KR20200066700A - 곤충 세포에서의 pcv2b orf2 단백질의 재조합 발현 - Google Patents

곤충 세포에서의 pcv2b orf2 단백질의 재조합 발현 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수의학 백신, 특히 PCV2 및 연관 질환에 대한 돼지 백신의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 돌연변이가 곤충 세포에서의 발현 시 그의 핵 축적을 방지하기 위해 PCV2b ORF2 단백질에서 요구되고; 돌연변이가 아미노산 위치 131에 프롤린을 도입한다는 발견에 관한 것이다. 이는 곤충 세포에서의 효율적인 발현, 용이한 수확을 허용하고, 대량의 바이러스-유사 입자를 생성한다. VLP는 PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후의 감소를 위한 돼지용 백신에서 매우 효과적이다.

Description

곤충 세포에서의 PCV2B ORF2 단백질의 재조합 발현
본 발명은 수의학 백신, 특히 PCV2에 대한 돼지 백신의 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 발현하는 이종 핵산 서열을 포함하는 곤충 세포, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 바이러스-유사 입자, 곤충 세포 또는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 생산 또는 사용 방법, 및 돼지 동물용 백신에 관한 것이다.
돼지 서코바이러스 2 (PCV2)는 돼지 동물의 병원체이며, 이는 전세계적으로 발생하고 많은 동물의 고통 및 농업 부문에 심각한 경제적 손실을 초래한다. 검토를 위해 문헌 [Gillespie et al. (2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163)]을 참조한다.
PCV2는 서코비리다에(Circoviridae) 과에 속하며, 약 1.76 kb의 원형 단일 가닥 DNA 게놈을 함유하는 작은 (17 nm) 20면체 비-외피보유 비리온을 갖는다. 게놈은 단지 소수의 오픈 리딩 프레임을 함유하며, 이 중 ORF2는 주요 바이러스-중화 에피토프를 함유하는 바이러스 캡시드 단백질을 코딩한다.
PCV2는 상대적으로 안정하고 감염성이 강하다. 이는 상이한 종류의 신체-분비물을 통해 뿌려지고, 돼지 무리에서 수평 및 수직 둘 다로 확산될 수 있다. PCV2 감염에 의해 유발된 주요 병변은 림프구 고갈이며; 얻어진 면역억제는 또한 감염된 동물을 이차- 또는 공동 감염에 대해 민감하게 만든다. 결과적으로 PCV2는 총괄하여 돼지 서코바이러스 연관 질환 (PCVAD)이라고 불리는 수많은 돼지 질환 증후군에 관여된다. 가장 두드러진 PCVAD는 어린 돼지에서 관찰되는 "이유후 전신 소모성 증후군" (PMWS)이다. PMWS의 임상 징후 및 병리는 진행성 소모, 호흡곤란, 빈호흡, 및 때때로 황달 및 황달병을 포함한다. 다른 PCVAD는 하기와 같다: 돼지 호흡기 복합 질환, 돼지 피부염 신장병증 증후군, 생식기 부전, 육아종성 장염, 선천성 진전 및 삼출성 표피염. 검토를 위해, 문헌 [the Merck Veterinary Manual, 11th ed., 2016, ISBN: 9780911910933]; 및 ["Diseases of Swine", 10th ed., 2012, ISBN: 9780813822679]을 참조한다.
그러나, 이차 감염 없이, PCV2 감염된 돼지의 대부분은 겉보기에 건강한 돼지에서의 불량한 성장 및 성능을 제외하고는 질환의 명확한 임상 증상을 나타내지 않을 수 있다. PCV2에 의해 유발된 PCVAD의 (준-)임상 증상은 자돈이 젖을 떼고 보호성 모계 유래 항체가 감퇴하기 시작하는 시기인 생후 3 또는 4주령부터 돼지에서 대개 관찰될 수 있다.
PCV2 감염 및 그의 연관 질환 징후로부터 보호하기 위해, 여러 상업용 백신이 이용가능하고, 전 세계적으로 매우 많은 수의 백신이 사용되고 있다. 상이한 유형의 PCV2 백신은 예를 들어 불활성화된 전체 PCV2 바이러스 (서코백(Circovac)™, 메리알(Merial)) 또는 불활성화된 키메라 PCV1/PCV2 바이러스 (수백신(Suvaxyn)™ PCV, 포스테라(Fostera)™ PCV, 조에티스(Zoetis))를 기반으로 하는 백신이다. 그러나, 가장 흔한 것은 흔히 ORF2 단백질 (인겔백(Ingelvac)™ 서코플렉스(CircoFLEX), 베링거 인겔하임(Boehringer Ingelheim); 및: 서컴벤트(Circumvent)™ PCV, 포실리스(Porcilis)™ PCV, MSD AH)이라고 불리는 재조합 발현된 PCV2 캡시드 단백질을 기반으로 하는 서브유닛 백신이다. ORF2 단백질 서브유닛 백신은 재조합 발현 시스템에서의 PCV2 ORF2 유전자의 발현에 의해 통상적으로 생산되며; 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템이 가장 많이 사용된다. 발현된 ORF2 단백질은 바이러스-유사 입자 (VLP)로 자가-어셈블리되며, 이는 바이러스 게놈 함량이 결여되어 비-복제성이라는 점을 제외하고는 천연 PCV2 비리온과 유사하다. 이러한 PCV2 ORF2 VLP를 기반으로 하는 백신은 매우 안정하고, 아주반트와 함께 제형화되는 경우에 면역원성이 높고, PCV2 항체에 대한 혈청양성 여부에 관계 없이 모든 연령의 돼지에게 안전한 것으로 입증되었다. PCV2 ORF2 단백질을 기반으로 하는 백신의 전형적인 전체 용량은 2 ml/동물의 용량 부피 중 약 80 μg의 ORF2 단백질을 함유한다. 그러나, 이들 서브유닛 백신은 동물 용량당 약 20 마이크로그램의 ORF2에서 이미 효능이 있으며, EP 1.926.496을 참조한다. 또한, 이들은 단일 샷 백신으로 제공될 수 있고, 상이한 투여 경로, 예컨대 근육내 (IM), 피하 (SC) 또는 피내 (ID) 경로에 의해 제공될 수 있다.
종 PCV2 내에는 상이한 유전자형의 바이러스가 존재한다. 이들은 이들의 ORF2 유전자 사이의 유전적 거리에 의해 구별될 수 있고, 과거에는 다양한 명명 규칙이 사용되어 왔다. 그러나, 문헌 [Segales et al. (2008, Vet. Rec., vol. 162, p. 867-868)]에는 PCV2 유전자형을 결정하고 명명하기 위해 현재 준수되는 표준이 된 방법이 공개되어 있다. 현재 인식되고 있는 PCV2의 5종의 상이한 유전자형 중에서, 단지 3종이 현재 관련 기술분야에서 수의학적 관련성을 갖는다: PCV2a, PCV2b 및 PCV2d.
모든 상업용 PCV2 백신은 현재 PCV2a를 기반으로 하지만, 유전자형 PCV2b 및 2d가 관련 기술분야에서 유병률이 증가하고 있는 것으로 보인다. 검토를 위해 문헌 [Karuppannan & Opriessnig, 2017, Viruses, vol. 9, p. 9, doi: 10.3390/v9050099]을 참조한다. 이들 저자는 이들 유전자형 사이에 적절한 수준의 교차-보호가 있다고 결론을 내리지만, 유형-동종 백신을 적용하는 것이 일반적으로 바람직하다. 결과적으로, PCV2a 이외의 PCV2 유전자형에 대해서도 안전하고 저렴하고 효과적인 백신을 생산할 필요성이 관련 기술분야에 존재한다.
WO 2009/000459 (겐트 대학교(University Gent))에는 ORF2 단백질을 기반으로 하는 PCV2의 항원성- 또는 병원성 변이체를 확인하기 위한 진단법; 구체적으로 상기 목적에 유용한 방법 및 항체가 기재되어 있다. 2종의 PCV2b 균주로부터의 ORF2의 핵산 및 아미노산 서열이 기재되어 있다. 모노클로날 항체에 의한 인식의 프로파일을 변화시키기 위해 ORF2 단백질의 여러 돌연변이가 제안된다. 많은 제안된 돌연변이 중에서 하나는 아미노산 위치 131에서의 트레오닌의 프롤린으로의 돌연변이이다. 그러나, WO 2009/000459에는 PCV2a (Stoon 1010, 1121) 및 PCV2b (48285)의 비돌연변이된 (야생형) 균주의 혈청학적 테스팅만이 충분히 개시되어 있고, 곤충 세포에서의 야생형 PCV2a 균주 (Stoon 1010) 중 하나로부터의 비돌연변이된 ORF2의 발현만이 개시되어 있다.
후속적으로, 문헌 [Saha et al., 2012 (J. of Gen. Virol., vol. 93, p. 1548-1555)]에는 그 중에서도 돌연변이된 PCV2 게놈의 감염성 클론의 형질감염에 의한 PK-15 세포에서의 T131P 돌연변이를 갖는 PCV2a ORF2 단백질의 발현이 기재되어 있다.
WO 2010/068969 (벡토겐(Vectogen))에는 ORF2의 바이러스-벡터 전달에 의한 PCV2에 대한 백신접종 방법이 기재되어 있으며, 여기서 ORF2 단백질은 '핵 국재화 신호', 즉 ORF2의 N-말단 41개 아미노산을 대체하거나 제거함으로써 돌연변이되었다. 결과적으로 ORF2는 이어서 세포질에서 발현되거나, 벡터-감염 세포로부터 분비된다. 바람직한 바이러스 벡터는 돼지 아데노바이러스이다.
WO 2015/051099 (베링거 인겔하임)에는 PCV2b ORF2 코딩 서열에 돌연변이를 도입함으로써 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템에서의 PCV2b ORF2 단백질 및 그의 바이러스-유사 입자의 발현 수준을 증가시키는 방법이 기재되어 있다: 개시된 돌연변이는 아미노산 위치 63의 아르기닌의 치환, 바람직하게는 트레오닌으로의 치환이다. PCV2b ORF2의 아미노산 위치 131에서의 임의의 돌연변이에 대한 언급은 없으며, 곤충 세포에서의 이러한 단백질의 발현에 관한 어떠한 문제점에 대한 정보도 없다.
EP 17184630 (인터벳 인터내셔널 비.브이.(Intervet Int. BV))에는 PCV2 백신에서, PCV2b 유전자형의 ORF2 단백질이 동종 보호 뿐만 아니라 이종 유전자형 PCV2a 및 PCV2d에 대한 양호한 교차-보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다는 것이 개시되어 있다. 또한, 이러한 효과는 동물 용량당 20 μg 미만의 PCV2b ORF2 단백질의 매우 적은 양으로도 예상치 못하게 얻어졌다. 결과적으로, PCV2b ORF2 단백질의 저용량으로 돼지를 백신접종하여, PCV2의 모든 현재 균주에 대해 효과적인 면역보호를 제공하기에 충분할 것이다.
단백질의 재조합 발현을 위한 곤충 세포의 사용은 널리 공지되어 있으며, 상이한 방식으로 적용된다: 살아있는 곤충, 일차 곤충 세포, 또는 배양에서 불멸화된 곤충 세포주에서의 발현. 가장 많이 사용되는 곤충 세포는 인시류 기원의 세포, 예컨대 스포도프테라(Spodoptera) 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 속으로부터의 세포이다. 이들 세포의 사용은 종종 대중적인 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템의 맥락에서 이루어지며, 여기서 재조합 바큘로바이러스는 배양에서 인시류 세포를 감염시키는데 사용된다. 바큘로바이러스는 바이러스가 세포-배양에서 복제할 때 요구되지 않는 수많은 강한 프로모터를 함유하므로; 이들은 이종 유전자의 발현을 구동하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 곤충 세포에서의 PCV2 ORF2 단백질의 재조합 발현을 최적화하는 방법을 제공함으로써 선행 기술의 단점을 극복하고 관련 기술분야에서의 요구를 수용하는 것이다.
ORF2 단백질 서브유닛을 기반으로 하는 PCV2 백신의 제조를 조사할 때, 본 발명자들은 곤충 세포에서의 PCV2b 유전자형 바이러스 균주로부터의 ORF2 단백질의 재조합 발현이 PCV2a 유전자형의 ORF2 단백질만큼 간단하지 않다는 것을 발견하였다. 발현된 PCV2b ORF2 단백질은 그것이 발현된 곤충 세포의 핵에 자연적으로 축적되는 경향을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이러한 형태에서, PCV2b ORF2 단백질의 총 발현 수준은 많이 감소되었고, 단백질은 하류 프로세싱에 의해 수확하고 정제하기가 매우 어려운 것으로 입증되었으며; 공격적인 해리가 사용되었더라도, 오직 매우 적은 양의 ORF2 단백질만이 단리될 수 있었다. 또한, 단리될 수 있는 소량의 단백질에서, VLP의 양은 매우 적었으며; 명백히 핵 국재화는 ORF2 단백질이 VLP로 자가-어셈블리하는 것을 유의한 정도로 방지하였다. 결과적으로, 이러한 발현된 단백질의 면역원성은 많이 감소되었다.
놀랍게도, 매우 특이적인 아미노산 치환이 PCV2b의 ORF2 단백질에 도입된 경우, 곤충 세포에서의 발현 시 핵 축적이 크게 방지될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
특이적 아미노산 치환은 전장 PCV2b ORF2 단백질의 위치 131에서 천연적으로 발생하는 아미노산의 프롤린 아미노산으로의 변화를 수반하였다. 위치 131에 프롤린이 있는 경우, 발현된 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질 ("ORF2b-131P")의 대부분은 핵에 축적되는 대신에 곤충 세포의 세포질에서 발생하였다. 이는 총 발현 수준을 증가시킬 뿐만 아니라 이들 곤충 세포로부터 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 수확을 크게 용이하게 하는 것으로 밝혀졌으며; 이러한 세포질 상태에서, 영향이 적은 표준 단리 절차를 사용하여, 다량의 단백질을 용이하게 단리할 수 있었다. 또한, 대부분의 ORF2b-131P는 돼지 동물용 PCV2 백신에 매우 효과적인 VLP로 효과적으로 어셈블리되는 것으로 밝혀졌다.
이는 특히 PCV2a ORF2 단백질의 상황과 비교하여 예상치 못한 것이었다: PCV2b 바이러스로부터의 ORF2 단백질에서, 위치 131에서의 천연 아미노산은 전형적으로 트레오닌인 반면; PCV2a 바이러스에서, 일부는 131에 트레오닌을 갖고 일부는 프롤린을 갖는다. 그러나, 곤충 세포에서 발현될 때, PCV2a ORF2의 두 변이체 중 어느 것도 핵에 축적되지 않는다. 결과적으로, 이러한 특정한 아미노산 위치가 곤충 세포에서 발현될 때 PCV2b ORF2 단백질에 대해 관찰된 핵 축적의 원인일 것으로 의심되는 표시는 없었다.
곤충 세포에서의 발현 시 핵 축적을 또한 나타내는 PCV2d ORF2 단백질은 위치 131에서의 그의 천연 트레오닌의 프롤린으로의 치환 후 세포질 발현 패턴으로 되돌릴 수 없다는 것이 훨씬 더 주목할 만하였다.
명백히 곤충 세포에서의 PCV2 ORF2 단백질의 발현에 관한 상황은 유전자형 각각에 대해 독특하다.
131P로의 아미노산 치환이 어떻게 곤충 세포에서의 발현 시 핵에서의 PCV2b ORF2 단백질의 축적을 방지하는지는 알려져 있지 않다. 본 발명자들은 이들 발견을 설명할 수 있는 임의의 이론 또는 모델에 구속되기를 원하지 않지만, PCV2b 유전자형의 ORF2 단백질 내 이러한 특정한 위치에 프롤린 아미노산을 가짐으로써 이러한 ORF2 단백질의 특성의 변화를 유도한다고 추측한다. 변화는 예를 들어 ORF2 단백질의 3차원 폴딩 또는 소수성 프로파일에 영향을 줄 수 있으며, 이는 곤충 세포 내에서의 그의 라우팅에 영향을 줄 수 있다.
이러한 발견은 재조합-발현된 PCV2b ORF2 단백질의 이용가능성 및 항원성 품질을 개선시킴으로써 수많은 유리한 용도로의 길을 열어준다. 결과적으로, 이는 돼지 동물용 효과적인 PCV2 서브유닛 백신을 대규모로 편리하게 제조하는 것을 가능하게 하며; 그의 단리를 위해 공격적인 해리성 화합물 또는 복잡한 기술이 필요하지 않기 때문에, 발현된 단백질은 저렴하고 안전하고 효율적인 방식으로 생산될 수 있다.
이러한 방식으로, 본 발명의 하나 이상의 목적이 충족될 수 있고, 결과적으로 선행 기술의 하나 이상의 단점이 극복될 수 있다.
그러므로, 한 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 이종 핵산을 포함하는 곤충 세포로서:
a. 유전자형 2b의 돼지 서코바이러스 2 (PCV2b)로부터의 ORF2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
b. 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 제어 서열,
뉴클레오티드 서열이 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는
곤충 세포에 관한 것이다.
본 발명을 위해, "곤충 세포"는 곤충강의 유기체로부터 유래된 세포이다. 세포는 생존가능하고 (즉, 복제가능하고), 단백질을 발현할 수 있도록 충분히 무손상이다. 세포는 휴지기이거나 활동기일 수 있고, 세포 주기의 임의의 단계에 있을 수 있다. 곤충 세포는 상이한 방식으로 본 발명에 이용될 수 있다: 전체 곤충을 사용함으로써; 곤충의 추출물 또는 일부를 사용함으로써; 곤충으로부터 유래된 일차 세포를 사용함으로써; 곤충의 조직 또는 기관을 사용함으로써; 또는 불멸화된 곤충 세포주를 사용함으로써.
본 발명의 곤충 세포는 통상적으로 적합한 담체 중에 함유될 것이다. 이러한 담체는 곤충 세포의 생존율을 유지하는 조성물이며, 예를 들어 액체, 예컨대 완충 용액 또는 배양 배지이다. 전체 곤충의 사용의 맥락에서, 곤충 유기체의 신체 그 자체가 담체로서 기능한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포함하는" (뿐만 아니라 변형, 예컨대 "포함하다", "포함한다" 및 "포함된")은, 이러한 요소 또는 조합이 명시적으로 언급되지 않은 경우라 할지라도 이러한 용어가 사용되는 본문의 부분, 단락, 청구범위 등에 포괄되거나 거기에 포함되는 모든 요소, 및 본 발명에서 생각할 수 있는 임의의 가능한 조합을 지칭하고자 하는 것이며; 이러한 요소(들) 또는 조합 중 어떠한 것도 배제하고자 하는 것이 아니다.
그러므로 임의의 이러한 본문의 부분, 단락, 청구범위 등은 또한 하나 이상의 실시양태(들)와 관련될 수 있으며, 여기서 용어 "포함하는" (또는 그의 변형)은 "로 이루어지다", "로 이루어진", 또는 "로 본질적으로 이루어지다"와 같은 용어로 대체된다.
본 발명을 위해, 핵산이 세포가 유래된 모 곤충 세포의 핵산에 존재하지 않는 경우, 핵산은 이를 포함하는 곤충 세포에 대해 "이종"이다. 핵산은 임의의 유형, 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있다.
본 발명을 위한 이종 핵산은 상이한 방식으로, 예컨대 핵산, 가능하게는 담체 상의 핵산의 형질감염 또는 전기천공에 의해; 대안적으로 재조합 미생물, 예를 들어 바이러스에 의한 감염에 의해 본 발명에 따른 곤충 세포에 도입될 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 그의 전사 및/또는 번역이 단백질 발현을 유발하는 경우에 단백질을 "코딩하고 있다" 또는 유사한 "코딩한다"이다. 전형적으로, 단백질을 코딩할 수 있는 이러한 뉴클레오티드 서열은 오픈 리딩 프레임 (ORF)이라고 불리며, 이는 단백질의 번역을 조기에 종결시키는 원치 않는 정지 코돈이 존재하지 않음을 나타낸다. 이러한 뉴클레오티드 서열은 완전 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있거나, 단백질의 절편을 코딩하는, 예를 들어 단백질의 성숙 또는 분비된 형태만을 코딩하는, 즉 '리더', '앵커', 또는 '신호 서열'이 없는 유전자-단편일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 천연 또는 합성 기원일 수 있다.
본 발명을 위해, "단백질"은 아미노산의 분자 쇄이다. 단백질은 천연 또는 성숙 단백질, 프리- 또는 프로-단백질, 또는 단백질의 일부일 수 있다. 특히: 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드가 단백질의 정의 내에 포함된다.
본 발명을 위한 "ORF2" 단백질은 PCV의 게놈 상에 오픈 리딩 프레임 2 (ORF2)에 의해 또는 ORF2의 일부에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다. 전장 PCV2 ORF2 단백질은 통상적으로 길이가 233개 아미노산이고, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에서 테스팅되는 경우에 약 26 kDa의 상대 분자량을 나타낸다. 그러나, ORF2 단백질의 말단절단된 형태, 예를 들어 그의 N-말단 측면으로부터 30개 아미노산이 분실된 PCV2 ORF2 단백질의 말단절단된 형태가 널리 공지되어 있으며, 본 발명을 위해 유리하게 사용될 수 있다. ORF2 단백질은 또한 캡시드라고 불리며, 코딩 핵산 서열은 ORF2 유전자 또는 캡시드 유전자라고 불린다.
코딩 영역의 분석을 돕고 편리한 방식으로 이러한 정보를 나타낼 수 있는 컴퓨터-프로그램은 다양한 공급업체로부터 상업적으로 입수가능하다.
"돼지 서코바이러스 2" 또는 PCV2는 그의 분류학적 그룹-구성원의 특징화 특색, 예컨대 형태학적, 게놈 및 생화학적 특징, 뿐만 아니라 생물학적 특징, 예컨대 생리학적, 면역학적 또는 병리학적 거동을 갖는 해당 종의 서코바이러스를 지칭한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 특정한 종으로서 미생물의 분류는 이러한 특색의 조합을 기반으로 한다. 그러므로, 본 발명은 또한 이로부터 임의의 방식으로, 예를 들어 아종, 균주, 단리물, 유전자형, 변이체, 하위유형 또는 하위군 등으로서 하위분류된 PCV2를 포함한다.
본 발명을 위한 특정한 PCV2가 현재 해당 종으로 할당될 수 있지만, 새로운 통찰력으로 시간에 따라 변할 수 있는 분류학적 분류가 새로운 또는 상이한 분류학적 그룹으로 재분류에 이르게 할 수 있다는 것은 본 발명의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 그러나, 이것은 미생물 그 자체 또는 그의 항원성 레퍼토리를 변화시키지 않을 뿐만 아니라, 단지 과학적인 명칭 또는 분류일 뿐이므로, 이러한 재분류된 미생물은 본 발명의 범위 내에 남아있다.
본 발명에 사용하기 위한 PCV2는 다양한 공급원으로부터, 예를 들어 야생 또는 농장의 돼지, 또는 다양한 실험실, (보관소) 기관 또는 (수의학) 대학교로부터의 현장 단리물로서 얻어질 수 있다. 대안적으로, PCV2는 그의 게놈 핵산을 합성하고 및 이를 적절한 세포로 형질감염시킴으로써 디지털 서열 정보로부터 재구성될 수 있다.
PCV2의 유전자형 분석은 뉴클레오티드 서열을 비교함으로써 수행된다. 본 발명을 위해, "유전자형 2b의 PCV2", 또는 "PCV2b"는 문헌 [Segales et al. (2008, Vet. rec. vol. 162, p. 867-868)]의 방법을 사용하여 유전자형 그룹 b로 분류된 PCV2 바이러스이다. 이러한 방법은 PCV2 ORF2 유전자 사이의 P-거리, 즉 그들의 PCV2 ORF2 유전자의 총 뉴클레오티드 수당 2개의 PCV2 ORF2 유전자 사이에 상이한 뉴클레오티드의 비율에 기초한 PCV2 유전자형 분석을 적용한다. 문헌 [Segales et al.]에 의해 확인된 PCV2의 상이한 유전자형에 대한 컷-오프는 ORF2 P-거리가 0.035이며; P 차이가 더 작으면, 두 서열은 동일한 유전자형에 속한다.
본 발명을 위해, 유전자형 2b의 PCV2의 참조 바이러스는 균주 48285라고도 공지된 단리물 'Imp.1011'이며, 그에 대한 게놈 서열은 수탁 번호: AF055394로 진뱅크™에 공개되어 있다.
결과적으로, 상기 문헌 [Segales et al.]의 방법을 사용하여 계산된 균주 48285의 ORF2 유전자와 0.035 미만의 ORF2 유전자 P-거리를 갖는 임의의 PCV2 바이러스는 본 발명을 위한 PCV2b 바이러스이다.
그러나, 통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, PCV의 게놈이 단일 가닥이고 원형이기 때문에, ORF2 유전자의 코딩 영역은 특정한 선형 뉴클레오티드 서열로부터 즉시 명백하지 않을 수 있고, 뉴클레오티드 서열이 역전, 보완 및/또는 회전될 것을 요구할 수 있다. 예를 들어: 진뱅크 수탁 번호: AF055394에서의 PCV2b 균주 48285의 게놈 서열에서, ORF2 유전자는 뉴클레오티드 번호 314로부터 nt. 1로 선형 공개된 가닥 상에서 실행되고, nt. 1767로부터 최대 nt. 1383까지 계속되며; 함께 이는 ORF2 유전자의 699개 뉴클레오티드 (정지 코돈을 포함하지 않음)를 나타내고, 공개된 가닥의 이러한 영역에 대해 상보적인 가닥에 의해 코딩된다. 다시, 코딩 영역의 이러한 분석 및 제시는 상업적으로 입수가능한 컴퓨터-프로그램을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "PCV2 유전자형 2a" (PCV2a) 및 "PCV2 유전자형 2d" (PCV2d)에 유사한 접근법이 적용되며; PCV2a에 대한 참조 바이러스는 단리물 'Imp.1010' (또한 'Stoon 1010'이라고 공지됨), 수탁 번호: AF055392이며; PCV2d에 대한 참조 바이러스는 단리물 'S99-1542/3a', acc.nr.: JX512856이다.
바이러스를 PCV2 바이러스로서 확인하고, 그의 ORF2 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 균주 48285의 ORF2 유전자와 비교하여 P-거리를 계산하는 방법은 본 발명의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고 쉽게 이용가능하다.
"전사 제어 서열"은 제어 인자의 결합을 통해 하류 코딩 영역의 RNA로의 DNA의 전사를 개시하고 수행하기 위해 세포의 단백질-발현 기구를 유도하는 핵산의, 전형적으로 DNA에서의 기능적 영역이다. 이러한 전사 제어 영역 (TCR)은 또한 프로모터라고 지칭될 수 있고, 수많은 조절 영역, 예컨대 첫 번째 출발 코돈의 상류에 약 30-40개 뉴클레오티드에 위치된 '전사 출발 부위'를 통상적으로 함유한다. 다른 널리 공지된 보존 요소는 TATA 박스, CAAT 박스 및 GC 박스이다. TCR은 또한 시간, 지속기간, 조건 및 전사 수준에 영향을 줄 수 있는 결합 조절 인자에 관여되는 소위 인핸서를 포함할 수 있다.
결과적으로, 전사 (및 후속 번역)는 사용된 TCR 및 전체로서 유전적 구축물의 세부사항에 따라 일시적 또는 영구적 성질, 즉 일과성 또는 안정한 발현일 수 있다.
(이종) 유전자의 발현을 위한 TCR은 하류 코딩 영역의 전사를 효과적으로 구동할 수 있을 필요가 있다. 이는 유전자가 TCR의 '제어 하에' 있거나, 이에 의해 '구동되도록' TCR이 유전자에 "작동가능하게 연결된" 것을 통상적으로 말한다. 이는 TCR 및 코딩 영역이 동일한 분자에 효과적으로 근접하여 연결되어 있고 효과적인 전사를 개입하는 신호 또는 이들 사이에 서열이 없음을 통상적으로 의미한다.
용어 "돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질"은 발현된 PCV2b ORF2 단백질이 그 단백질의 야생형 버전과 동일하지 않지만, 돌연변이를 포함한다는 것을 나타내는 역할을 한다. 이러한 돌연변이는 생체내 또는 시험관내 기술을 사용하여 상이한 방식으로 도입될 수 있다. 그러나, 가장 효과적인 것은 박테리아 플라스미드에서 PCV2b ORF2 유전자를 서브클로닝하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 합성 프라이머를 사용하여 원하는 위치에 원하는 돌연변이를 도입하는 재조합 DNA 기술을 이용하는 것이다. 세부사항은 이하 실시예에 제공된다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 진뱅크 acc. nr. AF055394로부터의 모 PCV2b ORF2 유전자의 DNA 서열은, 아미노산 위치 131에 트레오닌을 코딩하는 야생형 뉴클레오티드 트리플렛: 5'- aca -3'이 프롤린을 코딩하는 트리플렛: 5'- ccc -3'으로 돌연변이되도록 조작되었다.
곤충 세포 및/또는 바큘로바이러스의 코딩 선호도를 잘 준수하도록 ORF2 유전자의 코돈-최적화에 의해 추가 조작이 적용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hooft van Iddekinge et al., 1983, Virology, vol. 131, p. 561-565]에 공개된 바와 같이, AcMNPV 바큘로바이러스로부터의 폴리헤드린 유전자의 코돈 선호도를 사용한다. 이종 발현을 위한 유전자의 코돈-최적화의 개념은 널리 공지되어 있으며; 전형적으로 이러한 돌연변이는 모두 침묵이며, 이는 이것이 코딩 뉴클레오티드 서열을 변화시키지만, 코딩된 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않음을 의미한다. 세부사항은 실시예에 제공된다.
코돈-최적화는 곤충 세포에서의 ORF2 단백질의 발현 수준을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 이는 또한 곤충 세포에서 발현될 때 야생형 PCV2b ORF2 단백질의 핵 국재화를 최소 정도로 변화시켰다. 그러나, 곤충 세포에서의 핵 축적의 실질적 방지는 프롤린에 의한 위치 131에서의 아미노산의 치환에 의해 PCV2b로부터의 ORF2 단백질에 대해서만 얻을 수 있었다.
본 발명을 위해, '야생형'은 야생에서 그의 천연 형태로 발생하는 (미생물) 유기체의 형태, 예를 들어: 인간 개입에 의해 변화되기 전의 모 유기체의 형태를 지칭한다.
본 발명을 위한 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 발현하는 이종 핵산의 생성, 구축 및 어셈블리는 클로닝, 형질감염, 재조합, 선택 및 증폭을 수반하는 널리 공지된 분자 생물학적 기술에 의해 수행될 수 있다. 이들 및 다른 기술은 문헌 [Sambrook & Russell: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773)]; [Ausubel et al., in: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc., NY, 2003, ISBN: 047150338X)]; [C. Dieffenbach & G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (CSHL Press, ISBN 0879696540)]; 및 ["PCR protocols", by: J. Bartlett and D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421)]과 같은 표준 교과서에 아주 상세히 설명되어 있다.
본 발명을 위해, 특정한 "아미노산 위치"는 해당 PCV2 유전자형에 대한 참조 균주로부터의 전장 ORF2 단백질의 아미노산 서열 내 아미노산의 넘버링을 기초로 하여 넘버링된다. PCV2b를 위해, 참조 균주는 48285이고, 그의 ORF2 단백질의 전장 아미노산 서열은 진뱅크에 수탁 번호 AAC35331로 공개되어 있다.
본 발명에 따른 곤충 세포는 ORF2b-131P를 발현할 수 있고; 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질 (대부분의 경우)은 더 이상 핵에 축적되지 않으나, 곤충 세포의 세포질 전반에 걸쳐 분산되어 있다. 그의 비돌연변이된 대응부와 비교하여 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 세포 위치에서의 이러한 차이는 다른 것들 중에서 면역-형광 기술을 사용하여 (광-)현미경 및 시각화에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 세부사항은 실시예 섹션에 제공된다.
ORF2b-131P 단백질의 핵 축적의 잔류 수준은 곤충 세포에서 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 발현하는데 사용되는 유전적 구축물에 의존하여 어느 정도 상이한 것으로 밝혀졌다: 백-투-백(Bac-to-Bac) 시스템을 사용하여 제조된 재조합 바큘로바이러스를 통한 발현은 일부 핵 축적, 예를 들어 야생형 PCV2b ORF2 단백질에 대해 관찰된 수준의 약 10%를 여전히 나타내었다. 그러나, 돌연변이체 단백질이 프로이지(ProEasy) 시스템을 통해 구축된 재조합 바큘로바이러스로부터 생산될 때, 검출가능한 핵 축적이 더 이상 관찰되지 않았다. 또한, 단백질 발현 수준은 백-투-백 재조합 바큘로바이러스에 의해 생산된 것보다 높았다.
이는 아마도 사용된 유전적 구축물의 구성으로부터 설명될 수 있다: 백-투-백 구축물로부터 제조된 재조합 바큘로바이러스는 그의 게놈에 트랜스퍼벡터의 발현 카세트로부터의 요소, 예컨대 트랜스포손 및 항생제 내성 유전자를 여전히 보유한다. 이들은 복제 및 발현 수준에 영향을 줄 수 있다. 그러나, 프로이지 재조합체는 이러한 추가적인 유전적 요소를 더 이상 보유하지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시양태 및 다른 측면의 세부사항은 하기 설명될 것이다.
한 실시양태에서, 돌연변이체 PCV2b Orf2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈 최적화되었다. 보다 바람직하게는, AcMNPV 바큘로바이러스의 폴리헤드린 유전자의 코돈 선호도와 매칭하도록 코돈 최적화되었다.
가장 바람직하게는, 돌연변이체 PCV2b Orf2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1이다. 이는 PCV2b 균주 48285의 ORF2 서열을 나타내며, 여기서 아미노산 위치 번호 131을 코딩하는 트리플렛은 프롤린을 코딩하는 5'- ccc -3'으로 돌연변이되었다. 또한, 코돈 사용은 AcMNPV 폴리헤드린 유전자의 코돈 선호도에 맞게 적합화되었다. 서열식별번호: 2는 서열식별번호: 1에 의해 코딩되는 ORF2b-131P 단백질 서열을 차례로 나열한다.
PCV2b ORF2 유전자에 적용된 돌연변이의 결과로서, 특히 코돈-최적화 때문에, 서열식별번호: 1 및 야생형 ORF2b 유전자인 AF055394의 상응하는 영역 사이의 뉴클레오티드 서열 동일성은 77.2%이다. 그러나, 코돈-최적화 돌연변이는 침묵이기 때문에, 서열식별번호: 2 및 AAC35331 (균주 48285로부터의 야생형 PCV2b ORF2 단백질의 아미노산 서열임) 사이의 아미노산 서열 동일성은 99.6%이며, 즉 위치 131에서의 아미노산만이 상이하다.
다양한 곤충으로부터의 세포의 사용은 널리 공지되어 있다. 이들 중 여러 개는 또한 바큘로바이러스로 감염될 수 있기 때문에 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템의 맥락에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., 2005, In vitro Cell. Dev. Biol. Anim., vol. 41, p. 43-49]을 참조한다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 곤충 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 곤충으로부터 유래된다: 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) (알팔파 자벌레), 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) (가을 거염벌레), 스포도프테라 엑시구아(Spodoptera exigua) (비트 거염벌레), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) (양배추 자벌레), 리만트리아 디스파르(Lymantria dispar) (매미나방), 봄빅스 모리(Bombyx mori) (누에), 안티카르시아 겜마탈리스(Anticarsia gemmatalis) (벨벳콩 모충(velvetbean caterpillar)), 헬리오티스 비레센스(Heliothis virescens) (회색담배나방), 헬리오티스 서브플렉사(Heliothis subflexa) (밤나방과 나방), 마메스트라 브라시카에(Mamestra brassicae) (도둑나방), 헬리코베르파 아르미게라(Helicoverpa armigera) (목화다래벌레), 헬리코베르파 제아(Helicoverpa zea) (왕담배나방), 아그로티스 입실론(Agrotis ipsilon) (검거세미밤나방), 아나그라파 팔시페라(Anagrapha falcifera) (셀러리 자벌레), 갈레리아 멜로넬라(Galleria mellonella) (꿀벌부채명나방), 라키플루시아 오우(Rachiplusia ou) (회색 자벌레), 플루텔라 크실로스텔라(Plutella xylostella) (배추좀나방), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) (과실 파리), 및 아에데스 아에깁티(Aedes aegypti) (모기).
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 곤충 세포는 인시목(Lepidoptera); 보다 바람직하게는 밤나방과(Noctuidae); 훨씬 더 바람직하게는 스포도프테라 또는 트리코플루시아 속 중 하나로부터의 곤충으로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 곤충 세포는 스포도프테라 프루기페르다 종의 곤충으로부터 유래된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 곤충 세포는 트리코플루시아 니 종의 곤충으로부터 유래된다.
이종 단백질 발현을 위해 완전한 곤충을 번식시키는 것이 공지되어 있고 실현가능하며, 이러한 방식으로 본 발명에 따른 곤충 세포를 적용한다. 그러나, 불멸화된 곤충 세포주 형태의 곤충 세포를 사용하는 것이 더 편리할 것이며, 이는 제어된 조건 하에서 더 유연한 생산 및 규모 확대를 가능하게 할 것이기 때문이다. 그 후, 이러한 확립된 곤충 세포주는 본원에 기재된 통상적인 방법을 사용하여 본 발명에 따른 곤충 세포를 구축하는데 사용될 수 있다.
이러한 용도에 적합한 널리 공지된 곤충 세포주는, 둘 다 에스. 프루기페르다(S. frugiperda)로부터 유래된 Sf9 및 Sf21; 티. 니(T. ni)로부터 유래된 하이 파이브(High Five)™ (Hi-5); 비. 모리(B. mori)로부터 유래된 Bm5; 및 엘. 디스파르(L. dispar)로부터 유래된 Ld652Y 및 LdEIta이다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 곤충 세포는 Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y 및 LdEIta로 이루어진 군으로부터 선택된 곤충 세포주의 세포, 또는 이들 중 하나로부터 유래된 세포주로부터 제조된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 곤충 세포는 Sf9 또는 Sf21의 곤충 세포주로부터 제조된다.
곤충 세포주 배양을 위한 절차, 장비 및 재료는 널리 공지되어 있으며, 임의의 원하는 규모로, 예를 들어 5 ml 내지 5000 리터로 적용될 수 있다. 특히 특수화된 곤충 세포 배양 배지, 예를 들어: Sf-900™ (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)); 엑스-셀(Ex-Cell)™ 400 시리즈 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich)); 및 인섹트-엑스프레스(Insect-XPRESS)™ (론자(Lonza))가 이용가능하다.
이들 배지의 특징에 따라, 이는 특정 백분율의 혈청, 예컨대 소 태아 혈청의 첨가를 필요로 하거나, 혈청-무함유로 사용될 수 있다. 추가 첨가제, 예컨대 글루타민, 항생제, 소포제 등이 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 곤충 세포가 본 발명을 위한 이종 핵산을 포함할 수 있는 여러 방법이 있으며, 한 예는 곤충 세포의 게놈에서의 안정한 통합에 의한 것이다. 게놈 통합을 달성하는 방법은, 예를 들어, 무작위 삽입, 예컨대 트랜스포손 기술, 또는 예를 들어 동종 재조합 또는 CRISPR-Cas 기술을 사용한 지정된 삽입에 의한 것이다.
대안적으로, 곤충 세포는 그 자체가 담체, 예컨대 플라스미드 상에 존재할 수 있는 이종 핵산으로 화학적 (예를 들어, 리포펙틴(Lipofectin)™) 또는 물리적 (예를 들어, 전기천공) 수단에 의해 형질감염될 수 있다. 이종 핵산은 곤충 세포에 의해 일과성으로 또는 안정적으로 발현될 수 있다.
그러나, 이러한 이종 핵산을 본 발명에 따른 곤충 세포에 도입하는 바람직한 방법은 재조합 바큘로바이러스의 사용에 의한 것이다. 이러한 바큘로바이러스는 예를 들어 그의 바이러스 게놈에 안정적으로 통합되고 강한 바큘로바이러스 프로모터, 예컨대 매우 늦은 유전자 p10 또는 폴리헤드린의 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 이종 유전자를 함유할 것이다.
그러므로, 본 발명에 따른 곤충 세포의 한 실시양태에서, 전사 제어 서열은 바큘로바이러스 p10 유전자 프로모터 또는 바큘로바이러스 폴리헤드린 유전자 프로모터이다.
다음으로, 재조합 바큘로바이러스가 곤충 세포에 진입하게 하고; 이는 예를 들어 재조합 바큘로바이러스의 게놈의 형질감염에 의해 수동적으로, 또는 감염성 재조합 바큘로바이러스에 의한 감수성 곤충 세포의 감염에 의해 능동적으로 수행될 수 있다. 또한, 이어서 곤충 세포는 그 안에 재조합 바큘로바이러스 또는 그의 게놈을 포함함으로써 본 발명을 위한 이종 핵산을 포함할 것이다. 본 발명을 위해, "세포 내부"는 단순히 곤충 세포의 세포막의 내부 측면, 예를 들어 세포질에 있는 재조합 바큘로바이러스 게놈의 위치를 지칭한다.
곤충 세포 내부에서, 재조합 바큘로바이러스 또는 그의 게놈이 복제되어, 곤충 세포에서의 이종 유전자의 발현을 초래할 것이다. 그 후, 이종 발현 산물이 곤충 세포 또는 세포의 환경, 예컨대 세포의 배양 배지로부터 수확될 수 있다.
그러므로, 본 발명에 따른 곤충 세포의 한 실시양태에서, 이종 핵산은 재조합 바큘로바이러스 게놈에 포함된다.
"바큘로바이러스"는 바큘로비리다에(Baculoviridae) 과의 구성원; 바람직하게는 알파바큘로바이러스(Alphabaculovirus) 속의 구성원이다.
본 발명을 위한 바큘로바이러스는 이종 핵산을 포함하기 위해 그의 야생형 형태와 비교하여 인간 개입에 의해 변경된 경우에 "재조합"이다. 바람직하게는, 이러한 재조합 바큘로바이러스는 유전자 조작 방법에 의해 생성된다.
통상의 기술자가 이해하는 바와 같이, 특정한 배양 용기 내 또는 배양 플레이트의 웰 내 본 발명에 따른 곤충 세포를 고려할 때, 본 발명을 위한 이종 핵산을 실제로 포함하는 세포의 수는 동적일 것이다. 이는 수많은 생물학적 이유, 예컨대 세포의 생활주기 상태 또는 감염 또는 형질감염의 수준 때문이다. 이종 핵산을 포함하고 발현하는 가능한 많은 세포를 갖는 것이 바람직하지만, 특정 시점에, 해당 군의 개별 곤충 세포 각각 및 모두가 이종 핵산을 포함할 필요는 없다.
이종 단백질의 발현을 위한 곤충 세포 및 재조합 바큘로바이러스의 조합된 사용은 통상적으로 '바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템'이라고 지칭된다. 이러한 시스템에 대한 논문, 교과서 및 검토의 예는 문헌 [Luckow et al., 1988, Bio-technology, vol. 6, p. 47]; [Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual by David R. O'Reilly, Oxford University press, 1993, ISBN: 0716770172]; [The Baculovirus Expression System: A laboratory guide, ed. King & Possee, 1992, ISBN: 9401050473]이며; 검토는 문헌 [van Oers et al., 2015, J. of Gen. Virology, vol. 96, p. 6-23]이다.
바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템을 사용하는 효율적인 발현은 실험실 규모부터 매우 큰 산업 규모 생산에 적용될 수 있다. 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템이 공지된 30년 동안 다양한 기원의 이종 유전자가 발현되었으며, 이러한 기술을 적용하기 위한 많은 도구가 상업적으로 입수가능하다.
여러 바큘로바이러스 종은 곤충 세포에서의 이종 단백질의 발현을 위한 편리한 벡터로서 사용되어 왔다. 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템에 사용된 바큘로바이러스의 예는 아우토그라파 칼리포르니카 (알팔파 자벌레)의 (멀티캡시드) 뉴클레오폴리헤드로바이러스: AcMNPV, 또는 봄빅스 모리의 뉴클레오폴리헤드로바이러스: BmNPV이다.
본 발명을 위한 이종 핵산을 포함하는 재조합 바큘로바이러스의 한 실시양태에서, 상기 바큘로바이러스는 AcMNPV 또는 BmNPV이다.
본 발명에 사용하기 위한 재조합 바큘로바이러스를 효율적으로 생성하고 선택하기 위한 많은 도구 및 키트가 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어: 백-투-백™ (써모 피셔 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월섬); 프로이지™ (에이비 벡터(AB Vector), 미국 캘리포니아주 샌디에고); 및 플래쉬백(flashBAC)™ (옥스포드 익스프레션 테크놀로지스(Oxford Expression Technologies), 영국 옥스포드).
복제- 및 단백질 발현 수준을 최적화하기 위해, 본 발명을 위한 이종 핵산을 포함하는 재조합 바큘로바이러스는 물론 이종 핵산의 삽입, 및 삽입 로커스에서의 후속 붕괴 또는 결실을 제외하고는 야생형 바큘로바이러스에 가능한 한 근접한 것이 바람직하다. 실제로, 재조합 바큘로바이러스는 바람직하게는 그의 게놈에 재조합 프로세스로부터의 추가적인 유전적 요소, 예를 들어 요소, 예컨대: 태그, 표지, 마커-유전자, 트랜스포손 요소, 항생제 내성 유전자 등을 함유하지 않는 것을 의미한다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명을 위한 이종 핵산을 포함하는 재조합 바큘로바이러스는 그의 게놈에 재조합 프로세스로부터의 추가 유전적 요소를 함유하지 않는다.
바람직한 실시양태에서, 재조합 바큘로바이러스는 재조합 바큘로바이러스의 구축을 위해 사용된 트랜스퍼벡터로부터의 항생제 내성 유전자를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 곤충 세포의 한 실시양태에서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나, 그 초과 또는 모든 조건이 적용된다:
- 돌연변이체 PCV2b Orf2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화되었으며; 보다 바람직하게는 AcMNPV 바큘로바이러스의 폴리헤드린 유전자의 코돈 선호도와 매칭하도록 코돈 최적화되었음;
- 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열식별번호: 1임;
- 본 발명에 따른 곤충 세포는 인시목; 보다 바람직하게는 밤나방과; 훨씬 더 바람직하게는 스포도프테라 또는 트리코플루시아 속 중 하나로부터의 곤충으로부터 유래됨;
- 본 발명에 따른 곤충 세포는 스포도프테라 프루기페르다 종의 곤충으로부터 유래됨;
- 본 발명에 따른 곤충 세포는 트리코플루시아 니 종의 곤충으로부터 유래됨;
- 본 발명에 따른 곤충 세포는 Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y 및 LdEIta로 이루어진 군으로부터 선택된 곤충 세포주의 세포, 또는 이들 중 하나로부터 유래된 세포주로부터 제조됨;
- 본 발명에 따른 곤충 세포는 Sf9 또는 Sf21의 곤충 세포주로부터 제조됨;
- 전사 제어 서열은 바큘로바이러스 p10 유전자 프로모터 또는 바큘로바이러스 폴리헤드린 유전자 프로모터임;
- 이종 핵산은 곤충 세포 내부에 있는 재조합 바큘로바이러스 게놈에 포함됨;
- 본 발명을 위한 이종 핵산을 포함하는 재조합 바큘로바이러스는 AcMNPV 또는 BmNPV임; 및
- 본 발명을 위한 이종 핵산을 포함하는 재조합 바큘로바이러스는 그의 게놈에 재조합 프로세스로부터의 추가 유전적 요소를 함유하지 않음.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명에 대해 기재된 바와 같은 PCV2b ORF2 단백질에 대한 돌연변이는 본 발명에 따른 곤충 세포로부터의 ORF2b-131P 단백질의 발현이 증가되게 한다. 특히, 이는 PCV2b ORF2 단백질을 포함하는 VLP가 이러한 돌연변이 없이 가능한 한 훨씬 더 많은 정도로 생성되게 한다.
그러므로, 추가 측면에서, 본 발명은 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질이 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 것을 특징으로 하는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 바이러스-유사 입자 (VLP)에 관한 것이다.
ORF2b-131P 단백질의 VLP를 특징화하고 사용하기 위한 재료 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
바람직하게는, 곤충 세포에서의 본 발명을 위한 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 발현은 상기 기재된 바와 같은 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템의 사용에 의해 달성된다.
그러므로, 추가 측면에서, 본 발명은 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템의 사용을 이용하는, 본 발명에 따른 곤충 세포에서의 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 발현 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명을 위한 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 발현을 위해 사용되는 본 발명에 따른 곤충 세포가 곤충 세포주의 세포인 경우, 이는 표준 세포-배양 장비를 사용하여 편리하게 배양될 수 있으며, 이는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 발현을 유발한다. 곤충 세포-배양 장비는 임의의 규모로 이용가능하며; 적절한 온도에서 인큐베이션 캐비넷에 위치된 간단한 T-플라스크 또는 스피너 플라스크로부터; 프로세스 파라미터, 예컨대 온도, pH 및 용존 산소의 자동화 제어로 가열 맨틀, 교반기 및 스파저가 장착된 대규모 산업용 발효기까지 모든 방식으로 이용가능하다.
본 발명에 따른 곤충 세포의 배양 후, 발현된 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질이 추가 사용을 위해 곤충 세포 배양물로부터 수확된다. 배양과 마찬가지로, 이러한 수확은 관련 기술분야에 널리 공지된 표준 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 필요한 경우, 배양물은 물리적 (예를 들어, 열, 조사) 또는 화학적 (예를 들어, 브로모-에틸렌이민 (BEI)) 수단에 의해 먼저 불활성화 (즉, 멸균)될 수 있다.
사용된 곤충 세포의 특징 및 적용된 발현 유형에 따라, 발현된 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질은 곤충 세포 내부 또는 그의 막에 축적되거나, 세포 밖으로 분비된다. 능동적으로 분비되지 않더라도, 단백질은 세포가 파열될 때 세포의 배양 배지에서 어느 정도까지 종결될 수 있다.
그 후, 발현된 단백질의 수확 방법은 하기와 같이 선택될 수 있다:
발현된 단백질이 배양 배지에 주로 존재하는 경우, 이는 예를 들어 배양물의 원심분리 후 상등액으로서 수확될 수 있다. 그 후, 배양 부피의 벌크는, 예를 들어 농축을 사용하여, 편리하게 관련 기술분야에 널리 공지된 일부 한외여과 방법에 의해 원하는 정도로 감소될 수 있다.
단백질이 세포에 주로 존재하는 경우, 이들은 예를 들어 배양물의 원심분리 및 세포-펠릿의 더 작은 부피로의 재현탁에 의해 배양 부피의 벌크로부터 단리될 수 있다. 다음으로, 세포는 대략 침습적 기술을 사용하여 붕괴될 수 있다.
다음으로, 발현된 단백질은 일부 추출 및/또는 정제 방법을 사용하여 수득될 수 있다.
이 모든 것은 널리 공지된 방법 및 재료만을 사용하여 통상의 기술자에 의해 수행될 수 있다.
그러므로, 추가 측면에서, 본 발명은 하기로부터 선택된 하나의 단계 또는 둘 다의 단계를 포함하는, 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 생산 방법에 관한 것이다:
- 본 발명에 따른 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
- 곤충 세포 배양물로부터 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 수확하는 단계.
본 발명의 특히 유리한 결과는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질이 그것이 발현되는 곤충 세포의 핵에 더 이상 축적되지 않는다는 것이다. 이는 총 발현 수준을 증가시켰을 뿐만 아니라, 이들 곤충 세포로부터 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 수확을 크게 용이하게 하였다. 이는 이러한 세포질 상태에서 매우 영향이 적은 표준 단리 절차를 사용하여, 상대적으로 많은 양의 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 수득할 수 있기 때문이다. 또한, 대부분의 ORF2b-131P가 VLP로 효과적으로 어셈블리한 것으로 밝혀졌기 때문에, 수확된 단백질은 우수한 면역학적 품질을 가졌다.
보다 구체적으로, 실질적인 양으로 비돌연변이된 PCV2b ORF2 단백질을 수확하는 것은 화학물질, 예컨대 세제 또는 카오트로픽제, 예를 들어 SDS, 우레아, 데옥시콜레이트, 또는 구아니딘-HCl 등의 사용에 의한 추출을 필요로 할 것이다. 후속적으로, 이들은 다시 제거될 필요가 있을 것이다. 이러한 공격적인 화학물질을 대규모로 사용하는 것은 물론 바람직하지 않다.
그러나, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 수확은 예를 들어 곤충 세포의 초음파처리 또는 동결-해동을 적용함으로써 화학물질의 사용 없이 안전하고 편리하며 매우 온화한 기술에 의해 달성될 수 있다.
그러므로, 본 발명에 따른 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 생산 방법의 한 실시양태에서, 곤충 세포 배양물로부터 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 수확하는 단계는 세제 또는 카오트로픽제를 이용하지 않는다.
한 실시양태에서, 수확하는 것은 곤충 세포의 용해를 위한 화학적 방법이 아닌 물리적 방법을 이용하며; 세포-용해의 물리적 방법의 예는 초음파처리, 동결-해동 및 프렌치 프레스이다.
본 발명을 위해, 곤충 세포의 '배양' 또는 유사한 '배양하는 것'은 세포가 성장하고 분열하고 이종 삽입물을 발현할 수 있게 하는 적절한 조건 하에 곤충 세포를 인큐베이션하는 것을 지칭한다.
곤충 세포의 이러한 배양은 전형적으로 적절한 세포-배양 배지 및 편리한 장비의 사용을 수반할 것이며; 모두는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, 스포도프테라 또는 트리코플루시아 속의 곤충으로부터의 세포주의 배양물은 통상적으로 호기성 조건 하에 단층 또는 현탁액 중에서 26-28℃에서 배양된다.
실제 조건 하에, 깨끗한 곤충 세포의 생성을 위한 별도의 배양 용기를 감염될 또는 형질감염될 곤충 세포의 배양에 사용된 장비로부터 깨끗하게 유지하게 하는 것이 편리할 것이다. 통상적으로, 곤충 세포는 마스터 세포-스톡 및 작업 세포-스톡으로서 제조된다. 이러한 접근법은 제약 사용을 위한 재조합 단백질의 제조에 필요한 품질 제어 수준을 허용한다.
본 발명에 따른 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 생산 방법의 한 실시양태에서, 생산된 단백질은 VLP 형태이다.
본 발명에 따른 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 제조 방법을 적용함으로써, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질은 PCV2 또는 연관 질환 징후에 대한 백신을 제조하기에 충분한 양 및 요구되는 면역학적 효능으로 제조될 수 있다.
그러므로, 추가 측면에서, 본 발명은 제약상 허용가능한 담체 중 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 포함하는, PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후의 감소를 위한 돼지 동물용 백신으로서, 상기 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질이 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 것을 특징으로 하는 백신에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 유전자형 2a, 2b 및/또는 2d의 PCV2에 의한 감염의 감소를 위한 것이다.
보다 바람직하게는, 백신은 PCV2b에 의한 감염의 감소를 위한 것이다.
"백신"은 제약상 허용가능한 담체 중 면역학적으로 활성인 화합물을 포함하는 조성물인 것으로 널리 공지되어 있다. '면역학적으로 활성인 화합물'은 -'항원' 형태인 경우에- 접종된 표적의 면역 시스템에 의해 인식되어 면역학적 반응을 유도할 것이다. 반응은 선천성 또는 후천성 면역 시스템으로부터 기원할 수 있으며, 세포성 및/또는 체액성 유형의 것일 수 있다.
본 발명을 위해, "돼지"는 수이다에(Suidae) 과의 동물, 및 바람직하게는 수스(Sus) 속의 동물, 예를 들어 야생 또는 가축 돼지, 멧돼지, 바비루사 또는 워트호그를 지칭한다. 이는 또한 그의 성별 또는 연령을 지칭하는 임의의 명칭으로 표시되는 돼지, 예컨대 경산돈, 종모돈, 비육돈, 미경산돈, 이유자돈 또는 자돈을 포함한다.
본 발명에 따른 백신은 표적 동물에서 PCV2에 의한 증식성 감염의 확립 또는 증식을 예방 또는 감소시키는 것을 지칭하는 "PCV2에 의한 감염의 감소"를 제공할 수 있다. 이는 예를 들어 바이러스 로드를 감소시키거나 바이러스 복제 기간을 단축시킴으로써 달성된다. 결과적으로, 이는 표적 동물에서 바이러스 감염에 의해 유발된 병변 및 질환의 결과적인 임상 징후의 수, 강도 또는 중증도의 감소를 야기한다. 이러한 백신은 구어체로 PCV2'에 대한' 백신 또는 'PCV2 백신'이라고 지칭된다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 PCV2 바이러스 혈증의 예방에서의 보조, 및/또는 감염된 동물에 의한 PCV2의 흘림의 예방에서의 보조로서 작용한다.
PCV2에 의한 감염에 대한 백신 효능 이외에, 본 발명에 따른 백신은 또한 이차 또는 공동 질환으로서 발생할 수 있는 돼지 서코바이러스 연관 질환 (PCVAD)을 지칭하는 "연관 질환 징후의 ... 감소"를 제공할 수 있다. PCV2와 마찬가지로, 본 발명에 따른 백신은 이러한 PCVAD의 증상 또는 결과의 중증도 및/또는 지속기간의 감소를 제공할 수 있다.
PCV2 백신은 PCV2 바이러스 복제 및 확산을 감소시킨다. 이는 혈액, 폐 및 림프 조직 (예를 들어, 편도, 비장 및 림프절)에서 PCV2 바이러스 로드를 감소시키고, 림프구 고갈, 감염 확산 및 PCV2 연관 질환으로부터 보호한다. 결과적으로, 이는 파라미터: 감소된 사망률, 우수한 평균 매일 체중 증가, 개선된 사료 전환율, 및 개선된 생식 수율 중 하나 이상에서 반영된 바와 같이 백신접종된 돼지 무리에서 일반 건강 및 성능을 회복시킨다.
PCV2 백신의 유효성의 일반적인 결정은 일반 개업의의 기술 내에 있다. 이는 예를 들어 백신접종 후 면역학적 반응을 모니터링함으로써, 또는 챌린지 감염 후 임상 증상의 출현 또는 사망률을 테스팅함으로써, 예를 들어 표적의 질환 징후, 임상 점수, 혈청학적 파라미터의 모니터링에 의해, 또는 챌린지 병원체의 재단리에 의해, 및 이들 결과를 모의 백신접종된 동물에서 나타나는 백신접종-챌린지 반응과 바교함으로써 수행될 수 있다. 구체적으로, 백신 효능 및 보호는 PCV2-특이적 항체 수준의 혈청학적 결정에 의해; 혈청 내 또는 동물 분비물 (구강, 비강, 대변, 소변) 내 바이러스 검출에 의해; 또는 PCR, (면역-)조직학, 혼성화를 통해 또는 혈청학적으로 PCVAD에 관여된 다른 병원체를 검출함으로써 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 PCV2 백신의 경우, 효능은 바람직하게는 백신접종된 그룹 대 비백신접종된 그룹에서 PCV2 감염의 감소 수준을 평가함으로써 결정되며, 여기서 이러한 감염은 예를 들어 현장 조건 하에 자연적으로 획득될 수 있거나, 예를 들어 실험 조건 하에 챌린지로부터 의도적으로 얻어질 수 있다.
사용된 아주반트의 유형에 따라, PCV2 백신 효능은 체액성 또는 세포성 면역에 더 기초할 수 있다. 유도된 항체 역가는 예를 들어 많은 상업적으로 입수가능한 PCV 특이적 ELISA 키트 중 하나를 사용하여 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 백신의 다양한 실시양태, 선호도 및 예가 하기에 요약될 것이다.
아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 포함하는 본 발명에 따른 백신의 한 실시양태에서, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질은 바이러스-유사 입자의 형태이다.
전형적으로, 백신은 항원을 포함하는 "제약상 허용가능한 담체"를 포함하며, (심각한) 유해 효과를 유발하지 않으면서 백신의 제조, 적용 또는 보존을 도울 수 있다. 이러한 담체는 수용액, 예를 들어 완충액 또는 배양 배지일 수 있다.
본 발명에 따른 백신을 위한 바람직한 제약상 허용가능한 담체는 곤충 세포 배양 배지, 포스페이트-완충 염수 (PBS), 또는 이들의 조합이다.
또한, 제약상 허용가능한 담체는 추가 첨가제 및 부형제, 예컨대 충전제, 안정화제, 보존제, 계면활성제 또는 아주반트를 포함할 수 있다. 세부사항 및 예는, 예를 들어 편람, 예컨대 문헌 ["Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472)], 및 ["Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)]에 기재된 바와 같이 널리 공지되어 있다.
또한, 본 발명에 따른 백신은 아주반트를 포함할 수 있다. 특히 이러한 서브유닛 백신의 경우, 이는 서브유닛 항원에 대한 표적의 면역 반응을 유의하게 증가시킬 수 있다.
그러므로, 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 아주반트를 포함한다.
"아주반트"는 표적의 면역 반응을 비-특이적 방식으로 자극하는 널리 공지된 백신 성분이다. 많은 상이한 아주반트가 관련 기술분야에 공지되어 있다. 아주반트의 예는 하기와 같다: 프로인트 완전 및 불완전 아주반트, 비타민 E 또는 알파-토코페롤, 비-이온성 블록 폴리머 및 폴리아민, 예컨대 덱스트란 술페이트, 카르보폴(Carbopol)™, 피란, 사포닌, 예컨대 퀼 A(Quil A)™, 또는 Q-vac™. 사포닌 및 백신 구성성분은 ISCOM™에 조합될 수 있다.
또한, 펩티드, 예컨대 뮤라밀디펩티드, 디메틸글리신, 터프트신, 및 미네랄 오일, 예를 들어 베이올(Bayol)™, 드라케올(Drakeol)™, 클레아롤(Klearol)™, 또는 마르콜(Marcol)™, 몬타니드(Montanide)™ 또는 경질 미네랄 (파라핀) 오일; 비-미네랄 오일, 예컨대 스쿠알렌, 스쿠알란; 식물성 오일 또는 그의 유도체, 예를 들어 에틸-올레에이트는 종종 아주반트로서 사용된다. 또한, 조합 제품, 예컨대 ISA™ (세픽(Seppic)), 또는 딜루백포르테(DiluvacForte)™ 및 엑스솔브(Xsolve)™ (둘 다 엠에스디 애니멀 헬스(MSD Animal Health))가 유리하게 사용될 수 있다. 추가 옵션은 EP 16206789에 개시된 바와 같은 SVEA 아주반트 (스쿠알란 및 비타민 E-아세테이트 포함)의 사용이다.
아주반트 및 그의 용도 및 효과에 대한 편람은 "백신 아주반트" (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355)이다.
아주반트는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질에 대한 면역반응을 증진시키기 위해 본 발명에 따른 백신의 상이한 제형에 사용될 수 있다. 예를 들어, 아주반트가 유성 물질인 경우, 유성 상은 항원을 천천히 방출함으로써 백신접종된 동물에서 데포 효과를 제공하여, 이에 의해 표적의 면역 시스템의 연장된 자극을 제공할 수 있다.
유성 물질은 ORF2 단백질을 포함하는 수성 상과 상이한 방식으로 조합될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 수성 상 및 유성 상의 에멀젼으로서 제형화될 수 있으며; 바람직하게는, 에멀젼은 유중수 (w/o), 수중유 (o/w), 수중유중수 (w/o/w) 유형이거나, 이중 오일-에멀젼이다.
오일로 아주반트 첨가되고 수중유 에멀젼으로서 제형화된 본 발명에 따른 백신이 보다 바람직하다. 이러한 백신은 수성 상으로부터의 직접적인 면역 자극 및 유성 상의 데포 효과로부터의 연장된 면역 자극 둘 다의 특성을 유리하게 나타낸다.
그러므로, 본 발명에 따른 백신의 한 실시양태에서, 백신은 수중유 에멀젼으로서 제형화된다.
임의의 원하는 규모로 아주반트 첨가된 백신 에멀젼을 제조하기 위한 방법 및 장비는 예를 들어 장비, 예컨대 실버슨(Silverson), 울트라 투락스(Ultra Turrax)™, 디스팍스(Dispax) 반응기 (IKA), 또는 마이크로플루이다이져(Microfluidiser) (마이크로플루이딕스(Microfluidics))를 사용하여 균질화용으로 상업적으로 입수가능하다.
본 발명에 따른 백신의 수중유 에멀젼은 바람직하게는 매우 작은, 바람직하게는 1 마이크로미터 미만인 분산된 상의 입자 크기를 가지며; 이러한 에멀젼은 통상적으로 "서브마이크로미터 에멀젼"이라고 불린다.
본 발명에 따른 백신의 수중유 에멀젼의 한 실시양태에서, 에멀젼은 서브마이크로미터 에멀젼이다.
본 발명에 따른 백신의 한 실시양태에서, 아주반트는 경질 미네랄 오일, 몬타니드, 에무나데(Emunade) 및 SVEA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이러한 아주반트는 돼지 백신의 면역원성에 대한 유리한 효과를 갖는 것으로 공지되어 있다.
본 발명에 따른 백신의 한 실시양태에서, 백신은 수중유 에멀젼이고, 아주반트는 미네랄 오일이다.
본 발명에 따른 백신의 바람직한 실시양태에서, 미네랄 오일는 상표명, 예컨대 마르콜™ (엑손모빌(ExxonMobil)), 클레아롤™ (손번(Sonneborn)), 또는 드라케올™ (펜레코(Penreco))로 상업적으로 입수가능한 경질 또는 백색 미네랄 오일 또는 파라핀 오일이다.
추가적인 아주반트, 구체적으로 비타민 E, 예를 들어 알파 토코페롤 또는 알파 토코페롤 아세테이트의 사용이 보다 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명을 위한 백신 제형은 계면활성제, 경질 파라핀 오일 및 알파 토코페롤 아세테이트를 갖는 수중유 에멀젼을 포함한다. 계면활성제가 폴리소르베이트 80 (트윈(Tween)™ 80)이고/거나 파라핀 오일이 마르콜™ 52이고/거나 비타민 E가 알파 토코페롤 아세테이트인 제형이 보다 바람직하다. 마이크로솔 딜루백 포르테(Microsol Diluvac Forte)™ 또는 엑스솔브™ (둘 다: 엠에스디 애니멀 헬스)를 갖는 제형이 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 백신의 추가의 유리한 효과는 돼지 무리에서의 PCV2의 확산의 예방 또는 감소이다: 자손에게 수직으로, 및/또는 무리 또는 집단 및 지리적 구역 내에서 수평으로. 결과적으로, 본 발명에 따른 백신의 사용은 PCV2의 유병률의 감소를 야기한다.
그러므로, 본 발명에 따른 백신의 바람직한 실시양태에서, 백신은 돼지 집단 또는 지리적 구역에서 PCV2의 유병률을 감소시키기 위한 것이다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 또한 안정화제를 포함할 수 있다. 이는 백신 에멀젼의 특징을 개선시키고/거나, 분해-경향 구성성분을 보호하고/거나, 백신의 저장 수명을 증진시키는 역할을 할 수 있다. 일반적으로 이러한 안정화제는 고분자량의 큰 분자, 예컨대 지질, 탄수화물, 또는 단백질; 예를 들어 밀크-분말, 젤라틴, 혈청 알부민, 소르비톨, 수크로스, 트레할로스, 스페르미딘, 단백질-가수분해물, 덱스트란 또는 폴리비닐 피롤리돈, 및 완충제, 예컨대 알칼리 금속 포스페이트이다.
바람직하게는 안정화제는 동물 기원의 화합물을 함유하지 않거나 (동물 화합물 무함유 (ACF: animal compound free), 심지어 예를 들어 WO 2006/094974에 개시된 바와 같이 화학적으로 정의된다.
본 발명에 따른 백신은 보존제, 예컨대 티메로살, 메르티올레이트, 페놀성 화합물, 및/또는 겐타미신을 포함할 수 있다. 바람직하게는 보존제가 이용되지 않는다.
본 발명에 따른 백신의 제약 안정성 또는 효과에 요구되거나 유익한 다른 첨가제의 부가혼합은 통상의 기술자의 일상적인 능력 내에 있으며, 그러므로 본 발명의 범위 내에 있다는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명에 따른 백신에 대한 동물 표적은 돼지이다. 백신접종될 표적의 연령, 체중, 성별, 면역학적 상태 및 다른 파라미터가 중요하지는 않지만, 건강하고 감염되지 않은 동물을 백신접종하고 PCV2에 의한 임의의 현장 감염을 예방하기 위해 가능한 한 빨리 백신접종하는 것이 분명히 유리하다. 이는 이러한 감염이 어린 나이에 이미 확립될 수 있기 때문이다.
그러므로, 본 발명에 따른 백신의 한 실시양태에서, 백신은 이러한 선호도 순서로 출생 직후, 바람직하게는 출생 후 28일 이내에, 보다 바람직하게는 출생 후 21, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일 이내에 또는 심지어 1일 이내에 어린 돼지 동물에 적용된다.
대안적으로 본 발명에 따른 백신은 임신한 경산돈에게 투여되어, 자돈에게 모계 유래 PCV2 특이적 항체를 경태반 통로 및/또는 초유를 통한 전달에 의해 제공할 수 있다.
유리하게, 본 발명에 따른 백신의 효능은 어린 돼지 동물이 그의 모체로부터 획득할 수 있는 PCV2에 대한 모계 유래 항체의 수준에 의해 임의의 큰 정도로 영향을 받지 않으며; '어린'은 4주 이하의 나이를 지칭한다.
그러므로 본 발명에 따른 백신의 한 실시양태에서, 백신은 PCV2에 대한 모계 유래 항체를 보유하는 어린 돼지 동물에게 적용된다.
본 발명에 따른 백신은 또한 효과적인 프라이밍 백신접종으로서 작용할 수 있으며, 나중에 부스터 백신접종이 이어서 오고, 이에 의해 증폭될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 백신은 약 2 - 10일령의 자돈에게 및 다시 약 3주 후에 투여될 수 있으며, 각각의 백신접종은 약 1 ml의 부피이다.
그러나, 본 발명에 따른 백신이 단일 투여 후 이미 효과적이기 때문에, 바람직한 실시양태는 약 3주령부터 단일 용량, 예를 들어 약 2 ml의 투여이다. 이러한 백신접종은 약 5 - 6월령까지 전체 비육 기간 동안 돼지를 보호한다.
본 발명에 따른 백신의 돼지 표적, 예컨대 번식용 경산돈 또는 정자 생산용 수퇘지가 6개월 초과 동안 유지되도록 의도된 경우, 이들은 규칙적인 부스터 백신접종으로 1년당 1, 2 또는 3회 투여될 수 있으며, 예를 들어 경산돈의 경우에 각각의 분만 전에 1회 부스터 백신접종으로 투여되며, 이는 평균 약 2.2회/년이다.
본 발명을 위해, "약"은 숫자가 그의 지시된 값 주위의 ± 25% 사이에서 변할 수 있다는 것을 나타낸다. 바람직하게는 "약"은 그의 값 주위의 ± 20%를 의미하고, 보다 바람직하게는 "약"은 그의 값 주위의 ± 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2%를 의미하거나, 심지어 "약"은 선호도 순서로 그의 값 주위의 ± 1%를 의미한다.
본 발명에 따른 백신은 PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환의 확립 및 진행을 둘 다 방해하기 때문에 예방학적 또는 치료학적 치료, 또는 둘 다로서 사용될 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 백신은 비경구 주사에 적합한 형태, 즉 주사가능한 액체, 예컨대 현탁액, 용액, 분산액 또는 에멀젼으로 제형화된다.
본 발명에 따른 백신의 투여를 위한 투약법은 바람직하게는 동물에 대한 스트레스를 감소시키고 노동 비용을 감소시키기 위해 표적 돼지가 필요로 할 수 있는 다른 백신의 기준 백신접종 스케줄로 통합된다. 이들 다른 백신은 등록된 용도에 적합한 방식으로 동시, 공동 또는 순차적 방식으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 동물 용량당 약 0.1 내지 약 1000 마이크로그램의 PCV2b ORF2b-131P 단백질을 포함한다. 바람직하게는 백신은 동물 용량당 0.5 내지 500 μg, 1 내지 250, 또는 심지어 2 내지 200 μg의 PCV ORF2b-131P 단백질을 이러한 선호도 순서로 포함한다. 용량당 단백질의 양의 선택은 백신 및 표적 동물의 특징에 기초하여 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있다.
동물 용량당 ORF2b-131P 단백질의 양은 표준 생화학 실험실 절차를 사용하여, 예를 들어 에멀젼을 파괴하고 SDS-PAGE를 사용하여 수성 상을 테스팅함으로써 준비된 백신 에멀젼 중에서 결정될 수 있다. 그 후, 양의 결정은 공지된 양의 참조 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민과 비교함으로써 수행된다. 예를 들어, 문헌 [The Protein Protocols Handbook, 2nd edition, September 2002, ed. J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; Chapter 29, p. 237-242]을 참조한다.
대안적으로 ORF2 단백질 정량화는 질량 분광법을 사용하여 수행될 수 있다.
바람직하게는 동물 용량당 PCV ORF2b-131P 단백질의 양은 유성 상과 혼합 및/또는 유화 전에 항원 상의 수성 벌크 중에서 결정된다.
본 발명에 따른 백신은 표적 동물에 허용가능한 부피로 투여될 수 있으며, 예를 들어 약 0.1 내지 약 10 ml의 부피일 수 있다. 바람직하게는, 1회 용량은 약 0.1 내지 약 5 ml의 부피이고, 보다 바람직하게는 1회 동물 용량은 0.2 내지 3 ml이다.
근육내 경로로 투여되는 경우, 1회 용량의 부피는 바람직하게는 약 1 내지 약 3 ml, 보다 바람직하게는 약 2 ml이며; 피내 경로로 투여되는 경우, 1회 용량의 부피는 바람직하게는 약 0.1 내지 약 0.5 ml, 보다 바람직하게는 약 0.2 ml이다.
본 발명에 따른 백신은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 표적 돼지에게 투여될 수 있다. 바람직한 적용은 비경구 경로, 즉 피부를 통한, 예를 들어 근육내, 복강내, 피내, 점막하, 또는 피하에 의한 것이다. 본 발명에 따른 백신의 보다 바람직한 투여 경로는 근육내 또는 피하 주사에 의한 것이다. 뒷다리 또는 목에 근육내로 투여하는 것이 훨씬 더 바람직하다.
최적의 적용 경로는 사용되는 백신의 특성 및 표적의 특정한 특징에 좌우될 것임은 말할 필요도 없다.
한 실시양태에서 본 발명에 따른 백신은 약 2 ml의 단일 용량으로 약 3주령부터 돼지에게 근육내로 투여된다.
근육내 투여에 바람직한 부위는 목이다.
한 실시양태에서, 근육내 경로에 의한 본 발명에 따른 백신의 투여의 용량 부피는 유연하며, 즉 백신은 2 ml/동물의 단일 용량으로 또는 1 ml/동물의 2회 연속 용량으로 투여된다. 2회 용량으로 투여되는 경우, 두 용량은 바람직하게는 적어도 1주, 바람직하게는 2 - 5주, 보다 바람직하게는 약 3주만큼의 시간으로 분리된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 따른 백신은 약 0.2 ml의 단일 용량으로 약 3주령부터 돼지에게 피내로 투여된다.
피내 투여에 바람직한 부위는 목, 등 및 뒷다리로부터 선택된다.
본 발명에 따른 백신을 추가로 최적화하는 것은 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로 이는 그의 제공된 면역보호를 추가로 개선시키기 위한 백신의 효능의 미세-조정을 수반한다. 이는 백신의 용량, 부피 또는 항원 함량을 적합화시킴으로써; 또 다른 형태 또는 제형의 백신을 사용함으로써; 백신의 다른 구성요소 (예를 들어, 안정화제 또는 아주반트)를 적합화시킴으로써; 또는 상이한 경로, 방법 또는 투약법을 통해 적용함으로써 수행될 수 있다. 이들 모두는 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명에 따른 백신은 다른 화합물, 예컨대 추가적인 항원, 시토카인, 또는 메틸화되지 않은 CpG 등을 포함하는 면역자극 핵산을 추가적으로로 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 백신은 유리하게는 제약 구성성분, 예를 들어 항생제, 호르몬, 항염증 또는 항기생충 약물과 조합될 수 있다. 또는, 본 발명에 따른 백신은 그 자체가 백신에 첨가될 수 있다.
본 발명에 따른 백신은 유리하게는 하나 이상의 추가 항원, 예를 들어 또 다른 돼지 병원체로부터 유래된 항원과 조합될 수 있다. 이러한 조합 백신의 이점은 이것이 PCV2에 대한 면역 반응 뿐만 아니라 다른 병원체에 대한 면역 반응을 유도하며, 백신접종을 위한 표적 동물의 단일 취급만이 필요하므로, 이에 의해 동물에 대한 백신접종-스트레스를 감소시킬 뿐만 아니라 시간 및 노동 비용을 감소시킨다는 것이다.
그러므로, 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 백신은 돼지 동물에 병원성인 미생물의 추가 항원을 포함한다.
"추가 항원"은 그 자체가 감염성 미생물일 수 있거나, 불활성화되거나 서브유닛일 수 있으며, 아주반트가 있거나 없는 상태일 수 있다. 추가 항원은 생물학적 또는 합성 분자, 예컨대 단백질, 탄수화물, 리포폴리사카라이드, 지질 또는 핵산 분자로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 이는 다른 미생물로부터의 핵산으로부터의 발현 산물, 또는 이러한 핵산을 포함하는 벡터일 수 있으며; 벡터는 그 자체가 미생물 또는 진핵생물 숙주 세포일 수 있다.
추가 항원은 임의의 방식으로, 예를 들어 추출물, 분획물, 용해물, 균질물 또는 초음파처리물로서 돼지에 병원성인 다른 미생물"로부터 유래"될 수 있다.
본 발명을 위한 "돼지 동물에 병원성인 미생물"은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 그러므로 추가 항원은 원칙적으로 돼지에 병원성인 임의의 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균류, 리케치아, 원충 및/또는 기생충으로부터 유래될 수 있다.
돼지 동물에 병원성인 이러한 미생물의 예는 하기와 같다: 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스 (PRRSV), 가성광견병 바이러스, 돼지 파르보 바이러스, 고전 돼지 열병 바이러스, 돼지 인플루엔자 바이러스, 구제역 바이러스, 돼지 유행성 설사 바이러스, 전염성 위장염 바이러스, 수포성 구내염 바이러스, 미코플라스마 히오뉴모니아에(Mycoplasma hyopneumoniae), 라우소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis), 악티노바실루스 플레우로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae), 하에모필루스 파라수이스(Haemophilus parasuis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 스트렙토코쿠스 수이스(Streptococcus suis), 또는 살모넬라(Salmonella), 브라키스피라(Brachyspira), 클로스트리디아(Clostridia), 파스테우렐라(Pasteurella), 에리시펠로트릭스(Erysipelothrix), 보르데텔라(Bordetella), 톡소플라스마(Toxoplasma), 이소스포라(Isospora) 또는 트리키넬라(Trichinella).
본 발명에 따른 백신의 바람직한 실시양태에서, 백신은 PCV2로부터의 항원에 이어서, 엠. 히오뉴모니아에(M. hyopneumoniae), 엘. 인트라셀룰라리스(L. intracellularis) 및 PRRSV로 이루어진 군으로부터 선택된 돼지 동물에 병원성인 미생물로부터의 하나 이상의 항원을 포함한다.
이들이 현재 가장 두드러진 돼지 병원체이므로, 단일 샷으로 즉시 사용가능한 백신으로의 그의 조합은 경제적 관점 뿐만 아니라 수의학적 관점 둘 다에서 매우 유리하다.
바람직한 실시양태에서 하나 이상의 추가 항원은 동결건조 제제로서 본 발명에 따른 백신에 첨가되며, 여기서 조합 백신은 본 발명의 백신 에멀젼으로 재구성함으로써 제조된다. 이는 예를 들어 WO 2010/106095에 기재되어 있다.
바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 백신은 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질 및 엠. 히오뉴모니아에로부터의 항원을 포함하는 조합 백신이며, 상기 조합 백신은 엘. 인트라셀룰라리스 및/또는 PRRSV로부터의 항원의 동결건조 제제를 재구성하는데 사용된다.
바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 백신은 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질, 엠. 히오뉴모니아에로부터의 항원 및 엘. 인트라셀룰라리스로부터의 항원을 포함하는 조합 백신이며, 상기 조합 백신은 PRRSV로부터의 항원의 동결건조 제제를 재구성하는데 사용된다.
추가 측면에서, 본 발명은 돼지 동물에서 PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후를 감소시키는 방법으로서, 본 발명에 따른 백신을 상기 돼지에게 투여하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 백신은 통상의 기술자에게 널리 공지된 수단에 의해 제조될 수 있다. 기재된 바와 같이, 본 발명에 대해 기재된 바와 같은 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질, 또는 본 발명에 대해 기재된 바와 같은 곤충 세포의 사용은 본 발명에 대해 기재된 바와 같은 돼지용 백신의 제조를 허용한다. 이와 관련하여, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 수득가능하다.
그러므로 추가 측면에서 본 발명은 PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후의 감소를 위한 돼지 동물용 백신의 제조를 위한, 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 용도에 관한 것이다.
추가 측면에서 본 발명은 PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후의 감소를 위한 돼지 동물용 백신에 사용하기 위한, 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질에 관한 것이다.
추가 측면에서 본 발명은 하기로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 백신의 제조 방법에 관한 것이다:
- 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 제약상 허용가능한 담체와 부가혼합하는 단계; 및
- 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질 및 제약상 허용가능한 담체의 상기 부가혼합물을 아주반트와 함께 제형화하는 단계.
본 발명에 따른 백신의 제조 방법에 사용하기 위해, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질은 본 발명에 따른 곤충 세포에서의 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 발현 방법에 의해 수득가능하고/거나, 본 발명에 따른 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 생산 방법에 의해 수득가능하다.
본 발명에 따른 백신의 제조 방법의 한 실시양태에서, 돌연변이체 ORF2 단백질은 VLP 형태이다.
본 발명에 따른 백신은 돼지 표적에게 투여하기에 적합하고 원하는 적용 경로 및 원하는 효과와 매칭되는 형태로 통상의 기술자에 의해 제조될 수 있다. 통상적으로 이러한 백신은 멸균 및 생리학적 pH에서 제조된다.
본 발명에 따른 백신의 제조 방법, 용도 또는 공정의 세부사항 및 예는 본원에 기재되어 있으며, 이러한 절차는 통상적인 재료 및 방법을 사용하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 적용가능하다. 예를 들어, 본 발명에 대해 기재된 바와 같은 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질은 산업 규모로 곤충 세포에서 생산될 수 있고, 이어서 제약상 허용가능한 부형제와 조합되고, 예를 들어 유성 아주반트와 함께 유화에 의해 백신으로 제형화되고, 적절한 크기의 컨테이너에 충전된다. 제조 공정의 다양한 단계는 적절한 테스트에 의해, 예를 들어 항원의 품질 및 수량에 대한 면역학적 테스트에 의해; 불활성화, 멸균성 및 외래 작용제의 부재에 대한 미생물학적 테스트에 의해; 및 궁극적으로 효능 및 안전성을 확인하기 위한 동물에서의 백신접종-연구에 의해 모니터링될 것이다. 품질, 수량 및 멸균성에 대한 테스팅의 완료 후, 백신 제품은 판매용으로 출시될 수 있다.
이들 모두는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 백신 제조에 적용되는 일반적인 기술 및 고려사항은 예를 들어 정부 지침 및 규정 (약전, 9CFR) 및 널리 공지된 편람 (상기 문헌 [Pastoret, Lippincot])에 기재되어 있다.
본 발명은 이제 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 상이한 PCV2 ORF2 발현 재조합 구축물의 어셈블리
곤충 세포에서의 PCV2 ORF2 단백질의 발현을 위해, 표준 절차를 사용하여 재조합 바큘로바이러스를 생성하였다. 요컨대:
이들 실험에 사용된 야생형 PCV2 ORF2 유전자를 상이한 공급원으로부터 수득하였다: PCV2a 모 바이러스는 미국으로부터의 백신 균주로부터 수득하고; PCV2b는 프랑스 단리물 Imp1011, 진뱅크 acc. nr. AF055394로부터 수득하고; PCV2d는 중국, 균주 BDH, 진뱅크 acc.nr: HM038017로부터 수득하였다.
ORF2 유전자를 PCR을 사용한 증폭 및 클로닝 플라스미드로의 삽입에 의해 서브클로닝하였다. 다음으로, PCR-지정 돌연변이를 사용함으로써 아미노산 위치 131에 프롤린을 코딩하도록 ORF2 유전자의 일부를 돌연변이시켰다. 대안적으로 또는 추가적으로, AcMNPV 폴리헤드린 유전자의 코돈 사용 표와 유사하도록 ORF2 유전자를 코돈-최적화시켰다. PCV2b에 대해 본원에서 사용된 돌연변이된 서열은 기재된 바와 같이 첨부된 서열 목록에 제공된다.
돌연변이된 ORF2 유전자 삽입물의 합성 구축물을 상업적 공급업체로부터 주문하였다 (베이스클리어(BaseClear), 네덜란드; 또는 진스크립트(Genscript), 미국 뉴저지주 피스카타웨이).
백-투-백 시스템으로 사용하기 위해 이들을 클로닝 벡터 pFastBac1로 서브클로닝하고, 프로이지 시스템으로 사용하기 위해 트랜스퍼벡터 pVL1393으로 서브클로닝하였다. 양쪽 경우에서, 삽입물은 폴리헤드린 프로모터 뒤에 있었다. 재조합 바큘로바이러스의 생성 및 선택은 제조사의 지침서에 따라 수행하였다. PCV2a 재조합 바큘로바이러스 구축물 중 일부는 연질 한천 하에 감염된 곤충 세포의 플레이팅 및 플라크 피킹에 의해 재조합체의 형질감염 및 단리의 고전적 선택 기술을 사용하여 구축하였다.
모든 재조합 바큘로바이러스를 Sf9 세포 상에서 증폭시키고, 수확하고, 냉장 또는 냉동 저장하고, 적정하였다. 추가 실험을 위해 사용된 바이러스 스톡은 전형적으로 7.5 내지 8.5 Log10 TCID50/ml이었다.
곤충 세포에서의 PCV2 ORF2 단백질의 발현을 위해 사용된 재조합 바큘로바이러스의 선택은 하기 스케줄에 나열되어 있다:
NB: 모든 삽입물은 폴리헤드린 프로모터 뒤에 삽입되었다. 코돈 최적화 (적용된 경우)는 AcMNPV 폴리헤드린 유전자의 코돈 사용에 대한 것이었다.
Figure pct00001
실시예 2: 곤충 세포에서의 발현
상기 기재된 바와 같이 상이한 재조합 바큘로바이러스 구축물을 사용하여, 곤충 세포를 감염시키고 PCV2 ORF2 단백질의 여러 변이체를 발현하였다. 비변형된 단백질 또는 PCV2의 또 다른 유전자형의 단백질과 비교함으로써 생산된 단백질을 시각화하고 분석하여, 이루어진 다양한 돌연변이의 효과를 평가하였다. 돼지에서 테스팅하기 위한 PCV2 서브유닛 백신의 제형을 위한 단백질을 생산하기 위해 일부 재조합 바큘로바이러스를 규모 확대하였다.
2.1 곤충 세포 배양물
지수함수적 성장을 유지하기 위해 규칙적으로 분할된 깨끗한 세포의 스피너 배양물로부터 취한 Sf9 곤충 세포를 사용하여, 표준 감염 및 발현 실험을 소규모로 수행하였다. 전형적인 감염률은 0.01 내지 0.1 moi이고, 배양 기간은 3 내지 5일이었다. 비감염된 세포의 건강을 체크하기 위해 또는 감염된 배양물에서의 바이러스 복제의 진행을 모니터링하기 위해 배양물을 광학 현미경에 의해 규칙적으로 모니터링하였다.
사용된 배양 용기는 각각 5 또는 15 ml의 단층 배양물을 갖는 T25 또는 T75 플라스크 (팔콘(Falcon))였다. 대안적으로 100 ml의 현탁액 배양물을 스피너 플라스크 (코닝(Corning))에서 실행시켰다. 플라스크를 27℃에서 인큐베이션하였고, 사용된 배양 배지는 Sf-900™ II (써모 피셔 사이언티픽)이었다. 혈청을 첨가하지 않았으나, 항생제의 혼합물: 50 μg/ml 겐타마이신 및 0.25‰ 나타마이신을 첨가하였다.
대부분의 세포가 세포병원성 효과 (cpe: cytopathogenic effect)를 보였을 때, 배양물을 수확하였다: T-플라스크 배양물은 세포를 느슨하게 하기 위해 단단히 탭핑해야 했다. 그 후, 배양-수확물을 원심분리하고, 생산된 ORF2 단백질이 대부분 곤충 세포 내에 함유되었기 때문에 배양 상등액을 폐기하였다. 의도된 추가 용도에 따라, 이어서 세포-펠릿을 원하는 농도로 요구되는 액체에 재현탁시킬 수 있었다.
소규모 배양물은 일상적으로 불활성화되지 않았으며; 샘플을 격리 시설에서 사용하거나, 변성 전기영동 샘플 완충제로 처리한 후, 불활성화된 것으로 간주하였다.
대규모 배양물은 부피 및 장비에 대한 적합화 하에 본질적으로 동일한 개요를 따랐다. 실험 설정에서, 중간의 대규모 곤충 세포 현탁액 배양물을 자동화 프로세스 제어가 장착된 산업용 발효기에서 2 내지 10 리터 부피로 실행시켰다. 깨끗한 Sf9 곤충 세포를 전배양물로부터 수득하였다. Moi는 0.01 내지 0.1이고, 배양은 5 - 7일 동안이었다. 감염이 충분히 진행되었을 때, 세포를 중력에 의해 침강되도록 방치하였다. 그 후, 배양 부피의 상단 90%를 제거하고, 세포를 최초 배양 부피의 1/10로 수확하고, 초음파처리에 의해 용해시켰다. 중간 규모에서 초음파처리는 팁 초음파처리기 (비브라 셀(Vibra Cell)™, 소닉스(Sonics), 미국 코네티컷주)를 사용하여 얼음 상에서 배치식으로 수행하였다. 더 큰 규모에서 (100 l 이상의 부피), 초음파처리는 관통형 초음파처리 셀 (소노블록(Sonobloc)™, 반델린(Bandelin))을 통한 통과에 의해 수행하였다.
다음으로, BEI를 사용하여 초음파처리물을 불활성화시켰다. 그 후, Na-티오술페이트를 사용하여 이를 중화시켰다. 그 후, 불활성화된 수확물을 원심분리에 의해 청징화하고, ORF2 단백질을 함유하는 상등액을 벌크 항원의 수성 상으로 유지시켰다. 품질 제어 및 추가 프로세싱을 위해 이를 2 - 8℃에서 저장하였다. 이들 산물에서, 그러므로 항원을 위한 제약상 허용가능한 담체는 곤충 세포 배양물로부터 소비된 배지이다. 필요한 경우, 벌크 항원을 농축시키거나, 또는 PBS에 대해 투석시킬 수 있었다. 대안적으로, 항원을 신선한 곤충 세포 배양 배지 또는 PBS로 희석시킬 수 있었다.
2.2 ELISA
2.2.1 ELISA의 개요
PCV2b ORF2 단백질에서의 T131P 치환의 효과를 테스팅하기 위해, 곤충 세포 배양물을 재조합 바큘로바이러스 번호 6 (131에 트레오닌) 또는 바이러스 번호 8 (T131P 치환)로 감염시켰다. 둘 다는 백-2-백 형식의 구축물이고, 코돈-최적화를 갖지 않았다. 바이러스 6 중에서, 2개의 단리물을 테스팅하였다.
Sf9 세포의 T175 플라스크 배양물을 감염시키고, 인큐베이션하고, 전체 배양물의 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 펠릿을 10 ml의 주사용수에 녹였으며, 이는 모든 세포를 효과적으로 용해시켰다. 그 후, 세포-용해물을 하기와 같이 간단히 샌드위치 ELISA에서 그의 항원 질량에 대해 테스팅하였다:
폴리스티렌 미세-적정 플레이트의 웰을 PCV2 ORF2a에 대해 지정된 모노클로날 항체로 코팅하였다. 용해물 샘플의 계열 희석물을 PCV2a ORF2의 공지된 참조 표준의 일련의 희석물과 함께 인큐베이션하였다. 다음으로, 플레이트를 비오틴과 접합된 PCV2 ORF2a에 대해서도 지정된 이차 항체의 고정량과 함께 인큐베이션하였다. 최종적으로, 퍼옥시다제-접합된 스트렙타비딘과의 인큐베이션에 의해 결합된 접합체의 양을 정량화한 후, 자동 플레이트 판독기에 의해 발색단 검출을 수행하였다.
용해물 중 항원의 양을 참조 표준에 대해 계산하였으며, 항원의 양은 임의로 100 항원 단위 (AU)/ml로 설정하였다.
2.2.2 ELISA의 결과 및 결론
용해물에서 검출된 ORF2 단백질의 양은 하기와 같았다:
- 바이러스 6 감염된 세포 (2개의 변이체): 5.5 및 7.4 AU/ml,
- 바이러스 8 감염된 세포: 68 AU/ml.
131에 돌연변이가 없는 PCV2b ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바이러스로 감염된 세포로부터 순수한 물에서 제조된 용해물은 ELISA에 의해 검출된 바와 같이 매우 적은 ORF2 단백질만을 함유하였다. 그러나, T131P 치환을 갖는 ORF2를 발현하는 재조합 바큘로바이러스로 감염된 세포로부터의 이러한 용해물은 약 10배 더 많은 단백질을 함유하였다.
이들 ELISA 결과는 ORF2 아미노산 번호 131의 치환을 갖는 또는 갖지 않는 감염된 곤충 세포로부터 쉽게 단리될 수 있는 ORF2 단백질의 양의 큰 차이를 나타내었다. 한편으로, 이는 단백질이 비-변성 용해물에서 방출된 용이성과 관련이 있었다. 다른 한편으로, 이는 또한 위치 131에 아미노산의 돌연변이를 갖거나 갖지 않는 곤충 세포에서의 PCV2b ORF2 단백질의 전체 생산의 차이를 반영하였다.
2.3 면역형광 검정
2.3.1 IFT 검정의 개요
면역형광 테스트 (IFT)를 위해, 깨끗한 곤충 세포를 96-웰 미세적정 플레이트의 웰에 전형적으로 웰당 2.5 x 10^4개 세포로 100 μl의 배지에서 시딩하였다. 부착 후, 세포를 조사할 특정한 재조합 바큘로바이러스로 감염시켰다. 전형적으로 희석 범위의 바이러스로 접종하여, 상이한 moi에서 관찰할 수 있도록 하였다. 곤충 세포가 적절하게 감염되었으나 아직 용해되지 않았을 때인 4-5일의 인큐베이션 후 플레이트를 분석하였다. 배지를 제거하고, 세포를 냉 에탄올로 고정시키고, 표준 절차에 따라 적절한 항체로 염색하였다. FITC-접합된 제2 항체를 시각화에 사용하였다. 곤충 세포를 배경과의 대비를 증진시키기 위해 에반스 블루로 대비-염색하였다.
이들 IFT 연구를 위해, 사용된 일차 항체는 돼지 폴리클로날 항-PCV2a 항혈청이었으며, 이는 PCV2b 및 PCV2d 유전자형의 ORF2 단백질을 또한 염색하기에 충분히 강력하였다.
2.3.2 IFT 검정의 결과
상이한 ORF2 단백질 발현 산물에 대해 관찰된 IFT 결과를 비교할 때, 여러 관찰이 이루어졌다:
- PCV2a ORF2 단백질을 모두 발현하는 상기 기재된 바와 같은 재조합 바이러스 1-5는 모두 언제나 세포질 염색 패턴을 야기하여, 이에 의해 본질적으로 곤충 세포 전체가 밝은 착색을 나타내었다.
- 그러나, 야생형 PCV2b ORF2 단백질을 발현하는 재조합 바큘로바이러스 번호 6으로 감염된 곤충 세포는 본질적으로 상이한 패턴을 나타내었으며, 여기서 염색은 곤충 세포의 핵 주위에만 위치되었다. 세포질 염색은 관찰되지 않았다.
- 이러한 IFT 패턴은 또한 PCV2b ORF2 단백질을 발현하나 코돈-최적화된 유전자로부터 유래된 바이러스 번호 7로 감염된 곤충 세포에 대해 거의 동일하였다. 소량 (곤충 세포의 대략 10%)이 세포질 염색을 보인 반면, 대부분의 세포는 여전히 핵 염색을 나타냈다는 점만 차이가 있었다.
- 놀랍게도, 바이러스 번호 8로 감염된 곤충 세포는 형광 패턴이 재조합 바이러스 번호 7에 대한 것과 반대인 IFT 패턴을 제공하였다: 대부분의 곤충 세포는 세포질 염색을 나타내고, 일부 세포는 여전히 핵 염색을 나타내었다. 바이러스 번호 8은 아미노산 번호 131을 코딩하는 코돈이 트레오닌으로부터 프롤린으로 돌연변이된(T131P) PCV2b ORF2 유전자를 보유하였다.
- 최종적으로, 바이러스 번호 9로 감염된 곤충 세포 (깨끗한 구축물에서, 코돈 최적화를 갖고 T131P 치환을 보유하는 PCV2b ORF2 유전자)는 모두 오로지 세포질 염색만을 나타내었다.
- 놀랍게도, 재조합 바큘로바이러스 번호 10으로 감염된 곤충 세포 (T131P 치환, 코돈-최적화 및 깨끗한 구축물로 PCV2d ORF2 단백질을 코딩함)는 모두 여전히 핵 염색 패턴을 나타내었다.
2.3.3 IFT 검정으로부터의 결론
곤충 세포에서의 PCV2b로부터의 ORF2 단백질의 효과적인 발현은 항-PCV2a 항체와의 IFT에서 세포질 염색 패턴을 나타내는 프롤린에 의한 위치 번호 131에서의 아미노산의 치환을 필요로 한다는 결론을 내렸다. 이러한 돌연변이 없이, PCV2b ORF2 단백질은 그 단백질을 발현하는 곤충 세포의 핵에서만 또는 그 주변에서만 염색을 나타내었다.
오직 코돈 최적화에 의한 ORF2 유전자의 돌연변이는 아마도 증가된 발현 효율의 결과로서 IFT 염색 패턴의 약간의 이동을 제공하였다.
재조합 바큘로바이러스가 클로닝 벡터로부터의 잔류 요소를 함유하는 구축물에 기초하지 않았으나 (예컨대 백-투-백 시스템을 사용하여 생산된 재조합체), '깨끗한' 바큘로바이러스 구축물이었으며, 즉 그의 게놈에 재조합 프로세스로부터의 추가 유전적 요소를 함유하지 않은 경우, 핵 염색 패턴은 추가로 역전될 수 있었다. 이러한 깨끗한 재조합 바큘로바이러스는 고전적 동종 재조합 및 플라크 정제를 사용함으로써, 또는 보다 편리하게 상업용 키트, 예컨대 프로이지 시스템을 사용함으로써 수득될 수 있다.
그러므로, PCV2b ORF2 단백질을 발현하는 곤충 세포에서 관찰된 IFT 핵 염색 패턴의 가역성은 프롤린을 코딩하도록 ORF2 아미노산 번호 131을 코딩하는 트리플렛의 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 세포질 ORF2 단백질 발현의 추가 최적화는 코딩 유전자를 코돈-최적화함으로써 및 깨끗한 재조합 바큘로바이러스 구축물을 사용함으로써 도달될 수 있다.
2.4 겔-전기영동에 의한 정량화
2.4.1 겔-전기영동 검정의 개요
상이한 ORF2 단백질의 발현 수준의 정량화를 허용하기 위해, 감염된 곤충 세포 배양물로부터의 샘플을, 마커 단백질로서 공지된 양의 소 혈청 알부민 (BSA)을 갖는 레인을 따라 SDS-PAGE 상에서 실행시켰다. 염색 후, 겔을 스캐닝하고 분석하였다. 강한 변성 샘플 완충제를 사용함으로써, 이러한 실험은 다양한 재조합 바큘로바이러스 구축물로 감염된 곤충 세포의 총 발현 능력을 나타내었다.
테스팅될 상이한 재조합 바큘로바이러스를 기재된 바와 같이 T75 플라스크에서 배양하고, 수확하고, 원심분리하고, 세포 펠릿을 7.5 ml의 PBS에 녹였다. 그 후, 상등액 및 재현탁된 세포의 샘플을 표준 변성 램리 SDS-PAGE 샘플 완충액 (브로모페놀 블루 지시약 및 베타-메르캅토에탄올을 함유함)에 녹였다.
샘플을 표준 Tris-글리신-SDS 러닝 버퍼에서 표준 폴리-아크릴아미드 겔 (프리캐스트 크라이테리언(precast Criterion) TGX™, Any kD (15%), 바이오-래드(Bio-Rad)) 상에서 실행시켰다. 전기영동 후, 겔을 인스턴트 블루(Instant Blue)™ (익스페던(Expedeon))로 염색하였다. 최종적으로, 겔을 디지털화하고, 이미지 랩(Image Lab)™ 소프트웨어, 버전 5.2.1을 사용하여 바이오-래드 GS-900 보정 밀도계로 분석하여, 단백질의 양을 겔 상의 개별 밴드에 할당하였다.
2.4.2 겔-전기영동 검정의 결과
도 1 및 2에서, 이들 실험에 사용된 것과 같은 겔의 일부 대표적인 이미지가 제공된다: 도 1: 바이러스 번호 3, 6 또는 7로 감염된 곤충 세포의 배양물로부터의 샘플; 및 도 2: 바이러스 번호 8 또는 9로 감염된 곤충 세포의 배양물로부터의 샘플. 바이러스 유형에 따라, 첫 번째 레인은 배양 상등액의 샘플을 함유하고, 하기 3개의 레인은 좌측에서 우측으로 30, 20 및 10 μl의 2x 농축된 세포의 샘플을 함유한다. 가장 좌측 및 우측 레인: 분자량 마커 10 - 250 kDa (프리시전 플러스 프로틴(Precision Plus Protein)™ 스탠다드, 바이오-래드), 밴드 크기는 도면에 표시되어 있다.
각각의 겔은 또한 100 ng/μl 용액으로 사용된 희석 범위의 BSA (알부민 표준 고품질, 써모 피셔 사이언티픽)를 함유하였다. 사용된 양은 다음과 같다: 도 1: 레인 14 - 17에서: 0.25, 0.5, 1, 및 2 μg BSA; 도 2: 레인 11 - 15에서: 0.25, 0.5, 1, 2, 및 3 μg BSA.
밀도계에 의한 분석은 26 kDa에서의 PCV2 ORF2 단백질의 밴드에 초점을 맞추었다. 모든 샘플을 겔 상에서 2회 분석하였고, 계산된 수율 결과는 듀플로(Duplo)의 평균이다.
PCV2 ORF2 단백질의 수율은 최초 T75 배양물의 ml당 단백질의 마이크로그램 (15 ml 부피)으로 표시된다. 수율은 다음과 같은 것으로 밝혀졌다:
Figure pct00002
여러 관찰이 이루질 수 있었다:
- T131P 치환을 갖는 PCV2b ORF2의 2개의 구축물인 바이러스 번호 8 및 9에 의한 바이러스 감염의 경우, 겔 레인 (도 2 참조)은, SDS-PAGE에 의해 비교된 모든 배양물에 대해 moi (0.1), 배양 시간 (4일) 및 다른 조건은 모두 동일함에도 불구하고, 테스팅된 다른 바이러스보다 약간 더 어둡게 보였다. 이는 다른 바이러스만큼 감염이 진행되지 않아서, 샘플에 더 많은 세포-물질이 생길 수 있음을 나타낼 수 있었다. 아마도 프롤린 치환은 재조합 바큘로바이러스의 약간 감쇠를 유발하였다. 그러나, 단백질-발현 수준은 영향을 받지 않은 것으로 보였으며, 이러한 돌연변이가 없는 PCV2b ORF2보다 우수하였다.
- 상등액의 샘플 중 어느 것도 사용된 CBB 염색에 의해 시각화될 수 있는 ORF2 단백질의 양을 나타내지 않았다. 결과적으로, 이들 실험에 적용된 바와 같은 조건 하에, 효과적으로 발현된 ORF2 단백질 모두는 곤충 세포에 함유되었다.
- 비돌연변이된 PCV2b ORF2 단백질 (바이러스 6)의 발현 수준은 26 대 32 μg/ml로 PCV2a ORF2 (바이러스 3)의 발현 수준보다 낮았다. 이들 샘플은 이용된 공격적인 변성 (SDS 및 베타-메르캅토에탄올에서 비등) 때문에 생산된 모든 단백질의 총량을 나타냄을 상기시킨다. 이는 비돌연변이된 PCV2b ORF2 유전자로부터의 총 단백질 발현이 실제로 곤충 세포에서 전체적으로 더 낮음을 나타낸다.
NB: 수확이 (강한) 변성이 없는 경우, 수율에서의 이러한 차이는 실제로 훨씬 더 악화된다. 이러한 경우, 비돌연변이된 PCV2b ORF2를 발현하는 곤충 세포로부터의 용해물은 어떠한 검출가능한 ORF2 단백질도 전혀 나타내지 않았다.
- 비돌연변이된 PCV2b ORF2 단백질의 수율은 코돈 최적화된 ORF2 유전자의 사용에 의해 약간 증가될 수 있었다: 바이러스-배양물 6 및 7의 수율을 각각 26 및 36 μg/ml의 총 수율과 비교한다.
- 그러나, 가장 유의한 증가는 PCV2b ORF 단백질에 T131P 치환의 도입에 의해 달성되었으며, 26 대 56 μg/ml의 바이러스-배양물 6 및 8의 수율을 참조한다. 그러므로, T131P 치환은 임의의 최적화 없이 이들 소규모 배양에서도 ORF2 단백질의 총 수율을 2배 초과로 증가시킬 수 있었다.
- PCV2b ORF2 단백질의 훨씬 우수한 수율은 모든 돌연변이가 조합된 경우에 도달될 수 있었다: T131P 치환, 코돈 최적화 및 깨끗한 바큘로바이러스 구축물의 사용: 바이러스-배양물 6 및 9의 수율의 비교는 26으로부터 76 μg/ml로의 단백질 수율의 3배 증가를 나타낸다.
2 리터의 중간의 대규모 배양물에서 생산된 샘플에 대해서도 단백질 수율의 유사한 분석을 수행하였다. 총 배양 부피와 비교하여 수확물을 7.7x 농도로 수득하였다. 이하 기재된 실험 PCV2 백신을 생산하는데 이들 배양물로부터의 ORF2 단백질을 또한 사용하였다.
수득된 ORF2 단백질 수율은 다음과 같으며, 최초 2 리터 배양 부피의 μg/ml로 표시된다:
Figure pct00003
발효기에서의 배양 조건은 소규모 배양 sin T-플라스크에서보다 명확히 더 최적이었다. 온도, pH 및 용존 산소의 자동화 제어 때문일 뿐만 아니라, 이들이 배양물 ml당 더 높은 세포-밀도를 허용하는 현탁액 배양물이기 때문이었다.
사용된 재조합 바큘로바이러스를 또한 깨끗한 바큘로바이러스 구축물 (프로이지 시스템을 사용하여 생성됨)에서 코돈-최적화된 ORF2 유전자를 가졌다는 의미에서 최적의 방식으로 구축하였다.
이는 100 μg/ml 배양물 초과의 바이러스 번호 9로 감염된 곤충 세포에 대한 단백질 수율을 초래한 반면, T-플라스크에서는 76 μg/ml이었다.
놀랍게도, 프롤린에 의한 아미노산 번호 131의 치환을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 발현하는 곤충 세포로부터의 단백질의 수율은, 동일한 구축물 및 배양 조건이 사용되었음에도 불구하고 비변형된 PCV2a ORF2 단백질의 수율보다 실질적으로 더 높았다. 특히, 사용된 PCV2a의 ORF2 유전자는 또한 그의 천연 서열로부터 아미노산 위치 131에 프롤린을 가졌기 때문이다. PCV2에 대한 서브유닛 백신의 제조를 위한 PCV2b ORF2 단백질의 생성에 매우 유리한 것은 분명하지만, 무엇이 이러한 차이를 유발할 수 있는 것인지는 명백하지 않다.
2.4.3 겔-전기영동 검정으로부터의 결론
관찰된 모든 효과가 이러한 시점에 설명될 수는 없지만, 겔-전기영동에 의한 분석으로, 임의의 적합화 없이 PCV2b ORF2 단백질의 곤충 세포에서의 발현이 많아야 PCV2a ORF2의 발현보다 더 적은 단백질 양을 수득한다는 것이 명백히 명확하게 되었다. 이러한 차이는 비-변성 조건을 사용하여 세포를 수확할 때 더욱 악화된다.
그러나, 수율에서의 부족은 프롤린에 의해 PCV2b ORF2에서 위치 131에서의 아미노산을 치환함으로써 구성되는 것 이상일 수 있으며, 이는 비돌연변이된 PCV2b ORF2 단백질의 수율과 비교하여 수율을 적어도 2배로 증가시킨다.
수율에서의 훨씬 더 큰 증가는 코돈-최적화된 ORF2 유전자로부터 131P 돌연변이를 발현하고, 깨끗한 바큘로바이러스 구축물을 사용함으로써 도달될 수 있다. 수율에서의 훨씬 더 큰 개선은 대규모 현탁액 배양물에서 도달될 수 있다.
함께 이들 발견은 재조합 발현 시스템에 의한 PCV2b 유전자형으로부터의 ORF2 단백질의 상업적 및 대규모 생산을 최초로 가능하게 한다.
실시예 3: 돼지에서의 백신접종-챌린지 실험
3.1 도입부
3.1.1 목적
본 발명에 따른 곤충-세포 발현된 돌연변이체 PCV2 ORF2 단백질을 기반으로 하는 돼지 백신의 효능을 비교하고 평가하기 위해 본 연구를 수행하였다. 그의 보호 능력의 철저한 테스트를 제공하기 위해, 동종 뿐만 아니라 이종 PCV2 챌린지-감염에 대해서도 상이한 유전자형의 ORF2 단백질을 사용하였다. 또한 사용된 백신 용량은 상대적으로 적은 양의 ORF2 단백질을 함유하였다.
3.1.2 연구 개요
본 연구를 위해, 140마리의 자돈을 사용하였으며, 각각 10마리의 동물을 갖는 7개의 처리 그룹의 2개 세트에 할당하였고, 2회의 챌린지 각각에 대해 1개 세트를 할당하였다. 140마리의 동물은 14마리의 경산돈으로부터 유래되었다. 자돈은 낮은 역가 내지 매우 높은 역가 범위의 검출가능한 수준의 항-PCV2 ORF2 항체를 가졌으며; 모든 동물에 대한 평균 MDA 역가는 항체-ELISA에 의해 5.8 Log2였다.
자돈은 대략 3주령이 되었을 때 각각 2 ml로 목에 근육내로 백신접종하였다. 사용된 백신은 3가지 유전자형: PCV2a, 2b 또는 2d 중 하나로부터, 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템을 통해 생산된 상이한 양의 PCV2 ORF2 단백질을 포함하였다. 사용된 재조합 바큘로바이러스는, 아미노산 위치 131에 프롤린을 가지며, AcMNPV 폴리헤드린 유전자를 향해 코돈 최적화된 코딩 ORF2 유전자로부터 발현되고, 깨끗한 바큘로바이러스 구축물을 사용하여, 상기 기재된 바와 같이 번호 5, 9 및 10이었다. 백신을 에무나드™ 아주반트와 함께 수중유 에멀젼으로 제형화하였다. 백신은 상업용 백신: 포실리스™ PCV M Hyo와 유사한 미코플라스마 히오뉴모니아에 (J 균주)로부터의 항원을 추가적으로 함유하였다. PCV2 ORF2 항원과 관련하여, 테스팅된 백신은 동물당 표준 전체 용량의 1/4 또는 1/16을 포함하였다.
양쪽 세트에 대해, 그룹에 대한 백신 처리의 분할은 하기 스케줄에 나타낸 바와 같았다.
NB: 챌린지 대조군으로서 역할을 하기 위해 양쪽 세트 중 그룹 7의 동물을 백신접종하지 않았다.
Figure pct00004
백신접종 후 2주에, 모든 동물을 챌린지 시설로 이동시켰다. 백신접종 후 3주에 (6주령에), 모든 동물은 2b 또는 2d 유전자형으로부터 유독성 PCV2로 챌린지 감염을 받았다. 챌린지는 5 Log10 TCID50/ml에서 PBS 중 6 ml (비공당 3 ml)의 PCV2의 비강내 투여에 의해 수행하였으며, 세트 1: PCV2b 챌린지 바이러스 (네덜란드 단리물, 2003) 및 세트 2: PCV2d 챌린지 바이러스 (독일 단리물, 2015)를 사용하였다. 챌린지 바이러스는 PCV-무함유 PK15 세포 상에서 생산되었으며, 박테리아 및 진균 멸균성에 대해 체크하였다.
챌린지 후 3주에 (9주령에), 모든 동물을 안락사시키고 검사하였다: 내장을 원 위치에서 특히 주의하여 검사하였다: 폐, 서혜 및 장간막 림프절, 편도, 흉선, 비장, 간 및 신장. 다음으로, 면역조직화학 (IHC)에 의한 PCV2 챌린지 바이러스의 검출을 위해 편도, 폐, 장간막 림프절 및 서혜 림프절로부터 샘플을 제거하고 고정시켰다.
다른 분석, 예컨대 혈액 샘플에 대한 혈청학 및 조직 및 스왑 샘플에 대한 qPCR을 또한 수행하였다. 그러나, IHC 데이터가 가장 명백한 결과를 제공하였다.
3.2 재료 및 방법
3.2.1 PCV2 ORF2 단백질:
PCV2a, 2b 및 2d의 PCV2 ORF2 유전자 서열을 상기 섹션 2.1에 기재된 바와 같이 중간의 대규모 배양물에서 생산하였다. 겔-전기영동에 의한 이들의 정량화는 상기 섹션 2.3.2에 기재되어 있다.
3.2.2 테스트 동물
테스트 동물은 PCV2 바이러스 로드에 대해 음성이었고, 중간 수준의 항-PCV2 항체를 가졌다. 임의의 동물이 챌린지 전에 PCV2 감염의 임상 징후를 발병한 경우에 테스트는 거절되었을 것이다.
건강한 동물만이 시험에 포함되었다. 모든 자돈을 일반 건강, 및 질환의 임상적 또는 전신적 징후, 예컨대 식욕 상실, 움직이기를 꺼림, 눕는 경향, 무기력 또는 졸음, 떨림, 강모, 부종 (특히 눈 주위), 구토 및 설사 및 호흡곤란에 대해 매일 관찰하였다.
자돈을 이어-태그에 의해 개별적으로 마킹하였으며, 14 마리의 자돈을 테스트 그룹으로 균등하게 분할하였다. 이유 후 수돗물은 자유롭게 이용가능하였고, 표준 절차에 따라 사료 공급을 수행하였다.
백신접종은 분만 농장에서 제공되었다. 챌린지 시설로 이동 후, 1주일 순응이 포함되었다.
3.2.3 실험실 실험 절차
3.2.3.1 면역조직화학
조직 샘플을 10% 포르말린에 고정시키고 파라핀에 포매함으로써 조직학적 검사를 위해 준비하였다. 현미경 슬라이드를 준비하였다. 이들을 일차 항체로서 토끼 폴리클로날 항-PCV2 혈청과 함께 인큐베이션하고, 퍼옥시다제 염색 (엔비전+(Envision+)™, 다코(DAKO))으로 시각화하였다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 편도 및 림프절의 현미경 검사에서, 채색 정도에 따라 특징적 갈색 염색에 점수를 부여하였다:
- 점수 0: 림프 여포는 특정 양성 염색을 나타내지 않았다;
- 점수 1: 림프 여포의 10% 미만은 특정 양성 염색을 갖는 최대 15개의 세포를 함유하였다;
- 점수 2: 림프 여포의 10 - 50%는 특정 양성 염색을 갖는 최대 15개의 세포를 함유하였거나, 림프 여포의 10% 미만은 특정 양성 염색을 갖는 15개 초과의 세포를 함유하였다;
- 점수 3: 림프 여포의 > 50%는 특정 양성 염색을 갖는 세포를 함유하였다.
개별 조직의 점수의 합을 동물당 총 IHC 점수로서 기록하였고, 이들을 그룹의 모든 동물에 대해 조합하였다.
3.2.3.2 백신 제형
테스트 백신을 에무나드™와 함께 수중유 에멀젼으로 제형화하였으며, 이는 백신 항원 뿐만 아니라 수산화알루미늄을 함유하는 수성 상에 분산된 미네랄 오일를 갖는 이중 아주반트이다. 9% Mhyo 항원에 의한 제조는 WO 2016/091998에 개시된 바와 같은 절차에 따랐다.
또한, 전체 용량 (2 ml/동물)의 25%가 대략 20 μg의 ORF2 단백질을 포함하고, 6.25% 용량이 5 μg의 ORF2 단백질/동물 용량을 포함하도록, 백신을 EP 1.926.496과 유사하게 제조하였다.
3.3 결과 & 결론
면역조직화학에 의해, 사후 수집된 편도, 장간막 및 서혜 림프절의 조직 샘플을 분석하여, 검출가능한 챌린지 바이러스의 양을 평가하였다. 이들 결과의 그래픽 개요는 도 3 및 4에 제공된다: 도 3은 유독성 PCV2b 바이러스에 의한 챌린지를 받은 세트 1의 그룹 1-7의 동물에 대한 결과를 나타내고; 도 4는 동물이 유독성 PCV2d 바이러스로 챌린지된 세트 2의 모든 동물에 대한 IHC 데이터를 나타낸다.
수직축은 상기 기재된 규모에 따라 IHC 강도의 점수를 나타낸다. IHC 결과는 백신접종된 그룹 대 비백신접종된 그룹에서 PCV2 감염의 감소 수준을 비교함으로써 PCV2 ORF2 단백질을 기반으로 하는 백신의 효능을 결정하는데 사용될 수 있다.
여러 관찰이 이루질 수 있었다:
- 비백신접종된 동물은 백신접종된 그룹보다 상당히 더 높은 IHC 점수를 나타내었으며, 이는 자돈에서의 중간 수준의 항-PCV2 모계 항체의 맥락에서도 챌린지의 용량이 충분히 높고 챌린지 감염이 효과적이었다는 것을 나타낸다.
- 알 수 있는 바와 같이, 5 또는 20 μg의 ORF2 단백질을 포함하는 백신 용량은 챌린지 바이러스의 복제에 대한 강한 보호를 제공하여, IHC 점수가 최대 90%까지 감소하였다. 그러므로 이들 PCV2 백신은 매우 효능이 있었다.
- PCV2d 챌린지에 대한 최저 용량의 PCV2a ORF2 단백질에 대해 다소 적은 보호가 관찰되었다. 이는 본 발명에 따른 PCV2b 또는 PCV2d로부터의 곤충-세포 발현된 돌연변이체 ORF2 단백질을 기반으로 하는 PCV2 백신이 심지어 단일 용량으로 및 심지어 모계 유래 항체의 맥락에서도 PCV2 감염에 대한 백신으로서 매우 효과적임을 나타낸다. 동등한 용량에서, PCV2b 또는 PCV2d로부터의 돌연변이체 ORF2 단백질을 기반으로 하는 이들 백신은 심지어 PCV2a ORF2 단백질을 기반으로 하는 전통적인 백신보다 더 효과적인 것으로 보였다.
- 동종 보호가 이종 보호보다 대부분 우수하였으나, 테스팅된 3가지 백신 유전자형 모두에 의해 PCV2b 및 PCV2d 챌린지 바이러스에 대한 명확한 수준의 교차-보호가 있었다: PCV2a 및 PCV2d ORF2 단백질 백신은 PCV2b 챌린지에 대한 최저 용량으로 보호 효과에서 비교가능하였으나, PCV2a ORF2 단백질은 더 높은 용량에서 우수하였다. 그러나, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 기반으로 하는 백신은 두 용량 모두에서 PCV2d 챌린지에 대해 PCV2a ORF2 단백질보다 우수하였다.
도면의 간단한 설명
도 1:
재조합 바큘로바이러스에 의한 감염을 통해 상이한 PCV2 ORF 단백질을 발현하는 곤충 세포의 배양물로부터의 샘플로의 SDS-PAGE의 스캔.
레인 번호 및 레인 내용의 표시는 겔 이미지 위에 도시되어 있다.
- 레인 1 및 18: 분자량 마커; kDa의 분자량 표시는 이미지의 좌측에 표시되어 있다.
- 레인 2 - 5: 바이러스 3으로 감염된 세포; 레인 2: 상등액; 레인 3 - 5 세포-펠릿, 각각 30, 20 및 10 μl
- 레인 6 - 9: 바이러스 6으로 감염된 세포; 레인 6: 상등액; 레인 7 - 9 세포-펠릿, 각각 30, 20 및 10 μl
- 레인 10 - 13: 바이러스 7로 감염된 세포; 레인 10: 상등액; 레인 11 - 13 세포-펠릿, 각각 30, 20 및 10 μl
- 레인 14 - 17: BSA 단백질의 참조 샘플, 각각: 0.25, 0.5, 1 및 2 μg.
도 2:
재조합 바큘로바이러스에 의한 감염을 통해 상이한 PCV2 ORF 단백질을 발현하는 곤충 세포의 배양물로부터의 샘플로의 SDS-PAGE의 스캔.
레인 번호 및 레인 내용의 표시는 겔 이미지 위에 도시되어 있다.
- 레인 1 및 16: 분자량 마커; kDa의 분자량 표시는 이미지의 좌측에 표시되어 있다.
- 레인 2 - 5: 바이러스 8로 감염된 세포; 레인 2: 상등액; 레인 3 - 5 세포-펠릿, 각각 30, 20 및 10 μl
- 레인 6 - 9: 바이러스 9로 감염된 세포; 레인 6: 상등액; 레인 7 - 9 세포-펠릿, 각각 30, 20 및 10 μl
- 레인 10: 비어 있음
- 레인 11 - 15: BSA 단백질의 참조 샘플, 각각: 0.25, 0.5, 1, 2 및 3 μg.
도 3 및 4:
곤충 세포 발현된 PCV2 ORF2 단백질로부터 제조된 백신을 투여받은 후 PCV2에 의해 감염된 챌린지를 받은 돼지의 상이한 조직에 대한 면역조직화학으로부터의 결과의 그래프 표현. 편도, 장간막 림프절 ('Mes. ln') 및 서혜 림프절 ('Ing. ln')에 대한 조직 결과가 제공된다.
적용된 (또는 그렇지 않은) 다양한 백신은 수평축에 표시되어 있으며; 수직축은 특정한 점수화 등급에 따른 IHC 강도의 임의의 점수를 나타낸다.
도 3은 유독성 PCV2b 바이러스에 의한 챌린지 감염을 받은 세트 1의 그룹 1-7의 동물에 대한 IHC 결과를 나타내고;
도 4는 세트 2의 그룹 1-7의 동물에 대한 IHC 결과를 나타내며, 여기서 동물은 유독성 PCV2d 바이러스에 의해 챌린지되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Intervet Int. BV <120> Expression of PCV2 ORF2 in insect cells <130> 24469 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCV2b ORF2 gene - mutated <220> <221> CDS <222> (1)..(699) <400> 1 atg acc tac ccc cgt cgt cgt tac cgt cgt cgt cgt cac cgt ccc cgt 48 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 agc cat ctg ggc caa atc ctt cgt cgt cgt ccc tgg ctg gtt cac ccc 96 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 cgt cat cgt tac cgt tgg cgt cgt aag aac ggt atc ttc aac acc cgt 144 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 ctt tca cgt acc ttc gga tac act gtt aag cgt acc act gtg aaa act 192 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr 50 55 60 ccc agc tgg gct gtt gac atg atg cgt ttc aac atc aac gac ttc ctt 240 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu 65 70 75 80 ccc ccc gga ggt gga agc aac ccc cgt tct gtg ccc ttc gag tac tac 288 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 cgt atc cgt aag gtt aaa gtg gaa ttc tgg ccc tgc tct ccc atc acc 336 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 caa ggc gac cgt ggc gtt ggt agc tct gcc gtg atc ctt gac gac aac 384 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 ttc gtt ccc aaa gct acc gcc ctc act tac gac ccc tac gtg aac tac 432 Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 tca agc cgt cac acc atc act caa ccc ttc tct tac cat tca cgt tac 480 Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 ttc acc ccc aag ccc gtt ctc gac tct act atc gac tac ttc caa ccc 528 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 aac aac aaa cgt aac caa ctg tgg ctt cgt ctc caa acc act ggt aac 576 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn 180 185 190 gtt gac cac gtg gga ctg ggc acc gct ttc gag aac tca atc tac gac 624 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 caa gaa tac aac atc cgt gtt act atg tac gtg caa ttc cgt gag ttc 672 Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 aac ctc aag gac ccc ccc ctg aac ccc taa 702 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro 225 230 <210> 2 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 2 Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro 20 25 30 Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr 50 55 60 Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95 Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140 Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro 165 170 175 Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn 180 185 190 Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205 Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe 210 215 220 Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro 225 230

Claims (14)

  1. 하기를 포함하는 이종 핵산을 포함하는 곤충 세포로서:
    a. 유전자형 2b의 돼지 서코바이러스 2 (PCV2b)로부터의 ORF2 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및
    b. 상기 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 전사 제어 서열,
    뉴클레오티드 서열이 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는
    곤충 세포.
  2. 제1항에 있어서, 전사 제어 서열이 바큘로바이러스 p10 유전자 프로모터 또는 바큘로바이러스 폴리헤드린 유전자 프로모터인 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이종 핵산이 재조합 바큘로바이러스 게놈에 포함되는 것을 특징으로 하는 곤충 세포.
  4. 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질이 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 것을 특징으로 하는, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 바이러스-유사 입자 (VLP).
  5. 바큘로바이러스-곤충 세포 발현 시스템을 이용하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 곤충 세포에서의 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 발현 방법.
  6. 하기로부터 선택된 하나의 단계 또는 둘 다의 단계를 포함하는, 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 생산 방법:
    - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 곤충 세포를 배양하는 단계; 및
    - 곤충 세포 배양물로부터 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 수확하는 단계.
  7. 제약상 허용가능한 담체 중 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 포함하는, PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후의 감소를 위한 돼지 동물용 백신으로서, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질이 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 것을 특징으로 하는 백신.
  8. 제7항에 있어서, 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질이 VLP 형태인 백신.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 아주반트를 포함하는 백신.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 돼지 동물에 병원성인 미생물의 추가 항원을 포함하는 백신.
  11. 돼지 동물에서 PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후를 감소시키는 방법으로서, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 백신을 상기 돼지 동물에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  12. PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후의 감소를 위한 돼지 동물용 백신의 제조를 위한, 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질의 용도.
  13. PCV2에 의한 감염 또는 연관 질환 징후의 감소를 위한 돼지 동물용 백신에 사용하기 위한, 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질.
  14. 하기로부터 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는, 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 백신의 제조 방법:
    - 아미노산 위치 번호 131에 프롤린을 갖는 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질을 제약상 허용가능한 담체와 부가혼합하는 단계; 및
    - 돌연변이체 PCV2b ORF2 단백질 및 제약상 허용가능한 담체의 상기 부가혼합물을 아주반트와 함께 제형화하는 단계.
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