CN104984335A - 猪圆环病毒双亚型orf2共表达载体构建及疫苗制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体构建及疫苗制备。具体而言，本发明涉及一种免疫原性组合物、其制备方法、制药用途及含该免疫原性组合物的药盒，该免疫原性组合物含有PCV2a ORF2编码的Cap蛋白和PCV2b ORF2编码的Cap蛋白。本发明还涉及一种猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体、重组穿梭质粒和重组杆状病毒，其含有猪圆环病毒PCV2a ORF2和PCV2b ORF2。本发明的免疫原性组合物能够为PCV的防控提供更有效、更全面的防护，同时一针双防，在提供全面保护效果的同时，还可减少免疫次数，节约免疫成本。
Description
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体的构建及亚单位疫苗的制备。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是最小的动物病毒之一，病毒粒子直径17-20nm，属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，单股、环状、闭合的DNA病毒。根据致病性、抗原性和核酸序列的差异，PCV可分为PCV1和PCV2。PCV1为猪肾细胞系的一种污染物，对猪无致病性，而PCV2具有致病性，PCV2及其与其他病原体混合感染对养猪业带来重大经济损失。在猪圆环病毒病(Postwearing multisystemic wasting syndrome associated disease,PCVAD)中，断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)和猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease comples，PRDC)是最常见的临床表现形式。PCV2感染使机体在感染期间发生免疫抑制，可造成猪的淋巴细胞缺失，不能通过有效的免疫应答清除病毒。在患病最后阶段，PMWS病猪表现为严重的淋巴组织损伤，同时影响外周血单核细胞和淋巴组织器官中细胞因子的表达。
PCV2分为PCV2a，PCV2b和PCV2c三个基因亚型。PCV2主要有两个开放阅读框ORF1和ORF2。ORF1位于病毒基因组上，编码两种复制酶(Replicase，Rep和Rep’)；ORF2位于病毒基因组的链上，编码病毒粒子的Cap蛋白。该蛋白是PCV2唯一的结构蛋白，也是PCV2主要的免疫原性蛋白。PCV2ORF2的大部分基因是抗原表位的所在区域。
2003年前PCV2流行毒株以PCV2a亚型毒株为主，其后至今PCV2流行毒株则以PCV2b亚型为主。临床PMWS发生率与PCV2a向PCV2b基因型的改变有密切相关。如2004年加拿大魁北克州的猪场鉴定出新的基因型PCV2b，猪群中PCVAD的死亡率有所增加。韩国在2000～2008年期间鉴定出的PCV2毒株大部分为PCV2b。
为防控PCV2对养猪业造成的影响，研发了多种PCV2商品化疫苗。疫苗的应用有效控制了PCV2的流行。PCV2疫苗自从2006年商品化以来，该疫苗已成为防控PCVAD最重要的手段。目前为止，全球已成功注册的PCV2疫苗分为2类：全病毒灭活疫苗和单亚型亚单位疫苗。其中进口注册的商品化疫苗全部来源于PCV2a基因型毒株，国内近几年陆续有PCV2b亚型的灭活疫苗与亚单位疫苗上市，如申请人的猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C)株，武汉中博生物股份有限公司的猪圆环病毒2型杆状病毒载体灭活疫苗(CP08株)等。尽管已有上述国内外多个不同种类、不同亚型的疫苗上市，但圆环病毒的防控效果并不理想，仍然是困扰养殖业的一个重大疫病。如前所述，PCV2a疫苗株、PCV2b疫苗株虽然能够相互提供一定的交叉保护，但由于PCV2a与PCV2b毒株之间的抗原性存在差异，保护力无法达到100％，这可能是造成疫病防控效果不佳的主要原因之一。
因此，本领域仍然需要能够为PCV的防控提供更有效、更全面的防护，同时一针双防，在提供全面保护效果的同时，还可减少免疫次数，节约免疫成本的疫苗。
发明内容
本发明提供一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物含有PCV2a ORF2编码的Cap蛋白和PCV2b ORF2编码的Cap蛋白。
在一个具体实施例中，所述PCV2a ORF2编码的Cap蛋白如SEQ ID NO:2所示。
在一个具体实施例中，所述PCV2b ORF2编码的Cap蛋白如SEQ ID NO:4所示。
在一个具体实施例中，所述免疫原性组合物还含有佐剂。
在一个具体实施例中，所述佐剂选自：NeB复合缓释水性佐剂。
在一个具体实施例中，所述佐剂含有MONTANIDE ISA 28VG水性佐剂和Carbopol971P。
在一个具体实施例中，所述免疫原性组合物中每毫升免疫组合物含1μg-100μg，优选每毫升5μg-50μg，最优选每毫升20μg的Carbopol971P。
本发明还提供一种构建猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体，该表达载体使用pFastBac-Dual载体作为骨架，在该载体的Pp10启动子下游插入PCV2a的ORF2，在该载体的PpH启动子下游插入PCV2b的ORF2。
在一个具体实施例中，在该载体的Pp10启动子下游插入PCV2b的ORF2，在该载体的PpH启动子下游插入PCV2a的ORF2。
在一个具体实施例中，所述PCV2a的ORF2如SEQ ID NO:1所示。
在一个具体实施例中，所述的PCV2b的ORF2如SEQ ID NO:3所示。
在一个具体实施例中，所述共表达载体是重组转移质粒。
本发明还提供一种重组穿梭质粒，该重组穿梭质粒以杆状病毒骨架载体Bacmid为骨架，并含有PCV2a ORF2和PCV2b ORF2。
在一个具体实施例中，所述PCV2a的ORF2如SEQ ID NO:1所示。
在一个具体实施例中，所述的PCV2b的ORF2如SEQ ID NO:3所示。
在一个具体实施例中，所述重组穿梭质粒经由所述共表达载体与杆状病毒骨架载体Bacmid在宿主细胞中发生同源重组而制备得到。
在一个具体实施例中，所述宿主为大肠杆菌。
本发明还提供一种重组杆状病毒，该重组杆状病毒含有PCV2a ORF2和PCV2b ORF2。
在一个具体实施例中，所述PCV2a的ORF2如SEQ ID NO:1所示。
在一个具体实施例中，所述的PCV2b的ORF2如SEQ ID NO:3所示。
在一个具体实施例中，通过用所述重组穿梭质粒转染昆虫细胞而制备得到所述重组杆状病毒。
本发明还提供一种免疫原性组合物的制备方法，该方法包括：
(1)提供猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体；
(2)由(1)所述的猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体制备重组穿梭质粒；
(3)将步骤(2)所述重组穿梭质粒转染昆虫细胞，制备得到重组杆状病毒；
(4)将步骤(3)所获得的重组杆状病毒接触昆虫细胞，获得重组蛋白PCV2aCap和PCV2b Cap；
(5)将步骤(4)所获得的重组蛋白加到佐剂中，从而制备得到所述免疫原性组合物。
在一个具体实施例中，所述步骤(1)中的猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体使用pFastBac-Dual载体作为骨架，在该载体的Pp10启动子下游插入PCV2a的ORF2，在该载体的PpH启动子下游插入PCV2b的ORF2。
在一个具体实施例中，所述步骤(1)中的猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体使用pFastBac-Dual载体作为骨架，在该载体的Pp10启动子下游插入PCV2b的ORF2，在该载体的PpH启动子下游插入PCV2a的ORF2。
在一个具体实施例中，步骤(2)中的重组穿梭质粒以杆状病毒骨架载体Bacmid为骨架，并含有PCV2a ORF2和PCV2b ORF2。
在一个具体实施例中，所述佐剂为NeB复合缓释水性佐剂。
本发明还提供所述免疫原性组合物在制备能减轻PCV2感染相关性临床症状的严重性的药物中的应用。优选地，所述药物用于预防PCV2感染，尤其是PCV2a和PCV2b单独或混合感染，更优选用于小猪。
本发明还包括所述免疫原性组合物在制备用于(i)预防PCV2再次感染或(ii)减少或消除PCV2所致对象临床症状的药物中的应用。
附图说明
图1显示pFastBac-Dual载体图谱。
图2显示PCV2-OFR2进化树分析。
图3显示重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap的PCR鉴定。其中，M为DNA marker DL2000；1为重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap以PCV2a-Cap引物进行PCR扩增的产物；2为重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap以PCV2b-Cap引物进行PCR扩增的产物。
图4显示重组转移质粒pFastBac/PCV2a-PCV2b-Cap的酶切鉴定。其中，M1为DNA marker DL2000；M2为DNA marker DL15000；1和2分别为重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap的BamH Ⅰ、Not Ⅰ双酶切产物。
图5显示重组杆状病毒转染Sf9细胞，其中A为正常Sf9细胞(200X)，B为rBac/PCV2a-PCV2b-Cap转染Sf9细胞(200X)。
具体实施方式
本发明基于PCV2a-2b双亚型的亚单位疫苗。
本发明所用的“免疫原性或免疫原性组合物”指包含至少两种抗原的组合物，所述抗原能在宿主中引发针对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种作用：产生或激活抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞，其特异性针对感兴趣组合物或疫苗中包含的抗原。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫应答，而提高对新发感染的抵抗力和/或降低疾病的临床严重程度。可通过感染宿主通常所显示症状的减轻或缺失、恢复时间较短和/或感染宿主中病毒效价降低来表明这种保护作用。
本文中，“穿梭载体”或“穿梭质粒”指一种DNA分子，其包含至少一个复制起点、异源基因(在本文中是PCV2ORF2)和允许将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列。允许将所述异源基因克隆入病毒载体的DNA序列优选侧接于该异源基因。更优选的是，这些侧接序列至少与该病毒载体序列部分同源。这种序列同源性可允许病毒载体和穿梭载体的分子之间发生重组，而产生含有该异源基因的重组病毒载体。所述穿梭载体优选包含PCV2a和PCV2b的ORF2DNA。
在更优选的形式中，本发明将从分离PCV2a和PCV2b的ORF2DNA开始。通常，该DNA可来自已知或未知毒株，因为ORF2DNA似乎在不同分离物中高度保守，序列相同性至少约为95％。本领域已知的任何PCV2a和PCV2b的ORF2DNA均可用于本发明。SEQ ID NO:1和3分别显示了PCV2a ORF2DNA和PCV2b ORF2DNA的实例。
因此，本发明提供了构建含有PCV2a ORF2DNA和PCV2b ORF2DNA的重组病毒载体的方法。此方法包括以下步骤：i)将重组PCV2a ORF2DNA和PCV2b ORF2DNA克隆入穿梭载体；和ii)将含有重组PCV2a ORF2DNA和PCV2b ORF2DNA的穿梭载体转染到病毒载体中，产生重组病毒载体。
在步骤i)之前还可包括以下步骤：体外扩增PCV2a ORF2DNA和PCV2bORF2DNA；将体外扩增获得的PCV2a ORF2DNA和PCV2b ORF2DNA克隆到转移质粒中；和用该转移质粒转化宿主细胞(例如大肠杆菌)，使之与杆状病毒骨架载体在该宿主细胞中发生同源重组，从而制备得到所述穿梭载体。
用于构建转移质粒的载体例子包括pFastBac-Dual载体。通常，在pFastBac-Dual载体的Pp10启动子下游插入PCV2a的ORF2，PpH启动子下游插入PCV2b的ORF2，获得重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap。或者，也可在Pp10启动子下游插入PCV2b的ORF2，而在PpH启动子下游插入PCV2a的ORF2。此外，可将上述ORF进行合适次数的重复插入。
用于构建转移质粒的骨架可以是杆状病毒骨架载体Bacmid。
前述步骤ii)通常在昆虫细胞中进行，例如在Sf9细胞中进行。
基于制备得到的重组蛋白，本发明提供了一种用于引发抗PCV2a和PCV2b的免疫应答的药物组合物或免疫原性组合物，该组合物可包含一种或多种药学上可接受的载体。本文所用术语"药学上可接受的载体"包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。
稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等渗剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖等。稳定剂包括白蛋白、乙二胺四乙酸的碱金属盐、海藻糖、和蔗糖等。
此外，本发明的药物或免疫原性组合物(例如疫苗)可包含佐剂。本文所用“佐剂”可包括氢氧化铝和磷酸铝，皂苷如Quil A、QS-21，油包水乳液，水包油乳液，水包油包水乳液。具体说，乳液可基于轻质石蜡油；类异戊二烯油如角鲨烷或角鲨烯；链烯，具体是异丁烯或癸烯硫代寡聚化产生的油；含有直链烷基的酸或醇的酯，更具体是植物油、油酸乙酯、二(辛酸/癸酸)丙二醇酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或二油酸丙二醇酯；支链脂肪酸或醇的酯，具体是异硬脂酸酯。将油与乳化剂联用以形成乳液。乳化剂优选非离子性表面活性剂，具体是山梨聚糖、二缩甘露醇(如油酸脱水甘露醇酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯(任选乙氧基化)，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，具体是普朗尼克产品，尤其是L121。
佐剂的另一个例子是选自丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物的或者顺丁烯二酸酐与烯基衍生物共聚物的化合物。佐剂化合物宜为交联的、尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物。这些化合物称为卡波姆。以名称卡巴浦尔出售的产品(BF Goodrich，Ohio，USA)尤其合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基戊赤藓醇交联。其中，可提及的有卡巴浦尔974P、934P和971P。最优选采用卡巴浦尔971P。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解产生的酸溶液应予中和，优选中和至生理pH，以产生其中可掺入免疫原性、免疫或疫苗组合物本身的佐剂溶液。
优选每剂量加入约100μg-10mg量的佐剂。更优选每剂量加入约500μg-5mg量的佐剂。更优选每剂量加入约750μg-2.5mg量的佐剂。最优选每剂量加入约1mg量的佐剂。
在一个优选的实施例中，使用法国SEPPIC MONTANIDE ISA 28VG优质水性佐剂。在更优选的实施例中，使用法国SEPPIC公司MONTANIDE ISA28VG水性佐剂与CAM高级聚合物Carbopol971P的混合物(本文称该混合物为“NeB复合缓释水性佐剂”)。该NeB复合缓释水性佐剂具有复合缓释双重作用。所述MONTANIDE ISA 28VG能诱发高免疫力，且无副反应。Carbopol971P高聚物能使病毒颗粒均匀的分布在交联的高聚合物中，同时在整体和复微粒释放系统中均具有高效控释作用。优选的，每毫升免疫组合物(例如疫苗成品)中，Carbopol971P添加的比例约为1μg-100μg，更优选每毫升加入约5μg-50μg，最优选每毫升加入约20μg的Carbopol971P。
本发明组合物中包含的PCV2a和PCV2b Cap蛋白的水平至少为0.2μg抗原/ml最终免疫原性组合物(μg/ml)，更优选约0.2-400μg/ml，更优选约0.3-200μg/ml，更优选约0.35-100μg/ml，更优选约0.4-50μg/ml，更优选约0.45-30μg/ml，更优选约0.6-15μg/ml，更优选约0.75-8μg/ml，更优选约1.0-6μg/ml，更优选约1.3-3.0μg/ml，更优选约1.4-2.5μg/ml，更优选约1.5-2.0μg/ml。
本文所述组合物可制成已知的可注射、生理可接受的无菌溶液。对于制备用于胃肠道外注射或输注的即用型溶液而言，易于获得等渗水溶液，如盐水或相应的血浆蛋白质溶液。
本发明的该免疫原性组合物还可包含一种或多种其它免疫调节剂，如白介素、干扰素或其它细胞因子。该免疫原性组合物也可含庆大霉素和硫柳汞。
本发明还提供一种药盒，其装有本发明免疫原性组合物和说明手册，用以指导技术人员将所述免疫原性组合物给予所需的对象，如猪。
本发明还包括将本文所述任何组合物用作药物，优选用作兽用药物，更优选用作疫苗的应用。而且，本发明也涉及本文所述任何组合物用于制备能减轻PCV2感染相关性临床症状的严重性的药物的应用。优选地，所述药物用于预防PCV2感染，尤其是PCV2a和PCV2b单独或混合感染，更优选用于小猪。
本发明还包括用于(i)预防PCV2感染或再次感染或(ii)减少或消除PCV2所致对象临床症状的方法，所述方法包括将本文所述任何免疫原性组合物给予需要的对象。所述对象优选猪。优选通过肌肉内给予该免疫原性组合物。优选给予一个剂量或两个剂量的该免疫原性组合物，其中一个剂量优选含有至少约3μg PCV2a和PCV2b ORF2蛋白，更优选约3-4μg，和至少约10-100μg卡巴浦尔，优选约40μg卡巴浦尔。通常，一个剂量的体积约为2ml。
下文将以具体实施例的方式描述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不限制本发明的保护范围。实施例中所用的实验条件、试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的实验条件和试剂。
1、共表达载体的构建与鉴定
本研究使用重组杆状病毒的商品化载体pFastBac-Dual(购自Invitrogen公司)进行共表达载体的构建。pFastBac-Dual载体含有Pp10、PpH两套启动子，每套启动子下游均有一个多克隆位点，pFastBac-Dual载体可以插入两个目的基因。
1.1引物设计
1.1.1 PCV2a引物
根据GeneBank数据库中的PCV2a型毒株序列设计PCV2a-Cap扩增与鉴定引物，引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。引物序列如下：
F.PCV2a-Cap:5’-AGTTCTCGAGATGACGTATCCAAGGAGGC-3’(SEQID NO:5)
R.PCV2a-Cap:5’-AAGGTACCTTAGGGTTTAAGTGGGGGGTC-3’(SEQID NO:6)
上游引物及下游引物分别引入XhoI、KpnI酶切位点。
1.1.2 PCV2b引物
从临床上分离获得一株PCV2b型毒株NBV001株，序列及进化树分析见附图，设计PCV2b-Cap扩增与鉴定引物，引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。引物序列如下：
F.PCV2b-Cap:5’-ATGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3’(SEQ IDNO:7)
R.PCV2b-Cap:5’-TAGCGGCCGCTTAAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3’(SEQ ID NO:8)
上游引物及下游引物分别引入BamH Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点。
1.2重组转移质粒的构建
在pFastBac-Dual载体的Pp10启动子下游插入PCV2a的ORF2片段(PCV2a-Cap)，PpH启动子下游插入PCV2b的ORF2片段(PCV2b-Cap)，获得重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap。
具体操作为：
(1)以感染有PCV2a型仔猪的组织DNA为模板，以F.PCV2a-Cap和R.PCV2a-Cap为引物，用TaKaRa rTaq酶进行PCV2a-Cap片段的PCR扩增；反应程序为：95变性5min后进入循环，94℃变性60s，58℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃充分延伸10min。取5μL扩增产物加1μL 6×LoadingBuffer混匀后，于1％琼脂糖凝胶中电泳，分析扩增产物。PCV2a-Cap基因克隆扩增产物DNA，经过PCR检测结果与预期的结果一致，约为710bp。
(2)以PCV2b型毒株NBV001株DNA为模板，以F.PCV2b-Cap和R.PCV2b-Cap为引物，用TaKaRa rTaq酶进行PCV2b-Cap片段的PCR扩增；反应程序为：95变性5min后进入循环，94℃变性60s，58℃退火45s，72℃延伸30s，30个循环后，72℃充分延伸10min。取5μL扩增产物加1μL 6×LoadingBuffer混匀后，于1％琼脂糖凝胶中电泳，分析扩增产物。PCV2b-Cap基因克隆扩增产物DNA，经过PCR检测结果与预期的结果一致，约为710bp。
(3)XhoI、KpnI双酶切pFastBac-Dual载体以及PCV2a的Cap片段，T4DNA连接酶将双酶切的载体和片段连接，连接产物转化DH5α，挑取单菌落，用PCV2a的Cap引物对其进行PCR鉴定，获得阳性菌，提取pFastBac/PCV2a-Cap质粒，测序鉴定。BamH Ⅰ、Not Ⅰ双酶切pFastBac/PCV2a-Cap质粒以及PCV2b的Cap片段，T4DNA连接酶将双酶切的pFastBac/PCV2a-Cap质粒以及PCV2b的Cap片段连接，连接产物转化DH5α，挑取单菌落，用PCV2b的Cap引物对其进行PCR鉴定，获得重组转移质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap，用BamH Ⅰ、Not Ⅰ双酶切进行鉴定。
1.3重组穿梭质粒Bacmid/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap的获得
1.3.1大肠杆菌DH10Bac感受态细菌的制备与转化
在卡那霉素(50μg/ml)抗性平板上挑取一个新鲜的DH10Bac菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的5ml LB培养基中，37℃200rpm过夜振荡培养；第二天按1/100体积接种于新的含卡那霉素的LB培养基中，振荡培养。取1.5ml菌液制备感受态细胞，方法参见分子克隆。按照Bac-to-Bac表达系统说明书进行重组质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap转化DH10Bac感受态细胞，在DH10Bac中Helper质粒的辅助作用下，重组质粒pFastBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap和杆状病毒骨架载体Bacmid之间发生同源重组得到含有PCV2a-Cap-PCV2b-Cap的重组穿梭质粒Bacmid/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap。
1.3.2重组细菌的挑选和质粒提取
经过48h培养，挑取平板上大的白色菌落进行第二次蓝白斑筛选，挑取二次筛选仍为白色的菌落接种于3.0ml含四环素(10μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、庆大霉素(7μg/ml)的LB培养基中，过夜培养。按照说明书提供的方法提取重组质粒Bacmid/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap。
1.3.3重组质粒的PCR鉴定
以提取的重组质粒作为模板，以M13通用引物、PCV2a-Cap、PCV2b-Cap引物进行PCR鉴定，同时设立未插入外源基因片段的DH10Bac质粒对照组。
1.4重组质粒转染Sf9细胞
以LipofectaminTM2000为共转染试剂，按照说明书转染Sf9单层细胞，具体操作如下：
转染前一天，在24孔板上的每一孔接种5.0×104个Sf9细胞，每一孔用营养液0.5ml，营养液含10％的胎牛血清，27℃培养过夜，当细胞密度和活力达到90-95％时即可用于转染；在转染前取出-20℃保存的阳离子脂质体转染试剂，使之达到室温并涡旋；取一个灭菌的EP管按1μg质粒加入3μl转染试剂的比例加入Bacmid/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap和转染试剂，用无血清培养基补足200μl，室温温育15min；从温箱中取出细胞板，弃上清，把200μl混合物加入细胞孔。立即把细胞板放入温箱中，温育1.0h后，轻轻加入0.5ml室温的完全生长液，把细胞放入温箱，每天观察细胞病变。转染同时设立野生型Bacmid转染对照。
1.5重组病毒的获得与增殖
转染后每天观察细胞病变情况，在转染3天可见细胞病变(细胞变大变圆)，继续培养至第5天，收获培养上清，2000×g，离心10min，将上清转移至新的灭菌离心管中，即为第一代病毒P1，重组杆状病毒命名为rBac/PCV2a-Cap-PCV2b-Cap。将第一代重组病毒按1：10(重组病毒：Sf9)的体积比感染处于对数生长期的Sf9细胞，27℃培养3-4d至细胞出现明显病变时，即可收获上清得到第二代病毒P2；用同样的方法获得第三代病毒P3，每一代病毒均放置4℃避光保存。
1.6重组病毒滴度测定
按照Bac-to-Bac表达系统说明书的方法进行空斑试验，计算重组病毒的滴度。用营养液将重组病毒作10倍梯度稀释。然后分别接种于长满Sf9细胞单层的24孔细胞培养板，每个稀释度接种2个孔，每孔接种100μl。同时设定不接毒的阴性对照。27℃吸附1h，弃去病毒液，每孔加入配制好的琼脂0.5ml，27℃培养7-10天，中性红染色2h后计算每个稀释度每孔中空斑数量。病毒的滴度可达2×108pfu/ml。
2、重组蛋白的表达鉴定
2.1抗原捕获ELISA定量法分析PCV2的抗原表达量
利用包被液对兔抗-PCV2 IgG进行1:10000倍稀释后，包被于微量滴定板中，100μL/孔，4℃密封培育过夜。然后用含有1％吐温20的磷酸缓冲液PBS洗涤该平板三次。而后用1％BSA封闭液进行封闭，37℃密封作用60min。继续用含有1％吐温20的磷酸缓冲液PBS洗涤该平板三次。下一步将预先稀释200倍或500倍的待测抗原样品加入到平板第一列各孔中，然后依次倍比稀释，37℃密封作用60min。用洗液洗涤三次。抗PCV2 Cap蛋白的单抗(购自VMRD,Inc.)用稀释液进行1:500倍稀释后加入到各孔中，100μL/孔，37℃密封作用60min。用洗液洗涤三次。用含有1％BSA的稀释液1:10000稀释碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗，每孔加入100μL，37℃密封作用60min。用洗液洗涤三次。加入100μL底物显色，37℃密封作用30min，而后用每孔加入100μL 3M的NaOH终止反应。然后通过酶标仪进行读数，确定抗原稀释终点，以此为基准，计算抗原含量。
Sf9昆虫细胞以120r/min 27℃摇瓶悬浮培养，当浓度达到1～2×106/mL且活细胞比例高于95％时，以感染复数(M.O.I.)1.0的比例接入重组的杆状病毒。经过3-4天培养，10000g离心1min分离细胞碎片和上清，以抗原捕获ELISA法检测抗原表达量。重组蛋白的总表达量为110μg/ml左右。
3、亚单位疫苗的制备
以本发明构建的重组杆状病毒rBac-PCV2a-PCV2b-Cap，接种昆虫细胞Sf9，培养环境为27℃120r/min，培养72h，收获感染细胞，反复冻融3次，用PBS离心洗涤方法数次后取上清，将重组蛋白提纯加入佐剂(NeB复合缓释水性佐剂，含约20μg卡巴浦尔/毫升亚单位疫苗)并经过乳化即可制备出PCV2a-2b-Cap亚单位疫苗。
4、表达蛋白的免疫保护情况
4.1实验设计
选用14～21日龄的PCV2核酸和抗体检测均为阴性的健康仔猪45头，随机分为9组，每组5头。第一、二组均用本发明制备的PCV2a-2b亚单位疫苗进行免疫，分别用PCV2a毒株(每毫升含103.5TCID50)及PCV2b毒株进行攻毒(每毫升含103.0TCID50)；第三、四组均用商品化PCV2a疫苗进行免疫，分别用PCV2a毒株及PCV2b毒株进行攻毒；第五、六组均用商品化PCV2b疫苗进行免疫，分别用PCV2a毒株及PCV2b毒株进行攻毒；第七、八组不接种作为攻毒对照；第九组为空白对照组。分别为：A组：PCV2a-2b-Cap/PCV2a、B组PCV2a-2b-Cap/PCV2b、C组/PCV2a-Cap/PCV2a、D组：PCV2a-Cap/PCV2b、E组PCV2b-Cap/PCV2a、F组：PCV2b-Cap/PCV2b、G组：PCV2a攻毒对照组、H组：PCV2b攻毒对照组、I组：Blank group，具体试验方案见表1。
表1:实验设计
| 组别 | 免疫品种 | 免疫剂量 | 数量 | 攻毒情况 | 攻毒剂量 |
| A | PCV2a-2b-Cap | 1头份 | 5 | PCV2a | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| B | PCV2a-2b-Cap | 1头份 | 5 | PCV2b | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| C | PCV2a-Cap | 1头份 | 5 | PCV2a | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| D | PCV2a-Cap | 1头份 | 5 | PCV2b | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| E | PCV2b-Cap | 1头份 | 5 | PCV2a | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| F | PCV2b-Cap | 1头份 | 5 | PCV2b | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| G | 不免疫 | — | 5 | PCV2a | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| H | 不免疫 | — | 5 | PCV2b | 滴鼻、肌肉注射各2ml |
| I | 不免疫 | — | 5 | 不攻毒 | — |
4.2免疫保护检测结果的分析
4.2.1猪圆环病毒2型(PCV2)核酸载量检测法
4.2.1.1按下表所述合成所需引物：
4.2.1.2样品DNA的提取：称取至多25mg的组织块，按照试剂盒说明书要求提取总DNA。
4.2.1.3标准曲线的制作：取阳性对照模板，以灭菌蒸馏水进行100倍稀释后，按10倍比例进行梯度稀释，获得10-4～10-8稀释度的模板。
4.2.1.4按下表所述(每反应管所需量)分别配制PCV2和HMBS扩增反应体系：
将配制完成的反应体系加入PCR反应板中，每个样品重复3次，封膜，2000g离心2分钟。检查管底、管壁是否存在气泡，否则重新离心，使气泡消除。
4.2.1.5检测：将反应板放入设备中，设置如下热循环程序：95℃30s预变性；95℃5s，60℃30s，循环40次，荧光采集设置在退火延伸步骤；最后按设备要求进行60℃～95℃退火曲线检测。
4.2.1.6结果分析：
根据标准曲线，计算样品中PCV2和HMBS的含量。
按如下公式计算PCV2核酸载量：
4.2.2检测结果分析
攻毒后第28日，各组猪全部扑杀，采集每头猪的腹股沟淋巴结、肺门淋巴结及肠系膜淋巴结，猪圆环病毒2型(PCV2)核酸载量检测法检测猪淋巴结组织中的PCV2核酸载量。用Student’s t test方法对检测结果进行统计学分析，免疫组应显著低于对照组(P<0.05)，判为保护，具体结果见表2。
表2:免疫保护实验结果
| 组别 | 免疫品种 | 攻毒情况 | 发病情况 | 保护率 |
| A | PCV2a-2b-Cap | PCV2a | 0/5 | 100％ |
| B | PCV2a-2b-Cap | PCV2b | 0/5 | 100％ |
| C | PCV2a-Cap | PCV2a | 0/5 | 100％ |
| D | PCV2a-Cap | PCV2b | 2/5 | 60％ |
| E | PCV2b-Cap | PCV2a | 1/5 | 80％ |
| F | PCV2b-Cap | PCV2b | 0/5 | 100％ |
| G | 不免疫 | PCV2a | 5/5 | 5 |
| H | 不免疫 | PCV2b | 5/5 | 5 |
| I | 不免疫 | 不攻毒 | 0/5 | 5 |
攻毒后猪圆环病毒2型(PCV2)核酸载量检测法检测猪淋巴结组织中病毒载量，并与对照对比，结果显示，共表达PCV2a-2b的疫苗组合物组能很好的抵抗PCV2a与PCV2b强毒的攻击，保护率可达100％；而单独免疫PCV2a疫苗组能很好的抵抗PCV2a强毒的攻击，但对于PCV2b的保护率则较低，仅为60％；单独免疫PCV2b疫苗组能很好的抵抗PCV2b强毒的攻击，但对于PCV2a的保护率则仅为80％。
上述结果表明，虽然单独免疫PCV2a或PCV2b在面对不同亚型病毒攻击时，可以提供一定的交叉免疫保护，本试验结果显示交叉保护率为60％～80％，无法达到全面的保护；本发明的疫苗组合物因为同时含有PCV2a-2b的外壳蛋白，免疫猪后，相比单独免疫PCV2a或PCV2b而言，可以更加有效且全面的帮助机体抵抗猪圆环病毒不同亚型即PCV2a与PCV2b的攻击。
虽然以具体实施例的方式描述了本发明，但应理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明作出各种修改或变动，这些修改或变动都在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种免疫原性组合物，该免疫原性组合物含有PCV2a ORF2编码的Cap蛋白和PCV2b ORF2编码的Cap蛋白。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述PCV2a ORF2编码的Cap蛋白如SEQ ID NO:2所示；所述PCV2b ORF2编码的Cap蛋白如SEQ ID NO:4所示。
3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述免疫原性组合物还含有佐剂，优选为NeB复合缓释水性佐剂。
4.一种猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体，其特征在于，所述表达载体以pFastBac-Dual载体作为骨架，在该载体的Pp10启动子下游插入PCV2a的ORF2，在该载体的PpH启动子下游插入PCV2b的ORF2，或在该载体的Pp10启动子下游插入PCV2b的ORF2，在该载体的PpH启动子下游插入PCV2a的ORF2。
5.一种重组穿梭质粒，其特征在于，该重组穿梭质粒以杆状病毒骨架载体Bacmid为骨架，并含有PCV2a ORF2和PCV2b ORF2。
6.一种重组杆状病毒，其特征在于，该重组杆状病毒含有PCV2a ORF2和PCV2b ORF2。
7.如权利要求4所述的共表达载体、权利要求5所述的重组穿梭质粒或权利要求6所述的重组杆状病毒，其特征在于，
所述PCV2a的ORF2如SEQ ID NO:1所示，和/或
所述的PCV2b的ORF2如SEQ ID NO:3所示，和/或
所述重组穿梭质粒经由所述共表达载体与杆状病毒骨架载体Bacmid在宿主细胞例如大肠杆菌中发生同源重组而制备得到，和/或
通过用所述重组穿梭质粒转染昆虫细胞而制备得到所述重组杆状病毒。
8.一种免疫原性组合物的制备方法，该方法包括：
(1)提供猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体；
(2)由(1)所述的猪圆环病毒双亚型ORF2共表达载体制备重组穿梭质粒；
(3)将步骤(2)所述重组穿梭质粒转染昆虫细胞，制备得到重组杆状病毒；
(4)将步骤(3)所获得的重组杆状病毒接触昆虫细胞，获得重组蛋白PCV2aCap和PCV2b Cap；和
(5)将步骤(4)所获得的重组蛋白加到佐剂中，从而制备得到所述免疫原性组合物。
9.权利要求1－3中任一项所述免疫原性组合物在制备(i)减轻或消除PCV2a、PCV2b单独或混合感染相关性临床症状或其严重性或(ii)预防PCV2再次感染的药物中的应用。
10.一种药盒，所述药盒含有权利要求1－3中任一项所述的免疫原性组合物。
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