BR112020007498A2

BR112020007498A2 - expressão recombinante da proteína orf2 de pcv2b em células de insetos

Info

Publication number: BR112020007498A2
Application number: BR112020007498-5A
Authority: BR
Inventors: Paulus Jacobus Antonius Sondermeijer; Lisette SANDERS; Karin Huberdina Antonia Van Der Heijden - Liefkens
Original assignee: Intervet International B.V.
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2020-10-06
Also published as: JP7062760B2; RU2020115868A; MX2020003626A; JP2020537651A; JP7422795B2; CA3078281A1; KR102480771B1; EP3697804B1; WO2019076864A1; US20200299726A1; CN111212847A; PL3697804T3; CN111212847B; CA3078281C; ES2962449T3; DK3697804T3; JP2022065059A; US11279952B2; EP3697804A1; KR20200066700A

Abstract

A presente invenção refere-se ao campo de vacinas veterinárias, em particular vacinas porcinas contra PCV2 e doenças associadas. Especificamente, a invenção refere-se à descoberta de que é necessária uma mutação na proteína ORF2 de PCV2b para impedir seu acúmulo nuclear após a expressão em células de inseto; a mutação introduz uma Prolina na posição de aminoácido 131. Isso permite uma expressão eficiente nas células de insetos, fácil coleta e gera grandes quantidades de partículas semelhantes a vírus. As VLPs são altamente eficazes em vacinas para porcinos para redução de infecção pelo PCV2 ou de sinais de doença associados.

Description

EXPRESSÃO RECOMBINANTE DA PROTEÍNA ORF2 DE PCV2B EM CÉLULAS DE

INSETOS

[001] A presente invenção refere-se ao campo de vacinas veterinárias, em particular vacinas porcinas para PCV2. Especificamente, a invenção refere-se a células de inseto compreendendo uma sequência de ácido nucleico heteróloga expressando uma proteína mutante ORF2 de PCV2b, a partículas semelhantes a vírus da proteína mutante ORF2 de PCV2b, a métodos para produção ou uso de células de inseto ou da proteína ORF2 de PCF2b mutante e a vacinas para animais porcinos.

[002] O circovírus porcino 2 (PCV2) é um patógeno de animais porcinos, de ocorrência em todo o mundo e que causa muito sofrimento aos animais e severas perdas econômicas para o setor agrícola. Para uma revisão, ver Gillespie et al. (2009, J. Vet. Intern. Med., Vol. 23, p. 1151-1163).

[003] PCV2 pertence à família dos Circoviridae e possui um vírion icosaédrico não envelopado pequeno (17 nm), contendo um genoma circular de DNA de cadeia simples de cerca de 1,76 kb. O genoma contém apenas alguns quadros de leitura aberta, dos quais ORF2 codifica a proteína de capsídeo viral que contém os principais epítopos neutralizadores de vírus.

[004] PCV2 é relativamente estável e altamente infeccioso. É derramado por diferentes tipos de secreções corporais e pode se espalhar horizontal e verticalmente em um rebanho suíno. As principais lesões causadas pela infecção por PCV2 são depleções linfoides; a imunossupressão resultante também torna um animal infectado suscetível a infecções secundárias ou simultâneas. Consequentemente, PCV2 está envolvido em um número de síndromes da doença suína que são denominadas coletivamente: doença associada ao circovírus porcino (PCVAD). A PCVAD mais pronunciada é a “síndrome da refugagem multissistêmica” (PMWS), observada em suínos jovens. Os sinais clínicos e a patologia da PMWS incluem refugo progressivo, dispnéia, taquipnéia e, ocasionalmente, icterícia ocular e icterícia. Outros PCVADs são: Complexo de Doenças Respiratórias Porcinas, Síndrome da Nefropatia e Dermatite Porcina, falha reprodutiva, enterite granulomatosa, tremores congênitos e epidermite exsudativa. Para análises, consulte: the Merck Veterinary Manual, 11º ed., 2016, ISBN: 9780911910933; e: “Diseases of Swine”, 10º ed. 2012, ISBN:

9780813822679.

[005] No entanto, sem uma infecção secundária, a maioria dos suínos infectados com PCV2 pode não mostrar sintomas clínicos claros da doença, exceto pelo fraco crescimento e desempenho em suínos aparentemente saudáveis. Os sintomas (sub-)clínicos de PCVAD causados por PCV2 podem ser observados em suínos geralmente a partir de 3 ou 4 semanas de idade em diante, que é o momento em que os leitões são desmamados e os anticorpos de proteção materna começam a declinar.

[006] Para proteger contra a infecção pelo PCV2 e seus sinais associados a doença, várias vacinas comerciais estão disponíveis e estas estão sendo usadas em todo o mundo em um número muito grande. Diferentes tipos de vacinas para PCV2 são, por exemplo: uma vacina com base no vírus PCV2 completo inativado (Circovac"", Merial) ou no vírus PCV1/PCV2 quimérico inativado (Suvaxyn'" PCV, Fostera""* PCV, Zoetis). Mais comum, porém, é uma vacina de subunidade baseada na proteína de capsídeo PCV2 expressa recombinante, comumente denominada: proteína ORF2 (Ingelvac"" CircoFLEX, Boehringer Ingelheim; e: Circumvent"" PCV, Porcilis"" PCV, MSD AH). A vacina da subunidade de proteína ORF2 é comumente produzida pela expressão do gene ORF2 de PCF2 em um sistema de expressão recombinante; mais usado é o sistema de expressão de células de inseto-baculovírus. A proteína ORF2 expressa se auto-organiza em partículas semelhantes a vírus (VLP), que se assemelham a um vírion PCV2 nativo, exceto por não ter o teor do genoma viral e, portanto, não são replicativas. As vacinas baseadas em tais PCV2 ORF2 VLPs são muito estáveis, são altamente imunogênicas quando formuladas com um adjuvante e demonstraram ser seguras para porcos de todas as idades, sejam soropositivos para anticorpos de PCV2 ou não. Uma dose completa típica da vacina com base na proteína ORF2 de PCV2 contém cerca de 80 ug de proteína ORF2, em um volume de dose de 2 ml/animal. No entanto, estas vacinas de subunidade já são eficazes a dose de cerca de 20 microgramas de ORF2 por animal, ver EP

1.926.496. Também podem ser dadas como uma vacina de injeção única e podem ser dadas por diferentes rotas de administração, como intramuscular (IM), subcutânea (SC) ou intradérmica (ID).

[007] Dentro da espécie PCV2 existem diferentes genótipos do vírus. Eles podem ser distinguidos por meio da distância genética entre seus genes ORF2 e uma variedade de convenções de nomenclatura foram usadas no passado. No entanto, Segales et al. (2008, Vet. Rec., Vol. 162, p. 867-868) publicaram um método que se tornou o padrão atualmente adotado para determinar e nomear genótipos de PCV2. Dos 5 genótipos diferentes de PCV2 que agora são reconhecidos, apenas três são atualmente de relevância veterinária no campo: PCV2a, PCV2b e PCV2d.

[008] Embora todas as vacinas comerciais para PCV2 sejam atualmente baseadas em PCV2a, os genótipos PCV2b e 2d parecem estar aumentando em prevalência no campo. Para uma revisão, ver: Karuppannan & Opriessnig, 2017, Viruses, vol. 9, p. 9, doi: 10.3390/v9050099. Embora esses autores concluam que existe um nível adequado de proteção cruzada entre esses genótipos, geralmente é preferível aplicar vacinas homólogas ao tipo. Consequentemente, existe uma necessidade no campo de produzir vacinas seguras, baratas e eficazes também para genótipos de PCV2 que não sejam PCV2a.

[009] WO 2009/000459 (University Gent) descreve diagnósticos para identificar variantes antigênicas ou patogênicas de PCV2, com base na proteína ORF2; especificamente, métodos e anticorpos úteis para esse fim. Sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos são descritas de ORF2 a partir de duas cepas de PCV2b. São sugeridas várias mutações da proteína ORF2, a fim de alterar o perfil de reconhecimento por anticorpos monoclonais. Dentre as muitas mutações sugeridas, uma é a da treonina na posição do aminoácido 131 a Prolina. No entanto, WO 2009/000459 revela suficientemente apenas o teste sorológico de cepas não mutadas (tipo selvagem) de PCV2a (Stoon 1010, 1121) e PCV2b (48285) e apenas revela a expressão de ORF2 não mutado a partir de uma das cepas de PCV2a tipo selvagem (Stoon 1010) nas células de insetos.

[010] Posteriormente, Saha et al., 2012 (J. of Gen. Virol., Vol. 93, p. 1548- 1555), descrevem, entre outros, a expressão da proteína PCV2a ORV2 com mutação T131P em células PK-15, pela transfecção de clones infecciosos do genoma de PCV2 mutado.

[011] WO 2010/068969 (Vectogen) descreve métodos de vacinação contra PCV2 por liberação de vetor viral de ORF2, em que a proteína ORF2 foi mutada substituindo ou removendo o 'sinal de localização nuclear', isto é, os 41 aminoácidos N-terminais de ORF2. Como resultado, ORF2 torna-se expressa no citoplasma ou é secretada pelas células infectadas por vetores. O vector viral preferencial é o adenovírus porcino.

[012] WO 2015/051099 (Boehringer-Ingelheim) descreve métodos para aumentar o nível de expressão da proteína ORF2 de PCV2b e de suas partículas semelhantes a vírus em um sistema de expressão de células de inseto- baculovírus, introduzindo uma mutação na sequência de codificação de ORF2 de PCV2b: a mutação revelada é uma substituição de arginina na posição de aminoácido 63, preferencialmente para treonina. Não há menção de qualquer mutação na posição do aminoácido 131 de ORF2 de PCV2b, e nenhuma informações sobre quaisquer problemas com a expressão desta proteína em células de insetos.

[013] EP 17184630 (Intervet Int. BV) revela que em uma vacina contra PCV2, verificou-se que a proteína ORF2 do genótipo PCV2b fornece não apenas proteção homóloga, mas também uma boa proteção cruzada contra os genótipos heterólogos PCV2a e PCV2d. Também este efeito foi - inesperadamente - obtido mesmo em quantidades muito baixas, inferiores a 20 ug de proteína ORF2 de PCV2b por dose animal. Consequentemente, será suficiente vacinar suínos com uma dose baixa de proteína ORF2 de PCV2b, para fornecer proteção imunológica eficaz contra todas as cepas atuais de PCV2.

[014] O uso de células de inseto para a expressão recombinante de proteína é bem conhecido e é aplicado de diferentes maneiras: expressão em insetos vivos, em células de inseto primárias ou em linhagens celulares de insetos imortalizadas em cultura. As células de inseto mais usadas são de origem Lepidóptera, como os gêneros Spodoptera ou Trichoplusia. O uso dessas células é frequentemente no contexto do sistema de expressão de células de inseto- baculovírus popular, em que um baculovírus recombinante é usado para infectar células de lepidópteros em cultura. Um baculovírus contém um número de promotores fortes que não são necessários quando o vírus se replica na cultura de células; estes podem então ser usados para acionar a expressão de um gene heterólogo.

[015] É um objetivo da presente invenção superar uma desvantagem no estado da técnica e acomodar-se a uma necessidade no campo, fornecendo uma maneira de otimizar a expressão recombinante da proteína ORF2 de PCV2 em células de inseto.

[016] Ao investigar a preparação de vacinas PCV2 com base nas subunidades de proteína ORF2, os inventores descobriram que a expressão recombinante da proteína ORF2 a partir das cepas virais do genótipo PCV2b, nas células de insetos, não era tão direta quanto a proteína ORF2 do genótipo PCV2a. Verificou-se que a proteína ORF2 de PCV2b expressa tem uma tendência natural a acumular-se no núcleo das células de inseto em que foi expressa. Nesta forma, os níveis totais de expressão da proteína ORF2 de PCV2b foram muito reduzidos, e a proteína provou ser muito difícil de coletar e purificar pelo processamento a jusante; mesmo quando a dissociação agressiva foi usada, apenas quantidades muito baixas de proteína ORF2 podiam ser isoladas. Além disso, nas pequenas quantidades de proteína que poderiam ser isoladas, a quantidade de VLPs era muito baixa; aparentemente, a localização nuclear impediu a proteína ORF2 de se auto-agrupar em VLPs em um grau significativo. Como resultado, a imunogenicidade desta proteína expressa foi muito reduzida.

[017] Surpreendentemente, verificou-se que quando uma substituição de aminoácidos muito específica foi introduzida na proteína ORF2 de PCV2b, o acúmulo nuclear após a expressão nas células de insetos poderia ser amplamente evitado.

[018] A substituição de aminoácidos específica envolveu a alteração do aminoácido que ocorre naturalmente na posição 131 da proteína ORF2 de PCV2b de comprimento total, em um aminoácido Prolina. Com uma Prolina na posição 131, a maior parte da proteína ORF2 de PCF2b mutante expressa (“ORF2b- 131P”) ocorreu no citoplasma da célula de inseto, em vez de se acumular no núcleo. Verificou-se que isso aumenta os níveis totais de expressão, além de facilitar muito a coleta da proteína mutante ORF2 de PCV2b a partir dessas células de inseto; neste estado citoplasmático, poderiam ser usados procedimentos de isolamento padrão de baixo impacto, para que altas quantidades da proteína pudessem ser facilmente isoladas. Além disso, verificou-se que a maior parte da ORF2b-131P se reunia efetivamente em VLPs, que são muito eficazes em uma vacina PCV2 para animais porcinos.

[019] Isso foi inesperado, especialmente quando comparado à situação com a proteína ORF2 de PCV2a: enquanto na proteína ORF2 a partir do vírus PCV2b, o aminoácido natural na posição 131 é tipicamente uma Treonina; nos vírus PCV2a, alguns têm uma Treonina no 131 e alguns têm uma Prolina. No entanto, quando expresso em células de inseto, nenhuma das duas variantes de ORF2 de PCV2a se acumula no núcleo. Consequentemente, não havia indicação para suspeitar que esta posição específica de aminoácidos seria a causa do acúmulo nuclear observado para a proteína ORF2 de PCV2b quando expressa em células de insetos.

[020] Ainda mais notável foi que a proteína ORF2 de PCV2d, que também mostra acúmulo nuclear após a expressão em células de insetos, não pôde ser revertida para um padrão de expressão citoplasmática após a substituição de sua Treonina natural na posição 131 para Prolina.

[021] Aparentemente, a situação em torno da expressão da proteína ORF2 de PCV2 nas células de insetos é única para cada um dos genótipos.

[022] Não se sabe como a substituição de aminoácidos para 131P impede o acúmulo de proteína ORF2 de PCV2b no núcleo, mediante expressão em células de insetos. Embora os inventores não desejem se ligar a nenhuma teoria ou modelo que possa explicar essas descobertas, eles especulam que ter um aminoácido Prolina nessa posição específica na proteína ORF2 do genótipo PCV2b, induz uma alteração nas propriedades dessa proteína ORF2. A alteração pode, por exemplo, afetar a dobragem 3-dimensional ou o perfil de hidrofobicidade da proteína ORF2, que pode afetar seu roteamento dentro da célula de inseto.

[023] Essa invenção abre caminho para um número usos vantajosos, melhorando a disponibilidade e a qualidade antigênica da proteína ORF2 de PCV2b recombinante expressa. Por sua vez, isso permite a fabricação conveniente em larga escala de vacinas de subunidade PCV2 eficazes para animais porcinos; como não são necessários compostos dissociativos agressivos ou técnicas complicadas para seu isolamento, a proteína expressa pode ser produzida de maneira barata, segura e eficiente.

[024] Desta maneira, um ou mais objetos da presente invenção podem ser alcançados e, consequentemente, uma ou mais desvantagens do estado da técnica anterior podem ser superadas.

[025] Portanto, em um aspecto, a invenção refere-se a células de inseto compreendendo um ácido nucleico heterólogo compreendendo: a. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ORF2 a partir de circovírus porcino 2 de genótipo 2b (PCV2b), e b. uma sequência de controle de transcrição que é operacionalmente ligada à referida sequência de nucleotídeos, caracterizada pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codificar uma proteína mutante ORF2 de PCV2b tendo uma Prolina na posição do aminoácido número 131.

[026] Para a invenção, as "células de inseto" são células derivadas a partir de um organismo da classe Insecta. As células são viáveis (isto é, capazes de se replicar) e suficientemente intactas para serem capazes de expressão de proteína. As células podem estar em repouso ou ativas e podem estar em qualquer estágio do ciclo celular. As células de inseto podem ser empregadas na invenção de diferentes maneiras: ou usando um inseto inteiro; usando um extrato ou parte de um inseto; usando células primárias derivadas a partir de um inseto; usando tecido ou órgão de um inseto; ou usando uma linhagem celular imortalizada de insetos.

[027] As células de inseto da invenção estarão normalmente contidas em um veículo adequado. Tal veículo é uma composição que mantém a viabilidade das células de inseto e é, por exemplo, um líquido, como uma solução tamponada ou um meio de cultura. No contexto do uso de insetos inteiros, o corpo do próprio organismo de inseto funciona como o veículo.

[028] O termo "compreendendo" (bem como variações como "compreenda", "compreende" e "compreendido"), conforme usado na presente invenção, pretende se referir a todos os elementos e em qualquer combinação possível concebível para a invenção, que sejam cobertos por ou incluídos na seção de texto, parágrafo, reivindicação, etc., na qual esse termo é usado, mesmo que esses elementos ou combinações não sejam explicitamente recitados; e não excluindo nenhum desse(s) elemento(s) ou combinações.

[029] Assim, qualquer seção de texto, parágrafo, reivindicação etc. pode, portanto, também se relacionar a uma ou mais modalidade(s), nas quais o termo "compreendendo" (ou suas variantes) é substituído por termos como "consiste em", "consistindo em” ou" consiste essencialmente em".

[030] Para a invenção, um ácido nucleico é "heterólogo" para as células de inseto que o compreendem, se o ácido nucleico não estava presente nos ácidos nucleicos das células de inseto parentais das quais as células foram derivadas. O ácido nucleico pode ser de qualquer tipo, por exemplo, DNA ou RNA.

[031] O ácido nucleico heterólogo da invenção pode ser introduzido nas células de inseto de acordo com a invenção de diferentes maneiras, como por transfecção ou eletroporação do ácido nucleico, possivelmente em um veículo; alternativamente por infecção por um microrganismo recombinante, por exemplo, um vírus.

[032] Uma sequência de nucleotídeos "está codificando", ou o similar "codifica", uma proteína quando sua transcrição e/ou translação resulta na expressão dessa proteína. Tipicamente, uma sequência de nucleotídeos capaz de codificar uma proteína é chamada de quadro de leitura aberta (ORF), indicando que não estão presentes códons de parada indesejáveis que terminariam prematuramente a translação da proteína. Essa sequência de nucleotídeos pode ser um gene que codifica uma proteína completa ou pode ser um fragmento de gene que codifica uma seção de uma proteína, por exemplo, codificando apenas a forma madura ou secretada de uma proteína, ou seja, sem um 'líder', 'âncora' ou' sequência de sinal". A sequência de nucleotídeos pode ser de origem natural ou sintética.

[033] Para a invenção, uma "proteína" é uma cadeia molecular de aminoácidos. Uma proteína pode ser uma proteína nativa ou madura, uma pré ou pró-proteína ou parte de uma proteína. A propósito: peptídeos, oligopeptídeos e polipeptídeos estão incluídos na definição de proteína.

[034] A proteína "ORF2" para a invenção refere-se a uma proteína codificada por quadro de leitura aberta 2 (ORF2) no genoma de PCV ou por uma parte de ORF2. A proteína ORF2 de PCV2 de comprimento total é geralmente de 233 aminoácidos de comprimento e quando testada em eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) exibe um peso molecular relativo de cerca de 26 kDa. No entanto, as formas truncadas da proteína ORF2 são bem conhecidas e podem ser vantajosamente usadas para a invenção, por exemplo, a forma truncada da proteína ORF2 de PCV2 que está faltando 30 aminoácidos do seu lado N-terminal. A proteína ORF2 também é chamada de capsídeo, e a sequência de ácido nucleico codificadora é chamada de gene ORF2 ou gene de capsídeo.

[035] Programas de computador que podem ajudar na análise de regiões codificadoras e representam essas informações de maneira conveniente estão disponíveis comercialmente a partir de diversos fornecedores.

[036] "Circovírus porcino 2" ou PCV?2 refere-se aos circovírus dessa espécie, tendo os recursos caracterizantes de seus membros taxonômicos do grupo, como características morfológicas, genômicas e bioquímicas, bem como características biológicas, como comportamento fisiológico, imunológico ou patológico.

[037] Como é conhecido no campo, a classificação de um microrganismo como uma espécie específica é baseada em uma combinação de tais características. A invenção, portanto, também inclui PCV2 que são subclassificados a partir daí de qualquer forma, por exemplo, como subespécie, cepa, isolado, genótipo, variante, subtipo ou subgrupo e similares.

[038] Será evidente para um técnico no assunto da invenção que, embora um PCV?2 específico para a invenção possa estar atualmente atribuído a essa espécie, no entanto, essa é uma classificação taxonômica que pode mudar com o tempo à medida que novas ideias podem levar à reclassificação para um novo ou diferente grupo taxonômico. No entanto, como isso não altera o próprio microrganismo ou seu repertório antigênico, mas apenas seu nome científico ou classificação, tais microrganismos reclassificados permanecem dentro do escopo da invenção.

[039] PCV2 para uso na invenção pode ser obtido a partir de uma variedade de fontes, por exemplo, como isolado a partir de um porcino na natureza ou em uma fazenda, ou de vários laboratórios, instituições (depositório) ou universidades (veterinárias). Alternativamente, um PCV2 pode ser reconstituído a partir de informações de sequência digital, sintetizando seu ácido nucleico genômico e transfectando-o para células apropriadas.

[040] A genotipagem de PCV2 é realizada comparando sequências de nucleotídeos. Para a invenção, um "PCV2 do genótipo 2b", ou um "PCV2b", é um vírus PCV2 que é classificado no grupo genótipo b usando o método de Segales et al. (2008, Vet. Rec. Vol. 162, p. 867-868). Este método aplica a genotipagem de PCV2 com base na distância P entre os genes ORF2 de PCV2, isto é, a relação de nucleotídeos que difere entre dois genes ORF2 de PCV2, por número total de nucleotídeos do gene ORF2 de PCV2. O ponto de corte para os diferentes genótipos de PCV?2 identificados por Segales et al. está em um ORF2 P-distância de 0,035; portanto, quando a diferença de P é menor, as duas sequências pertencem ao mesmo genótipo.

[041] Para a invenção, o vírus de referência de um PCV2 de genótipo 2bé o isolado 'Imp.1011', também conhecido como cepa 48285, para o qual a sequência do genoma é publicada no GenBank"" sob o número de acesso: AFOSS394.

[042] Consequentemente, qualquer vírus PCV2 com uma distância P do gene ORF2 inferior a 0,035 com o gene ORF2 da cepa 48285, calculado usando o método de Segales et al. (supra), é um vírus PCV2b para a invenção.

[043] No entanto, e como o técnico no assunto apreciará, como o genoma de PCV é de cadeia simples e circular, a região codificante do gene ORF2 pode não ser aparente imediatamente a partir de uma sequência de nucleotídeos linear específica e pode exigir que a sequência de nucleotídeos seja inversa, complementada e/ou girada. Por exemplo: na sequência genômica de PCV2b da cepa 48285 no número de acesso ao GenBank: AFO55394, o gene ORF2 é executado na cadeia linear publicada a partir de nucleotídeo número 314 até nt. 1 e continua a partir de nt. 1767 até e incluindo nt. 1383; juntos, isso representa os 699 nucleotídeos do gene ORF2 (não incluindo o códon de parada) e é codificado pela cadeia complementar a esta região da cadeia publicada. Mais uma vez, essa análise e representação das regiões de codificação podem ser convenientemente desempenhadas usando um programa de computador disponível comercialmente.

[044] Uma abordagem semelhante se aplica ao "PCV2 genótipo 2a" (PCV2a) e "PCV2 genótipo 2d" (PCV2d), conforme usado na presente invenção; o vírus de referência para PCV2a é o isolado '!mMp.1010', também conhecido como 'Stoon 1010', número de acesso: AFO55392; e o vírus de referência para PCV2d é o isolado '599-1542 / 3a', nº de acesso: JX512856.

[045] Os métodos para identificar um vírus como um vírus PCV2, para determinar a sequência de nucleotídeos de seu gene ORF2 e para calcular uma distância P em comparação com o gene ORF2 da cepa 48285 são bem conhecidos e estão prontamente disponíveis para o técnico no assunto da presente invenção.

[046] Uma "sequência de controle de transcrição" é uma região funcional do ácido nucleico, normalmente no DNA, que através da ligação de fatores de controle, induz a maquinaria de expressão de proteínas de uma célula a iniciar e desempenhar a transcrição de DNA no RNA de uma região de codificação a jusante. Essa região de controle de transcrição (TCR), também pode ser chamada de promotor e geralmente contém várias regiões reguladoras, como o 'local de início da transcrição", localizado em cerca de 30-40 nucleotídeos a montante do primeiro códon de início. Outros elementos conservados conhecidos são TATA box, CAAT box e GC box. O TCR também pode compreender um chamado intensificador que está envolvido em fatores reguladores de ligação que podem influenciar o tempo, a duração, as condições e o nível de transcrição.

[047] Consequentemente, a transcrição (e translação subsequente) pode ser de natureza temporária ou permanente, ou seja, expressão transitória ou estável, dependendo dos detalhes do TCR usado e do constructo genético como um todo.

[048] Um TCR para a expressão de um gene (heterólogo) precisa ser capaz de efetivamente conduzir a transcrição dessa região de codificação a jusante. Isso é comumente referido como o TCR sendo "operacionalmente ligado" a um gene, de modo que o gene esteja 'sob o controle' ou seja 'acionado' pelo TCR. Isso geralmente significa que o TCR e a região de codificação estão conectados na mesma molécula, em proximidade efetiva e sem sinais ou sequências entre eles que interfeririam com uma transcrição efetiva.

[049] Os termos "proteína mutante ORF2 de PCV2b" servem para indicar que a proteína PCV2b ORF2 expressa não é idêntica à versão de tipo selvagem dessa proteína, mas compreende uma mutação. Essa mutação pode ser introduzida de diferentes maneiras, usando técnicas in vivo ou in vitro. Mais eficaz, contudo, é o uso da tecnologia de DNA recombinante para subclonar um gene ORF2 de PCV2b em um plasmídeo bacteriano e empregar, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR) e iniciadores sintéticos para introduzir uma mutação desejada em um local desejado. Os detalhes são apresentados nos exemplos a seguir. Desta forma, por exemplo, a sequência de DNA do gene PCV2b ORF2 parental, do GenBank nº de acesso AFO55394 foi manipulado por meio do qual o tripleto de nucleotídeo do tipo selvagem que codifica Treonina na posição do aminoácido 131: 5'-aca -3', foi modificado para o tripleto: 5'-ccc - 3', que codifica Prolina.

[050] Manipulação adicional pode ser aplicada por otimização de códon do gene ORF2, para torná-lo melhor em conformidade com a preferência de codificação de células de inseto e/ou de um baculovírus. Por exemplo, usando a preferência de códon do gene da poliedrina a partir do baculovírus ACMNPV, conforme publicado em: Hooft van Iddekinge et al., 1983, Virology, vol. 131, p.

561-565. O conceito de otimização de códons de um gene para expressão heteróloga é bem conhecido; tipicamente, essas mutações são todas silenciosas, o que significa que, embora isso altere a sequência de nucleotídeos codificante, não altera a sequência de aminoácidos da proteína codificada. Os detalhes são fornecidos nos Exemplos.

[051] Verificou-se que a otimização de códon aumenta o nível de expressão da proteína ORF2 nas células de insetos. Em um grau mínimo, isso também alterou a localização nuclear da proteína ORF2 de PCV2b do tipo selvagem quando expressa em células de insetos. Contudo, uma prevenção substancial de acumulação nuclear em células de insetos só pode ser obtida para a proteína ORF2 de PCV2b pela substituição do aminoácido na posição 131 por Prolina.

[052] Para a invenção, 'tipo selvagem' refere-se à forma de (micro) organismo em que ocorre em sua forma natural na natureza, por exemplo: a forma do organismo parental antes de ser alterada pela intervenção humana.

[053] A geração, construção e montagem do ácido nucleico heterólogo que expressa a proteína mutante ORF2 de PCV2b para a invenção, pode ser feita por técnicas biológicas moleculares bem conhecidas, envolvendo clonagem, transfecção, recombinação, seleção e amplificação. Essas e outras técnicas são explicadas em grande detalhe em livros didáticos padrão como Sambrook & Russell: “Molecular cloning: a laboratory manual” (2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubel et al., in: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley & Sons Inc., NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach e G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (CSHL Press, ISBN 0879696540); e "PCR protocols", por: J. Bartlett e D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).

[054] Para a invenção, uma "posição de aminoácido" específica é numerada com base na numeração dos aminoácidos na sequência de aminoácidos da proteína ORF2 de comprimento total a partir da cepa de referência para esse genótipo PCV2. Para PCV2b a cepa de referência é 48285 e a sequência de aminoácidos de comprimento total de sua proteína ORF2 é publicada no GenBank sob o número de acesso AAC35331.

[055] As células de inseto de acordo com a invenção podem expressar ORF2b-131P; a proteína mutante ORF2 de PCV2b (na maior parte) não se acumula mais no núcleo, mas é dispersa por todo o citoplasma da célula de inseto. Essa diferença na localização celular da proteína mutante ORF2 de PCV2b, em comparação com sua contraparte não mutada, pode ser facilmente detectada, entre outras por microscopia (de luz) e visualização usando a tecnologia de imunofluorescência. Os detalhes são apresentados na seção Exemplos.

[056] Verificou-se que o nível residual de acúmulo nuclear da proteína ORF2b-131P difere um pouco, dependendo do constructo genético usado para expressar a proteína mutante ORF2 de PCV2b nas células de insetos: expressão via baculovírus recombinante feita usando o sistema Bac-to-bac, ainda mostrou alguma acumulação nuclear, por exemplo, cerca de 10% do nível observado para a proteína ORF2 de PCV2b do tipo selvagem. No entanto, quando a proteína mutante foi produzida a partir de um baculovírus recombinante construído via sistema Pro£asy, não foi mais observado acúmulo nuclear detectável. Além disso, o nível de expressão de proteína foi superior ao produzido pelo baculovírus recombinante Bac-to-bac.

[057] Provavelmente, isso pode ser explicado a partir da constituição do constructo genético usado: os baculovírus recombinantes preparados a partir dos constructos de Bac-to-bac ainda carregam elementos de cassete de expressão do vetor de transferência em seu genoma, como um transposão e um gene de resistência a antibióticos. Isso pode influenciar o nível de replicação e expressão. No entanto, os recombinantes ProfEasy não carregam mais tais elementos genéticos adicionais.

[058] Detalhes das modalidades preferidas e outros aspectos da invenção serão descritos abaixo.

[059] Em uma modalidade, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína mutante ORF2 de PCV2b teve seu códon otimizado. Mais preferencialmente: teve seu códon otimizado para corresponder à preferência do códon do gene da poliedrina de baculovírus ACMNPV.

[060] Mais preferencial, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína mutante ORF2 de PCV2b é a SEQID NO: 1. Isto representa a sequência ORF2 da cepa 48285 de PCV2b, em que o tripleto que codifica a posição do aminoácido número 131 foi mutado para 5'- ccc -3', que codifica Prolina. Além disso, o uso de códons foi adaptado para atender à preferência de códons do gene da poliedrina ACMNPV. SEQ ID NO: 2, por sua vez, lista a sequência de proteína ORF2b-131P que é codificada por SEQ ID NO: 1.

[061] Como consequência das mutações aplicadas ao gene ORF2 de PCV2b, em particular por causa da otimização de códons, a identidade da sequência de nucleotídeos entre SEQID NO: 1 e a região correspondente de AFO55394, o gene ORF2b de tipo selvagem, é de 77,2%. No entanto, como as mutações que otimizam códon são silenciosas, a identidade da sequência de aminoácidos entre a SEQ ID NO: 2 e AAC35331 (que é a sequência de aminoácidos da proteína PCV2b ORV?2 do tipo selvagem a partir da cepa 48285) é de 99,6%, diferindo apenas no aminoácido na posição 131.

[062] O uso de células de uma variedade de insetos é bem conhecido. Vários desses também podem ser usados no contexto do sistema de expressão de células de inseto-baculovírus, pois podem ser infectados com um baculovírus.

Ver por exemplo: Chen et al., 2005, In vitro Cell. Dev. Biol. Anim., vol. 41, p. 43-

49.

[063] Portanto, em uma modalidade, as células de inseto de acordo com a invenção são derivadas de um inseto selecionado dentre o grupo que consiste em: Autographa californica (alfalfa looper), Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho), Spodoptera exigua (beet armyworm), Trichoplusia ni (lagarta-mede- palmo), Lymantria dispar (mariposa-cigana), Bombyx mori (bicho-da-seda), Anticarsia gemmatalis (lagarta da soja), Heliothis virescens (lagarta da maçã), Heliothis subflexa (Subflexus straw moth), Mamestra brassicae (lagarta do repolho), Helicoverpa armigera (lagarta do tomate), Helicoverpa zea (lagarta da espiga), Agrotis ipsilon (lagarta rosca), Anagrapha falcifera (celery looper), Galleria mellonella (traça do favo de mel), Rachiplusia ou (lagarta falsa medideira), Plutella xylostella (traça das crucíferas), Drosophila melanogaster (mosca da fruta), e Aedes aegypti (mosquito).

[064] Em uma modalidade, as células de inseto de acordo com a invenção são derivadas de um inseto da ordem Lepidoptera; mais preferido da família dos Noctuidae; ainda mais preferido de um dos gêneros: Spodoptera ou Trichoplusia.

[065] Em uma modalidade, as células de inseto de acordo com a invenção são derivadas de um inseto da espécie Spodoptera frugiperda.

[066] Em uma modalidade, as células de inseto de acordo com a invenção são derivadas de um inseto da espécie Trichoplusia ni.

[067] É conhecido e possível criar insetos completos para expressão heteróloga de proteínas e, desta maneira, aplicar as células de insetos de acordo com a invenção. Contudo, será mais conveniente utilizar células de inseto na forma de uma linhagem celular de inseto imortalizada, pois isso permitirá uma produção e expansão mais flexíveis sob condições controladas. Tais linhagens celulares de inseto estabelecidas podem então ser usadas para construir células de inseto de acordo com a invenção, usando métodos de rotina como descrito na presente invenção.

[068] As linhagens celulares de insetos conhecidas que são adequadas para esse uso são: Sf9 e Sf21, ambos derivados de S. frugiperda; High Five "“ (Hi-5), derivado de 7. ni; Bm5, derivado de B. mori; e Ld652Y e LdElta, derivados de L. dispar.

[069] Portanto em uma modalidade, as células de inseto de acordo com a invenção são preparadas a partir de células de uma linhagem celular de inseto selecionada do grupo que consiste em Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y e LdElta, ou uma linhagem celular derivada de um destes.

[070] Preferencialmente, as células de inseto de acordo com a invenção são preparadas a partir de uma linhagem celular de inseto de Sf9 ou Sf21.

[071] Os procedimentos, equipamentos e materiais para a cultura de linhagens celulares de insetos são bem conhecidos e podem ser aplicados em qualquer escala desejada, por exemplo, de 5 ml a 5000 litros. Em particular meio de cultura de células de insetos especializados estão disponíveis, por exemplo: Sf-900"" (Thermo Fisher Scientific); Série Ex-Cell"“ 400 (Sigma Aldrich); e Insect- XPRESS'" (Lonza).

[072] Dependendo das características desses meios, eles precisam da adição de uma certa porcentagem de soro, como o soro fetal de bezerro, ou podem ser usados sem soro. Aditivos adicionais podem ser adicionados, como glutamina, antibióticos, agente antiespumante, etc.

[073] Existem várias maneiras pelas quais uma célula de inseto de acordo com a invenção pode compreender um ácido nucleico heterólogo para a invenção, um exemplo é pela integração estável no genoma da célula de inseto. As formas de alcançar a integração genômica são, por exemplo: por inserções aleatórias, como por tecnologia de transposão ou por inserções direcionadas usando, por exemplo, recombinação homóloga ou tecnologia CRISPR-Cas.

[074] Alternativamente, as células de inseto podem ser transfectadas por meios químicos (por exemplo, Lipofectin'"") ou físicos (por exemplo, eletroporação) com um ácido nucleico heterólogo, que pode estar em um veículo como um plasmídeo. O ácido nucleico heterólogo pode ser expresso de forma transitória ou estável pela célula de inseto.

[075] Contudo, o modo preferencial de introduzir tal ácido nucleico heterólogo nas células de inseto de acordo com a invenção é pelo uso de um baculovírus recombinante. Tal baculovírus conterá, por exemplo, um gene heterólogo de interesse integrado de maneira estável em seu genoma viral e operacionalmente ligado a um forte promotor de baculovírus, como os promotores dos genes muito tardios p10 ou poliedrina.

[076] Portanto, em uma modalidade das células de inseto de acordo com a invenção, a sequência de controle de transcrição é um promotor do gene p10 do baculovírus ou um promotor do gene da poliedrina do baculovírus.

[077] Em seguida, o baculovírus recombinante é feito para entrar na célula de inseto; isto pode ser feito passivamente, por exemplo, por transfecção do genoma do baculovírus recombinante ou ativamente pela infecção de uma célula de inseto suscetível por um baculovírus recombinante infeccioso. A célula de inseto, compreendendo o baculovírus recombinante ou seu genoma dentro dela, também compreenderá o ácido nucleico heterólogo para a invenção. Para a invenção, "dentro da célula" refere-se simplesmente à localização do genoma do baculovírus recombinante, estando no lado interno da membrana celular da célula de inseto, por exemplo, no citoplasma.

[078] Dentro da célula de inseto, o baculovírus recombinante ou seu genoma será replicado, levando à expressão do gene heterólogo na célula de inseto. O produto de expressão heteróloga pode então ser coletado, a partir das células de insetos ou do ambiente da célula, como o meio de cultura da célula.

[079] Portanto, em uma modalidade das células de inseto de acordo com a invenção, o ácido nucleico heterólogo está compreendido em um genoma de baculovírus recombinante.

[080] Um "baculovírus" é um membro da família Baculoviridae; de preferência um membro do gênero Alphabaculovirus.

[081] Um baculovírus para a invenção é "recombinante" se tiver sido alterado por intervenção humana em comparação com sua forma de tipo selvagem, a fim de compreender um ácido nucleico heterólogo. Preferencialmente, tal baculovírus recombinante é criado por métodos de manipulação genética.

[082] Como o técnico no assunto apreciará ao considerar as células de inseto de acordo com a invenção em um recipiente de cultura específico ou em um poço de uma placa de cultura, o número de células que realmente compreende o ácido nucleico heterólogo para a invenção será dinâmico. Isso ocorre por várias razões biológicas, como o status do ciclo de vida da célula ou o nível de infecção ou transfecção. Embora seja preferido ter o maior número possível de células compreendendo e expressando o ácido nucleico heterólogo, não é necessário que, em um determinado momento, cada célula de inseto individual desse grupo compreenda o ácido nucleico heterólogo.

[083] O uso combinado de células de inseto e baculovírus recombinante, para a expressão de uma proteína heteróloga, é comumente referido como o 'sistema de expressão de células de inseto-baculovírus'. Exemplos de artigos, livros didáticos e resenhas sobre esse sistema são: Luckow et al., 1988, Bio- technology, vol. 6, p. 47; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual por David R. O'Reilly, Oxford University press, 1993, ISBN: 0716770172; The

Baculovirus Expression System: A laboratory guide, ed. King & Possee, 1992, ISBN: 9401050473; e uma revisão é: van Oers et al., 2015, /. of Gen. Virology, vol. 96, p. 6-23.

[084] A expressão eficiente usando o sistema de expressão de células de inseto-baculovírus pode ser aplicada desde a escala de laboratório até a produção em escala industrial muito grande. Genes heterólogos de origem variada foram expressos nos 30 anos em que o sistema de expressão de células de inseto-baculovírus é conhecido e muitas ferramentas estão disponíveis comercialmente para a aplicação dessa tecnologia.

[085] Várias espécies de baculovírus têm sido usadas como vetores convenientes para expressão de proteínas heterólogas em células de insetos. Exemplos de baculovírus usados no sistema de expressão de células de inseto- baculovírus são nucleopoliedrovírus (multicapsídeos) de Autographa californica (alfalfa looper): ACMNPV ou Bombyx mori: BM NPV.

[086] Em uma modalidade do baculovírus recombinante compreendendo o ácido nucleico heterólogo para a invenção referido baculovírus é um ACMNPV ou um BmMNPV;

[087] Muitas ferramentas e kits estão disponíveis comercialmente para gerar e selecionar efetivamente baculovírus recombinantes para uso na invenção. Por exemplo: Bac-to-bac "“ (Thermo Fisher Sci., Waltham, MA, EUA); Progasy "“ (AB Vector, San Diego, CA., EUA); e flashBAC "“ (Oxford Expression Technologies, Oxford, Reino Unido).

[088] Para otimizar os níveis de replicação e expressão de proteínas, o baculovírus recombinante que compreende o ácido nucleico heterólogo da invenção é preferencialmente o mais próximo possível de um baculovírus de tipo selvagem, exceto, é claro, a inserção do ácido nucleico heterólogo e a subsequente interrupção ou exclusão no local de inserção. Na prática, isso significa que o baculovírus recombinante preferencialmente não contém elementos genéticos adicionais a partir do processo de recombinação em seu genoma, por exemplo, elementos como: uma etiqueta, rótulo, gene marcador, elemento de transposão, gene de resistência a antibióticos, etc.

[089] Portanto, em uma modalidade, o baculovírus recombinante compreendendo o ácido nucleico heterólogo da invenção não contém outros elementos genéticos do processo de recombinação em seu genoma.

[090] Em uma modalidade preferencial, o baculovírus recombinante não compreende um gene de resistência a antibióticos a partir do vector de transferência que foi usado para o constructo desse baculovírus recombinante.

[091] Em uma modalidade das células de inseto de acordo com a invenção, uma, mais ou todas as condições se aplicam, selecionadas a partir do grupo que consiste em: - a sequência nucleotídica que codifica a proteína mutante ORF2 de PCV2b teve seu códon otimizado; mais preferencialmente: teve seu códon otimizado para corresponder à preferência do códon do gene da poliedrina do baculovírus ACMNPV; - a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína mutante ORF2 de PCV2b é a SEQID NO: 1 - as células de inseto de acordo com a invenção são derivadas de um inseto da ordem Lepidoptera; mais preferido da família dos Noctuidae; ainda mais preferido de um dos gêneros: Spodoptera ou Trichoplusia; - as células de inseto de acordo com a invenção são derivadas de um inseto da espécie Spodoptera frugiperda; - as células de inseto de acordo com a invenção são derivadas de um inseto da espécie Trichoplusia ni;

- as células de inseto de acordo com a invenção são preparadas a partir de células de uma linhagem celular de inseto selecionada do grupo que consiste em Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y e LdElta, ou uma linhagem celular derivada de um destes.

- as células de inseto de acordo com a invenção são preparadas a partir de uma linhagem celular de inseto de Sf9 ou Sf21.

- a sequência de controle de transcrição é um promotor do gene p10 de baculovírus ou um promotor do gene da poliedrina de baculovírus; - o ácido nucleico heterólogo é constituído por um genoma de baculovírus recombinante que está dentro da célula de inseto; - o baculovírus recombinante compreendendo o ácido nucleico heterólogo para a invenção é um ACMNPV ou um BMNPV; e - o baculovírus recombinante compreendendo o ácido nucleico heterólogo para a invenção não contém outros elementos genéticos a partir do processo de recombinação em seu genoma.

[092] Como na presente invenção, a mutação para a proteína ORF2 de PCV2b, como descrita para a invenção, permite uma expressão aumentada da proteína ORF2b-131P a partir das células de inseto de acordo com a invenção. Especialmente, isso permite a geração de VLPs compreendendo a proteína ORF2 de PCV2b em uma extensão muito maior do que a possível sem essa mutação.

[093] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção refere se a partículas semelhantes a vírus (VLPs) de uma proteína mutante ORF2 de PCV2b, caracterizadas pela proteína mutante ORF2 de PCV2b ter uma Prolina na posição do aminoácido número 131.

[094] Os materiais e métodos para caracterizar e usar VLPs da proteína ORF2b-131P são bem conhecidos no estado da técnica.

[095] Preferencialmente, a expressão da proteína mutante ORF2 de PCV2b para a invenção em células de inseto é alcançada pelo uso do sistema de expressão de célula de inseto-baculovírus, como descrito acima.

[096] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para a expressão de uma proteína mutante ORF2 de PCV2b nas células de inseto de acordo com a invenção, o método que emprega o uso do sistema de expressão de células de inseto-baculovírus.

[097] Particularmente, quando as células de inseto de acordo com a invenção que são usadas para a expressão da proteína mutante ORF2 de PCV2b para a invenção são células de uma linhagem celular de insetos, elas podem ser convenientemente cultivadas usando equipamento padrão de cultura de células, o que resulta na expressão da proteína mutante ORF2 de PCV2b. O equipamento para cultura de células de insetos está disponível em qualquer escala; a partir de um simples frasco T ou frasco rotativo colocado em um armário de incubação na temperatura apropriada; até um fermentador industrial em larga escala com manta, agitador e aspersor aquecidos, com controle automatizado de parâmetros de processo, como temperatura, pH e oxigênio dissolvido.

[098] Subsequentemente à cultura das células de inseto de acordo com a invenção, a proteína mutante ORF2 de PCV2b expressa é coletada da cultura de células de inseto para uso adicional. Tal como a cultura, tal coleta pode ser feita usando procedimentos padrão bem conhecidos no estado da técnica. Além disso, quando necessário, a cultura pode primeiro ser inativada (isto é, esterilizada) por meios físicos (por exemplo, calor, irradiação) ou químicos (por exemplo, Bromoetilenoimino (BEI)).

[099] Dependendo das características da célula de inseto usada e do tipo de expressão aplicada, a proteína mutante ORF2 de PCV2b expressa se acumula dentro das células de inseto, ou em sua membrana, ou é secretada para fora da célula. Mesmo quando não secretada ativamente, a proteína pode acabar em certa medida no meio de cultura da célula quando as células se rompem.

[0100] Um método de coletar a proteína expressa pode então ser selecionado:

[0101] Quando a proteína expressa está principalmente presente no meio de cultura, esta pode ser coletada, por exemplo, como o sobrenadante após a centrifugação da cultura. O volume da cultura em massa pode então ser reduzido até um grau desejado, por exemplo, usando a concentração, convenientemente por algum método de ultrafiltração, todos bem conhecidos no estado da técnica.

[0102] Quando a proteína está principalmente nas células, estas podem ser isoladas a partir do volume da cultura em massa, por exemplo, por centrifugação da cultura e ressuspensão do pellet celular em um volume menor. Em seguida, as células podem ser interrompidas usando técnicas mais ou menos invasivas.

[0103] Em seguida, a proteína expressa pode ser obtida usando algum método de extração e/ou purificação.

[0104] Tudo isso pode ser desempenhado por um técnico no assunto, usando apenas métodos e materiais conhecidos.

[0105] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para a produção de uma proteína mutante ORF2 de PCV2b com uma Prolina na posição do aminoácido número 131, a produção compreendendo uma ou ambas as etapas selecionadas a partir de: - cultivar as células de inseto de acordo com a invenção; e - coletar a proteína ORF2 de PCV2b mutante a partir da cultura de células de insetos.

[0106] Um resultado especialmente vantajoso da invenção é que a proteína mutante ORF2 de PCV2b não se acumula mais no núcleo das células de inseto em que é expressa. Isso não apenas aumentou o nível total de expressão, mas também facilitou muito a coleta da proteína mutante ORF2 de PCV2b a partir dessas células de insetos. Isso ocorre porque, nesse estado citoplasmático, podem ser usados procedimentos de isolamento de baixo impacto e padrão, rendendo quantidades relativamente grandes da proteína mutante ORF2 de PCV2b. Além disso, a proteína coletada era de excelente qualidade imunológica, uma vez que a maioria das ORF2b-131P foi efetivamente reunida nos VLPs.

[0107] Mais especificamente: a coleta de proteína ORF2 de PCV2b não mutada em quantidades substanciais exigiria extração usando produtos químicos como detergentes ou agentes caotrópicos, por exemplo, SDS, ureia, desoxicolato ou guanidina-HCl, etc. Posteriormente, estes precisariam ser removidos novamente. O uso de tais produtos químicos agressivos em larga escala obviamente não é desejável.

[0108] No entanto, a coleta da proteína mutante ORF2 de PCV2b pode ser alcançada por técnicas seguras, convenientes e muito leves, sem o uso de produtos químicos, aplicando, por exemplo, sonicação ou descongelamento das células de insetos.

[0109] Portanto, em uma modalidade do método para a produção de proteína mutante ORF2 de PCV2b de acordo com a invenção, a etapa de coleta da proteína ORF2 PCV2b mutante a partir da cultura de células de inseto não emprega um detergente ou um agente caotrópico.

[0110] Em uma modalidade, a coleta emprega um método físico e não químico para a lise das células de inseto; exemplos de um método físico de lise celular são: sonicação, degelo e imprensa francesa.

[0111] Para a invenção, uma 'cultura' de células de inseto, ou a 'cultura' semelhante, refere-se à incubação de células de inseto em condições apropriadas, permitindo que as células cresçam e se dividam e expressem a inserção heteróloga.

[0112] Tal cultura de células de inseto envolverá tipicamente o uso de meio de cultura de células apropriado e equipamento conveniente; todos são bem conhecidos no estado da técnica e estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, culturas de linhagens celulares de insetos dos gêneros Spodoptera ou Trichoplusia são comumente cultivadas sob condições aeróbicas, em monocamada ou em suspensão, a 26-28 "ºC.

[0113] Sob condições práticas, será conveniente ter um recipiente de cultura separado para a geração de células de inseto limpas, mantido bem afastado do equipamento usado para o cultivo de células de inseto a serem infectadas ou transfectadas. Geralmente, as células de inseto são preparadas como estoque principal de células e estoque de células de trabalho. Essa abordagem permite o nível de controle de qualidade necessário para a preparação de proteínas recombinantes para uso farmacêutico.

[0114] Em uma modalidade do método ou para produção de proteína mutante ORF2 de PCV2b de acordo com a invenção, a proteína produzida está na forma de VLPs.

[0115] Aplicando os métodos para a preparação da proteína mutante ORF2 de PCV2b de acordo com a invenção, a proteína mutante ORF2 de PCV2b pode ser preparada em quantidades suficientes e com a eficácia imunológica necessária, para fabricar uma vacina contra PCV2 ou sinais associados a doença.

[0116] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma vacina para animais porcinos para redução de infecção por PCV2 ou de sinais associados a doença, a vacina compreendendo uma proteína mutante ORF2 de PCV2b em um veículo farmaceuticamente aceitável, caracterizada pela referida proteína mutante ORF2 de PCV2b ter uma Prolina na posição do aminoácido número 131.

[0117] Em uma modalidade, a vacina de acordo com a invenção é para redução de infecção por PCV2 do genótipo 2a, 2b e/ou 2d.

[0118] Mais preferencialmente, a vacina é para a redução de infecção pelo PCV2b.

[0119] Uma "vacina" é bem conhecida por ser uma composição compreendendo um composto imunologicamente ativo, em um veículo farmaceuticamente aceitável. O 'ctomposto imunologicamente ativo' - quando na forma de um 'antígeno '- será reconhecido pelo sistema imunológico do alvo inoculado, induzindo uma resposta imunológica. A resposta pode originar-se do sistema imunológico inato ou adquirido e pode ser do tipo celular e/ou do tipo humoral.

[0120] Para a invenção, "porcino" refere-se a animais da família Suidae e, preferencialmente, a animais do gênero Sus, por exemplo: um porco selvagem ou doméstico, javali selvagem, babirussa ou javali-africano. Isso também inclui porcinos indicados por um nome arbitrário referente ao sexo ou idade, tais como: porca, javali, suíno, marrã, marrão desmamado ou leitão.

[0121] A vacina de acordo com a invenção pode proporcionar uma "redução de infecção por PCV2", que se refere à prevenção ou redução do estabelecimento ou à proliferação de uma infecção produtiva por PCV2 em um animal alvo. Isto é conseguido, por exemplo, reduzindo a carga viral ou diminuindo a duração da replicação viral. Por sua vez, isso leva o animal alvo a uma redução do número, da intensidade ou da gravidade das lesões e consequentes sinais clínicos da doença causados pela infecção viral. Essa vacina é coloquialmente referida como: vacina 'contra' PCV2 ou uma 'vacina PCV2'.

[0122] EM uma modalidade preferencial, a vacina de acordo com a invenção funciona como um auxílio na prevenção da viremia PCV2 e/ou como um auxílio na prevenção do derramamento de PCV2 por animais infectados.

[0123] Além da eficácia da vacina contra a infecção pelo PCV2, a vacina de acordo com a invenção também pode fornecer uma "redução... de sinais associados a doença" que se refere à doença associada ao circovírus porcino (PCVAD) que pode ocorrer como doença secundária ou concomitante. Como para PCV2, a vacina de acordo com a invenção pode fornecer uma redução da gravidade e/ou da duração dos sintomas ou consequências de tal PCVAD.

[0124] As vacinas PCV2 reduzem a replicação viral e a disseminação de PCV?2. Isso reduz a carga viral de PCV2 no sangue, pulmão e tecidos linfoides (por exemplo, tonsilas, baço e linfonodos) e protege contra a depleção linfoide, a disseminação de infecções e contra doenças associadas a PCV2. Consequentemente, isso restaura a saúde geral e o desempenho em rebanhos de porcinos vacinados, conforme refletido em um ou mais dos parâmetros: mortalidade reduzida, melhor ganho médio diário de peso, conversão alimentar aprimorada e rendimentos reprodutivos aprimorados.

[0125] A determinação geral da eficácia de uma vacina PCV2 está dentro das habilidades do profissional de rotina. Isso pode ser feito, por exemplo, monitorando a resposta imunológica após a vacinação ou testando o aparecimento de sintomas clínicos ou mortalidade após uma infecção inoculada, por exemplo, monitorando os sinais de doença dos alvos, resultados clínicos, parâmetros sorológicos ou re-isolamento do patógeno de Inoculação e a comparação desses resultados com uma resposta de Inoculação-vacinação observada em animais de vacina simulada. Especificamente, a eficácia e proteção da vacina podem ser medidas por determinação sorológica de níveis de anticorpos específicos para PCV2; por detecção de vírus no soro ou em secreções de animais (oral, nasal, fecal, urinária); ou por detectar outros patógenos envolvidos em PCVAD, via PCR, (imuno-)histologia, hibridação ou sorologicamente.

[0126] Para as vacinas de PCV2 de acordo com a invenção, a eficácia é preferencialmente determinada pela avaliação do nível de redução de infecção por PCV2 em grupos vacinados versus não vacinados, em que tal infecção pode ser adquirida naturalmente, por exemplo, em condições de campo ou pode ser deliberada, por exemplo, resultante de inoculação em condições experimentais.

[0127] Dependendo do tipo de adjuvante usado, a eficácia da vacina PCV2 pode se basear mais na imunidade humoral ou celular. Os titulados de anticorpos induzidos podem ser medidos, por exemplo, usando um dos muitos kits comerciais ELISA específicos para PCV disponíveis.

[0128] Várias modalidades, preferências e exemplos de uma vacina de acordo com a invenção serão esboçadas abaixo.

[0129] EM uma modalidade da vacina de acordo com a invenção compreendendo a proteína mutante ORF2 de PCV2b com uma Prolina na posição do aminoácido número 131, a proteína mutante ORF2 de PCV2b está na forma de partículas semelhantes a vírus.

[0130] Tipicamente, uma vacina compreende um "veículo farmaceuticamente aceitável" que compreende o antígeno e pode auxiliar na fabricação, aplicação ou conservação de uma vacina, sem causar efeitos adversos (graves). Esse veículo pode ser uma solução aquosa, por exemplo, um tampão ou um meio de cultura.

[0131] Um veículo farmaceuticamente aceitável preferencial para a vacina de acordo com a invenção é um meio de cultura de células de insetos, solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou uma combinação dos mesmos.

[0132] Além disso, o veículo farmaceuticamente aceitável pode compreender aditivos e excipientes adicionais, tais como um diluente, estabilizador, conservante, surfactante ou adjuvante. Detalhes e exemplos são bem conhecidos, por exemplo, como descrito em manuais como: "Remington:

the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, EUA, ISBN: 683306472) e: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. Ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).

[0133] Além disso, a vacina de acordo com a invenção pode compreender um adjuvante. Especialmente para tais vacinas de subunidade, isso pode aumentar significativamente a resposta imune do alvo contra o antígeno da subunidade.

[0134] Portanto, em uma modalidade, a vacina de acordo com a invenção compreende um adjuvante.

[0135] Um "adjuvante" é um ingrediente de vacina bem conhecido que estimula a resposta imune de um alvo de maneira não específica. Muitos adjuvantes diferentes são conhecidos no estado da técnica. Exemplos de adjuvantes são: O adjuvante Completo e Incompleto de Freund, vitamina E ou alfa-tocoferol, polímeros de bloco não iônicos e poliaminas como sulfato de dextrano, Carbopol"", pirano, saponina, tal como: Quil A"“ ou Q-vac"". Saponina e componentes da vacina podem ser combinados em um ISCOM "".

[0136] Além disso, peptídeos como muramildipeptídeos, dimetilglicina, tuftsina, são frequentemente usados como adjuvante e óleo mineral, por exemplo, Bayol'"", Drakeol"", Klearol"" ou Marcol"", Montanide"" ou óleo mineral claro (parafina); óleo não mineral, como esqualeno, esqualano; óleos vegetais ou derivados dos mesmos, por exemplo, oleato de etila. Também podem ser usados vantajosamente produtos combinados como ISA" (Seppic) ou DiluvacForte"" e Xsolve"" (ambos MSD Animal Health). Uma opção adicional é o uso de adjuvante SVEA (compreendendo esqualano e acetato de vitamina E) como revelado na EP 16206789.

[0137] Um manual sobre adjuvantes e seus usos e efeitos é: "Vaccine adjuvants" (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355).

[0138] Um adjuvante pode ser usado em diferentes formulações de uma vacina de acordo com a invenção, para aumentar a resposta imunológica à proteína mutante ORF2 de PCV2b. Por exemplo, quando o adjuvante é uma substância oleosa, a fase oleosa pode fornecer um efeito de depósito no animal vacinado liberando lentamente o antígeno, proporcionando assim uma estimulação prolongada do sistema imunológico do alvo.

[0139] A substância oleosa pode ser combinada de diferentes maneiras com a fase aquosa que compreende a proteína ORF2. Em uma modalidade, a vacina de acordo com a invenção, pode ser formulada como uma emulsão de uma fase aquosa e oleosa; de preferência a emulsão é do tipo: água em óleo (a/o), óleo em água (0/a), água em óleo em água (a/0/a) ou é uma dupla emulsão de óleo.

[0140] Mais preferencial é uma vacina de acordo com a invenção que é adjuvada com um óleo e é formulada como uma emulsão de óleo em água. Tal vacina demonstra vantajosamente propriedades tanto de estimulação imune direta da fase aquosa quanto de estimulação imune prolongada do efeito de depósito da fase oleosa.

[0141] Portanto, em uma modalidade da vacina de acordo com a invenção, a vacina é formulada como uma emulsão de óleo em água.

[0142] Métodos e equipamentos para a preparação de uma emulsão de vacina adjuvada em qualquer escala desejada estão disponíveis comercialmente, por exemplo, para homogeneização usando equipamentos como: Silverson, Ultra Turrax "", um reator Dispax (IKA) ou um Microfluidizador (Microfluídicos).

[0143] A emulsão óleo-em-água da vacina de acordo com a invenção tem preferencialmente um tamanho das partículas da fase dispersa que é bastante pequena, preferencialmente abaixo de 1 micrômetro; essas emulsões são comumente chamadas de "emulsões submicrônicas".

[0144] Em uma modalidade da emulsão óleo em água da vacina de acordo com a invenção, a emulsão é uma emulsão submicrônica.

[0145] EM uma modalidade da vacina de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado dentre o grupo que consiste em: um óleo mineral claro, um Montanide, Emunade e SVEA.

[0146] Sabe-se que tais adjuvantes têm efeitos favoráveis na imunogenicidade de vacinas porcinas.

[0147] Em uma modalidade de uma vacina de acordo com a invenção, a vacina é uma emulsão de óleo em água e o adjuvante é um óleo mineral.

[0148] Em uma modalidade preferencial da vacina de acordo com a invenção, o óleo mineral é um óleo mineral claro ou branco ou óleo de parafina, comercialmente disponível sob nomes comerciais, tais como: Marcol'"" (ExxonMobil), Klearol"“ (Sonneborn) ou Drakeol"“ (Penreco).

[0149] Mais preferencial é o uso de um adjuvante adicional, especificamente: uma vitamina E, por exemplo, alfa tocoferol ou acetato de alfa tocoferol.

[0150] Em uma modalidade preferencial uma formulação de vacina para a invenção compreende uma emulsão de óleo em água com surfactante, óleo de parafina leve e acetato de alfa tocoferol. Mais preferida é uma formulação em que o surfactante é o Polissorbato 80 (Tween *“ 80) e/ou o óleo de parafina é Marcol*" 52, e/ou a Vitamina E é o acetato de alfa tocoferol. O mais preferencial é uma formulação com Microsol Diluvac Forte"" ou com Xsolve"“ (ambos: MSD Animal Health).

[0151] Um outro efeito vantajoso da vacina de acordo com a invenção é a prevenção ou redução da disseminação do PCV2 em um rebanho de porcinos verticalmente para a prole e/ou horizontalmente dentro do rebanho ou população e dentro de uma área geográfica. Consequentemente, o uso de uma vacina de acordo com a invenção leva a uma redução da prevalência de PCV2.

[0152] Portanto, em uma modalidade preferencial da vacina de acordo com a invenção, a vacina é para reduzir a prevalência de PCV2 em uma população de porcinos ou em uma área geográfica.

[0153] Em uma modalidade, a vacina de acordo com a invenção também pode compreender um estabilizador. Isso pode servir para melhorar as características da emulsão da vacina, proteger componentes propensos à degradação e/ou melhorar o prazo de validade da vacina. Geralmente esses estabilizadores são grandes moléculas de alto peso molecular, como lipídios, carboidratos ou proteínas; por exemplo leite em pó, gelatina, albumina sérica, sorbitol, sacarose, trealose, espermidina, um hidrolisado de proteínas, Dextrano ou polivinilpirrolidona e tampões, como fosfatos de metais alcalinos.

[0154] Preferencialmente, o estabilizador é isento de compostos de origem animal (isento de compostos animais, ACF) ou mesmo: é quimicamente definido, por exemplo, como é revelado no documento WO 2006/094974.

[0155] Uma vacina de acordo com a invenção pode compreender um conservante, como timerosal, mertiolato, compostos fenólicos e/ou gentamicina. Preferencialmente, nenhum conservante é empregado.

[0156] Desnecessário dizer que a mistura de outros aditivos, que são necessários ou benéficos para a estabilidade farmacêutica ou para a eficácia da vacina de acordo com a invenção, está dentro das capacidades rotineiras do técnico no assunto e, portanto, está dentro do escopo da invenção.

[0157] Os alvos animais para a vacina de acordo com a invenção são porcinos. A idade, peso, sexo, estado imunológico e outros parâmetros do alvo a ser vacinado não são críticos, embora seja evidentemente favorável vacinar animais saudáveis e não infectados e vacinar o mais cedo possível para evitar qualquer infecção de campo com PCV2. Porque essa infecção pode ser estabelecida já em tenra idade.

[0158] Portanto, em uma modalidade da vacina de acordo com a invenção, a vacina é aplicada a animais porcinos jovens logo após o nascimento, preferencialmente dentro de 28 dias após o nascimento, mais preferencialmente dentro de 21, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou até 1 dia após o nascimento, nessa ordem de preferência.

[0159] Alternativamente, a vacina de acordo com a invenção pode ser administrada a uma porca prenha, para fornecer leitões com anticorpos específicos para PCV2 de origem materna, por passagem transplacentária e/ou por transferência via colostro.

[0160] Vantajosamente, a eficácia da vacina de acordo com a invenção não é influenciada em grande medida pelo nível de anticorpos de origem materna contra o PCV2 que os animais porcinos jovens podem ter adquirido de sua mãe; 'jovem' refere-se a uma idade de 4 semanas ou menos.

[0161] Portanto, em uma modalidade da vacina de acordo com a invenção, a vacina é aplicada a animais porcinos jovens carregando anticorpos de origem materna contra PCV2.

[0162] A vacina de acordo com a invenção também pode servir como uma vacinação primária eficaz, que pode mais tarde ser seguida e amplificada por uma vacinação de reforço. Por exemplo, a vacina de acordo com a invenção pode ser administrada a um leitão com cerca de 2 a 10 dias de idade e novamente cerca de 3 semanas depois, com cada vacinação a um volume de cerca de 1 ml.

[0163] No entanto, como a vacina de acordo com a invenção já é eficaz após uma única administração, uma modalidade preferencial é a administração de uma dose única, por exemplo, de cerca de 2 ml, a partir das 3 semanas de idade. Esta vacinação protege os porcos durante todo o período de engorda, até cerca dos 5 - 6 meses de idade.

[0164] Quando o alvo porcino da vacina de acordo com a invenção se destina a ser mantido por mais de 6 meses, como porcas para reprodução ou javalis para produção de espermatozoides, eles podem receber uma vacinação de reforço regular, 1, 2 ou 3 vezes por ano, por exemplo, para porcas: uma vacinação de reforço antes de cada parto, que é em média cerca de 2,2 vezes/ano.

[0165] Para a invenção, "cerca de" indica que um número pode variar entre + 25% em torno do seu valor indicado. Preferencialmente "cerca de" significa + 20% em torno de seu valor, mais preferencialmente "cerca de" significa + 15, 12, 10,8, 6, 5, 4, 3, 2% em torno de seu valor, ou mesmo "cerca de" significa + 1% em torno de seu valor, nessa ordem de preferência.

[0166] Uma vacina de acordo com a invenção pode ser usada como tratamento profilático ou terapêutico, ou ambos, pois interfere tanto com o estabelecimento quanto com a progressão de uma infecção por PCV2 ou doenças associadas.

[0167] Preferencialmente, uma vacina de acordo com a invenção é formulada sob uma forma que é adequada para injeção parenteral, isto é, como um líquido injetável, como: uma suspensão, solução, dispersão ou emulsão.

[0168] O regime para a administração de uma vacina de acordo com a invenção é preferencialmente integrado aos esquemas de vacinação existentes de outras vacinas que o porcino alvo possa exigir, a fim de reduzir o estresse para os animais e reduzir os custos de mão de obra. Essas outras vacinas podem ser administradas de modo simultâneo, concomitante ou sequencial, de maneira compatível com o uso registrado.

[0169] A vacina de acordo com a invenção compreende entre cerca de 0,1 e cerca de 1000 microgramas de proteína ORF2b-131P de PCV2b por dose animal. Preferencialmente, a vacina compreende entre 0,5 e 500 ug, entre 1 e 250, ou mesmo entre 2 e 200 ug de proteína ORF2b-131P de PCV por dose animal, nesta ordem de preferência. A seleção da quantidade de proteína por dose pode ser feita pelo técnico no assunto, com base nas características da vacina e do animal alvo.

[0170] A quantidade de proteína ORF2b-131P por dose animal pode ser determinada na emulsão pronta da vacina, usando procedimentos laboratoriais bioquímicos padrões, por exemplo, quebrando a emulsão e testando a fase aquosa usando SDS-PAGE. A determinação das quantidades é então realizada comparando-se as quantidades conhecidas de uma proteína de referência, por exemplo, albumina sérica bovina. Ver, por exemplo: The Protein Protocols Handbook, 2º edição, setembro de 2002, ed. JM Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Capítulo 29, p. 237-242.

[0171] Alternativamente, a quantificação da proteína ORF2 pode ser feita usando espectrometria de massa.

[0172] Preferencialmente, a quantidade de proteína ORF2b-131P de PCV por dose animal é determinada em um volume aquoso da fase antigênica, antes da mistura e/ou emulsificação com uma fase oleosa.

[0173] Uma vacina de acordo com a invenção, pode ser administrada em um volume aceitável para o animal alvo e, por exemplo, pode estar entre cerca de 0,1 e cerca de 10 ml em volume. Preferencialmente, uma dose está em um volume entre cerca de 0,1 e cerca de 5 ml, mais preferencialmente uma dose de animal está entre 0,2 e 3 ml.

[0174] Quando administrado por via intramuscular, o volume de uma dose é preferencialmente entre cerca de 1 e cerca de 3 ml, mais preferencialmente cerca de 2 ml; Quando administrado por via intradérmica, o volume de uma dose é preferencialmente entre cerca de 01 e cerca de 05 ml, mais preferencialmente cerca de 0,2 ml.

[0175] A vacina de acordo com a invenção pode ser administrada a um porcino alvo de acordo com métodos conhecidos no estado da técnica. À aplicação preferencial é por via parenteral, isto é, através da pele, por exemplo: intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, submucosa ou subcutânea. A via de administração mais preferencial da vacina de acordo com a invenção é por injeção intramuscular ou subcutânea. Ainda mais preferencial é a administração intramuscular na perna traseira ou no pescoço.

[0176] Escusado será dizer que a via ideal de aplicação dependerá das especificidades da vacina usada e das características particulares do alvo.

[0177] EM uma modalidade, a vacina de acordo com a invenção é administrada por via intramuscular a um porcino a partir de cerca de 3 semanas de idade, como uma dose única de cerca de 2 ml.

[0178] O local preferencial para administração intramuscular é o pescoço.

[0179] Em uma modalidade, o volume da dose de administração da vacina de acordo com a invenção por via intramuscular é flexível, isto é, a vacina é administrada como uma dose única de 2 ml/animal ou como duas doses consecutivas de 1 ml/animal. Quando administradas em duas doses, ambas são preferencialmente separadas no tempo por pelo menos 1 semana, preferencialmente por 2 a 5 semanas, mais preferencialmente por cerca de 3 semanas.

[0180] Em uma modalidade, a vacina de acordo com a invenção é administrada por via intradérmica a um porcino a partir de cerca de 3 semanas de idade, como uma dose única de cerca de 0,2 ml.

[0181] O local preferencial para administração intradérmica é selecionado dentre: pescoço, costas e perna traseira.

[0182] Está bem ao alcance do técnico no assunto otimizar adicionalmente uma vacina de acordo com a invenção. Geralmente, isso envolve o ajuste fino da eficácia da vacina para melhorar adicionalmente sua proteção imune fornecida. Isso pode ser feito adaptando a dose, o volume ou o conteúdo de antígenos da vacina; usando a vacina em outra forma ou formulação; adaptando os outros constituintes da vacina (por exemplo, o estabilizador ou o adjuvante); ou por aplicação através de uma rota, método ou regime diferente. Todos estes estão dentro do escopo da invenção.

[0183] Uma vacina de acordo com a invenção pode adicionalmente compreender outros compostos, como um antígeno adicional, uma citocina ou um ácido nucleico imunoestimulador compreendendo uma CpG não metilada, etc. Alternativamente, uma vacina de acordo com a invenção pode ser vantajosamente combinada com um componente farmacêutico, por exemplo, um antibiótico, um hormônio, um medicamento anti-inflamatório ou anti- parasitário. Ou, a vacina de acordo com a invenção, pode ela própria ser adicionada a uma vacina.

[0184] A vacina de acordo com a invenção pode vantajosamente ser combinada com um ou mais antígenos adicionais, por exemplo, derivados de outro patógeno porcino. A vantagem de tal vacina combinada é que ela não apenas induz uma resposta imune contra o PCV2, mas também contra outros patógenos, enquanto é necessária apenas uma única manipulação do animal alvo para a vacinação, reduzindo assim o estresse da vacinação para o animal, bem como redução de custos de tempo e mão de obra.

[0185] Portanto, em uma modalidade preferencial, a vacina de acordo com a invenção compreende um antígeno adicional de um microrganismo patogênico para animais porcinos.

[0186] O "antígeno adicional" pode ser ele próprio um microrganismo infeccioso, ou ser inativado ou uma subunidade, e pode estar com ou sem um adjuvante. O antígeno adicional pode consistir em uma molécula biológica ou sintética, como uma proteína, um carboidrato, um lipopolissacarídeo, um lipídio ou uma molécula de ácido nucleico. Alternativamente, pode ser um produto de expressão de um ácido nucleico desse outro microrganismo ou um vetor compreendendo esse ácido nucleico; o vetor pode ser ele próprio um microrganismo ou uma célula hospedeira eucariótica.

[0187] O antígeno adicional pode ser "derivado" de outro microrganismo patogênico para o porcino de qualquer forma, por exemplo, como extrato, fração, lisado, homogenato ou sonicado.

[0188] Um "microrganismo patogênico para animais porcinos" para a invenção é bem conhecido no estado da técnica. O antígeno adicional pode, portanto, derivar, em princípio, de qualquer vírus, bactéria, parasita, fungo, rickettsia, protozoário e/ou parasita que seja patogênico para os porcinos.

[0189] Exemplos de tal microrganismo patogênico para animais porcinos são: vírus da síndrome reprodutiva e respiratória de porcinos (PRRSV), vírus da pseudo-raiva, vírus da parvo porcina, vírus da febre suína clássica, vírus da influenza suína, vírus da febre aftosa, vírus da diarréia epidêmica porcina , vírus da gastroenterite transmissível, vírus da estomatite vesicular, Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Escherichia coli, Streptococcus suis ou um Salmonella,

Brachyspira, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Bordetella, Toxoplasma, Isospora, ou Trichinella.

[0190] Em uma modalidade preferida da vacina de acordo com a invenção, a vacina compreende - próximo ao antígeno de PCV2 - um ou mais antígenos de um microrganismo patogênico a animais porcinos selecionados do grupo que consiste em M. hyopneumoniae, L. intracellularis e PRRSV.

[0191] Como esses atualmente são os patógenos porcinos mais proeminentes, sua combinação em uma única injeção e vacina pronta para uso é muito favorável, tanto do ponto de vista econômico quanto veterinário.

[0192] Em uma modalidade preferencial o um ou mais antígeno adicional é adicionado a uma vacina de acordo com a invenção como uma preparação liofilizada, em que a vacina combinada é preparada por reconstituição com a emulsão de vacina da invenção. Isso é descrito, por exemplo, no documento WO 2010/106095.

[0193] EM uma modalidade preferencial, a vacina de acordo com a invenção é uma vacina combinada compreendendo a proteína mutante ORF2 de PCV2b e um antígeno de M. hyopneumoniae, e a referida vacina combinada é usada para reconstituir uma preparação liofilizada de um antígeno de L. intracellularis e/ou de PRRSV.

[0194] Em uma modalidade preferencial, a vacina de acordo com a invenção é uma vacina combinada compreendendo a proteína mutante ORF2 de PCV2b, um antígeno de M. hyopneumoniae e um antígeno de L. intracellularis, e a referida vacina combinada é usada para reconstituir uma preparação liofilizada de um antígeno de PRRSV.

[0195] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um método para redução de infecção por PCV2 ou de sinais associados a doença em um animal porcino, o método compreendendo a administração ao referido porcino da vacina de acordo com a invenção.

[0196] Uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparada por meios bem conhecidos por um técnico no assunto. Conforme descrito, o uso de uma proteína mutante ORF2 de PCV2b como descrita para a invenção ou das células de insetos como descritas para a invenção permite a fabricação de uma vacina para porcinos, como descrito para a invenção. A este respeito, a proteína mutante ORF2 de PCV2b também é obtida por um método de acordo com a invenção.

[0197] Portanto, em um aspecto adicional, a invenção se refere ao uso de proteína mutante ORF2 de PCV2b com uma Prolina na posição do aminoácido número 131, para a fabricação de uma vacina para animais porcinos para redução de infecção por PCV2 ou de sinais associados a doença.

[0198] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a proteína mutante ORF2 de PCV2b tendo uma Prolina na posição do aminoácido número 131, para uso em uma vacina para animais porcinos para redução de infecção por PCV2 ou de sinais associados a doença.

[0199] Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um processo para preparar uma vacina de acordo com a invenção, o processo compreendendo uma ou mais etapas selecionadas a partir de: - misturar a proteína mutante ORF2 de PCV2b tendo uma Prolina na posição do aminoácido número 131 com um veículo farmaceuticamente aceitável; e - formular a referida mistura de proteína mutante ORF2 de PCV2b e veículo farmaceuticamente aceitável com um adjuvante.

[0200] Para uso no processo para preparar uma vacina de acordo com a invenção, a proteína mutante ORF2 de PCV2b é obtido por um método para a expressão da proteína mutante ORF2 de PCV2b nas células de inseto de acordo com a invenção e/ou é obtido por um método para a produção de proteína mutante ORF2 de PCV2b de acordo com a invenção.

[0201] Em uma modalidade do processo para preparar uma vacina de acordo com a invenção, a proteína ORF2 mutante está na forma de VLPs.

[0202] Uma vacina de acordo com a invenção pode ser preparada por um técnico no assunto, em uma forma que seja adequada para administração a um alvo porcino e que combine com a via de aplicação desejada e com o efeito desejado. Geralmente essas vacinas são preparadas estéreis e em pH fisiológico.

[0203] Detalhes e exemplos de um método, uso ou processo para preparar uma vacina de acordo com a invenção são descritos na presente invenção e tais procedimentos são facilmente aplicáveis por um técnico no assunto, usando materiais e métodos de rotina. Por exemplo, a proteína mutante ORF2 de PCV2b como descrita para a invenção pode ser produzida em células de inseto em escala industria e é, em seguida, combinada com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, é formulada em uma vacina, por exemplo, por emulsificação com um adjuvante oleoso, e preenchido em receptáculos de tamanho apropriado. Os vários estágios do processo de fabricação serão monitorados por testes adequados, por exemplo, por testes imunológicos para a qualidade e quantidade dos antígenos; por testes microbiológicos para inativação, esterilidade e ausência de agentes estranhos; e, finalmente, por estudos de vacinação em animais para confirmar eficácia e segurança. Após a conclusão dos testes de qualidade, quantidade e esterilidade, o produto da vacina pode ser liberado para venda.

[0204] Tudo isso é bem conhecido por um técnico no assunto e as técnicas e considerações gerais que se aplicam à preparação de vacinas são descritas, por exemplo, em diretrizes e regulamentos governamentais (Farmacopeia, 9CFR) e em manuais conhecidos (Pastoret, Lippincot, supra).

[0205] A invenção será agora descrita mais detalhadamente pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplos Exemplo 1: Montagem de diferentes constructos recombinantes que expressam ORF2 de PCV2

[0206] Para a expressão de proteínas ORF2 de PCV2 em células de insetos, foram gerados baculovírus recombinantes, usando procedimentos padrão. Em suma:

[0207] Os genes ORF2 de PCV2 do tipo selvagem usados nesses experimentos foram obtidos a partir de diferentes fontes: o vírus parental PCV2a era de uma cepa de vacina dos EUA; PCV2b era do isolado francês Imp1011, GenBank nº de acesso AFO55394; PCV2d era da China, cepa BDH, GenBank nº de acesso: HMO038017.

[0208] O gene ORF2 foi subclonado por amplificação usando PCR e inserção em um plasmídeo de clonagem. Em seguida, alguns dos genes ORF2 foram mutados, ou para codificar uma Prolina na posição do aminoácido 131, usando a mutação direcionada por PCR. Alternativa ou adicionalmente, os genes ORF2 tiveram seus códons otimizados para se parecer com a tabela de uso de códons do gene da poliedrina ACMNPV. As sequências mutadas usadas na presente invenção para PCV2b são apresentadas na lista de sequências anexas, como descrito.

[0209] Constructos sintéticos de inserções do gene ORF2 mutados foram solicitados a um fornecedor comercial (BaseClear, Holanda; ou Genscript, Piscataway, NJ, EUA).

[0210] Para uso com o sistema Bac-to-bac, estes foram subclonados no vetor de clonagem pFastBac1 e para uso com o sistema Profasy no vetor de transferência pVL1393. Nos dois casos, a inserção estava atrás do promotor da poliedrina. A geração e seleção de baculovírus recombinante foram desempenhadas de acordo com as instruções do fabricante. Alguns dos constructos de baculovírus recombinantes de PCV2a foram construídos usando a técnica clássica de seleção de transfecção e isolamento de recombinantes por plaqueamento de células de inseto infectadas sob ágar mole e coleta de placas.

[0211] Todos os baculovírus recombinantes foram amplificados em células Sf9, coletados, armazenados refrigerados ou congelados e titulados. Os estoques de vírus usados para experimentos adicionais estavam tipicamente entre 7,5 e 8,5 Log10 TCID50/ ml.

[0212] Uma seleção dos baculovírus recombinantes usados para a expressão da proteína PCV2 ORF2 em células de inseto está listada na tabela abaixo:

[0213] NB: Todas as inserções foram inseridas atrás do promotor da poliedrina. A otimização de códon (quando aplicada) foi direcionada ao uso de códon do gene da poliedrina ACMNPV.

RN

Exemplo 2: Expressão em células de insetos

[0214] Os diferentes constructos de baculovírus recombinantes, como descritos acima, foram usados para infectar células de insetos e expressar várias variantes da proteína PCV2 ORF2. A proteína produzida foi visualizada e analisada para avaliar o efeito das várias mutações feitas, comparando-se com a proteína não modificada ou com a proteína de outro genótipo de PCV2. Alguns baculovírus recombinantes foram ampliados para produzir proteína para a formulação da vacina da subunidade PCV2 para teste em porcos.

2.1 CULTURAS DE CÉLULAS DE INSETOS

[0215] Os experimentos padrão de infecção e expressão foram feitos em pequena escala, usando células de inseto Sf9, que foram retiradas de uma cultura rotativa de células limpas que foram regularmente divididas para manter o crescimento exponencial. As taxas típicas de infecção foram entre 0,01 e 0,1 moi e as durações de cultura foram entre 3 e 5 dias. As culturas foram monitoradas regularmente por microscopia de luz para verificar a saúde das células não infectadas ou para monitorar o progresso de replicação viral em culturas infectadas.

[0216] Os recipientes de cultura usados foram os frascos T25 ou T75 (Falcon) com culturas de monocamada de 5 ou 15 ml, respectivamente. Alternativamente, 100 ml de culturas em suspensão foram executadas em frascos rotativos (Corning). Os frascos foram incubados a 27 ºC e o meio de cultura usado foi o Sf-900"" Il (Thermo Fisher Scientific). Nenhum soro foi adicionado, mas uma mistura de antibióticos: 50 ug/ml de gentamicina e 0,25 %o de natamicina.

[0217] Quando a maioria das células apresentou efeito citopatogênico (cpe), as culturas foram coletadas: culturas de frasco-T exigiram bater com firmeza para soltar as células. As coletas de cultura foram então centrifugadas e o sobrenadante da cultura foi descartado, pois a proteína ORF2 produzida estava principalmente contida nas células de insetos. Dependendo do uso pretendido, o pellet celular pode então ser ressuspenso em um líquido necessário na concentração desejada.

[0218] As culturas de pequena escala não eram rotineiramente inativadas; as amostras foram usadas em instalações de contenção ou tratadas com tampão de amostra de eletroforese desnaturante e depois consideradas inativadas.

[0219] As culturas em grande escala seguiram essencialmente o mesmo esboço, com adaptações para volume e equipamento. Em ambiente experimental, culturas de suspensão de células de inseto intermediárias em larga escala foram executadas com volume de 2 a 10 litros, em fermentadores industriais com controles de processo automatizados. As células de inseto Sf9 limpas foram obtidas a partir de uma pré-cultura. Moi estava entre 0,01 e 0,1 e a cultura durou de 5 a 7 dias. Quando a infecção progrediu o suficiente, as células foram deixadas para assentar por gravidade. Em seguida, os 90% superiores do volume da cultura foram removidos, as células foram coletadas em 1/10 do volume original da cultura e foram lisadas por sonificação. A sonificação em média escala foi desempenhada em batelada, em gelo, usando um sonificador de ponta (Vibra Cell"”, Sonics, CT, EUA). Em escalas maiores (volumes de 100 | ou mais), a sonicação era realizada por passagem através de uma célula de sonificação de fluxo contínuo (Sonobloc"", Bandelin).

[0220] Em seguida, o sonicado foi inativado usando BEI. Isso foi então neutralizado usando Na-tiossulfato. Em seguida, a coleta inativada foi clarificada por centrifugação e o sobrenadante contendo a proteína ORF2 foi mantido como a fase aquosa do antígeno em massa. Este foi armazenado de 2 a 8 ºC para controle de qualidade e processamento posterior. Nestes produtos, o veículo farmaceuticamente aceitável para o antígeno é assim meio gasto a partir da cultura de células de insetos. Quando necessário, o antígeno em massa pode ser concentrado ou dialisado contra PBS. Alternativamente, o antígeno pode ser diluído com meio de cultura de células de inseto fresco ou com PBS.

2.2 ELISA

2.2.1 Esboço dos ensaios de ELISA

[0221] As culturas de células de insetos foram infectadas com baculovírus recombinante número 6 (Treonina a 131) ou vírus número 8 (substituição de T131P), para testar o efeito da substituição de T131P na proteína ORF2 de PCV2b. Ambos são constructos no formato Bac-2-Bac e não tinham otimização de códons. Do vírus 6, dois isolados foram testados.

[0222] As culturas em frasco T175 de células Sf9 foram infectadas, incubadas e coletadas por centrifugação de toda a cultura. Os pellets celulares foram recoletados em 10 ml de água para injeção, que lisou efetivamente todas as células. Os lisados celulares foram então testados quanto à sua massa antigênica em um ELISA sanduíche, brevemente como segue:

[0223] Os poços de uma placa de microtitulação de poliestireno foram revestidos com um anticorpo monoclonal direcionado contra ORF2a de PCV2. As diluições em série das amostras de lisado foram incubadas juntamente com uma série de diluições de um padrão de referência conhecido de PCV2a ORF2. Em seguida, as placas foram incubadas com uma quantidade fixa de um anticorpo secundário também direcionado contra ORF2a de PCV2, que foi conjugado com biotina. Finalmente, a quantidade de conjugado ligado foi então quantificada por incubação com estreptavidina conjugada com peroxidase, seguida por detecção cromofórica por leitor automático de placas.

[0224] A quantidade de antígeno nos lisados foi calculada em relação ao padrão de referência, do qual a quantidade de antígeno foi arbitrariamente estabelecida em 100 unidades antigênicas (AU)/ml.

2.2.2 Resultados e conclusões de ELISA

[0225] A quantidade de proteína ORF2 detectada nos lisados foi a seguinte: - - células infectadas pelo vírus 6 (duas variantes): 5,5 e 7,4 AU/ml, - - células infectadas pelo vírus 8: 68 AU/ml.

[0226] Um lisado preparado em água pura a partir das células infectadas com o vírus recombinante que expressa a proteína PCV2b ORF2 sem mutação em 131 continha apenas muito pouca proteína ORF2 como detectado por ELISA. No entanto, esse lisado de células infectadas com baculovírus recombinante que expressa ORF2 com a substituição T131P continha cerca de 10 vezes mais proteína.

[0227] Estes resultados de ELISA ilustraram a grande diferença na quantidade de proteína ORF2 que poderia ser facilmente isolada de células de inseto infectadas, com ou sem a substituição do aminoácido ORF2 número 131. Por um lado, isso estava relacionado à facilidade com que a proteína foi liberada em um lisado não desnaturante. Por outro lado, isso também refletiu a diferença na produção geral da proteína PCV2b ORF2 em células de inseto, sem ou sem mutação do aminoácido na posição 131.

2.3 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

2.3.1 Esboço dos ensaios de IFT

[0228] Para testes de imunofluorescência (IFTs), células de inseto limpas foram semeadas nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços, tipicamente a 2,5 x 10 9 4 células por poço, em 100 ul de meio. Após a fixação, as células foram infectadas com o baculovírus recombinante específico a ser investigado. As variações de diluição típicas do vírus foram inoculadas para permitir a observação em diferentes mois. As placas foram analisadas após 4-5 dias de incubação, quando as células dos insetos haviam sido infectadas adequadamente, mas ainda não estavam lisadas. O meio foi removido, as células foram fixadas com etanol frio e coradas com anticorpos apropriados de acordo com procedimentos padrão. Um segundo anticorpo conjugado com FITC foi usado para a visualização. As células de insetos foram contra-coradas com azul de Evans para aumentar o contraste com o fundo.

[0229] Para estes estudos de IFT, o anticorpo primário usado foi um antissoro anti-PCV2a policlonal suíno, que foi suficientemente potente para também corar a proteína ORF2 de genótipo PCV2b e PCV2d.

2.3.2 Resultados dos ensaios de IFT

[0230] Ao comparar os resultados de IFT observados para os diferentes produtos de expressão da proteína ORF2, várias observações foram feitas: - Os vírus recombinantes 1 a 5, como descrito acima, todos expressando a proteína PCV2a ORF2, todos causaram invariavelmente um padrão de coloração citoplasmática, pelo que essencialmente toda a célula de inseto mostrou uma coloração brilhante.

- No entanto, as células de inseto infectadas com o baculovírus recombinante número 6, expressando a proteína PCV2b ORF2 do tipo selvagem, exibiram um padrão essencialmente diferente, em que a coloração estava localizada exclusivamente ao redor do núcleo das células de inseto. Não foi observada coloração citoplasmática.

- Esse padrão de IFT foi basicamente o mesmo para células de inseto infectadas com o vírus número 7, que também está expressando a proteína PCV2b ORF2, mas a partir de um gene de códon otimizado. A única diferença foi que uma pequena quantidade (aproximadamente 10% das células de inseto)

mostrou coloração citoplasmática, enquanto a maioria das células ainda exibia coloração nuclear.

- Surpreendentemente, as células de inseto infectadas com o vírus número 8 deram um padrão de IFT em que o padrão de fluorescência era o inverso do vírus recombinante número 7: a maioria das células de inseto exibiram coloração citoplasmática, com algumas células ainda mostrando coloração nuclear. O vírus número 8 carregava um gene PCV2b ORF2 em que o códon que codifica o aminoácido número 131 foi mutado de uma Treonina para uma Prolina (T131P).

- Finalmente, as células de inseto infectadas com o vírus número 9 (gene PCV2b ORF2 com otimização de códon e carregando a substituição T131P, em um constructo limpo), todas apresentaram exclusivamente coloração citoplasmática.

- Notavelmente, as células de inseto infectadas com o baculovírus recombinante número 10 (que codifica a proteína PCV2d ORF2 com a substituição T131P, otimização de códon e em um constructo limpo) todas ainda exibiam um padrão de coloração nuclear.

2.3.3 Conclusões a partir dos ensaios de IFT

[0231] Concluiu-se que a expressão eficaz de proteína ORF2 a partir do PCV2b em células de insetos exigiu a substituição do aminoácido na posição número 131 por Prolina, exibindo um padrão de coloração citoplasmática, em um IFT com um anticorpo anti-PCV2a. Sem tal mutação, a proteína PCV2b ORF2 exibia uma coloração exclusivamente no ou ao redor do núcleo da célula de inseto que expressa essa proteína.

[0232] A mutação do gene ORF2 apenas pela otimização de códon deu uma ligeira mudança no padrão de coloração de IFT, provavelmente como resultado do aumento da eficiência da expressão.

[0233] O padrão de coloração nuclear poderia ser revertido adicionalmente quando o baculovírus recombinante não fosse baseado em um constructo contendo elementos residuais a partir do vetor de clonagem (como em um recombinante produzido usando o sistema Bac-to-bac), mas fosse um constructo de baculovírus "limpo" , ou seja, não contém elementos genéticos adicionais a partir do processo de recombinação em seu genoma. Tais baculovírus recombinantes limpos podem ser obtidos usando recombinação homóloga clássica e purificação de placas, ou mais convenientemente usando um kit comercial como o sistema Profasy.

[0234] Assim: uma reversão do padrão de coloração nuclear de IFT observado em células de inseto que expressam a proteína PCV2b ORF2 pode ser obtida por mutação do tripleto de codificação do aminoácido ORF2 número 131 para codificar Prolina. Uma otimização adicional da expressão da proteína ORF2 citoplasmática pode ser alcançada otimizando o códon do gene codificador e usando um constructo de baculovírus recombinante limpo.

2.4 QUANTIFICAÇÃO POR ELETROFORESE EM GEL

2.4.1 Esboço dos ensaios de eletroforese em gel

[0235] Para permitir uma quantificação do nível de expressão das diferentes proteínas ORF2, amostras a partir de culturas de células de insetos infectadas foram realizadas em SDS-PAGE, ao longo de faixas com quantidades conhecidas de albumina de soro bovino (BSA) como proteína marcadora. Após a coloração, os géis foram digitalizados e analisados. Ao usar um tampão de amostra fortemente desnaturante, este experimento revelou a capacidade total de expressão de células de insetos infectadas com os vários constructos de baculovírus recombinantes.

[0236] Os diferentes baculovírus recombinantes a serem testados foram cultivados em frascos T75 como descrito, coletados, centrifugados e os pellets celulares foram recoletados em 7,5 ml de PBS. As amostras do sobrenadante e das células ressuspensas foram então retomadas em tampão de amostra Laemmli SDS-PAGE desnaturante padrão (contendo indicador azul de bromofenol e beta-mercaptoetanol).

[0237] As amostras foram realizadas em géis de poli-acrilamida padrão (pré-fabricado Criterion TGX"", Any kD (15%), Bio-Rad), em tampão de execução Tris-Glicina-SDS padrão. Após a eletroforese, os géis foram corados com Instant Blue"" (Expedeon). Finalmente, os géis foram digitalizados e analisados com um densitômetro calibrado Bio-Rad GS-900 usando o Software Image Lab"", versão

5.2.1, para atribuir uma quantidade de proteína a bandas individuais no gel.

2.4.2 Resultados dos ensaios de eletroforese em gel

[0238] Nas Figuras 1 e 2 são apresentadas algumas imagens representativas de gel, como as usadas nesses experimentos: Figura 1: amostras a partir de culturas de células de insetos infectadas com vírus nº 3, 6 ou 7; e Figura 2: amostras a partir de culturas com vírus nº 8 ou 9. Por tipo de vírus, a primeira faixa contém uma amostra de sobrenadante da cultura, as próximas três faixas contêm amostras das células concentradas 2x, com 30, 20 e 10 uml da esquerda para a direita. Faixas mais à esquerda e à direita: marcadores de peso molecular de 10 a 250 kDa (padrões Precision Plus Protein'"", Bio-Rad), os tamanhos das bandas são indicados nas figuras.

[0239] Cada gel também continha uma faixa de diluição de BSA (Padrão de Albumina de alta qualidade, Thermo Fisher Scientific), que foi usado como uma solução de 100 ng/ul. As quantidades usadas foram: Figura 1: nas faixas 14 - 17: 0,25, 0,5, 1 e 2 ug de BSA; Figura 2: nas faixas 11 a 15: 0,25, 0,5, 1, 2 e 3 ug de BSA.

[0240] As análises por densitômetro focalizaram nas bandas de proteína PCV2 ORF2, a 26 kDa. Todas as amostras foram analisadas em géis duas vezes, os resultados de rendimento calculados são médias dos de Duplo.

[0242] Várias observações podem ser feitas: - Para infecções por vírus com vírus números 8 e 9, as duas constructos de PCV2b ORF2 com substituição de T131P, as faixas de gel (ver a Figura 2) pareciam ligeiramente mais escuras do que para os outros vírus testados, embora em todas as culturas comparadas pelo SDS-PAGE o moi (0,1), tempo de cultura (4 dias) e outras condições foram iguais. Isso pode indicar que a infecção pode não ter progredido tanto quanto nos outros vírus, resultando em mais material celular na amostra. Talvez a substituição de Prolina tenha causado uma ligeira atenuação do baculovírus recombinante. No entanto, os níveis de expressão de proteína pareceram não ser afetados e foram melhores do que para PCV2b ORF2 sem essa mutação.

- Nenhuma das amostras de sobrenadante mostrou uma quantidade de proteína ORF2 que poderia ser visualizada pela coloração de CBB que foi usada. Consequentemente, sob condições aplicadas nestas experiências, efetivamente toda a proteína ORF2 expressa estava contida nas células de inseto.

- O nível de expressão de proteína PCV2b ORF2 não mutada (vírus 6) foi inferior ao da ORF2 de PCV2a (vírus 3), com 26 versus 32 ug/ml. Lembra-se que essas amostras exibem o total de toda a proteína produzida, devido à desnaturação agressiva empregada (ebulição em SDS e beta-mercaptoetanol). Isso indica que a expressão total da proteína a partir do gene PCV2b ORF2 não mutado é realmente mais baixa em geral em células de insetos.

- NB: Essa diferença no rendimento é muito pior na prática, quando a coleta é sem desnaturação (forte). Nesse caso, os lisados a partir de células de insetos que expressam ORF2 de PCV2b não mutado praticamente não mostraram nenhuma proteína ORF2 detectável.

- O rendimento da proteína ORF2 de PCV2b não mutada pode ser ligeiramente aumentado pelo uso de um gene ORF2 de códon otimizado: comparar os rendimentos das culturas de vírus 6 e 7, com rendimentos totais de 26 e 36 ug/ml, respectivamente.

- No entanto, o aumento mais significativo foi alcançado com a introdução da substituição de T131P na proteína ORF de PCV2b, ver os rendimentos de culturas de vírus 6 e 8, com 26 versus 56 ug/ml. A substituição de T131P foi, portanto, capaz de causar mais do que uma duplicação no rendimento total de proteína ORF2, mesmo nessas culturas de pequena escala sem qualquer otimização.

- Rendimentos ainda melhores de proteína ORF2 de PCV2b podem ser alcançados quando todas as mutações forem combinadas: A substituição de T131P, otimização de códon e uso de um constructo de baculovírus limpo: comparando os rendimentos das culturas de vírus 6 e 9, mostra uma triplificação do rendimento de proteínas, a partir de 26 a 76 ug/ml.

[0243] Uma análise semelhante do rendimento de proteínas também foi desempenhada em amostras que foram produzidas em culturas de larga escala intermediárias de 2 litros. As coletas foram obtidas na concentração de 7,7x em relação ao volume total da cultura. A proteína ORF2 destas culturas também foi usada para produzir as vacinas experimentais para PCV2 descritas a seguir.

[0244] Os rendimentos de proteína ORF2 obtidos foram os seguintes, indicados em ug/ml do volume de cultura original de 2 litros: 1 Constructo NA NA Rendimento Vírus nº Genótipo de de Otimização Aminoácido de ORF2 mn fer io ee ess SS [E IT pressy Tm Trina Ts 1

[0245] As condições de cultura nos fermentadores eram claramente mais ideais do que na cultura de pequena escala nos frascos T. Não apenas por causa do controle automatizado de temperatura, pH e oxigênio dissolvido, mas também por serem culturas de suspensão, as quais permitem densidades celulares mais altas por ml de cultura.

[0246] Os baculovírus recombinantes usados também foram construídos da maneira ideal, no sentido de que tinham um gene ORF2 de códon otimizado, em um constructo de baculovírus limpo (produzido usando o sistema ProE£asy).

[0247] Isto resultou em um rendimento de proteína para células de insetos infectadas com o vírus nº 9 de mais de 100 ug/ml de cultura, enquanto nos frascos T era de 76 ug/ml.

[0248] Notavelmente, o rendimento de proteína a partir de células de inseto que expressam a proteína mutante ORF2 de PCV2b com a substituição do aminoácido número 131 por Prolina foi substancialmente maior do que o da proteína ORF2 de PCV2a não modificada, mesmo que as mesmas condições de cultura e constructos tenham sido usadas. Em particular porque o gene ORF2 de PCV2a usado na presente invenção também tinha uma Prolina na posição do aminoácido 131 a partir de sua sequência nativa. Não é imediatamente aparente o que pode causar essa diferença, embora seja evidentemente altamente favorável para a produção da proteína ORF2 de PCV2b para a fabricação de vacinas de subunidades contra o PCV2.

2.4.3 Conclusões dos ensaios de eletroforese em gel

[0249] Embora nem todos os efeitos observados pudessem ser explicados neste momento, a análise por eletroforese em gel deixou explicitamente claro que a expressão em células de inseto da proteína ORF2 de PCV2b sem qualquer adaptação, na melhor das hipóteses, produziu quantidades de proteína inferiores à expressão de ORF2 de PCV2a. Essa diferença é ainda pior quando as células são coletadas usando condições não desnaturantes.

[0250] A falta de rendimento pode, contudo, ser mais do que compensada substituindo o aminoácido na posição 131 em ORF2 de PCV2b por Prolina, que pelo menos duplica o rendimento em comparação com o da proteína ORF2 de PCV2b não mutada.

[0251] Aumentos ainda maiores no rendimento podem ser alcançados expressando a mutação 131P a partir de um gene ORF2 de códon otimizado e usando um constructo de baculovírus limpo. Ainda melhorias adicionais nos rendimentos podem ser alcançadas em culturas de suspensão de larga escala.

[0252] Juntos, esses achados permitem, pela primeira vez, a produção comercial e em larga escala da proteína ORF2 a partir do genótipo PCV2b, por um sistema de expressão recombinante.

Exemplo 3: Experimentos de vacinação-inoculação em porcos

3.1. INTRODUÇÃO

3.1.1 Objetivo

[0253] Este estudo foi desempenhado para comparar e avaliar a eficácia de vacinas porcinas com base em proteínas ORF2 de PCV2 mutantes expressas em células de insetos de acordo com a invenção. Para fornecer um teste completo de sua capacidade protetora, as proteínas ORF2 de diferentes genótipos foram usadas não apenas contra uma infecção-inoculação homóloga, mas também contra uma infecção-inoculação heteróloga por PCV2. Também as doses de vacina usadas continham quantidades relativamente baixas de proteína ORF2.

3.1.2 Esboço do estudo

[0254] Para este estudo foram usados 140 leitões, distribuídos em 2 conjuntos de 7 grupos de tratamento com 10 animais cada, um conjunto para cada uma das duas inoculações. Os 140 animais foram derivados de 14 porcas. Os leitões tinham níveis detectáveis de anticorpos anti-PCV2 ORF2, variando dentre titulados baixos a muito altos; o titulado médio de MDA para todos os animais foi de 5,8 Log2 pelo anticorpo-ELISA.

[0255] Os leitões foram vacinados intramuscularmente no pescoço com 2 ml cada, quando tinham aproximadamente três semanas de idade. As vacinas usadas compreenderam diferentes quantidades de proteína ORF2 de PCV2 produzida através do sistema de expressão de células de inseto-baculovírus, a partir de um dos três genótipos: PCV2a, 2b ou 2d. Os baculovírus recombinantes usados foram os números 5, 9 e 10, como descrito acima, tendo uma Prolina na posição do aminoácido 131, expresso a partir de um gene ORF2 codificador que teve seu códon otimizado em direção ao gene da poliedrina ACMNPV e usando um constructo de baculovírus limpo. As vacinas foram formuladas como emulsões de óleo em água com adjuvante Emunade'". A vacina continha adicionalmente antígeno a partir de Mycoplasma hyopneumoniae (cepa J), para se parecer com a vacina comercial: Porcilis"" PCV M Hyo. No que diz respeito ao antígeno PCV2 ORF2, a vacina testada compreendia um quarto ou um décimo sexto de uma dose completa padrão por animal.

[0256] Para os dois conjuntos, a divisão dos tratamentos da vacina entre os grupos foi conforme indicado no cronograma abaixo.

[0257] NB: Os animais no grupo 7 de ambos conjuntos não foram vacinados, para servir como controle de inoculação.

ECENEIEZENENENENAA

ETTA Sem ORF2/animal) | vacina Genótipo de 2a 2b 2d eae 8 |» | 3 |

[0258] Duas semanas após a vacinação, todos os animais foram transportados para as instalações de inoculação. Às 3 semanas após a vacinação (às 6 semanas de idade), todos os animais receberam uma inoculação infectada com PCV?2 virulento, a partir do genótipo 2b ou do 2d. A inoculação foi por via de administração intranasal de 6 ml (3 ml por narina) de PCV2 em PBS, a 5 Log10 TCID50/ml; usando para o conjunto 1: um vírus de inoculação de PCV2b (isolado na Holanda, 2003) e para o conjunto 2: um vírus de inoculação de PCV2d (isolado na Alemanha, 2015). Os vírus de inoculação foram produzidos em células PK15 livres de PCV e foram verificados quanto à esterilidade bacteriana e fúngica.

[0259] Três semanas após a inoculação (às 9 semanas de idade), todos os animais foram sacrificados e examinados: as vísceras foram inspecionadas in situ, prestando atenção especial a: pulmões, linfonodos inguinais e mesentéricos, tonsilas, timo, baço, fígado e rins. Em seguida, amostras de tonsila, pulmão, linfonodo mesentérico e linfonodo inguinal foram removidas e fixadas para detecção do vírus de inoculação de PCV2, por imuno-histoquímica (IHC).

[0260] Outras análises também foram desempenhadas, tais como sorologia em amostras de sangue e qPCR em amostras de tecido e cotonete. No entanto, os dados de IHC deram os resultados mais explícitos.

3.2. MATERIAIS E MÉTODOS

3.2.1 Proteínas ORF2 DE PCV2:

[0261] As sequências do gene ORF2 de PCV2 de PCV2a, 2b e 2d foram produzidas em culturas intermediárias de larga escala, como descrito na seção

2.1 acima. Sua quantificação por eletroforese em gel é descrita na seção 2.3.2 acima.

3.2.2 Animais de teste

[0262] Os animais de teste eram negativos para a carga viral de PCV2 e tinham níveis moderados de anticorpos anti-PCV2. O teste teria sido rejeitado se algum dos animais tivesse desenvolvido sinais clínicos de infecção por PCV2 antes da inoculação.

[0263] Apenas animais saudáveis foram incluídos no ensaio. Todos os leitões foram observados diariamente para a saúde geral e para sinais clínicos ou sistêmicos da doença, como perda de apetite, relutância em se mover, tendência a se deitar, apatia ou sonolência, tremores, arrepios, edema (especialmente ao redor dos olhos), vômitos e diarréia e dispneia.

[0264] Os leitões foram marcados individualmente por marcas auriculares, com os leitões das 14 ninhadas sendo igualmente divididos entre os grupos de teste. Após o desmame, a água da torneira ficou disponível ad libitum e a alimentação foi realizada de acordo com procedimentos padrão.

[0265] A vacinação foi dada na fazenda de parto. Após o transporte para as instalações de inoculação, foi incluída uma semana de aclimatação.

3.2.3 Procedimentos experimentais de laboratório

3.2.3.1 Imuno-histoquímica

[0266] As amostras de tecido foram preparadas para exame histológico, fixando-se em formalina a 10% e incorporando-se em parafina. Lâminas de microscopia foram preparadas. Estes foram incubados com um soro anti-PCV2 policlonal de coelho como anticorpo primário e visualizados com coloração com peroxidase (Envisiont+"", DAKO). As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina. No exame microscópico de tonsilas e linfonodos, a coloração marrom característica recebeu uma pontuação dependendo da extensão da coloração: - pontuação O: folículos linfoides não mostraram coloração positiva específica; - pontuação 1: menos de 10% dos folículos linfoides continham até 15 células com coloração positiva específica; - pontuação 2: 10 - 50% dos folículos linfoides continham até 15 células com coloração positiva específica ou menos de 10% dos folículos linfoides continham mais de 15 células com coloração positiva específica; - pontuação 3: > 50% dos folículos linfoides continham células com coloração positiva específica;

[0267] A soma das pontuações dos tecidos individuais foi registrada como a pontuação total de IHC por animal, e estas foram combinadas para todos os animais de um grupo.

3.2.3.2 Formulações de vacina

[0268] As vacinas de teste foram formuladas como emulsões de óleo em água com Emunade"", este é um adjuvante duplo com óleo mineral disperso em uma fase aquosa contendo os antígenos da vacina, bem como o hidróxido de alumínio. A preparação, com 9% de antígeno Mhyo, estava de acordo com o procedimento revelado no WO 2016/091998.

[0269] A vacina também foi preparada de acordo com EP 1.926.496, de modo que 25% de uma dose completa (2 ml/animal) compreendia aproximadamente 20 ug de proteína ORF2 e uma dose de 6,25% compreendia 5 ug de proteína ORF2/dose animal.

3.3. RESULTADOS E CONCLUSÕES

[0270] Por meio de imuno-histoquímica, as amostras de tecido das tonsilas, linfonodos mesentéricos e inguinais coletados post mortem foram analisadas para avaliar a quantidade de vírus de inoculação detectável. Uma visão geral gráfica desses resultados é apresentada nas Figuras 3 e 4: A Figura 3 representa os resultados para os animais nos grupos 1-7 do conjunto 1, recebendo uma inoculação infectada pelo vírus PCV2b virulento; A Figura 4 representa os dados de IHC para todos os animais do conjunto 2, nos quais os animais foram inoculados com o vírus PCV2d virulento.

[0271] O eixo vertical apresenta a pontuação de intensidade de IHC de acordo com a escala descrita acima. Os resultados de IHC podem ser usados para determinar a eficácia das vacinas baseadas na proteína PCV2 ORF2, comparando o nível de redução de infecção por PCV2 nos grupos vacinados versus não vacinados.

[0272] Várias observações podem ser feitas: - Os animais não vacinados mostraram pontuações de IHC consideravelmente mais altos do que os grupos vacinados, indicando que a dose da inoculação foi alta o suficiente e que a inoculação infectada foi eficaz, mesmo no contexto de níveis moderados de anticorpos maternos anti-PCV2 nos leitões.

- Como pode ser visto: as doses da vacina compreendendo 5 ou 20 ug de proteína ORF2 deram forte proteção contra a replicação do vírus de inoculação, atingindo uma redução de até 90% na pontuação de IHC. Portanto, estas vacinas para PCV2 foram altamente eficazes.

- Foi observada uma proteção um pouco menor para a dose mais baixa de proteína ORF2 de PCV2a contra inoculação de PCV2d. Isso indica que as vacinas para PCV2 baseadas na proteína ORF2 mutante expressa em células de insetos a partir de PCV2b ou de PCV2d de acordo com a presente invenção são muito eficazes como vacina contra a infecção pelo PCV2, mesmo em uma dose única, e mesmo no contexto de anticorpos de origem materna. Em doses iguais, essas vacinas com base na proteína ORF2 mutante a partir de PCV2b ou do PCV2d pareciam ser mais efetivas do que a vacina tradicional com base na proteína ORF2 de PCV2a.

- Embora a proteção homóloga fosse melhor do que a proteção heteróloga, havia um nível claro de proteção cruzada contra os vírus de inoculação PCV2b e PCV2d, por todos os três genótipos de vacina testados: as vacinas de proteína ORF2 de PCV2a e PCV2d foram comparáveis em efeito protetor à sua menor dose contra a inoculação de PCV2b, enquanto a proteína ORV2 de PCV2a foi melhor na dose mais alta. No entanto, a vacina com base na proteína mutante ORF2 de PCV2b foi melhor que a proteína ORF2 de PCV2a contra a inoculação de PCV2d em ambas as doses.

Breve Descrição das Figuras Figura 1:

[0273] Digitalização de gel SDS-PAGE com amostras a partir de culturas de células de insetos que expressam diferentes proteínas ORF de PCV2 via infecção por baculovírus recombinantes.

[0274] Os números das faixas e uma indicação do teor da faixa são mostrados acima da imagem do gel.

- Faixas 1 e 18: Marcadores de peso molecular; indicações de pesos moleculares em kDa são indicados à esquerda da imagem.

- Faixas 2-5: células infectadas com o vírus 3; Faixa 2: sobrenadante; Faixas 3-5 grânulos celulares, respectivamente 30, 20 e 10 ul.

- Faixas 6 - 9: células infectadas com o vírus 6; Faixa 6: sobrenadante; Faixas 7 - 9 grânulos celulares, respectivamente 30, 20 e 10 ul.

- Faixas 10 - 13: células infectadas com o vírus 7; Faixa 10: sobrenadante; Faixas 11-13 grânulos celulares, respectivamente 30, 20 e 10 ul.

- Faixas 14 - 17: amostras de referência de proteína BSA, respectivamente: 0,25,0,5,1e 2 ug.

Figura 2:

[0275] Digitalização de gel SDS-PAGE com amostras a partir de culturas de células de insetos que expressam diferentes proteínas ORF de PCV2 via infecção por baculovírus recombinantes.

[0276] Os números das faixas e uma indicação do teor da faixa são mostrados acima da imagem do gel.

- Faixas 1 e 16: Marcadores de peso molecular; indicações de pesos moleculares em kDa são indicados à esquerda da imagem.

- Faixas 2-5: células infectadas com o vírus 8; Faixa 2: sobrenadante; Faixas 3-5 grânulos celulares, respectivamente 30, 20 e 10 ul.

- Faixas 6 - 9: células infectadas com o vírus 9; Faixa 6: sobrenadante; Faixas 7 - 9 grânulos celulares, respectivamente 30, 20 e 10 ul.

- Faixa 10: vazio - Faixas 11 - 15: amostras de referência de proteína BSA, respectivamente: 0,25, 0,5, 1, 2e 3 ug.

Figuras 3 e 4:

[0277] Representações gráficas dos resultados da imuno-histoquímica em diferentes tecidos de porcos que receberam uma inoculação infectada provocada com PCV2, após receberem uma vacina preparada a partir da proteína ORF2 de PCV2 expressa em células de inseto. Os resultados de tecido são apresentados para tonsilas, linfonodos mesentéricos ('Ln. Mes.) e linfonodos inguinais ('Ln. Ing.').

[0278] As várias vacinas aplicadas (ou não) são indicadas no eixo horizontal; o eixo vertical apresenta a pontuação arbitrária de intensidade de IHC de acordo com um grau de pontuação particular.

[0279] A Figura 3 representa os resultados de IHC para os animais nos grupos 1-7 do conjunto 1, recebendo uma inoculação infectada pelo vírus PCV2b virulento;

[0280] A Figura 4 representa os resultados de IHC para os animais nos grupos 1-7 do conjunto 2, nos quais os animais foram inoculados com o vírus PCV2d virulento.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Células de inseto compreendendo um ácido nucleico heterólogo compreendendo: a. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína ORF2 de circovírus porcino 2 de genótipo 2b (PCV2b), e b. uma sequência de controle de transcrição que é operacionalmente ligada à referida sequência de nucleotídeos, as células sendo caracterizadas pelo fato de que a sequência de nucleotídeos codifica uma proteína mutante ORF2 de PCV2b tendo uma prolina na posição do aminoácido número 131.

2. Células de inseto de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que a sequência de controle de transcrição é um promotor do gene p10 de baculovírus ou um promotor do gene da poliedrina de baculovírus.

3. Células de inseto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas pelo fato de que o ácido nucleico heterólogo está compreendido em um genoma de baculovírus recombinante.

4, Partículas semelhantes a vírus (VLPs) da proteína mutante ORF2 de PCV2b, caracterizadas pelo fato de que a proteína mutante ORF2 de PCV2b tem uma prolina na posição do aminoácido número 131.

5. Método para expressar uma proteína mutante ORF2 de PCV2b nas células de inseto definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o método sendo caracterizado pelo fato de que emprega o sistema de expressão de células de inseto-baculovírus.

6. Método para produção de uma proteína mutante ORF2 de PCV2b com uma prolina na posição do aminoácido número 131, o método sendo caracterizado pelo fato de que compreende uma ou ambas as etapas selecionadas a partir de:

- cultivar as células de inseto definidas em qualquer uma das reivindicações l1a3e - coletar a proteína mutante ORF2 de PCV2b da cultura de células de insetos.

7. Vacina para animais porcinos para redução de infecção por PCV2 ou de sinais associados à doença, a vacina compreendendo uma proteína mutante ORF2 de PCV2b em um veículo farmaceuticamente aceitável, a vacina sendo caracterizada pelo fato de que a proteína mutante ORF2 de PCV2b tem uma prolina na posição do aminoácido número 131.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a proteína mutante ORF2 de PCV2b está na forma de VLPs.

9. Vacina de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que compreende um adjuvante.

10. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que compreende um antígeno de um microrganismo patogênico para animais porcinos adicional.

11. Uso de proteína mutante ORF2 de PCV2b tendo uma prolina na posição do aminoácido número 131, o uso sendo caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para animais porcinos para redução de infecção por PCV2 ou de sinais associados à doença.

12. Proteína mutante ORF2 de PCV2b tendo uma prolina na posição do aminoácido número 131, caracterizada pelo fato de ser para uso em uma vacina para animais porcinos para redução de infecção por PCV2 ou de sinais associados à doença.

13. Processo para preparar uma vacina definida em qualquer uma das reivindicações 7 a 10, o processo sendo caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais etapas selecionadas a partir de:

- misturar a proteína mutante ORF2 de PCV2b tendo uma prolina na posição do aminoácido número 131 com um veículo farmaceuticamente aceitável; e - formular a referida mistura de proteína mutante ORF2 de PCV2b e veículo farmaceuticamente aceitável com um adjuvante.

14. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.