブタの場合は、年1、2若しくは3回の
定期的ブースターワクチン接種を行うことができ;各分娩前に1回のブースターワクチン
接種を行い、それは平均約2回/年である。
ことを示している。好ましくは、「約」はそれの値近傍±20%を意味し、より好ましく
は、「約」はそれの値の近傍±15、12、10、8、6、5、4、3、2%を意味し、
さらには、「約」はそれの値の近傍±1%を意味する(その望ましい順で)。
進行の両方を妨害することから、予防的処置として又は治療的処置として、又はその両方
として用いることができる。
射用液体、例えば懸濁液、液剤、分散液又はエマルジョンとして製剤される。
、そして人件費を削減するために、標的ブタが必要とし得る他のワクチンの既存のワクチ
ン接種スケジュールに組み込まれる。これらの他のワクチンは、それらの登録された用途
に適合するやり方で、一斉に、同時に又は順次に投与することができる。
質約0.1~約1000μgを含む。好ましくは、ワクチンは、動物用量当たりPCV2
b ORF2b-131Pタンパク質0.5~500μg、1~250、又は2~200
μgを含む(その望ましい順で)。用量当たりのタンパク質の量の選択は、ワクチン及び
標的動物の特性に基づいて当業者が行うことができる。
ョンで、標準的な生化学研究室手順を用い、乳化を破壊し、SDS-PAGEを用いて水
相を調べることで求めることができる。次に、既知量の基準タンパク質、例えばウシ血清
アルブミンと比較することで量の測定を行う。例えば、The Protein Pro
tocols Handbook,2nd edition,September 20
02,ed.J.M.Walker,Humana Press Inc.,Totow
a,NJ;Chapter 29,p.237-242を参照する。
の混合及び/又は乳濁の前に、抗原相の水系部分で測定する。
体積約0.1~約10mLであり得る。好ましくは、1用量は、約0.1~約5mLの体
積、より好ましくは、1動物用量は0.2~3mLである。
ましくは約2mLであり;皮内経路によって投与する場合、1用量の体積は、好ましくは
約0.1~約0.5mL、より好ましくは約0.2mLである。
る。好ましい投与は、非経口経路によるもの、即ち皮膚から、例えば筋肉、腹腔内、皮内
、粘膜下又は皮下である。本発明によるワクチンのより好ましい投与経路は、筋肉注射又
は皮下注射によるものである。さらにより好ましくは、後足又は首での筋肉投与である。
徴によって決まる。
Lとして筋肉投与される。
あり、即ち、そのワクチンは、2mL/動物の単回投与として又は1mL/動物の二連続
投与として投与される。2用量として投与される場合、両用量は、好ましくは、少なくと
も1週間、好ましくは2~5週間、より好ましくは約3週間の時間間隔をあけて投与され
る。
週齢からのブタに皮内投与される。
に、それには、その提供される免疫保護をさらに改善するための、ワクチンの効力微調整
が含まれる。それは、ワクチンの用量、体積若しくは抗原含有量を調節し;別の形態若し
くは製剤でワクチンを用い;ワクチンの他の構成成分(例えば、安定剤又はアジュバント
)を調節し;又は異なる経路、方法若しくは投与法によって投与することで、行うことが
できる。これらはいずれも本発明の範囲内である。
を含む免疫刺激核酸のような他の化合物を含むことができる。或いは、本発明によるワク
チンは、有利には、医薬成分、例えば抗生物質、ホルモン、抗炎症薬又は抗寄生虫薬と組
み合わせることができる。又は、本発明によるワクチン自体を、ワクチンに加えることが
できる。
と組み合わせることができる。そのような組み合わせワクチンの利点は、それがPCV2
に対する免疫応答を誘発するだけでなく、他の病原体に対する免疫応答も誘発し、一方、
ワクチン接種のために必要なのは標的動物を1回扱うことのみであり、それによって、動
物へのワクチン接種ストレスが軽減され、並びに、時間コスト及び労働コストが削減され
る。
微生物のさらなる抗原を含む。
きるか、サブユニットであることができ、そして、アジュバントを含んでいても含んでい
なくても良い。さらなる抗原は、タンパク質、炭水化物、リポ多糖、脂質若しくは核酸分
子のような生体分子又は合成分子からなるものであることができる。或いは、それは、そ
の他の微生物からの核酸からの発現産生物、又はそのような核酸を含むベクターであるこ
とができ;そのベクターは、自体が微生物又は真核宿主細胞であることができる。
しての、何らかの形でブタ動物に対して病原性である他の微生物「由来」であり得る。
、前記さらなる抗原は、基本的に、ブタに対して病原性であるウィルス、細菌、寄生虫、
真菌、リケッチア、原虫及び/又は寄生虫由来であり得る。
(PRRSV)、仮性狂犬病ウィルス、ブタパルボウィルス、ブタコレラウィルス、ブタ
インフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、ブタ流行性下痢ウィルス、伝染性胃腸炎ウィ
ルス、水疱性口内炎ウィルス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ(Mycoplasm
a hyopneumoniae)、ローソニア・イントラセルラリス(Lawsoni
a intracellularis)、アクチノバチルス・プルロニューモニア(Ac
tinobacillus pleuropneumoniae)、ヘモフィルス・パラ
スライス(Haemophilus parasuis)、エシェリキア・コリ(Esc
herichia coli)、ストレプトコッカス・スイス(Streptococc
us suis)、又はサルモネラ菌、ブラキスピラ属、クロストリジウム菌、パスツレ
ラ菌、エリジペロスリックス属、ボルデテラ属、トキソプラズマ、イソスポラ属、又は旋
毛虫属がある。
に隣接して、M.ヒオニューモニエ(M. hyopneumoniae)、L.イント
ラセルラリス(L. intracellularis)及びPRRSVからなる群から
選択される、ブタに対して病原性である微生物からの1以上の抗原を含む。
へのそれらの組み合わせが、経済的観点並びに獣医学的観点の両方から非常に好ましい。
によるワクチンに加えることで、前記組み合わせワクチンを、本発明のワクチンエマルジ
ョンによる再構築によって調製する。これは、例えばWO2010/106095に記載
されている。
パク質及びM.ヒオニューモニエ(M. hyopneumoniae)からの抗原を含
む組み合わせワクチンであり、前記組み合わせワクチンを用いて、L.イントラセルラリ
ス(L. intracellularis)及び/又はPRRSVからの抗原の凍結乾
燥製剤を再構築させる。
パク質、M.ヒオニューモニエ(M. hyopneumoniae)からの抗原、及び
L.イントラセルラリス(L. intracellularis)からの抗原を含む組
み合わせワクチンであり、前記組み合わせワクチンを用いて、PRRSVからの抗原の凍
結乾燥製剤を再構築させる。
疾患徴候の軽減方法であって、該方法は、本発明によるワクチンを前記ブタへ投与するこ
とを含む方法に関する。
ように、本発明に関して記載の変異PCV2b ORF2タンパク質、又は本発明に関し
て記載の昆虫細胞の使用によって、本発明について記載のようにブタ用ワクチンの製造が
可能となる。これに関して、変異PCV2b ORF2タンパク質は、本発明による方法
によって得ることもできる。
の軽減のためのブタ用ワクチンの製造のための、アミノ酸位置番号131にプロリンを有
する変異PCV2b ORF2タンパク質の使用に関する。
ためにブタ用ワクチンで使用されるための、アミノ酸位置番号131にプロリンを有する
変異PCV2b ORF2タンパク質に関する。
は、
-アミノ酸位置番号131にプロリンを有する変異PCV2b ORF2タンパク質を
、薬学的に許容される担体と混合する段階;及び
-変異PCV2b ORF2タンパク質及び薬学的に許容される担体の前記混合物をア
ジュバントと製剤する段階
から選択される1以上の段階を含む方法に関する。
ク質は、本発明による昆虫細胞における変異PCV2b ORF2タンパク質の発現方法
によって得ることができ、及び/又は本発明による変異PCV2b ORF2タンパク質
の製造方法によって得ることができる。
、VLPの形態のものである。
効果と適合する形態で当業者が製造することができる。一般に、そのようなワクチンは、
無菌的にそして生理的pHで製造される。
明細書において記載し、そのような手順は、通常の材料及び方法を用いて当業者が容易に
実施可能である。例えば、本発明について記載の変異PCV2b ORF2タンパク質は
、工業的規模で昆虫細胞において製造することができ、そして、薬学的に許容される賦形
剤と組み合わせ、例えば油状アジュバントと乳濁させることでワクチンに製剤し、適切な
大きさの容器に充填される。製造方法の各種段階は、十分な試験によって、例えば抗原の
品質及び量についての免疫学的試験により;失活、無菌性及び外部作用剤がないことにつ
いての微生物学的試験により;及び最終的に、効力及び安全性を確認するための動物での
ワクチン接種試験によってモニタリングされる。品質、量及び無菌性についての試験が完
了した後、そのワクチン製品を発売することができる。
留意事項が、例えば、政府指令及び規則(薬局方、9CFR)及び公知のハンドブック(
Pastoret、Lippincot、上述)に記載されている。
昆虫細胞でのPCV2 ORF2タンパク質の発現のため、標準的手順を用いて、組換
えバキュロウィルスを産生した。即ち:
これらの実験で用いた野生型PCV2 ORF2遺伝子は、異なる入手先から得た:P
CV2a親ウィルスは、USAからのワクチン株からのものであり;PCV2bは、フラ
ンスの単離株Imp1011、GenBank受託番号AF055394からのものであ
り;PCV2dは、中国、株BDH、GenBank受託番号:HM038017からの
ものであった。
グプラスミドへ挿入した。次に、ORF2遺伝子の一部を、PCR-定方向突然変異を用
いることで突然変異させて、アミノ酸位置131にプロリンをコードした。或いは又はさ
らに、ORF2遺伝子をコドン最適化して、AcMNPVポリへドリン遺伝子のコドン使
用頻度表に似せた。PCV2b用に本明細書で使用される変異配列は、上記の添付の配列
表にある。
ear,Netherlands;or Genscript,Piscataway,
NJ,USA)。
astBac1にサブクローニングし、ProEasyシステムで用いるためには、トラ
ンスファーベクターpVL1393にサブクローニングする。両方の場合で、挿入物は、
ポリへドリンプロモーターの後ろにあった。組換えバキュロウィルスの発生及び選択を、
製造者の説明書に従って行った。PCV2a組換えバキュロウィルス構築物の一部は、軟
寒天下での感染昆虫細胞のプレーティング、及びプラークピッキングによる組換え体のト
ランスフェクション及び単離の旧来の選択技術を用いて構築された。
存し、力価測定した。さらなる実験に用いたウィルスストックは、代表的には7.5~8
.5Log10 TCID50/mLであった。
選択を、下記のスケジュールに列記している。
上記の各種組換えバキュロウィルス構築物を用いて、昆虫細胞を感染させ、PCV2
ORF2タンパク質の各種変異体を発現させた。産生されたタンパク質を目視で観察し、
分析して、PCV2の未修飾のタンパク質又は別の遺伝子型のタンパク質と比較すること
で生じた各種突然変異の効果を評価した。一部の組換えバキュロウィルスをスケールアッ
プして、ブタでの試験用のPCV2サブユニットワクチンの製剤用のタンパク質を製造し
た。
標準的な感染及び発現実験を、級数的増殖を維持するために定期的に分割したクリーン
な細胞の攪拌培養物から取ったSf9昆虫細胞を用いて小規模で行った。典型的な感染率
は0.01~0.1moiであり、培養期間は3~5日であった。培養物は、光学顕微鏡
によって定期的にモニタリングして、未感染細胞の健康を調べ、感染培養物でのウィルス
複製の進行をモニタリングした。
フラスコ(Falcon)であった。或いは、100mL懸濁液培養を、スピナーフラス
コ(Corning)で行った。フラスコを27℃でインキュベートし、使用した培地は
、Sf-900(商標名)II(Thermo Fisher scientific)
であった。血清は加えずに、抗生物質の混合物:50μg/mLゲンタマイシン及び0.
25‰ナタマイシンを加えた。
ために、T型培養瓶培養物をしっかり叩く必要があった。次に、細胞回収物を遠心し、産
生されたORF2タンパク質はほとんど昆虫細胞内に含まれていたことから、細胞上清は
廃棄した。所期のさらなる使用に応じて、次に、必要な液体に細胞ペレットを所望の濃度
で再懸濁させることができた。
性電気泳動サンプル緩衝剤で処理し、そして失活したと見なした。
、中間大規模昆虫細胞懸濁培養を、自動プロセス制御を行う工業的発酵槽で2~10リッ
トル体積で行った。クリーンなSf9昆虫細胞を、前培養物から得た。Moiは0.01
~0.1であり、培養は5~7日間行った。感染が十分に進行したら、細胞を重力で沈降
させた。次に、培養物体積の上90%を除去し、細胞を元の培養物体積の1/10で回収
し、超音波処理によって溶解させた。中規模では、超音波処理は、チップ超音波装置(t
ip sonifier)(Vibra Cell(商標名)、Sonics, CT,
USA)を用いて氷上でバッチ式で行った。大規模では(体積100リットル以上)、超
音波処理は、フロースルー超音波セル(Sonobloc(商標名)、Bandelin
)に通すことで行った。
て中和した。次に、失活させた回収物を、遠心によって透明とし、ORF2タンパク質を
含む上清をバルク抗原の水相として維持した。これを、品質管理及びさらなる処理のため
に2~8℃で保存した。従って、これらの生成物において、抗原用の薬学的に許容される
担体は、昆虫細胞からの使用済み培地である。必要な場合、バルク抗原を濃縮することが
できるか、PBSに対して透析することができよう。或いは、抗原を新鮮な細胞培地で、
又はPBSで希釈することができよう。
2.2.1 ELISAの概要
昆虫細胞培養物を、組換えバキュロウィルス番号6(131のトレオニン)又はウィル
ス番号8(T131P置換)で感染させて、PCV2b ORF2タンパク質におけるT
131P置換の効果を調べた。両方ともBic-2-Bac様式での構築物であり、コド
ン最適化を持たなかった。ウィルス6のうち、二つの単離物を調べた。
物の遠心によって回収した。細胞ペレットを、注射用水10mLに溶解し、それによって
全細胞を効果的に溶解させた。次に、細胞溶解物について、サンドイッチELISAでそ
れらの抗原質量(antigenic mass)を調べた。即ち、下記の通りである;
ポリスチレンミクロタイトレーションプレートのウェルを、PCV2 ORF2aに対
するモノクローナル抗体でコーティングした。溶解物サンプルの連続希釈液を、PCV2
a ORF2の既知の基準標準の一連の希釈液と一緒にインキュベートした。次に、ビオ
チンと結合した、やはりPCV2 ORF2aに対する二次抗体の固定量とともにインキ
ュベートした。最後に、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとともにインキュベー
トし、次に自動プレートリーダーによって色素体検出することで結合複合体の量を定量し
た。
準標準に対して計算した。
溶解物で検出されたORF2タンパク質の量は、下記の通りであった;
-ウィルス6感染細胞(二つの変異体):5.5及び7.4AU/mL、
-ウィルス8感染細胞:68AU/mL。
ルスで感染した細胞からの純水中で調製された溶解物は、ELISAによる検出でごく少
量のみのORF2タンパク質を含んでいた。しかしながら、T131P置換を有するOR
F2を発現する組換えバキュロウィルスで感染した細胞からのそのような溶解物は、約1
0倍多いタンパク質を含んでいた。
から容易に単離できたORF2タンパク質の量に大きな違いを示した。一方で、それは、
そのタンパク質が非変性溶解物で放出される容易さに関係するものであった。他方、それ
は、位置131にアミノ酸の変異が無い若しくは無い昆虫細胞におけるPCV2b OR
F2タンパク質の総産生量における差を反映したものでもあった。
2.3.1 IFTアッセイの概要
免疫蛍光試験(IFT)においては、クリーンな昆虫細胞を、典型的には培地100μ
L中2.5×104細胞/ウェルで、96ウェルマイクロタイトレーションプレートのウ
ェルに蒔いた。付着後、細胞を特定の被験組換えバキュロウィルスで感染させた。典型的
には、ウィルスの希釈範囲を接種して、異なるmoiで観察できるようにした。昆虫細胞
が適切に感染しているがまだ溶解していないとき、接種から4~5日後にプレートを分析
した。培地を除去し、細胞を冷エタノールで固定し、そして、標準的手順に従って適切な
抗体で染色した。FITC結合第2抗体を肉眼観察に用いた。昆虫細胞をエバンスブルー
で対比染色して、バックグラウンドとの対比を高めた。
血清であり、それは、PCV2b及びPCV2d遺伝子型のORF2タンパク質を染色す
るのにも十分に強力であった。
異なるORF2タンパク質発現産生物について観察されたIFT結果を比較すると、次
のいくつかの所見が得られた;
-上記の組換えウィルス1~5(いずれも、PCV2a ORF2タンパク質を発現)
は全て、必ず細胞質染色パターンを生じ、実質的に昆虫細胞の全体が鮮明な発色を示した
。
ウィルス番号6で感染した昆虫細胞は、実質的に異なるパターンを示し、ここで、染色は
、専ら昆虫細胞の核周囲であった。細胞質染色は全く認められなかった。
した昆虫細胞とかなり同じであったが、やはりPCV2b ORF2タンパク質を発現し
ている。唯一の相違は、少量(昆虫細胞の約10%)が細胞質染色を示したが、大半の細
胞がやはり核染色を示したという点であった。
ルス番号7についてのものと逆であるIFTパターンを与えた;ほとんどの昆虫細胞が細
胞質染色を示し、一部の細胞はなお核染色を示した。ウィルス番号8は、アミノ酸番号1
31をコードするコドンがトレオニンからプロリンに変異している(T131P)PCV
2b ORF2遺伝子を有していた。
するPCV2b ORF2遺伝子)で感染した昆虫細胞は、いずれも専ら細胞質染色を示
した。
、明構築物中で、PCV2d ORF2タンパク質をコード)で感染した昆虫細胞は、い
ずれもやはり核染色パターンを示した。
結論として、昆虫細胞におけるPCV2bからのORF2タンパク質の効果的発現には
、位置番号131のアミノ酸のプロリンによる置換が必要であり、抗PCV2a抗体を有
するIFTで細胞質染色パターンを示した。そのような突然変異がないと、PCV2b
ORF2タンパク質は、専らそのタンパク質を発現する昆虫細胞の核で又はその核周囲で
染色を示した。
の結果として、IFT染色パターンのわずかなシフトが生じた。
、Bac-to-Bacシステムを用いて生じた組換えで)に基づくものではなく、「ク
リーンな」バキュロウィルス構築物である、即ち、それのゲノムにおける組換えプロセス
からのさらなる遺伝的要素を含まない場合、その核染色パターンは、さらに逆転し得ると
考えられる。そのようなクリーンな組換えバキュロウィルスは、旧来の相同組換え及びプ
ラーク精製を用いることで、又はより簡便には、ProEasyシステムのような市販キ
ットを用いることで得られよう。
色パターンの逆転は、ORF2アミノ酸番号131をコードするトリプレットの突然変異
によるプロリンコードによって得ることができる。細胞質ORF2タンパク質発現のさら
なる最適化は、コードする遺伝子をコドン最適化することで、そしてクリーンな組換えバ
キュロウィルス構築物を用いることで行うことができる。
2.4.1 ゲル電気泳動アッセイの概要
異なるORF2タンパク質の発現レベルの定量を可能とするため、感染昆虫細胞培養物
からのサンプルについて、マーカータンパク質として既知量のウシ血清アルブミン(BS
A)での列と一緒にSDS-PAGEを行った。染色後、ゲルを走査し、分析した。強変
性サンプル緩衝液を用いることで、この実験によって、各種組換えバキュロウィルス構築
物で感染した昆虫細胞の総発現能力が明らかになった。
、遠心し、細胞ペレットをPBS 7.5mLに溶解した。次に、上清のサンプル及び再
懸濁細胞のサンプルを、標準変性Laemmli SDS-PAGEサンプル緩衝液(ブ
ロモフェノールブルー指示薬及びβ-メルカプトエタノールを含む)に溶解した。
クリルアミドゲル(プレキャストCriterion TGX(商標名)、あらゆるkD
(15%)、Bio-Rad)を行った。電気泳動後、ゲルを、Instant Blu
e(商標名)(Expedeon)で染色した。最後に、Image Lab(商標名)
ソフトウェア、バージョン5.2.1を用いて、ゲルをデジタル化し、Bio-Rad
GS-900較正密度計で分析して、タンパク質の量をそのゲルにおける個々のバンドに
割り当てた。
図1及び2において、これらの実験で用いたもののようなゲルについてのいくつかの代
表的な画像を提供しており、図1は、ウィルス番号3、6若しくは7で感染した昆虫細胞
の培養物からのサンプルであり、図2は、ウィルス番号8若しくは9での培養液からのサ
ンプルである。ウィルスの型ごとに、第1の列は培養上清のサンプルを含み、次の3列は
2倍濃縮細胞のサンプルを含み、左から右に向かって30、20及び10μmLであった
。最も左及び最も右の列は、分子量マーカー10~250kDa(Precision
Plus Protein(商標名) Standards、Bio-Rad)であり、
バンドの大きさは図に示している。
d high-quality)、Thermo Fisher Scientific
)も含み、それは100ng/μL溶液として用いた。使用した量は、図1:列14~1
7で、0.25、0.5、1及び2μgBSAであり、図2:列11~15で、0.25
、0.5、1、2及び3μgBSAであった。
当てたものであった。全てのサンプルをゲル上で2回分析し、計算収量結果は、その二連
の平均である。
-ウィルス番号8及び9によるウィルス感染では、T131P置換があるPCV2b
ORF2の二つの構築物の場合、ゲル列(図2参照)は、SDS-PAGEによって比較
した全ての培養物について、moi(0.1)、培養時間(4日間)、及び他の条件は全
て同一であったが、調べた他のウィルスの場合より若干暗いように見えた。これは、感染
が、他のウィルスの場合ほど進行していなかったことで、サンプル中により多くの細胞材
料があった可能性があることを示していると考えられる。恐らく、プロリン置換によって
、組換えバキュロウィルスが若干減弱されたものである。しかしながら、タンパク質-発
現レベルは影響されていないように見え、この突然変異がないPCV2b ORF2より
良好であった。
サンプルはなかった。結果的に、これらの実験で適用された条件下では、事実上、発現O
RF2タンパク質の全てが昆虫細胞に含まれていた。
a ORF2(ウィルス3)の場合より低く、26μg/mLに対して32μg/mLで
あった。留意すべき点として、これらのサンプルは、積極的(aggressive)変
性を用いた(SDS及びβ-メルカプトエタノール中で煮沸)ことから、産生した全ての
タンパク質の合計を示している。これは、未変異のPCV2b ORF2遺伝子からの総
タンパク質発現が、実際には、昆虫細胞全体ではより低いことを示している。
なり悪い。その場合、未変異のPCV2b ORF2を発現する昆虫細胞からの溶解物は
、検出可能なORF2タンパク質を示すことはほとんどなかった。
用いることで若干上昇させることができ、ウィルス-培養物6及び7の収量を比較すると
、それぞれ総収量は26μg/mL及び36μg/mLである。
を導入することで達成されたものであり、ウィルス-培養物6及び8の収量26μg/m
L対56μg/mLを参照する。従って、T131P置換は、最適化を行っていないこれ
らの小規模培養物であっても、ORF2タンパク質の合計収量を倍以上とすることができ
た。
アーなバキュロウィルス構築物の使用を組み合わせた場合に、さらにより良好なPCV2
b ORF2タンパク質が達成されると考えられ;ウィルス-培養物6及び9の収量を比
較すると、26μg/mLから76μg/mLへのタンパク質収量の三倍化が示される。
ンプルについても行った。回収物は、総培養物体積と比較して7.7倍濃度で得た。やは
り、これらの培養物からのORF2タンパク質を用いて、後述する実験的PCV2ワクチ
ンを製造した。
あった。温度、pH及び溶存酸素の自動制御のためだけでなく、さらにはこれらが懸濁培
養であったため、培養液1mL当たりの細胞密度がより高くなった。
(ProEasyシステムを用いて製造)中で、コドン最適化ORF2遺伝子を有してい
たという意味で、至適に構築された。
いてのタンパク質収量となったが、T-フラスコでは、それは76μg/mLであった。
質を発現する昆虫細胞からのタンパク質の収量は、同じ構築物及び培養条件を用いても、
格段に未変性PCV2a ORF2タンパク質の場合よりかなり高かった。特に、ここで
使用されるPCV2aのORF2遺伝子も、それの天然配列からアミノ酸位置131にプ
ロリンを有していたからである。それはPCV2に対するサブユニットワクチンの製造の
ためのPCV2b ORF2タンパク質の製造に明らかに非常に好ましいが、何がこの差
の原因である可能性があるかは直ちに明らかではない。
観察された効果が全てこの時点で説明できるとは限らないが、ゲル電気泳動による分析
によって、調整のないPCV2b ORF2タンパク質の昆虫細胞での発現によっては、
せいぜいPCV2a ORF2の発現の場合よりも低いタンパク質量を生じることが明ら
かになった。この差は、細胞を非変性条件を用いて回収した場合は、さらに悪くなる。
プロリンに代えることで十分以上に補償できるものであり、それによって、未変異のPC
V2b ORF2タンパク質の場合と比較して収量は少なくとも倍加する。
バキュロウィルス構築物を用いることで、収量をさらに高めることができる。大規模懸濁
培養で、収量をさらに改善することができる。
ンパク質の商業的な大規模製造が初めて可能となる。
3.1 イントロダクション
3.1.1 目的
本試験は、本発明による昆虫細胞発現変異体PCV2 ORF2タンパク質に基づいて
、ブタワクチンの効力を比較及び評価するために実施した。保護能力についての徹底的な
試験を提供するため、異なる遺伝子型のORF2タンパク質を、同種だけでなく異種PC
V2攻撃-感染に対しても用いた。さらに、使用したワクチン用量は、比較的低量のOR
F2タンパク質を含んでいた。
本試験においては、仔ブタ140頭を用い、2セットの動物各10頭の7処理群に割り
当て、二つの攻撃のそれぞれにつき1セットとした。動物140頭は、14頭の雌ブタ由
来であった。仔ブタは、低力価から非常に高力価にわたる検出可能レベルの抗PCV2
ORF2抗体を有しており;全動物についての平均MDA力価は、抗体-ELISAによ
り5.8log2であった。
。使用したワクチンは、三つの遺伝子型:PCV2a、2b又は2dのうちの一つからの
バキュロウィルス-昆虫細胞発現系を介して産生された異なる量のPCV2 ORF2タ
ンパク質を含んでいた。使用した組換えバキュロウィルスは、クリーンなバキュロウィル
ス構築物を用いて、AcMNPVポリへドリン遺伝子向けにコドン最適化されたコードO
RF2遺伝子から発現される、アミノ酸位置131にプロリンを有する上記の番号5、9
及び10であった。ワクチンは、Emunade(商標名)アジュバントを用いて水中油
型エマルジョンとして製剤した。そのワクチンはさらに、マイコプラズマ・ヒオニューモ
ニエ(Mycoplasma hyopneumoniae)(J株)からの抗原を含み
、市販のワクチン:Porcilis(商標名)PCV M Hyoに似たものとした。
PCV2 ORF2抗原に関して、被験ワクチンは、動物当たり、標準総用量の1/4又
は1/16を含んでいた。
た通りとした。
週間後(6週齢)、全ての動物に、2b遺伝子型又は2d遺伝子型からの有毒PCV2に
よる攻撃感染を行った。攻撃は、セット1についてはPCV2b攻撃ウィルス(オランダ
単離物、2003)を用い、セット2についてはPCV2d攻撃ウィルス(ドイツ単離物
、2015)を用いて、5log10 TCID50/mLでPCV2/PBS 6mL
(3mL/鼻孔)を経鼻投与することで行った。攻撃ウィルスは、PCVを含まないPK
15細胞で産生させたものであり、細菌及び真菌無菌性について検査済みのものであった
。
リンパ節、扁桃腺、胸腺、脾臓、肝臓及び腎臓に特に注意を払いながら、内臓をイン・サ
イツで調べた。次に、扁桃腺、肺、腸間膜リンパ節及び鼠径リンパ節からの検体を摘出し
、免疫組織化学検査(IHC)によるPCV2攻撃ウィルスの検出のために固定した。
も行った。しかしながら、IHCデータが、最も明確な結果を与えた。
3.2.1 PCV2 ORF2タンパク質
PCV2a、2b及び2dのPCV2 ORF2遺伝子配列を、上記のセクション2.
1に記載のように中間規模培養で製造した。ゲル電気泳動によるそれらの定量については
、上記セクション2.3.2に記載されている。
試験動物は、PCV2ウィルス負荷に関して陰性であり、中等度レベルの抗PCV2抗
体を有していた。動物が攻撃前にPCV2感染の臨床徴候を発症していたら、試験は除外
となっていたであろう。
くは全身徴候、例えば食欲低下、運動を嫌がること、横たわる傾向、倦怠若しくは眠気、
震え、毛の逆立ち、浮腫(特に眼球周囲)、嘔吐及び下痢及び呼吸困難について1日1回
観察した。
分けた。離乳後、水道水を自由に摂取させ、給餌は標準的な手順に従って行った。
3.2.3.1 免疫組織化学検査
10%ホルマリンで固定しパラフィンに包埋することで、組織学的検査用に組織検体を
準備した。顕微鏡検査スライドを準備した。これらを、一次抗体としてのウサギポリクロ
ーナル抗PCV2血清とともにインキュベートし、ペルオキシダーゼ染色(Envisi
on+(商標名)、DAKO)によって視覚化した。スライドを、ヘマトキシリンによっ
て対比染色した。扁桃腺及びリンパ節の顕微鏡検査で、特徴的な褐色染色が得られ、着色
の程度に応じたスコアとした;
スコア0:リンパ濾胞が、特異的陽性染色を全く示さなかった。
でいた。
でいたか、又は10%未満のリンパ濾胞が特異的陽性染色を有する細胞を15個より多く
含んでいた。
値を群の全動物について合わせた。
被験ワクチンを、Emunade(商標名)を含む水中油型エマルジョンとして製剤し
、それは、ワクチン抗原並びに水酸化アルミニウムを含む水相中に分散した鉱油を含む二
重アジュバントである。9%Mhyo抗原を含む製剤は、WO2016/091998に
記載の手順によるものであった。
2タンパク質約20μgを含み、6.25%の用量がORF2タンパク質/動物用量5μ
gを含むようにワクチンを製造した。
免疫組織化学的検査によって、死後に摘出した扁桃腺、腸間膜リンパ節及び鼠径リンパ
節の組織検体を分析し、検出可能な攻撃ウィルスの量を評価した。これらの結果のグラフ
による概観を図3及び4で提供し;図3は、毒性PCV2bウィルスによる攻撃感染を受
けたセット1の群1~7における動物についての結果を表し;図4は、動物が毒性PCV
2dウィルスによる攻撃を受けたセット2の全ての動物についてのIHCデータを表す。
を用いてワクチン接種群と非ワクチン接種群でのPCV2感染の低減レベルを比較するこ
とで、PCV2 ORF2タンパク質に基づくワクチンの効力を求めることができる。
-非ワクチン接種動物は、ワクチン接種群と比較してかなり高いIHCスコアを示し、
それは、攻撃の用量が十分高いこと、及びその攻撃感染が、仔ブタでの中等度レベルの抗
PCV2母体抗体のものであっても有効であったことを示している。
ウィルスの複製に対する強力な保護を提供し、最大90%のIHCスコア低下に達した。
従って、これらのPCV2ワクチンは、非常に有効であった。
や低い保護が認められた。これは、本発明によるPCV2b若しくはPCV2dからの昆
虫細胞発現変異体ORF2タンパク質に基づくPCV2ワクチンが、単回投与であっても
、そして母体由来抗体に関連するものであっても、PCV2感染に対するワクチンとして
非常に有効であることを示している。等しい用量で、PCV2bから若しくはPCV2d
からの変異体ORF2タンパク質に基づくこれらのワクチンであっても、PCV2a O
RF2タンパク質に基づく従来のワクチンより効果が高いように見えた。
遺伝子型により、PCV2b及びPCV2d攻撃ウィルスに対する明らかなレベルの交差
保護があり;PCV2a及びPCV2d ORF2タンパク質ワクチンは、PCV2b攻
撃に対して最低用量で保護効果は匹敵するが、それより高い用量ではPCV2a ORF
2タンパク質の方が良好であった。しかしながら、変異PCV2b ORF2タンパク質
に基づくワクチンは、両方の用量でPCV2d攻撃に対してPCV2a ORF2タンパ
ク質より良好であった。
Claims (14)
- a.遺伝子型2bのブタサーコウィルス2(PCV2b)からのORF2タンパク質を
コードするヌクレオチド配列、及び
b.前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結されている転写制御配列
を含む異種核酸を含む昆虫細胞であって、
前記ヌクレオチド配列が、アミノ酸位置番号131にプロリンを有する変異PCV2b
ORF2タンパク質をコードすることを特徴とする昆虫細胞。 - 転写制御配列が、バキュロウィルスp10遺伝子プロモーター又はバキュロウィルスポ
リへドリン遺伝子プロモーターであることを特徴とする、請求項1に記載の昆虫細胞。 - 異種核酸が、組換えバキュロウィルスゲノム中に含まれていることを特徴とする、請求
項1又は2に記載の昆虫細胞。 - 変異PCV2b ORF2タンパク質のウィルス様粒子(VLP)であって、変異PC
V2b ORF2タンパク質がアミノ酸位置番号131にプロリンを有することを特徴と
する粒子。 - 請求項1~3のいずれか1項に記載の昆虫細胞での変異PCV2b ORF2タンパク
質の発現方法であって、該方法は、バキュロウィルス-昆虫細胞発現系を用いる、方法。 - アミノ酸位置番号131にプロリンを有する変異PCV2b ORF2タンパク質の製
造方法であって、該方法が、
-請求項1~3のいずれか1項に記載の昆虫細胞を培養する段階;及び
-昆虫細胞培養液から変異PCV2b ORF2タンパク質を回収する段階
から選択される一方又は両方の段階を含む方法。 - 薬学的に許容される担体中に変異PCV2b ORF2タンパク質を含む、PCV2に
よる感染の若しくは関連する疾患徴候の軽減のためのブタ動物用ワクチンであって、変異
PCV2b ORF2タンパク質がアミノ酸位置番号131にプロリンを有することを特
徴とするワクチン。 - 変異PCV2b ORF2タンパク質がVLPの形態であることを特徴とする、請求項
7に記載のワクチン。 - アジュバントを含む、請求項7又は8に記載のワクチン。
- 更に、ブタ動物に対して病原性である微生物抗原を含む、請求項7~9のいずれか1項
に記載のワクチン。 - ブタ動物におけるPCV2による感染の又は関連する疾患徴候の軽減方法であって、請
求項7~10のいずれか1項に記載のワクチンを前記ブタ動物に投与することを含む方法
。 - PCV2による感染の又は関連する疾患徴候の軽減のためのブタ動物用ワクチンの製造
のための、アミノ酸位置番号131にプロリンを有する変異PCV2b ORF2タンパ
ク質の使用。 - PCV2による感染の又は関連する疾患徴候の軽減のためのブタ動物用ワクチンにおい
て使用される、アミノ酸位置番号131にプロリンを有する変異PCV2b ORF2タ
ンパク質。 - 請求項7~10のいずれか1項に記載のワクチンの調製方法であって、該方法は、
-アミノ酸位置番号131にプロリンを有する変異PCV2b ORF2タンパク質を
、薬学的に許容される担体と混合する段階;及び
-変異PCV2b ORF2タンパク質及び薬学的に許容される担体の前記混合物を、
アジュバントと製剤化する段階
から選択される1以上の段階を含む方法。
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