CN111212847B - PCV2b ORF2蛋白在昆虫细胞中的重组表达 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及兽医疫苗的领域，尤其涉及针对PCV2和相关疾病的猪疫苗。具体地，本发明涉及以下发现：在PCV2b ORF2蛋白中需要突变，以防止其在昆虫细胞中表达后的核积累；所述突变在氨基酸位置131处引入脯氨酸。这允许在昆虫细胞中的有效表达，容易收获，且生成大量病毒样颗粒。VLP在猪的疫苗中对于减少PCV2的感染或相关疾病体征高度有效。

Description

PCV2b ORF2蛋白在昆虫细胞中的重组表达
本发明涉及兽医疫苗的领域，尤其涉及针对PCV2的猪疫苗。具体地，本发明涉及包含表达突变型PCV2b ORF2蛋白的异源核酸序列的昆虫细胞，突变型PCV2b ORF2蛋白的病毒样颗粒，昆虫细胞或突变型PCV2b ORF2蛋白的生产或使用方法，以及猪动物的疫苗。
猪圆环病毒2(PCV2)是猪动物的病原体，其在全世界存在，并引起许多动物患病并给农业部门造成严重的经济损失。对于综述，参见Gillespie等人 (2009, J. Vet.Intern. Med., vol. 23, p. 1151-1163)。
PCV2属于圆环病毒科(Circoviridae)，而且具有小的(17 nm)二十面体无包膜病毒粒子，其含有约1.76 kb的环状、单链DNA基因组。该基因组仅含有几个开放阅读框，其中ORF2编码含有主要的病毒中和表位的病毒衣壳蛋白。
PCV2是相对稳定且高度感染性的。其经由不同种类的机体-分泌而脱落，并且可以在猪群中横向和纵向传播。由PCV2感染引起的主要病变是淋巴耗竭；所得的免疫抑制还使受感染动物对继发性或并发性感染易感。因此，PCV2参与许多猪疾病综合征，其统称为：猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。最显著的PCVAD是在幼龄猪中观察到的“断奶后多系统衰竭综合征”(PMWS)。PMWS的临床体征和病理包括渐进性消瘦、呼吸困难、呼吸急促、以及偶尔的黄疸(icterus)和黄疸病(jaundice)。其他PCVAD是：猪呼吸道疾病综合症、猪皮炎和肾病综合征、繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、先天性震颤、和渗出性表皮炎。对于综述，参见：the MerckVeterinary Manual, 第11版, 2016, ISBN: 9780911910933；和：“Diseases of Swine”,第10版, 2012, ISBN: 9780813822679。
然而，在没有继发性感染的情况下，大多数PCV2感染的猪可能不显示清晰的疾病临床症状，除了明显健康的猪中的不良生长和表现。由PCV2引起的PCVAD的(亚-)临床症状通常可从3或4周龄起(这是小猪断奶并且保护性的母体来源的抗体开始下降的时间)在猪中观察到。
为了针对PCV2感染及其相关疾病体征进行保护，几种商业疫苗可得，并且这些正在全世界以非常大量使用。不同类型的PCV2疫苗是例如：基于灭活的完整PCV2病毒的疫苗(Circovac™, Merial)或基于灭活的嵌合PCV1/PCV2病毒的疫苗(Suvaxyn™ PCV,Fostera™ PCV, Zoetis)。然而，最常见的是基于重组表达的PCV2衣壳蛋白、通常命名为：ORF2蛋白的亚单位疫苗(Ingelvac™ CircoFLEX, Boehringer Ingelheim；和：Circumvent™ PCV, Porcilis™ PCV, MSD AH)。ORF2蛋白亚单位疫苗通常通过在重组表达系统中表达PCV2 ORF2基因来产生；最常用的是杆状病毒-昆虫细胞表达系统。表达的ORF2蛋白自组装成病毒样颗粒(VLP)，其类似于天然PCV2病毒粒子，除了其缺乏病毒基因组内容物，且因此是非复制性的。基于此类PCV2 ORF2 VLP的疫苗非常稳定，当与佐剂一起配制时是高度免疫原性的，并且已表明对所有年龄的猪都是安全的，无论是否对于PCV2抗体呈血清阳性。典型全剂量的基于PCV2 ORF2蛋白的疫苗含有约80 µg ORF2蛋白，剂量体积为2 ml/动物。然而，这些亚单位疫苗在每动物剂量约20微克ORF2已经有效，参见EP 1.926.496。它们也可以作为单次注射疫苗给予，并且它们可以通过不同的施用途径(诸如肌肉内(IM)、皮下(SC)或皮内(ID))给予。
在PCV2物种内，存在不同的病毒基因型。这些可以通过它们的ORF2基因之间的遗传距离的方式来区分，并且过去已经使用了各种命名惯例。然而，Segales等人(2008, Vet.Rec., vol. 162, p. 867-868)公开了已经变为目前坚持用于确定和命名PCV2基因型的标准的方法。在现在公认的5种不同的PCV2基因型中，在野外目前只有3种有兽医相关性：PCV2a、PCV2b和PCV2d。
尽管目前所有商业PCV2疫苗都基于PCV2a，但基因型PCV2b和2d看起来在野外的流行日益增加。对于综述，参见：Karuppannan & Opriessnig, 2017, Viruses, vol. 9, p.9, doi: 10.3390/v9050099。尽管这些作者得出结论，这些基因型之间存在足够水平的交叉-保护，但通常优选应用类型-同源疫苗。因此，在本领域中需要产生也针对除了PCV2a以外的PCV2基因型的安全、便宜和有效的疫苗。
WO 2009/000459 (University Gent)描述了用于基于ORF2蛋白鉴定PCV2的抗原性或致病性变体的诊断剂；特别是可用于该目的的方法和抗体。描述了来自两种PCV2b毒株的ORF2的核酸和氨基酸序列。建议ORF2蛋白的几种突变，以改变单克隆抗体识别的概况。在许多建议的突变中，一种是氨基酸位置131处的苏氨酸突变为脯氨酸。然而，WO 2009/000459仅充分公开了PCV2a (Stoon 1010, 1121)和PCV2b (48285)的未突变(野生型)毒株的血清学测试，并且仅公开了在昆虫细胞中表达来自野生型PCV2a毒株之一(Stoon 1010)的未突变的ORF2。
随后，Saha等人, 2012 (J. of Gen. Virol., vol. 93, p. 1548-1555)尤其描述了通过转染突变的PCV2基因组的感染性克隆在PK-15细胞中表达具有T131P突变的PCV2aORF2蛋白。
WO 2010/068969 (Vectogen)描述了通过ORF2的病毒-载体递送来针对PCV2接种疫苗的方法，其中ORF2蛋白已通过替换或除去‘核定位信号’(即ORF2的N-末端41个氨基酸)进行突变。作为结果，ORF2然后变为在细胞质中表达或从载体-感染的细胞分泌。优选的病毒载体是猪腺病毒。
WO 2015/051099 (Boehringer-Ingelheim)描述了通过在PCV2b ORF2编码序列中引入突变来增加PCV2b ORF2蛋白及其病毒样颗粒在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达水平的方法：公开的突变是氨基酸位置63处的精氨酸的取代，优选取代为苏氨酸。没有提及PCV2b ORF2的氨基酸位置131处的任何突变，并且没有关于该蛋白在昆虫细胞中的表达的任何问题的信息。
EP 17184630 (Intervet Int. BV)公开了在PCV2疫苗中，发现PCV2b基因型的ORF2蛋白不仅提供同源保护，而且提供针对异源基因型PCV2a和PCV2d的良好的交叉-保护。而且，甚至在每动物剂量少于20 µg PCV2b ORF2蛋白的非常低的量下，也(出乎意料地)获得了这种效果。因此，用低剂量的PCV2b ORF2蛋白为猪接种疫苗将足以提供针对PCV2的所有目前毒株的有效免疫保护。
昆虫细胞用于重组表达蛋白的用途是众所周知的，并且以不同的方式应用：在活昆虫中、在原代昆虫细胞中或在培养中的永生化昆虫细胞系中表达。大多数使用的昆虫细胞是鳞翅目来源的，诸如来自斜纹夜蛾属(Spodoptera)或粉夜蛾属(Trichoplusia)。这些细胞的使用经常在流行的杆状病毒-昆虫细胞表达系统的背景下，其中重组杆状病毒用于感染培养中的鳞翅目细胞。杆状病毒含有许多强启动子，当病毒在细胞培养物中复制时，所述强启动子是不需要的；然后可以将这些用于驱动异源基因的表达。
本发明的目标是通过提供优化PCV2 ORF2蛋白在昆虫细胞中的重组表达的方式来克服现有技术中的缺点，并适应本领域中的需求。
当研究基于ORF2蛋白亚单位的PCV2疫苗的制备时，本发明人发现，在昆虫细胞中重组表达来自PCV2b基因型病毒毒株的ORF2蛋白不如PCV2a基因型的ORF2蛋白那样简单。发现表达的PCV2b ORF2蛋白具有在表达它的昆虫细胞的核中积累的自然趋势。以这种形式，PCV2b ORF2蛋白的总表达水平大大降低，并且证明该蛋白非常难以收获和通过下游加工进行纯化；甚至当使用侵袭性解离时，也仅可以分离非常少量的ORF2蛋白。同样，在可以分离的少量蛋白中，VLP的量非常低；显然，核定位在明显程度上阻止ORF2蛋白自组装成VLP。作为结果，这种表达的蛋白的免疫原性大大降低。
令人惊讶地发现，当将非常特定的氨基酸取代引入PCV2b的ORF2蛋白中时，可以大大防止在昆虫细胞中表达后的核积累。
特定氨基酸取代涉及将天然存在于全长PCV2b ORF2蛋白的位置131处的氨基酸变为脯氨酸氨基酸。用位置131处的脯氨酸，大多数表达的突变型PCV2b ORF2蛋白(“ORF2b-131P”)则存在于昆虫细胞的细胞质中，而不是积累在核处。发现这增加表达的总水平，以及大大促进从这些昆虫细胞收获突变型PCV2b ORF2蛋白；在这种细胞质状态下，可以使用低影响的标准分离程序，使得可以容易地分离大量蛋白。而且，发现大多数ORF2b-131P已经有效地组装成VLP，这在猪动物的PCV2疫苗中非常有效。
这是出乎意料的，尤其是当与用PCV2a ORF2蛋白的情况相比时：在来自PCV2b病毒的ORF2蛋白中，位置131处的天然氨基酸通常是苏氨酸；而在PCV2a病毒中，一些在131处具有苏氨酸，并且一些具有脯氨酸。然而，当在昆虫细胞中表达时，PCV2a ORF2的两种变体都不会在核处积累。因此，没有迹象怀疑这种特定氨基酸位置是当在昆虫细胞中表达时对于PCV2b ORF2蛋白观察到的核积累的原因。
甚至更显著的是PCV2d ORF2蛋白(其在昆虫细胞中表达后也显示核积累)在将其位置131处的天然苏氨酸取代为脯氨酸后无法逆转为细胞质表达模式。
显然，对于每种基因型，昆虫细胞中的PCV2 ORF2蛋白的表达周围的情况是独特的。
不知道氨基酸取代为131P如何阻止在昆虫细胞中表达后，PCV2b ORF2蛋白在核处的积累。尽管本发明人不想被可能解释这些发现的任何理论或模型所束缚，但他们推测在PCV2b基因型的ORF2蛋白中该特定位置处具有脯氨酸氨基酸诱导该ORF2蛋白的特性的变化。该变化可以例如影响ORF2蛋白的3维折叠或疏水性概况，这可能影响其在昆虫细胞内的路径(routing)。
通过提高重组表达的PCV2b ORF2蛋白的可用性和抗原性质量，该发现为许多有利用途开辟了道路。进而，这允许以大规模便利地制造用于猪动物的有效PCV2亚单位疫苗；因为由于其分离不需要侵袭性的解离化合物或复杂的技术，可以以便宜、安全和有效的方式产生表达的蛋白。
以这种方式，可以实现本发明的一个或多个目标，且因此可以克服现有技术的一个或多个缺点。
因此，在一个方面，本发明涉及包含异源核酸的昆虫细胞，所述异源核酸包含：
a. 编码来自基因型2b的猪圆环病毒2(PCV2b)的ORF2蛋白的核苷酸序列，和
b. 与所述核苷酸序列可操作连接的转录控制序列，
所述昆虫细胞的特征在于所述核苷酸序列编码突变型PCV2b ORF2蛋白，所述突变型PCV2b ORF2蛋白在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸。
对于本发明，“昆虫细胞”是源自昆虫纲的生物的细胞。所述细胞是活的(即能够复制)并且足够完整以能够进行蛋白表达。所述细胞可以是静息的或活跃的，并且可以处于细胞周期的任何阶段中。所述昆虫细胞可以以不同的方式用于本发明：或者通过使用整个昆虫；通过使用昆虫的提取物或部分；通过使用源自昆虫的原代细胞；使用昆虫的组织或器官；或者通过使用永生化的昆虫细胞系。
本发明的昆虫细胞将通常将包含在合适的载体中。这种载体是维持昆虫细胞的活力的组合物，并且是例如液体，诸如缓冲溶液或培养基。在使用整个昆虫的情况下，昆虫生物的机体本身作为载体发挥功能。
如本文所用的术语“包含(comprising)”(以及变型，诸如“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprised)”)，意指其中使用该术语的文字部分、段落、权利要求等涵盖或在其中包括的所有要素，并且呈对于本发明可想到的任何可能的组合，即使此类要素或组合并未明确列举；且并不意指排除任何这种一种或多种要素或组合。
因此，任何这种文本部分、段落、权利要求等因此也可以涉及一个或多个实施方案，其中术语“包含”(或其变体)被术语诸如“由...组成(consist of)”、“由...组成(consisting of)”或“基本上由...组成(consist essentially of)”替换。
对于本发明，如果核酸不存在于所述细胞所来源的亲本昆虫细胞的核酸中，则该核酸对于包含该核酸的昆虫细胞是“异源”的。核酸可以是任何类型的，例如DNA或RNA。
本发明的异源核酸可以以不同的方式(诸如通过核酸的转染或电穿孔，可能在载体上；或者通过经由重组微生物、例如病毒进行感染)引入根据本发明的昆虫细胞。
当核苷酸序列的转录和/或翻译导致蛋白被表达时，所述核苷酸序列“正在编码”或类似“编码”该蛋白。通常，这种能够编码蛋白的核苷酸序列被称为开放阅读框(ORF)，表明不存在会过早终止蛋白的翻译的不期望的终止密码子。这种核苷酸序列可以是编码完整蛋白的基因，或者可以是这样的基因片段，其编码蛋白的部分，例如仅编码蛋白的成熟或分泌的形式，即没有‘前导’、‘锚”或‘信号序列’。所述核苷酸序列可以是天然或合成来源的。
对于本发明，“蛋白”是氨基酸的分子链。蛋白可以是天然或成熟蛋白，前蛋白或原蛋白或蛋白的部分。尤其：肽、寡肽和多肽包括在蛋白的定义内。
本发明的“ORF2”蛋白是指由PCV的基因组上的开放阅读框2(ORF2)或ORF2的部分编码的蛋白。全长PCV2 ORF2蛋白通常长度为233个氨基酸，并且当在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)中测试时展示约26 kDa的相对分子量。然而，ORF2蛋白的截短形式是众所周知的并且可以有利地用于本发明，例如PCV2 ORF2蛋白的从其N-末端侧缺失30个氨基酸的截短形式。ORF2蛋白也被称为衣壳，并且编码核酸序列被称为ORF2基因或衣壳基因。
可以帮助编码区域的分析且以便利的方式展示这种信息的计算机-程序由各个供应商市售。
“猪圆环病毒2”或PCV2是指该物种的圆环病毒，其具有其分类学组成员的表征性质，诸如形态学、基因组、和生物化学特征，以及生物学特征，诸如生理学、免疫学、或病理学的行为。
如本领域中已知的，基于此类特征的组合将微生物分类为特定物种。本发明因此还包括以任何方式由其细分，例如细分为亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚组等的PCV2。
对于本发明领域中的技术人员将显而易见，尽管本发明的具体PCV2目前可以被指定为该物种，然而其为分类学分类，其可以随着时间改变，因为新的见解可以导致重新分类为新的或不同的分类组。然而，由于这并不改变微生物本身、或其抗原性谱系(repertoire)，而其仅为科学命名或分类，所以此类重新分类的微生物仍然在本发明的范围内。
用于本发明中的PCV2可以获得自各种来源，例如作为来自野外或农场的猪的野外分离株，或获得自各种实验室、(保藏)机构或(兽医)大学。或者，可以通过合成其基因组核酸并将其转染至适当的细胞中，从数字序列信息重构PCV2。
PCV2的基因分型通过比较核苷酸序列进行。对于本发明，“基因型2b的PCV2”或“PCV2b”是使用Segales等人(2008, Vet. rec. vol. 162, p. 867-868)的方法分类于基因型组b中的PCV2病毒。该方法应用基于PCV2 ORF2基因之间的P-距离(即，两个PCV2 ORF2基因之间不同的核苷酸数相对于其PCV2 ORF2基因的核苷酸的总数的比率)的PCV2基因分型。由Segales等人鉴定的PCV2的不同基因型的截止值在0.035的ORF2 P-距离处；因此，当P差异较小时，则两个序列属于同一基因型。
对于本发明，基因型2b的PCV2的参考病毒是分离株‘Imp.1011’，也已知为毒株48285，其基因组序列在GenBank™中在登录号：AF055394下公开。
因此，使用Segales等人(同上)的方法计算的，与毒株48285的ORF2基因具有小于0.035的ORF2基因P-距离的任何PCV2病毒是本发明的PCV2b病毒。
然而，且如技术人员将理解，因为PCV的基因组是单链和环状的，所以ORF2基因的编码区域可能不会从特定的线性核苷酸序列立即显而易见，并且可能需要将核苷酸序列进行反转、互补和/或旋转。例如：在GenBank登录号：AF055394中的PCV2b毒株48285的基因组序列中，ORF2基因在公开的线性链上从核苷酸编号314运行至nt. 1，并且从nt.1767继续直至且包括nt.1383；这一起代表ORF2基因的699个核苷酸(不包括终止密码子)，并且由与公开链的该区域互补的链编码。再次，可以使用市售的计算机-程序便利地进行编码区域的这种分析和展示。
类似的方法适用于如本文所用的“PCV2基因型2a”(PCV2a)和“PCV2基因型2d”(PCV2d)；PCV2a的参考病毒是分离株‘Imp.1010’，又称‘Stoon 1010’，登录号：AF055392；且PCV2d的参考病毒是分离株‘S99-1542/3a’，登录号：JX512856。
将病毒鉴定为PCV2病毒、测定其ORF2基因的核苷酸序列和计算与毒株48285的ORF2基因相比的P-距离的方法是对于本发明领域技术人员而言众所周知且是容易获得的。
“转录控制序列”是通常在DNA中的核酸的功能区域，其通过控制因子的结合，诱导细胞的蛋白-表达机制，以起始和进行下游编码区域的DNA至RNA的转录。这种转录控制区域(TCR)也可以被称为启动子，并且通常含有许多调节区域，诸如‘转录起始位点’，其位于第一个起始密码子上游的约30-40个核苷酸处。其他众所周知的保守元件是TATA盒、CAAT盒和GC盒。TCR还可以包含所谓的增强子，其参与结合调节因子，其可以影响转录的时间、持续时间、条件和水平。
因此，取决于所用TCR和作为整体的基因构建体的细节，转录(和随后的翻译)可以是暂时或永久性质的，即是瞬时或稳定表达。
用于表达(异源)基因的TCR需要能够有效地驱动该下游编码区域的转录。这通常被称为TCR与基因“可操作连接”，使得该基因在TCR的‘控制下’，或由TCR‘驱动’。这通常意味着TCR和编码区域在有效接近的情况下连接在同一分子上，并且它们之间没有会干扰有效转录的信号或序列。
术语“突变型PCV2b ORF2蛋白”用于表明表达的PCV2b ORF2蛋白与该蛋白的野生型形式不相同，但包含突变。可以使用体内或体外技术以不同的方式引入这种突变。然而，最有效的是使用重组DNA技术将PCV2b ORF2基因亚克隆在细菌质粒中，并且采用例如聚合酶链式反应(PCR)和合成引物在期望位置处引入期望的突变。细节在下文的实施例中呈现。以这种方式，例如，操作来自GenBank登录号AF055394的亲本PCV2b ORF2基因的DNA序列，由此将编码氨基酸位置131处的苏氨酸的野生型核苷酸三联体：5'- aca -3'突变为编码脯氨酸的三联体：5'- ccc -3'。
可以通过如下来应用进一步操作：对ORF2基因进行密码子优化，以使其更好地符合昆虫细胞和/或杆状病毒的编码偏好。例如，使用来自AcMNPV杆状病毒的多角体蛋白基因的密码子偏好，如以下中所公开：Hooft van Iddekinge等人, 1983, Virology, vol.131, p. 561-565。用于异源表达的基因的密码子优化的概念是众所周知的；通常，此类突变都是沉默的，意味着尽管这改变编码核苷酸序列，但其不改变编码蛋白的氨基酸序列。细节提供在实施例中。
发现密码子优化增加昆虫细胞中的ORF2蛋白的表达水平。在最小程度上，这也改变野生型PCV2b ORF2蛋白在昆虫细胞中表达时的核定位。然而，仅对于来自PCV2b的ORF2蛋白，可以通过由脯氨酸取代位置131处的氨基酸来获得昆虫细胞中的核积累的实质性阻止。
对于本发明，'野生型'是指(微)生物的形式，其中所述(微)生物以其在野外的天然形式(例如：在其通过人干预改变之前的亲本生物的形式)存在。
表达本发明的突变型PCV2b ORF2蛋白的异源核酸的生成、构建和组装可以通过众所周知的分子生物学技术(涉及克隆、转染、重组、选择和扩增)进行。这些和其他技术非常详细地解释于标准教科书，如Sambrook & Russell: “Molecular cloning: a laboratorymanual” (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773);Ausubel等人: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc.,NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach & G. Dveksler: “PCR primers: alaboratory manual” (CSHL Press, ISBN 0879696540); 和“PCR protocols”, 由: J.Bartlett和D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421)。
对于本发明，基于来自该PCV2基因型的参考毒株的全长ORF2蛋白的氨基酸序列中的氨基酸的编号来编号特定的“氨基酸位置”。对于PCV2b，参考毒株是48285，并且其ORF2蛋白的全长氨基酸序列在GenBank中公开于登录号AAC35331下。
根据本发明的昆虫细胞可以表达ORF2b-131P；突变型PCV2b ORF2蛋白(对于大多数部分)不再积累在核，但分散在整个昆虫细胞的细胞质中。与其未突变的对应物相比，突变型PCV2b ORF2蛋白的细胞位置的这种差异可以尤其通过(光学)显微镜和使用免疫-荧光技术的可视化来容易地检测。细节呈现在实施例部分中。
发现ORF2b-131P蛋白的核积累的残余水平有点不同，这取决于用于在昆虫细胞中表达突变型PCV2b ORF2蛋白的基因构建体：经由使用Bac-to-Bac系统制备的重组杆状病毒进行表达，仍然显示一些核积累，例如对于野生型PCV2b ORF2蛋白观察到的水平的约10%。然而，当突变型蛋白从经由ProEasy系统构建的重组杆状病毒产生时，不再观察到可检测到的核积累。此外，蛋白表达的水平高于由Bac-to-Bac重组杆状病毒产生的水平。
这可能可以从所用的基因构建体的构成解释：由Bac-to-Bac构建体制备的重组杆状病毒在其基因组中仍然携带来自转移载体的表达盒的元件，诸如转座子和抗生素抗性基因。这些可以影响复制和表达的水平。然而，ProEasy重组体不再携带此类额外的遗传元件。
下面将描述本发明的优选实施方案和其他方面的细节。
在一个实施方案中，编码突变型PCV2b Orf2蛋白的核苷酸序列已被密码子优化。更优选地：已被密码子优化以匹配AcMNPV杆状病毒的多角体蛋白基因的密码子偏好。
最优选地，编码突变型PCV2b Orf2蛋白的核苷酸序列是SEQ ID NO:1。其代表PCV2b毒株48285的ORF2序列，其中编码氨基酸位置编号131的三联体已被突变为5'- ccc -3'，其编码脯氨酸。另外，密码子使用已被调整以适合AcMNPV多角体蛋白基因的密码子偏好。SEQ ID NO:2进而列出由SEQ ID NO:1编码的ORF2b-131P蛋白序列。
作为应用于PCV2b ORF2基因的突变的结果，尤其是由于密码子-优化，SEQ ID NO:1和AF055394的相应区域(野生型ORF2b基因)之间的核苷酸序列同一性为77.2%。然而，因为密码子优化突变是沉默的，所以SEQ ID NO:2和AAC35331(其为来自毒株48285的野生型PCV2b ORF2蛋白的氨基酸序列)之间的氨基酸序列同一性为99.6%，即仅在位置131处的氨基酸不同。
来自各种昆虫的细胞的使用是众所周知的。这些中的几种也可以在杆状病毒-昆虫细胞表达系统的背景下使用，因为它们可以被杆状病毒感染。参见例如：Chen等人,2005, In vitro Cell. Dev. Biol. Anim., vol. 41, p. 43-49。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的昆虫细胞源自选自以下的昆虫：苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)(苜蓿环纹夜蛾(alfalfa looper))，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(草地夜蛾(fall army worm))，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)(甜菜夜蛾(beet armyworm))，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(粉纹夜蛾(cabbagelooper))，舞毒蛾(Lymantria dispar)(舞毒蛾(gypsy moth))，家蚕(Bombyx mori)(桑蚕(silkworm))，黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)(黎豆毛虫(velvetbeancaterpillar))，烟芽夜蛾(Heliothis virescens)(烟草夜蛾(tobacco budworm))，Heliothis subflexa (Subflexus straw moth)，甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)(甘蓝夜蛾(cabbage moth))，棉铃虫(Helicoverpa armigera)(棉铃虫(cotton bollworm)) ，玉米穗虫(Helicoverpa zea)(玉米穗虫(corn earworm))，球菜夜蛾(Agrotis ipsilon)(黑地老虎(black cutworm))，芹菜夜蛾(Anagrapha falcifera)(芹菜夜蛾(celery looper))，大蜡螟(Galleria mellonella)(蜂窝蛾(honeycomb moth))，Rachiplusia ou (graylooper)，小菜蛾(Plutella xylostella)(小菜蛾(diamondback moth))，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)，和埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)。
在一个实施方案中，根据本发明的昆虫细胞源自来自鳞翅目；更优选来自夜蛾科；甚至更优选来自斜纹夜蛾属(Spodoptera)或粉夜蛾属(Trichoplusia)之一的昆虫。
在一个实施方案中，根据本发明的昆虫细胞源自物种草地贪夜蛾的昆虫。
在一个实施方案中，根据本发明的昆虫细胞源自物种粉纹夜蛾的昆虫。
繁殖完整昆虫用于异源蛋白表达是已知且可行的，并且以该方式应用根据本发明的昆虫细胞。然而，以永生化昆虫细胞系的形式利用昆虫细胞将更便利，因为这将允许在受控条件下更灵活地生产和按比例放大。然后可以使用此类建立的昆虫细胞系，以使用如本文所述的常规方法构建根据本发明的昆虫细胞。
适用于这种用途的众所周知的昆虫细胞系是：两者均源自草地贪夜蛾的Sf9和Sf21；源自粉纹夜蛾的High Five™ (Hi-5)；源自家蚕的Bm5；和源自舞毒蛾的Ld652Y和LdEIta。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的昆虫细胞从选自Sf9、Sf21、Hi-5、Bm5、Ld652Y和LdEIta的昆虫细胞系或源自这些之一的细胞系的细胞制备。
优选地，根据本发明的昆虫细胞从Sf9或Sf21的昆虫细胞系制备。
用于培养昆虫细胞系的程序、设备和材料是众所周知的，并且可以以任何期望的规模(例如5 ml直至5000升)应用。具体而言，专门的昆虫细胞培养基是可得的，例如：Sf-900™ (Thermo Fisher Scientific)；Ex-Cell™ 400系列(Sigma Aldrich)；和Insect-XPRESS™ (Lonza)。
取决于这些培养基的特征，它们需要添加特定百分比的血清，诸如胎牛血清，或者可以无血清地使用。可以添加另外的添加剂，诸如谷氨酰胺、抗生素、消泡剂等。
存在几种方式，其中根据本发明的昆虫细胞可以包含用于本发明的异源核酸，一个实例是通过在昆虫细胞的基因组中稳定整合。实现基因组整合的方式是例如：通过随机插入，诸如通过转座子技术，或通过使用例如同源重组或CRISPR-Cas技术的定向插入。
或者，可以用异源核酸通过化学(例如Lipofectin™)或物理(例如电穿孔)方式转染昆虫细胞，所述异源核酸本身可以在载体诸如质粒上。所述异源核酸可以由昆虫细胞瞬时或稳定表达。
然而，将这种异源核酸引入根据本发明的昆虫细胞的优选方式是通过使用重组杆状病毒。这种杆状病毒将例如含有稳定整合在其病毒基因组中且可操作连接至强杆状病毒启动子、诸如非常晚期基因p10或多角体蛋白的启动子的目标异源基因。
因此，在根据本发明的昆虫细胞的一个实施方案中，所述转录控制序列是杆状病毒p10基因启动子或杆状病毒多角体蛋白基因启动子。
接下来，使重组杆状病毒进入昆虫细胞；这可以例如通过转染重组杆状病毒的基因组来被动进行，或通过感染性重组杆状病毒感染易感昆虫细胞来主动进行。昆虫细胞，通过在其内包含重组杆状病毒或其基因组，则将还包含用于本发明的异源核酸。对于本发明，“细胞内”简单地是指重组杆状病毒基因组的位置，其在昆虫细胞的细胞膜的内侧，例如在细胞质中。
在昆虫细胞内，重组杆状病毒或其基因组将被复制，导致异源基因在昆虫细胞中表达。然后可以从昆虫细胞或从细胞的环境(诸如细胞的培养基)收获异源表达产物。
因此，在根据本发明的昆虫细胞的一个实施方案中，所述异源核酸包含在重组杆状病毒基因组中。
“杆状病毒”是杆状病毒科的成员；优选地是甲型杆状病毒属的成员。
如果用于本发明的杆状病毒与其野生型形式相比已通过人干预而改变以包含异源核酸，则其为“重组的”。优选地，这种重组杆状病毒通过遗传操作的方法产生。
如技术人员将理解，当在特定培养容器中或在培养板的孔中考虑根据本发明的昆虫细胞时，实际上包含本发明的异源核酸的细胞数目将是动态的。这是由于许多生物学原因，诸如细胞的生命周期状态或感染或转染的水平。尽管优选具有尽可能多的包含和表达异源核酸的细胞，但不一定在特定的时间点该组的各个和每个单独的昆虫细胞都包含异源核酸。
昆虫细胞和重组杆状病毒用于表达异源蛋白的组合用途通常被称为“杆状病毒-昆虫细胞表达系统”。关于该系统的论文、教科书和综述的实例为：Luckow等人, 1988,Bio-technology, vol. 6, p. 47; Baculovirus Expression Vectors: A LaboratoryManual, David R. O'Reilly, Oxford University press, 1993, ISBN: 0716770172;The Baculovirus Expression System: A laboratory guide, 编 King & Possee,1992, ISBN: 9401050473，且综述为：van Oers等人, 2015, J. of Gen. Virology, vol.96, p. 6–23。
使用杆状病毒-昆虫细胞表达系统的有效表达可以从实验室规模直至非常大工业规模生产进行应用。在杆状病毒-昆虫细胞表达系统已知的30年中已经表达了各种来源的异源基因，并且用于应用该技术的许多工具是市售的。
几种杆状病毒物种已被用作用于在昆虫细胞中表达异源蛋白的便利载体。在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中使用的杆状病毒的实例是苜蓿银纹夜蛾(Autographacalifornica)(苜蓿环纹夜蛾(alfalfa looper))的(多衣壳)核多角体病毒：AcNPPV，或家蚕的(多衣壳)核多角体病毒：BmNPV。
在包含用于本发明的异源核酸的重组杆状病毒的一个实施方案中，所述杆状病毒是AcMNPV或BmNPV。
许多工具和试剂盒是市售的，以有效地生成和选择用于本发明中的重组杆状病毒。例如：Bac-to-Bac™ (Thermo Fisher Sci., Waltham, MA., USA)；ProEasy™ (ABVector, San Diego, CA., USA)；和flashBAC™ (Oxford Expression Technologies,Oxford, UK)。
为了优化复制-和蛋白表达水平，包含用于本发明的异源核酸的重组杆状病毒优选与野生型杆状病毒尽可能接近，当然除了异源核酸的插入以及随后在插入基因座处的破坏或缺失。在实践中，那意味着重组杆状病毒优选在其基因组中不含来自重组过程的另外的遗传元件，例如元件，诸如：标签、标记物、标记-基因、转座子元件、抗生素抗性基因等。
因此，在一个实施方案中，包含用于本发明的异源核酸的重组杆状病毒在其基因组中不含来自重组过程的另外的遗传元件。
在一个优选实施方案中，所述重组杆状病毒不包含来自用于构建该重组杆状病毒的转移载体的抗生素抗性基因。
在根据本发明的昆虫细胞的一个实施方案中，选自以下的条件中的一种、多种或全部适用：
- 编码突变型PCV2b Orf2蛋白的核苷酸序列已被密码子优化；更优选地：已被密码子优化以匹配AcMNPV杆状病毒的多角体蛋白基因的密码子偏好；
- 编码突变型PCV2b ORF2蛋白的核苷酸序列是SEQ ID NO:1；
- 根据本发明的昆虫细胞源自昆虫，其来自鳞翅目；更优选来自夜蛾科；甚至更优选来自以下属之一：斜纹夜蛾属或粉夜蛾属；
- 根据本发明的昆虫细胞源自物种草地贪夜蛾的昆虫；
- 根据本发明的昆虫细胞源自物种粉纹夜蛾的昆虫；
- 根据本发明的昆虫细胞从选自Sf9、Sf21、Hi-5、Bm5、Ld652Y和LdEIta的昆虫细胞系或源自这些之一的细胞系的细胞制备。
- 根据本发明的昆虫细胞从Sf9或Sf21的昆虫细胞系制备。
- 所述转录控制序列是杆状病毒p10基因启动子或杆状病毒多角体蛋白基因启动子；
- 所述异源核酸包含于在昆虫细胞内的重组杆状病毒基因组中；
- 包含用于本发明的异源核酸的重组杆状病毒是AcMNPV或BmNPV；且
- 包含用于本发明的异源核酸的重组杆状病毒在其基因组中不含来自重组过程的另外的遗传元件。
如本文所述，对如对于本发明所述的PCV2b ORF2蛋白的突变允许所述ORF2b-131P蛋白从根据本发明的昆虫细胞的表达增加。尤其地，这允许在比在没有该突变的情况下尽可能大得多的程度上生成包含PCV2b ORF2蛋白的VLP。
因此，在一个进一步方面，本发明涉及突变型PCV2b ORF2蛋白的病毒样颗粒(VLP)，其特征在于所述突变型PCV2b ORF2蛋白在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸。
用于表征和使用ORF2b-131P蛋白的VLP的材料和方法是本领域中众所周知的。
优选地，通过使用杆状病毒-昆虫细胞表达系统来实现本发明的突变型PCV2bORF2蛋白在昆虫细胞中的表达，如上所述。
因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于在根据本发明的昆虫细胞中表达突变型PCV2b ORF2蛋白的方法，所述方法采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统的使用。
具体而言，当用于表达本发明的突变型PCV2b ORF2蛋白的根据本发明的昆虫细胞是昆虫细胞系的细胞时，它们可以使用标准细胞-培养设备便利地培养，其导致突变型PCV2b ORF2蛋白的表达。昆虫细胞-培养设备以任何规模可得；从置于适当温度下的孵育箱中的简单的T-烧瓶或旋转烧瓶；一直到具有加热罩、搅拌器和喷洒器的大规模工业发酵罐，其具有工艺参数、诸如温度、pH和溶解氧的自动控制。
在培养根据本发明的昆虫细胞之后，从昆虫细胞培养物收获表达的突变型PCV2bORF2蛋白用于进一步使用。像培养一样，这种收获可以使用本领域中众所周知的标准程序进行。同样，当需要时，培养物可以首先通过物理(例如热、辐射)或化学(例如溴乙撑亚胺(BEI))方式灭活(即灭菌)。
取决于使用的昆虫细胞的特征和应用的表达的类型，表达的突变型PCV2b ORF2蛋白积累在昆虫细胞内部或昆虫细胞膜处，或者分泌到细胞外。甚至当没有主动分泌时，当细胞破裂时，蛋白可以在某种程度上终止于细胞的培养基中。
然后可以选择收获表达的蛋白的方法：
当表达的蛋白主要存在于培养基中时，可以将此收获，例如作为培养物离心后的上清液。然后可以将培养体积的主体减小至期望的程度，例如使用浓缩，便利地通过一些超滤方法，这都是本领域中众所周知的。
当蛋白主要在细胞中时，这些可以例如通过如下从培养体积的主体分离：离心培养物并将细胞-沉淀重悬浮于较小体积中。接下来，可以使用或多或少的侵入性技术破坏细胞。
接下来，可以使用一些提取和/或纯化方法获得表达的蛋白。
所有这些都可以由技术人员仅使用众所周知的方法和材料来进行。
因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于产生在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸的突变型PCV2b ORF2蛋白的方法，所述产生包括一个或两个选自以下的步骤：
- 培养根据本发明的昆虫细胞；和
- 从昆虫细胞培养物收获突变型PCV2b ORF2蛋白。
本发明的特别有利的结果是突变型PCV2b ORF2蛋白不再积累在表达该蛋白的昆虫细胞的核处。这不仅增加总表达水平，而且其还大大促进从这些昆虫细胞收获突变型PCV2b ORF2蛋白。这是因为在这种细胞质状态下，可以使用影响非常小和标准的分离程序，产生相对大量的突变型PCV2b ORF2蛋白。另外，收获的蛋白具有优异的免疫学质量，因为发现大多数ORF2b-131P已有效地组装至VLP中。
更具体地：大量的未突变的PCV2b ORF2蛋白的收获将需要通过使用化学品诸如去污剂或离液剂、例如SDS、尿素、脱氧胆酸盐或盐酸胍等等进行提取。随后，将需要再次除去这些。当然，以大规模使用此类侵袭性化学品是不期望的。
然而，可以通过安全、便利且非常温和的技术来实现突变型PCV2b ORF2蛋白的收获，而不使用化学品，通过应用例如昆虫细胞的声处理或冷冻-解冻。
因此，在用于产生根据本发明的突变型PCV2b ORF2蛋白的方法的一个实施方案中，从昆虫细胞培养物收获突变型PCV2b ORF2蛋白的步骤不采用去污剂或离液剂。
在一个实施方案中，所述收获采用物理方法而非化学方法来裂解昆虫细胞；细胞-裂解的物理方法的实例是：声处理、冷冻-解冻和法式压榨。
对于本发明，昆虫细胞的‘培养’或类似的‘培养’是指在适当条件下孵育昆虫细胞，允许细胞生长和分裂，并表达异源插入物。
昆虫细胞的这种培养通常将涉及使用适当的细胞-培养基和便利的设备；所有都是本领域中众所周知的并且市售的。例如，通常在有氧条件下在单层中或在悬浮液中在26-28℃下培养来自斜纹夜蛾属(Spodoptera)或粉夜蛾属(Trichoplusia)的昆虫的细胞系的培养物。
在实际条件下，将便利的是，具有用于生成干净的昆虫细胞的分开的培养容器，其与用于培养待感染或转染的昆虫细胞的设备保持远离。通常将昆虫细胞制备为主细胞-储备物和工作细胞-储备物。该方法允许制备用于药物用途的重组蛋白所需的质量控制水平。
在用于产生根据本发明的突变型PCV2b ORF2蛋白的方法的一个实施方案中，产生的蛋白呈VLP的形式。
通过应用用于制备根据本发明的突变型PCV2b ORF2蛋白的方法，可以制备足够量且具有所需免疫学效力的突变型PCV2b ORF2蛋白，以制造针对PCV2或相关疾病体征的疫苗。
因此，在一个进一步方面，本发明涉及用于减少PCV2的感染或相关疾病体征的猪动物的疫苗，所述疫苗包含在药学上可接受的载体中的突变型PCV2b ORF2蛋白，其特征在于所述突变型PCV2b ORF2蛋白在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸。
在一个实施方案中，根据本发明的疫苗用于减少基因型2a、2b和/或2d的PCV2的感染。
更优选地，所述疫苗用于减少PCV2b的感染。
众所周知，“疫苗”是包含在药学上可接受的载体中的免疫活性化合物的组合物。‘免疫活性化合物’ - 当呈‘抗原’的形式时 – 将被接种靶标的免疫系统识别，诱导免疫应答。所述应答可以源自先天性免疫系统或源自获得性免疫系统，并且可以是细胞类型和/或体液类型的。
对于本发明，“猪”是指猪科的动物，且优选地是指猪属的动物，例如：野生猪或家猪，野生公猪，鹿豚或疣猪。这也包括通过涉及其性别或年龄的任意名称指示的猪，诸如：母猪、公猪、阉猪、小母猪、断奶小猪或小猪。
根据本发明的疫苗可以提供“PCV2的感染的减少”，其是指预防或减少靶标动物中的PCV2的生产性感染的建立或增殖。这例如通过降低病毒载量或缩短病毒复制的持续时间来实现。进而，这在靶标动物中导致由病毒感染引起病变和随之发生的临床疾病体征的数目、强度或严重程度的减少。这种疫苗被通俗地称为：‘针对’PCV2的疫苗或'PCV2疫苗'。
在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗发挥作用以帮助预防PCV2病毒血症，和/或帮助预防受感染动物的PCV2脱落。
除了针对PCV2的感染的疫苗效力以外，根据本发明的疫苗还可以提供“相关疾病体征的…减少”，其是指可以作为继发或并发疾病发生的猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。像对于PCV2一样，根据本发明的疫苗可以提供这种PCVAD的症状或后果的严重程度和/或持续时间的减少。
PCV2疫苗减少PCV2病毒复制和传播。这减少血液、肺和淋巴组织(例如扁桃体、脾脏和淋巴结)中的PCV2病毒载量，并且针对淋巴耗竭、感染扩散和针对PCV2相关疾病进行保护。因此，这恢复接种疫苗的猪群中的总体健康和表现，如以下参数中的一种或多种中所反映：降低的死亡率，更好的平均每日增重，提高的饲料转化率和提高的生殖产率。
PCV2疫苗的有效性的一般确定完全在常规从业者的技术之内。这可以例如如下进行：通过监测接种疫苗后的免疫应答或通过测试攻击感染后的临床症状的出现或死亡率，例如通过监测靶标的疾病的体征、临床评分、血清学参数，或通过重新分离攻击病原体，且将这些结果与模拟接种疫苗的动物中看到的接种疫苗-攻击应答进行比较。具体地，疫苗效力和保护可以如下测量：通过血清学测定PCV2-特异性抗体水平；通过血清或动物分泌物(口腔、鼻腔、粪便、尿液)中的病毒检测；或通过经由PCR、(免疫)组织学、杂交或血清学检测参与PCVAD的其他病原体。
对于根据本发明的PCV2疫苗，优选地通过评价接种疫苗组vs未接种疫苗组中的PCV2感染的降低水平来测定效力，由此这种感染可以例如在野外条件下自然地获取，或者可以是故意的，例如由在实验条件下的攻击导致。
取决于使用的佐剂的类型，PCV2疫苗效力可以更多地基于体液免疫或基于细胞免疫。诱导的抗体滴度可以例如使用许多市售的PCV特异性ELISA试剂盒之一进行测量。
下面将概述根据本发明的疫苗的各个实施方案、优选项和实例。
在根据本发明的疫苗(其包含在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸的突变型PCV2bORF2蛋白)的一个实施方案中，所述突变型PCV2b ORF2蛋白呈病毒样颗粒的形式。
通常，疫苗包含“药学上可接受的载体”，其包含抗原，并且可以帮助疫苗的制造、应用或保存，而不引起(严重)不良影响。这种载体可以是水溶液，例如缓冲液或培养基。
根据本发明的疫苗的优选的药学上可接受的载体是昆虫细胞培养基、磷酸盐-缓冲盐水(PBS)或其组合。
另外，所述药学上可接受的载体可以包含另外的添加剂和赋形剂，诸如填充剂、稳定剂、防腐剂、表面活性剂或佐剂。细节和实例是众所周知的，例如如诸如以下的手册中所述：“Remington: the science and practice of pharmacy” (2000, Lippincot, USA,ISBN: 683306472)，和：“Veterinary vaccinology” (P. Pastoret等人编, 1997,Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681)。
另外，根据本发明的疫苗可以包含佐剂。尤其对于此类亚单位疫苗，这可以显著增加靶标针对亚单位抗原的免疫应答。
因此，在一个实施方案中，根据本发明的疫苗包含佐剂。
“佐剂”是众所周知的疫苗成分，其以非特异性的方式刺激靶标的免疫应答。许多不同的佐剂是本领域中已知的。佐剂的实例为：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、维生素E或α-生育酚、非离子嵌段聚合物和聚胺诸如硫酸葡聚糖、Carbopol™、吡喃、皂苷，诸如：Quil A™，或者Q-vac™。皂苷和疫苗组分可以在ISCOM™中组合。
另外，作为佐剂，经常使用肽诸如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸、特夫素，以及矿物油例如Bayol™、Drakeol™、Klearol™、或者Marcol™、Montanide™或轻质矿物(石蜡)油；非矿物油诸如角鲨烯、角鲨烷；植物油或其衍生物，例如油酸乙酯。也可以有利地使用组合产品诸如 ISA™ (Seppic)或DiluvacForte™和Xsolve™ (均来自MSD Animal Health)。另外的选项是使用SVEA佐剂(包含角鲨烷和维生素E-乙酸酯)，如EP 16206789中所公开。
关于佐剂及其用途和作用的手册为：“Vaccine adjuvants” (Methods inmolecular medicine, vol. 42, D. O’Hagan编, 2000, Humana press, NJ, ISBN:0896037355)。
佐剂可以用于根据本发明的疫苗的不同制剂中，以增强对突变型PCV2b ORF2蛋白的免疫应答。例如，当所述佐剂是油性物质时，所述油相可以通过缓慢释放抗原而在接种疫苗的动物中提供储库作用，由此提供靶标的免疫系统的延长刺激。
所述油性物质可以以不同方式与包含ORF2蛋白的水相组合。在一个实施方案中，根据本发明的疫苗可以被配制为水相和油相的乳剂；优选地，所述乳剂是以下类型的：油包水(w/o)、水包油(o/w)、水包油包水(w/o/w)，或者是双油-乳剂。
更优选的是根据本发明的疫苗，其用油佐剂化，并且被配制为水包油乳剂。这种疫苗有利地展示来自水相的直接免疫刺激和来自油相的储库作用的延长的免疫刺激两者的特性。
因此，在根据本发明的疫苗的一个实施方案中，所述疫苗被配制为水包油乳剂。
用于以任何期望的规模制备佐剂化的疫苗乳剂的方法和设备是市售的，例如对于均质化，使用诸如来自以下的设备：Silverson，Ultra Turrax™，Dispax反应器(IKA)，或Microfluidiser (Microfluidics)。
根据本发明的疫苗的水包油乳剂优选地具有相当小、优选小于1微米的分散相的颗粒的大小；此类乳剂通常被称为“亚微米乳剂”。
在根据本发明的疫苗的水包油乳剂的一个实施方案中，所述乳剂是亚微米乳剂。
在根据本发明的疫苗的一个实施方案中，所述佐剂选自：轻质矿物油、Montanide、Emunade和SVEA。
已知此类佐剂对猪疫苗的免疫原性具有有利的作用。
在根据本发明的疫苗的一个实施方案中，所述疫苗是水包油乳剂并且所述佐剂是矿物油。
在根据本发明的疫苗的一个优选实施方案中，所述矿物油是轻质矿物油或白矿物油或石蜡油，以诸如以下的商品名市售：Marcol™ (ExxonMobil)、Klearol™(Sonneborn)、或者Drakeol™ (Penreco)。
更优选的是使用额外的佐剂，特别是：维生素E，例如α生育酚或α生育酚乙酸酯。
在一个优选实施方案中，本发明的疫苗制剂包含具有表面活性剂、轻质石蜡油和α生育酚乙酸酯的水包油乳剂。更优选的是这样的制剂，其中所述表面活性剂是聚山梨酯80(Tween™ 80)，和/或所述石蜡油是Marcol™ 52，和/或所述维生素E是α生育酚乙酸酯。最优选的是用Microsol Diluvac Forte™或用Xsolve™ (两者均为：MSD Animal Health)的制剂。
根据本发明的疫苗的另外的有利作用在于预防或减少PCV2在猪群中的扩散：纵向扩散至后代、和/或横向在猪群或种群中、以及在地理区域内扩散。因此，根据本发明的疫苗的使用导致PCV2流行性的减少。
因此，在根据本发明的疫苗的一个优选实施方案中，所述疫苗用于减少PCV2在猪群中或在地理区域中的流行。
在一个实施方案中，根据本发明的疫苗还可以包含稳定剂。这可以用于改进疫苗乳剂的特征，保护易于降解的组分、和/或增强疫苗的储存期。通常，此类稳定剂是高分子量的大分子，诸如脂质、碳水化合物、或者蛋白；例如奶粉、明胶、血清白蛋白、山梨醇、蔗糖、海藻糖、亚精胺、蛋白-水解物、右旋糖苷(Dextrane)或聚乙烯吡咯烷酮，和缓冲剂，诸如碱金属磷酸盐。
优选地，所述稳定剂没有动物来源的化合物(无动物化合物，ACF)，或者甚至是化学定义的，例如，如WO 2006/094974中公开的。
根据本发明的疫苗可包含防腐剂，诸如硫汞撒(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)、酚类化合物、和/或庆大霉素。优选地，不采用防腐剂。
无需赘言，与对于根据本发明的疫苗的药物稳定性或有效性所需的或有益的其他添加剂混合完全在技术人员的常规能力内，且因此在本发明的范围内。
根据本发明的疫苗的动物靶标是猪。待接种疫苗的靶标的年龄、体重、性别、免疫学状况和其他参数并不是关键的，尽管明显有利的是对健康的、未感染的动物接种疫苗，以及尽可能早地接种疫苗以预防PCV2的任何野外感染(field infection)。因为这种感染可以在幼龄时就已经确立。
因此，在根据本发明的疫苗的一个实施方案中，将所述疫苗在出生后不久、优选在出生后28天内、更优选在出生后21、14、12、10、8、7、6、5、4、3、2或甚至1天(以该优先顺序)内施用于幼龄猪动物。
或者，可以通过经胎盘传代和/或通过经由初乳转移，将根据本发明的疫苗施用于怀孕母猪，以便为小猪提供母体来源的PCV2特异性抗体。
有利地，根据本发明的疫苗的效力不在任何大的程度上受幼龄猪动物可能从其母亲获取的母体来源的针对PCV2的抗体的水平的影响；‘幼龄’是指4周龄或以下。
因此，在根据本发明的疫苗的一个实施方案中，将所述疫苗应用于携带母体来源的针对PCV2的抗体的幼龄猪动物。
根据本发明的疫苗也可以充当有效的引发接种疫苗，其后来可以继之并通过加强接种疫苗进行增强。例如，根据本发明的疫苗可以施用于约2-10日龄的小猪，并且约3周后再次施用，其中每次接种疫苗的体积为约1 ml。
然而，由于根据本发明的疫苗在单次施用后就已经有效，因此一个优选实施方案是从约3周龄起施用单一剂量，例如约2 ml的单一剂量。这种接种疫苗使猪在整个肥育期期间得到保护，直至约5-6个月龄。
当根据本发明的疫苗的猪靶标意欲保持超过6个月(诸如用于培育的母猪，或者用于产生精子的公猪)时，可以对这些每年施用1次、2次、或3次定期的加强接种疫苗，例如对于母猪：每次产小猪前进行一次加强接种疫苗，其平均为约2.2次/年。
对于本发明，“约”表明数字可以在其指示值附近±25%之间变化。优选地，“约”意指其值附近的±20%，更优选地，“约”意指其值附近的±15、12、10、8、6、5、4、3、2%，或者甚至“约”意指其值附近的±1%，以该优先顺序。
根据本发明的疫苗可以用作预防性或治疗性的处理(或两者)，因为其干扰PCV2的感染或相关疾病的确立和进展两者。
优选地，根据本发明的疫苗被配制为适用于肠胃外注射的形式，即作为可注射液体，诸如：悬浮液、溶液、分散液或乳剂。
根据本发明的疫苗的施用的方案优选整合至靶标猪可需要的其他疫苗的现有接种疫苗时间表中，以减少对动物的压力和减少劳动力成本。这些其他疫苗可以同步的、同时的、或依次的方式，以与其登记的用途相容的方式进行施用。
根据本发明的疫苗，每动物剂量包含约0.1至约1000微克的PCV2b ORF2b-131P蛋白。优选地，所述疫苗，每动物剂量包含0.5至500μg、1至250μg或甚至2至200μg的PCVORF2b-131P蛋白，以该优先顺序。技术人员可以基于疫苗和靶标动物的特征来进行每剂量的蛋白的量的选择。
可以使用标准的生物化学实验室程序，例如通过破坏乳剂并使用SDS-PAGE测试水相，在即用的疫苗乳剂中测定每动物剂量的ORF2b-131P蛋白的量。然后通过与已知量的参考蛋白、例如牛血清白蛋白的比较来进行量的确定。参见例如：The Protein ProtocolsHandbook, 第2版, September 2002, 编 J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa,NJ; 第29章, p. 237-242。
或者，可以使用质谱法进行ORF2蛋白定量。
优选地，在与油相混合和/或乳化之前，在抗原相的水样主体中测定每动物剂量的PCV ORF2b-131P蛋白的量。
根据本发明的疫苗，可以以对于靶标动物可接受的体积进行施用，并且可以例如体积为约0.1 ml至约10 ml。优选地，一个剂量体积为约0.1 ml至约5 ml，更优选一个动物剂量为0.2 ml至3 ml。
当通过肌肉内途径施用时，一个剂量的体积优选为约1 ml至约3ml，更优选约2ml；当通过皮内途径施用时，一个剂量的体积优选为约0.1 ml至约0.5 ml，更优选约0.2 ml。
根据本发明的疫苗可以根据本领域中已知的方法施用于靶标猪。优选的应用是通过肠胃外途径，即通过皮肤，例如：肌肉内、腹膜内、皮内、粘膜下、或者皮下。根据本发明的疫苗的更优选的施用途径是通过肌肉内注射或通过皮下注射。甚至更优选的是在后腿中、或在颈部中肌肉内施用。
无需赘言，应用的最佳途径将取决于所使用的疫苗的细节，以及取决于靶标的特定特征。
在一个实施方案中，将根据本发明的疫苗作为约2 ml的单一剂量，肌肉内施用于约3周龄起的猪。
优选的肌肉内施用部位是颈部。
在一个实施方案中，通过肌肉内途径施用根据本发明的疫苗的剂量体积是灵活的，即所述疫苗作为2 ml/动物的单一剂量或作为1 ml/动物的两个连续剂量施用。当作为两个剂量施用时，两者在时间上优选分开至少1周，优选分开2-5周，更优选分开约3周。
在一个实施方案中，将根据本发明的疫苗作为约0.2 ml的单一剂量，皮内施用于约3周龄起的猪。
用于皮内施用的优选部位选自：颈部、背部和后腿。
进一步优化根据本发明的疫苗完全在技术人员的能力之内。通常，这涉及对疫苗效力的微调，以进一步提高其提供的免疫保护。这可以如下进行：通过调整疫苗的剂量、体积、或抗原含量；通过使用另一种形式或制剂的疫苗；通过调整疫苗的其他组分(例如所述稳定剂或所述佐剂)；或者通过经由不同的途径、方法、或方案来应用。所有这些都在本发明的范围内。
根据本发明的疫苗可额外包含其他化合物，诸如额外的抗原、细胞因子、或者包含未甲基化的CpG的免疫刺激性核酸等。或者，根据本发明的疫苗可有利地与药物组分、例如抗生素、激素、抗炎-或抗寄生虫药物进行组合。或者，根据本发明的疫苗本身可以添加至疫苗。
根据本发明的疫苗可以有利地与(例如源自另一猪病原体的)一种或多种另外的抗原组合。这种组合疫苗的优势在于其不仅诱导针对PCV2的免疫应答，而且还诱导针对其他病原体的免疫应答，而仅需要对靶标动物针对接种疫苗进行单次处理，由此减少对动物的接种疫苗压力，以及减少时间和劳动力成本。
因此，在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含对猪动物致病性的微生物的另外的抗原。
“另外的抗原”可以本身是感染性微生物或是灭活的，或者是亚单位，以及可以是具有或没有佐剂。所述另外的抗原可以由生物的或合成的分子(诸如蛋白、碳水化合物、脂多糖、脂质或核酸分子)组成。或者，其可以是来自该其他微生物的核酸的表达产物，或者是包含这种核酸的载体；所述载体本身可以是微生物或真核宿主细胞。
所述另外的抗原可以是以任何方式“源自”对猪致病性的其他微生物，例如作为提取物、级分、裂解物、匀浆或声处理物。
用于本发明的“对猪动物致病性的微生物”，是本领域中众所周知的。因此，所述另外的抗原原则上可以源自对猪致病性的任何病毒、细菌、寄生虫、真菌、立克次氏体、原生动物和/或寄生虫。
此类对猪动物致病性的微生物的实例为：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、经典猪瘟病毒、猪流感病毒、口蹄疫病毒、猪流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎病毒、水疱性口炎病毒、猪肺炎支原体、胞内劳森氏菌(Lawsonia intracellularis)、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、猪链球菌或沙门氏菌(Salmonella)、短螺旋体(Brachyspira)、梭菌(Clostridia)、巴斯德菌(Pasteurella)、丹毒丝菌(Erysipelothrix)、博德特氏菌(Bordetella)、弓形虫(Toxoplasma)、等孢子球虫(Isospora)或旋毛虫(Trichinella)。
在根据本发明的疫苗的一个优选实施方案中，所述疫苗除了来自PCV2的抗原以外还包含一种或多种来自对猪动物致病性的微生物的抗原，所述对猪动物致病性的微生物选自猪肺炎支原体、胞内劳森氏菌和PRRSV。
从经济以及兽医观点两者来看，由于这些是目前最突出的猪病原体，因此将它们组合成单次注射的即用型疫苗是非常有利的。
在一个优选实施方案中，将一种或多种另外的抗原作为冻干制剂添加至根据本发明的疫苗，由此通过用本发明的疫苗乳剂重构来制备组合疫苗。这描述于例如WO 2010/106095中。
在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗是包含突变型PCV2b ORF2蛋白和来自猪肺炎支原体的抗原的组合疫苗，且所述组合疫苗用于重构来自胞内劳森氏菌和/或来自PRRSV的抗原的冻干制剂。
在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗是包含突变型PCV2b ORF2蛋白、来自猪肺炎支原体的抗原和来自胞内劳森氏菌的抗原的组合疫苗，且所述组合疫苗用于重构来自PRRSV的抗原的冻干制剂。
在一个进一步方面，本发明涉及用于减少猪动物中的PCV2的感染或相关疾病体征的方法，所述方法包括向所述猪施用根据本发明的疫苗。
根据本发明的疫苗可以通过技术人员众所周知的方式制备。如所述，如对于本发明所述的突变型PCV2b ORF2蛋白或如对于本发明所述的昆虫细胞的使用允许制造如对于本发明所述的猪的疫苗。在这方面，突变型PCV2b ORF2蛋白也可通过根据本发明的方法获得。
因此，在一个进一步方面，本发明涉及在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸的突变型PCV2b ORF2蛋白用于制造猪动物的疫苗的用途，所述猪动物的疫苗用于减少PCV2的感染或相关疾病体征。
在一个进一步方面，本发明涉及在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸的突变型PCV2b ORF2蛋白，其用于猪动物的疫苗中，所述猪动物的疫苗用于减少PCV2的感染或相关疾病体征。
在一个进一步方面，本发明涉及用于制备根据本发明的疫苗的方法，所述方法包括一个或多个选自以下的步骤：
- 将在氨基酸位置编号131处具有脯氨酸的突变型PCV2b ORF2蛋白与药学上可接受的载体混合；和
- 将突变型PCV2b ORF2蛋白和药学上可接受的载体的所述混合物与佐剂一起配制。
为了在用于制备根据本发明的疫苗的方法中使用，所述突变型PCV2b ORF2蛋白可通过用于在根据本发明的昆虫细胞中表达突变型PCV2b ORF2蛋白的方法获得，和/或可通过用于产生根据本发明的突变型PCV2b ORF2蛋白的方法获得。
在用于制备根据本发明的疫苗的方法的一个实施方案中，所述突变型ORF2蛋白呈VLP的形式。
根据本发明的疫苗可以由技术人员以适用于施用于猪靶标且与期望的应用途径且与期望效果匹配的形式制备。通常，此类疫苗是无菌且在生理pH下制备的。
本文描述了用于制备根据本发明的疫苗的方法、用途或方法的细节和实例，并且本领域技术人员使用常规材料和方法可容易地应用此类程序。例如，如对于本发明所述的突变型PCV2b ORF2蛋白可以在昆虫细胞中以工业规模生产，且然后与药物上可接受的赋形剂组合，配制成疫苗，例如通过用油性佐剂乳化，并填充至适当大小的容器中。制造方法的各个阶段将通过充分的测试进行监测，例如通过针对抗原的质量和量的免疫学测试；通过针对灭活、无菌性、和外来试剂的不存在的微生物学测试；以及最终通过在动物中接种疫苗-研究用于证实效力和安全性。在完成对质量、量和无菌性的测试后，可以发布疫苗产品用于销售。
所有这些都是技术人员众所周知的，并且应用于疫苗制备的一般技术和考量描述于例如政府指令和法规(Pharmacopoeia，9CFR)和众所周知的手册(Pastoret, Lippincot，同上)中。
本发明现在将通过以下的非限制性的实施例进一步描述。
实施例
实施例1：不同的表达PCV2 ORF2的重组构建体的组装
为了在昆虫细胞中表达PCV2 ORF2蛋白，使用标准程序生成重组杆状病毒。简而言之：
这些实验中使用的野生型PCV2 ORF2基因从不同来源获得：PCV2a亲本病毒来自美国的疫苗毒株；PCV2b来自法国分离株Imp1011，GenBank登录号AF055394；PCV2d来自中国，毒株BDH，GenBank登录号：HM038017。
通过使用PCR扩增并插入克隆质粒中来亚克隆ORF2基因。接下来，通过使用PCR-定向突变，将一些ORF2基因突变，以在氨基酸位置131处编码脯氨酸。可替代地或另外地，将ORF2基因密码子优化以类似于AcMNPV多角体蛋白基因的密码子使用表。本文对于PCV2b使用的突变序列在所附序列表中呈现，如上所述。
突变的ORF2基因插入物的合成构建体从商业供应商(BaseClear, Netherlands；或Genscript, Piscataway, NJ, USA)订购。
为了与Bac-to-Bac系统一起使用，将这些亚克隆至克隆载体pFastBac1中，并且为了与ProEasy系统一起使用，将这些亚克隆于转移载体pVL1393中。在两种情况下，插入物都在多角体蛋白启动子后面。根据制造商的说明进行重组杆状病毒的生成和选择。所述PCV2a重组杆状病毒构建体中的一些已经使用重组体的转染和分离的经典选择技术通过在软琼脂下将感染的昆虫细胞铺板并进行噬斑挑选来构建。
所有重组杆状病毒均在Sf9细胞上扩增，收获，冷藏或冷冻储存并滴定。用于进一步实验的病毒储备物通常为7.5至8.5 Log10 TCID50/ml。
下表中列出用于在昆虫细胞中表达PCV2 ORF2蛋白的重组杆状病毒的选择：
NB: 所有插入物均插入多角体蛋白启动子的后面。密码子优化(当应用时)是朝向AcMNPV多角体蛋白基因的密码子使用。
病毒编号 PCV2基因型 杆状病毒构建体 密码子优化 在131处的氨基酸
1 2a 噬斑挑取的 否 脯氨酸
2 2a 噬斑挑取的 是 脯氨酸
3 2a Bac-to-Bac 否 脯氨酸
4 2a Bac-to-Bac 是 脯氨酸
5 2a ProEasy 是 脯氨酸
6 2b Bac-to-Bac 否 苏氨酸
7 2b Bac-to-Bac 是 苏氨酸
8 2b Bac-to-Bac 否 脯氨酸
9 2b ProEasy 是 脯氨酸
10 2b ProEasy 是 脯氨酸
实施例2：昆虫细胞中的表达
如上所述的不同的重组杆状病毒构建体用于感染昆虫细胞，并表达PCV2 ORF2蛋白的几种变体。对产生的蛋白进行可视化并且通过与未修饰的蛋白或与另一种基因型的PCV2的蛋白比较进行分析，以评价进行的各种突变的影响。将一些重组杆状病毒按比例放大，以产生蛋白用于配制PCV2亚单位疫苗，用于在猪中进行测试。
2.1 昆虫细胞培养
使用Sf9昆虫细胞以小规模进行标准的感染和表达实验，所述Sf9昆虫细胞取自干净细胞的旋转培养物，所述干净细胞被定期分开以维持指数生长。典型的感染率在0.01和0.1 moi之间，且培养持续时间在3和5天之间。通过光学显微镜定期监测培养物，以检查未感染细胞的健康，或监测感染培养物中的病毒复制的进程。
使用的培养容器是T25或T75烧瓶(Falcon)，其分别具有5或15 ml的单层培养物。或者，在旋转烧瓶(Corning)中运行100 ml悬浮培养。将烧瓶在27℃下孵育，并且使用的培养基为Sf-900™ II (Thermo Fisher scientific)。没有添加血清，但添加以下抗生素的混合物：50 µg/ml庆大霉素和0.25 ‰纳他霉素。
当大多数细胞显示致细胞病变作用(cpe)时，收获培养物：T-烧瓶培养需要牢牢地敲击以使细胞松弛。然后离心培养物-收获物，并且弃去培养物上清液，因为产生的ORF2蛋白主要包含在昆虫细胞内。然后，取决于预期的进一步用途，可以将细胞-沉淀以期望的浓度重悬浮于所需液体中。
小规模培养物没有常规灭活；样品或者用于封隔设施(containment facilities)中，或者用变性电泳样品缓冲液处理，且然后视为灭活的。
大规模培养遵循基本上相同的概述，其中对体积和设备进行调整。在实验环境中，在具有自动过程控制的工业发酵罐中，以2至10升体积运行中等大规模昆虫细胞悬浮培养。干净Sf9昆虫细胞获得自预培养物。Moi在0.01和0.1之间，并且培养持续5-7天。当感染已足够进展时，使细胞通过重力沉降。然后除去培养体积的上面90%，将细胞收获在原始培养体积的1/10中，并通过声处理进行裂解。在中等规模下，使用尖端声处理仪(Vibra Cell™,Sonics, CT, USA)在冰上逐批进行声处理。在较大规模(100 l或更大体积)下，通过穿过流通声处理室(Sonobloc™, Bandelin)进行声处理。
接下来，使用BEI将声处理物灭活。然后使用硫代硫酸钠将其中和。然后通过离心澄清灭活的收获物，并保持含有ORF2蛋白的上清液作为主体抗原(bulk antigen)的水相。将其储存在2–8℃用于进行质量控制和进一步处理。因此，在这些产物中，抗原的药学上可接受的载体是来自昆虫细胞培养物的耗尽培养基。当需要时，可以将主体抗原浓缩，其可以针对PBS进行透析。或者，所述抗原可以用新鲜昆虫细胞培养基或用PBS稀释。
2.2 ELISA
2.2.1 ELISA的概述
用重组杆状病毒编号6(131处的苏氨酸)或病毒编号8 (T131P取代)感染昆虫细胞培养物，以测试PCV2b ORF2蛋白中的T131P取代的影响。两者都是Bac-2-Bac格式的构建体，并且不具有密码子优化。在病毒6中，测试两个分离株。
将Sf9细胞的T175烧瓶培养物感染，孵育，并通过离心整个培养物来收获。将细胞沉淀吸收至10 ml注射用水中，其有效裂解所有细胞。然后在夹心ELISA中针对其抗原质量测试细胞-裂解物，简而言之如下：
用针对PCV2 ORF2a的单克隆抗体包被聚苯乙烯微量滴定板的孔。将裂解物样品的系列稀释液与一系列PCV2a ORF2的已知参考标准品的稀释液一起孵育。接下来，将板与固定量的也针对PCV2 ORF2a的二抗(其与生物素缀合)孵育。最后，然后通过与过氧化物酶-缀合的链霉抗生物素蛋白孵育、随后通过自动读板器进行发色检测来定量结合的缀合物的量。
针对参考标准品计算裂解液中的抗原的量，在所述参考标准品中，抗原的量被任意设置为100抗原单位(AU)/ml。
2.2.2 ELISA的结果和结论
裂解物中检测到的ORF2蛋白的量如下：
- 病毒6感染的细胞(两种变体)：5.5和7.4 AU/ml，
- 病毒8感染的细胞：68 AU/ml。
在纯水中由以表达在131处没有突变的PCV2b ORF2蛋白的重组病毒感染的细胞制备的裂解物仅含有非常少的ORF2蛋白，如通过ELISA所检测到。然而，来自以表达具有T131P取代的ORF2的重组杆状病毒感染的细胞的这种裂解物含有多约10倍的蛋白。
这些ELISA结果说明，在有或没有ORF2氨基酸编号131的取代的情况下，可以容易地从感染的昆虫细胞分离的ORF2蛋白的量的很大差异。一方面，这与蛋白易于释放在非变性裂解物中相关。另一方面，这也反映在有或没有位置131处的氨基酸的突变的情况下，昆虫细胞中的PCV2b ORF2蛋白的总产量的差异。
2.3 免疫荧光测定
2.3.1 IFT测定的概述
对于免疫荧光测试(IFT)，将干净的昆虫细胞通常以2.5 x 10^4个细胞/孔接种于96-孔微量滴定板的孔中的100 µl培养基中。在附着后，将细胞用待研究的特定重组杆状病毒感染。通常，接种稀释范围的病毒，以允许在不同的moi进行观察。在孵育4-5天后，当昆虫细胞已被正确感染但尚未裂解时，分析板。除去培养基，将细胞用冷乙醇固定，并根据标准程序用适当的抗体染色。FITC-缀合的二抗用于可视化。昆虫细胞用伊文思蓝复染以增强与背景的对比。
对于这些IFT研究，使用的一抗是猪多克隆抗PCV2a抗血清，这足够有效以便还染色PCV2b和PCV2d基因型的ORF2蛋白。
2.3.2 IFT测定的结果
当比较对于不同ORF2蛋白表达产物观察到的IFT结果时，进行几项观察：
- 全部表达PCV2a ORF2蛋白的如上所述的重组病毒1-5总是全部引起细胞质染色模式，由此基本上整个昆虫细胞显示明亮的颜色。
- 然而，被表达野生型PCV2b ORF2蛋白的重组杆状病毒编号6感染的昆虫细胞展示基本上不同的模式，其中染色仅位于昆虫细胞的核周围。没有观察到细胞质染色。
- 对于被病毒编号7感染的昆虫细胞，这种IFT模式是很大程度上相同的，所述病毒编号7也表达PCV2b ORF2蛋白，但来自密码子优化的基因。唯一差异是少量(昆虫细胞的近似10%)显示细胞质染色，而大多数细胞仍展示核染色。
- 令人惊讶地，被病毒编号8感染的昆虫细胞给出这样的IFT模式，其中荧光模式与重组病毒编号7的荧光模式相反：大多数昆虫细胞展示细胞质染色，其中一些细胞仍显示核染色。病毒编号8携带PCV2b ORF2基因，其中编码氨基酸编号131的密码子已从苏氨酸突变为脯氨酸(T131P)。
- 最后，被病毒编号9(具有密码子优化且携带T131P取代的PCV2b ORF2基因，在干净的构建体中)感染的昆虫细胞全部仅显示细胞质染色。
- 值得注意的是，被重组杆状病毒编号10(编码具有T131P取代的PCV2d ORF2蛋白，密码子优化，且在干净的构建体中)感染的昆虫细胞全部仍展示核染色模式。
2.3.3 来自IFT测定的结论
结论是，在昆虫细胞中有效表达来自PCV2b的ORF2蛋白需要由脯氨酸取代位置编号131处的氨基酸，其在用抗PCV2a抗体的IFT中展示细胞质染色模式。没有这种突变，PCV2bORF2蛋白展示仅在表达该蛋白的昆虫细胞的核处或其周围的染色。
仅通过密码子优化对ORF2基因进行的突变给出IFT染色模式的轻微偏移，可能是由于表达的效率增加。
当重组杆状病毒不基于含有来自克隆载体的残余元件的构建体(诸如在使用Bac-to-Bac系统产生的重组体中)，而是‘干净的’杆状病毒构建体，即在其基因组中不含来自重组过程的另外的遗传元件时，可以进一步逆转核染色模式。可以通过使用经典的同源重组和噬斑纯化，或更便利地通过使用商业试剂盒，诸如ProEasy系统，获得这种干净的重组杆状病毒。
因此：在表达PCV2b ORF2蛋白的昆虫细胞中观察到的IFT核染色模式的逆转可以通过将编码ORF2氨基酸编号131的三联体突变以编码脯氨酸来获得。可以通过密码子优化编码基因和通过使用干净的重组杆状病毒构建体来实现细胞质ORF2蛋白表达的进一步优化。
2.4 通过凝胶-电泳的定量
2.4.1 凝胶-电泳测定的概述
为了允许定量不同ORF2蛋白的表达水平，在SDS-PAGE上运行来自感染的昆虫细胞培养物的样品，旁边是以已知量的牛血清白蛋白(BSA)作为标记蛋白的泳道。染色后，扫描凝胶并进行分析。通过使用强变性样品缓冲液，该实验揭示被各种重组杆状病毒构建体感染的昆虫细胞的总表达能力。
将待测试的不同重组杆状病毒如所述在T75烧瓶中培养，收获，离心，并将细胞沉淀吸收在7.5 ml PBS中。然后将上清液和重悬浮的细胞的样品吸收至标准变性LaemmliSDS-PAGE样品缓冲液(含有溴酚蓝指示剂和β-巯基乙醇)中。
样品在标准聚丙烯酰胺凝胶(预制Criterion TGX™, Any kD (15 %), Bio-Rad)上，在标准Tris-甘氨酸-SDS运行缓冲液中运行。在电泳后，将凝胶用Instant Blue™(Expedeon)染色。最后，将凝胶数字化并用Bio Lab GS-900校准的密度计使用Image Lab™软件，版本5.2.1进行分析，以将蛋白的量指定给凝胶上的各个条带。
2.4.2 凝胶-电泳测定的结果
在图1和2中，呈现凝胶、诸如在这些实验中使用的凝胶的一些代表性图像：图1：来自被病毒编号3、6或7感染的昆虫细胞的培养物的样品；和图2：来自具有病毒编号8或9的培养物的样品。每种类型的病毒，第一个泳道含有培养上清液的样品，接下来三个泳道含有2x浓缩细胞的样品，其中从左至右为30、20和10 µml。最左边和最右边的泳道：分子量标记10– 250 kDa (Precision Plus Protein™标准品，Bio-Rad)，条带大小在图中指示。
每个凝胶还含有稀释范围的BSA(高质量白蛋白标准品, Thermo FisherScientific)，其作为100 ng/µl溶液使用。使用的量为：图1：在泳道14-17中：0.25、0.5、1和2 µg BSA；图2：在泳道11-15中：0.25、0.5、1、2和3 µg BSA。
通过密度计的分析集中于在26 kDa处的PCV2 ORF2蛋白的条带。所有样品均在凝胶上分析两次，计算的产率结果为重复的平均值。
PCV2 ORF2蛋白的产率以每ml原始T75培养物(15 ml体积)的蛋白微克数表示。发现产率如下：
病毒编号 PCV2基因型 杆状病毒构建体 密码子优化 在131处的氨基酸 ORF2产率(μg/ml)
3 2a Bac-to-Bac 否 脯氨酸 32
6 2b Bac-to-Bac 否 苏氨酸 26
7 2b Bac-to-Bac 是 苏氨酸 36
8 2b Bac-to-Bac 否 脯氨酸 58
9 2b ProEasy 是 脯氨酸 76
可以进行几项观察：
- 对于用病毒编号8和9(具有T131P取代的PCV2b ORF2的两种病毒构建体)的病毒感染，凝胶泳道(参见图2)看起来比测试的其他病毒略微更暗，即使对于通过SDS-PAGE比较的所有培养物，moi (0.1)、培养时间(4天)和其他条件都是相同的。这可能表明感染可能没有与其他病毒一样快地进展，导致样品中的细胞-物质更多。可能脯氨酸取代引起重组杆状病毒的略微减毒。然而，蛋白-表达水平似乎未受影响，并且比没有该突变的PCV2b ORF2更好。
- 上清液的样品无一显示可通过使用的CBB染色可视化的ORF2蛋白的量。因此，在这些实验中应用的条件下，在昆虫细胞中有效地含有所有表达的ORF2蛋白。
- 未突变的PCV2b ORF2蛋白(病毒6)的表达水平低于PCV2a ORF2(病毒3)的表达水平，为26 µg/ml相比于32 µg/ml。应提醒的是，由于采用的侵袭性变性(在SDS和β-巯基乙醇中煮沸)，这些样品展示产生的总共所有蛋白。这表明，在昆虫细胞中，来自未突变的PCV2b ORF2基因的总蛋白表达实际上全面较低。
NB: 当在没有(强烈)变性的情况下收获时，这种产率的差异在实践中差得多。在该情况下，来自表达未突变的PCV2b ORF2的昆虫细胞的裂解物几乎完全没有显示任何可检测到的ORF2蛋白。
- 通过使用密码子优化的ORF2基因，可以略微增加未突变的PCV2b ORF2蛋白的产率：比较病毒-培养物6和7的产率，其中总产率分别为26 µg/ml和36 µg/ml。
- 然而，最显著的增加通过在PCV2b ORF蛋白中引入T131P取代而实现，参见病毒-培养物6和8的产率，为26 µg/ml相比于56 µg/ml。因此，甚至在没有任何优化的这些小规模培养中，T131P取代也能够引起ORF2蛋白的总产率增加超过一倍。
- 当组合所有突变(T131P取代、密码子优化和使用干净的杆状病毒构建体)时，可以实现甚至更好的PCV2b ORF2蛋白的产率：比较病毒-培养物6和9的产率，显示蛋白产率增至三倍，从26 µg/ml至76 µg/ml。
还对在2升的中间大规模培养中产生的样品进行类似的蛋白产率的分析。与总培养体积相比，以7.7x浓度获得收获物。来自这些培养物的ORF2蛋白也用于产生下文所述的实验性PCV2疫苗。
获得的ORF2蛋白产率如下，以最初2升培养体积的µg/ml指示：
病毒编号 PCV2基因型 杆状病毒构建体 密码子优化 在131处的氨基酸 ORF2产率(μg/ml)
5 2a ProEasy 是 脯氨酸 44.2
9 2b ProEasy 是 脯氨酸 103.9
发酵罐中的培养条件显然比T-烧瓶中的小规模培养中更佳。不仅因为温度、pH和溶解氧的自动控制，而且因为这些是悬浮培养物，其允许每ml培养物更高的细胞-密度。
在它们具有在干净的杆状病毒构建体(使用ProEasy系统产生)中的密码子优化的ORF2基因的意义上，所使用的重组杆状病毒也是以最佳方式构建的。
这导致被病毒编号9感染的昆虫细胞的蛋白产率超过100 µg/ml培养物，而在T-烧瓶中，这是76 µg/ml。
值得注意的是，即使使用相同的构建体和培养条件，来自表达具有脯氨酸取代氨基酸编号131的突变型PCV2b ORF2蛋白的昆虫细胞的蛋白的产率也显著高于未修饰的PCV2a ORF2蛋白的产率。具体而言，因为此处使用的PCV2a的ORF2基因在来自其天然序列的氨基酸位置131处也具有脯氨酸。并不立即清楚什么可能引起这种差异，但这对于产生用于制造针对PCV2的亚单位疫苗的PCV2b ORF2蛋白显然是高度有利的。
2.4.3 来自凝胶-电泳测定的结论
尽管此时并不能解释观察到的所有影响，但通过凝胶-电泳进行的分析使得明确地清楚的是，在昆虫细胞中表达没有任何调整的PCV2b ORF2蛋白最多得到比PCV2a ORF2的表达更低的蛋白量。当使用非变性条件收获细胞时，这种差异甚至更差。
然而，产率的缺乏完全可以通过由脯氨酸取代PCV2b ORF2中的位置131处的氨基酸来弥补，与未突变的PCV2b ORF2蛋白的产率相比，其至少使产率增加一倍。
通过表达来自密码子优化的ORF2基因的131P突变并使用干净的杆状病毒构建体，可以达到产率的甚至进一步增加。在大规模悬浮培养中，可以达到产率的仍然进一步提高。
这些发现一起首次通过重组表达系统来实现来自PCV2b基因型的ORF2蛋白的商业化和大规模生产。
实施例3：猪中的接种疫苗-攻击实验
3.1 引言
3.1.1 目标
进行该研究以比较和评估基于昆虫-细胞表达的根据本发明的突变型PCV2 ORF2蛋白的猪疫苗的效力。为了提供其保护能力的彻底测试，使用不同基因型的ORF2蛋白，其不仅针对同源PCV2攻击-感染，而且针对异源PCV2攻击-感染。此外，使用的疫苗剂量含有相对少量的ORF2蛋白。
3.1.2 研究概述
对于该研究，使用140只小猪，分配至2个集合，每个集合7个治疗组，每个治疗组10只动物，两种攻击各自一个集合。140只动物源自14只母猪。小猪具有可检测水平的抗PCV2ORF2抗体，范围为低至非常高滴度；通过抗体-ELISA，所有动物的平均MDA滴度为5.8 Log2。
当小猪为近似三周龄时，将它们在颈部肌肉内接种疫苗，每只2 ml。使用的疫苗包含经由杆状病毒-昆虫细胞表达系统产生的不同量的PCV2 ORF2蛋白，其来自三种基因型之一：PCV2a、2b或2d。如上所述，使用的重组杆状病毒是编号5、9和10，其具有氨基酸位置131处的脯氨酸，其由朝向AcMNPV多角体蛋白基因密码子优化的编码ORF2基因表达，且使用干净的杆状病毒构建体。所述疫苗用Emunade™佐剂配制成水包油乳剂。所述疫苗额外含有来自猪肺炎支原体(J毒株)的抗原，以类似于商业疫苗：Porcilis™ PCV M Hyo。关于PCV2ORF2抗原，测试的疫苗占每只动物的标准完全剂量的四分之一或十六分之一。
对于两个集合，疫苗治疗在各组中的划分如下表中所示。
NB: 两个集合的第7组中的动物均未接种疫苗，以充当攻击对照。
接种疫苗后两周，将所有动物运输至攻击设施。在接种疫苗后3周(在6周龄)，所有动物都接受用来自2b基因型或2d基因型的毒性PCV2的攻击感染。攻击是通过以5 Log10TCID50/ml鼻内施用6 ml(每个鼻孔3 ml)PBS中的 PCV2的方式；对于集合1，使用：PCV2b攻击病毒(荷兰分离株，2003)，且对于集合2，使用：PCV2d攻击病毒(德国分离株，2015)。攻击病毒已经在不含PCV的PK15细胞上产生，并且已经针对细菌和真菌无菌性进行检查。
攻击后三周(在9周龄)，将所有动物安乐死并检查：原位检查内脏，尤其注意：肺、腹股沟和肠系膜淋巴结、扁桃体、胸腺、脾脏、肝脏和肾脏。接下来，移取来自扁桃体、肺、肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结的样品，并固定用于通过免疫-组织化学(IHC)检测PCV2攻击病毒。
还进行其他分析，诸如对血液样品的血清学分析，以及对组织和拭子样品的qPCR。然而，IHC数据给出最明确的结果。
3.2 材料和方法
3.2.1 PCV2 ORF2蛋白：
在中等大规模培养中产生PCV2a、2b和2d的PCV2 ORF2基因序列，如上文部分2.1中所述。通过凝胶-电泳对它们的定量描述于上文部分2.3.2中。
3.2.2 测试动物
测试动物对于PCV2病毒载量为阴性，并且具有中等水平的抗PCV2抗体。如果任何动物在攻击前已经发展PCV2感染的临床体征，则将拒绝该测试。
在试验中仅包括健康动物。每天观察所有小猪的总体健康，以及疾病的临床或全身性体征，诸如食欲不振，不愿移动，倾向于躺下，无精打采或嗜睡，发抖，毛发竖立，浮肿(尤其是眼睛周围)，呕吐以及腹泻和呼吸困难。
通过耳标单独地标记小猪，其中14窝的小猪等同地分配给测试组。断奶后，可随意取自来水，并且根据标准程序进行喂食。
在产小猪农场给予接种疫苗。运输至攻击设施后，包括一周适应环境。
3.2.3 实验室实验程序
3.2.3.1 免疫组织化学
通过固定在10%福尔马林中且包埋在石蜡中来制备组织样品用于组织学检查。制备显微镜载片。将这些与作为一抗的兔多克隆抗PCV2血清孵育，并用过氧化物酶染色(Envision+™, DAKO)来可视化。将载片用苏木精复染。在扁桃体和淋巴结的显微镜检查中，取决于着色的程度，对特征性的棕色染色给予评分：
- 评分0：淋巴滤泡显示无特异性阳性染色；
- 评分1：少于10%的淋巴滤泡含有最多达15个具有特异性阳性染色的细胞；
- 评分2：10 – 50%的淋巴滤泡含有最多达15个具有特异性阳性染色的细胞，或少于10%的淋巴滤泡具有超过15个具有特异性阳性染色的细胞；
- 评分3：> 50%的淋巴滤泡含有具有特异性阳性染色的细胞。
记录单独组织的评分的总和作为每只动物的总IHC评分，并且对于一组的所有动物组合这些。
3.2.3.2 疫苗制剂
将测试疫苗用Emunade™(这是一种双重佐剂，其具有分散在含有疫苗抗原以及氢氧化铝的水相中的矿物油)配制为水包油乳剂。具有9 % Mhyo抗原的制剂根据如WO 2016/091998中所公开的程序。
此外，所述疫苗按照EP 1.926.496制备，使得25%的完全剂量(2 ml/动物)包含近似20 µg的ORF2蛋白，且6.25%剂量包含5μg ORF2蛋白/动物剂量。
3.3 结果和结论
通过免疫组织化学的方式，分析尸检后收集的扁桃体、肠系膜和腹股沟淋巴结的组织样品，以评价可检测的攻击病毒的量。这些结果的图形概述呈现于图3和4中：图3代表接受用毒性PCV2b病毒的攻击感染的集合1的第1-7组中的动物的结果；图4代表集合2的所有动物的IHC数据，在所述集合2中，用毒性PCV2D病毒攻击动物。
纵轴呈现根据上述标度的IHC强度的得分。通过比较接种疫苗组相比于未接种疫苗组中的PCV2感染的降低水平，IHC结果可用于确定基于PCV2 ORF2蛋白的疫苗的效力。
可以进行几项观察：
- 未接种疫苗的动物显示比接种疫苗的组明显更高的IHC评分，表明攻击的剂量足够高，并且甚至在小猪中的中等水平的抗PCV2母体抗体的背景下，攻击感染也是有效的。
- 如可见：包含5或20 µg ORF2蛋白的疫苗剂量给出针对攻击病毒的复制的强烈保护，达到IHC评分的最多达90%的降低。因此，这些PCV2疫苗是高度有效的。
- 对于最低剂量的PCV2a ORF2蛋白，观察到针对PCV2d攻击的有点更低的保护。这表明根据本发明的基于昆虫-细胞表达的来自PCV2b或PCV2d的突变型ORF2蛋白的PCV2疫苗作为针对PCV2感染的疫苗是非常有效的，甚至在单一剂量下，且甚至在母体来源的抗体的背景下。在相等剂量下，这些基于来自PCV2b或PCV2d的突变型ORF2蛋白的疫苗甚至看起来比基于PCV2a ORF2蛋白的传统疫苗更有效。
- 尽管同源保护大多数比异源保护更好，但通过测试的所有三种疫苗基因型，存在明显水平的针对PCV2b和PCV2d攻击病毒的交叉-保护：PCV2a和PCV2d ORF2蛋白疫苗在其最低剂量下针对PCV2b攻击的保护作用方面是相当的，而PCV2a ORF2蛋白在较高剂量下更好。然而，在两种剂量下，基于突变型PCV2b ORF2蛋白的疫苗针对PCV2d攻击比PCV2a ORF2蛋白更好。
附图简述
图1：
具有来自经由用重组杆状病毒感染表达不同PCV2 ORF蛋白的昆虫细胞的培养物的样品的SDS-PAGE凝胶的扫描。
泳道编号和泳道内容物的指示描绘在凝胶图像上方。
- 泳道1和18：分子量标记；图像左侧指示以kDa计的分子量的指示
- 泳道2 - 5：用病毒3感染的细胞；泳道2：上清液；泳道3-5细胞-沉淀，分别为30、20和10 µl
- 泳道6 - 9：用病毒6感染的细胞；泳道6：上清液；泳道7-9 细胞-沉淀，分别为30、20和10 µl
- 泳道10 - 13：用病毒7感染的细胞；泳道10：上清液；泳道11-13 细胞-沉淀，分别为30、20和10 µl
- 泳道14 - 17：BSA蛋白的参考样品，分别为：0.25、0.5、1和2 µg。
图2：
具有来自经由用重组杆状病毒感染表达不同PCV2 ORF蛋白的昆虫细胞的培养物的样品的SDS-PAGE凝胶的扫描。
泳道编号和泳道内容物的指示描绘在凝胶图像上方。
- 泳道1和16：分子量标记；图像左侧指示以kDa计的分子量的指示
- 泳道2 - 5：用病毒8感染的细胞；泳道2：上清液；泳道3-5细胞-沉淀，分别为30、20和10 µl
- 泳道6 - 9：用病毒9感染的细胞；泳道6：上清液；泳道7-9 细胞-沉淀，分别为30、20和10 µl
- 泳道10：空
- 泳道11 - 15：BSA蛋白的参考样品，分别为：0.25、0.5、1、2和3 µg。
图3和4：
来自对猪的不同组织的免疫组织化学的结果的图形表示，所述猪在接受由昆虫细胞表达的PCV2 ORF2蛋白制备的疫苗后，接受用PCV2感染的攻击。呈现对于扁桃体、肠系膜淋巴结(‘Mes. ln’)和腹股沟淋巴结(‘Ing. ln’)的组织结果。
在横轴上指示应用(或未应用)的各种疫苗；纵轴呈现根据特定评分标度的IHC强度的任意评分。
图3代表接受用毒性PCV2b病毒的攻击感染的集合1的第1-7组中的动物的IHC结果；
图4代表集合2的第1-7组中的动物的IHC结果，在所述集合2中，用毒性PCV2d病毒攻击动物。
序列表
<110> Intervet Int. BV
<120> PCV2b ORF2蛋白在昆虫细胞中的重组表达
<130> 24469
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCV2b ORF2基因 - 突变的
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(699)
<400> 1
atg acc tac ccc cgt cgt cgt tac cgt cgt cgt cgt cac cgt ccc cgt 48
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
agc cat ctg ggc caa atc ctt cgt cgt cgt ccc tgg ctg gtt cac ccc 96
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
cgt cat cgt tac cgt tgg cgt cgt aag aac ggt atc ttc aac acc cgt 144
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
ctt tca cgt acc ttc gga tac act gtt aag cgt acc act gtg aaa act 192
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50 55 60
ccc agc tgg gct gtt gac atg atg cgt ttc aac atc aac gac ttc ctt 240
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
ccc ccc gga ggt gga agc aac ccc cgt tct gtg ccc ttc gag tac tac 288
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
cgt atc cgt aag gtt aaa gtg gaa ttc tgg ccc tgc tct ccc atc acc 336
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
caa ggc gac cgt ggc gtt ggt agc tct gcc gtg atc ctt gac gac aac 384
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
ttc gtt ccc aaa gct acc gcc ctc act tac gac ccc tac gtg aac tac 432
Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
tca agc cgt cac acc atc act caa ccc ttc tct tac cat tca cgt tac 480
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
ttc acc ccc aag ccc gtt ctc gac tct act atc gac tac ttc caa ccc 528
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
aac aac aaa cgt aac caa ctg tgg ctt cgt ctc caa acc act ggt aac 576
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180 185 190
gtt gac cac gtg gga ctg ggc acc gct ttc gag aac tca atc tac gac 624
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
caa gaa tac aac atc cgt gtt act atg tac gtg caa ttc cgt gag ttc 672
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
aac ctc aag gac ccc ccc ctg aac ccc taa 702
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230
<210> 2
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg
1 5 10 15
Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro
20 25 30
Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg
35 40 45
Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Lys Thr
50 55 60
Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu
65 70 75 80
Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Arg Ser Val Pro Phe Glu Tyr Tyr
85 90 95
Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr
100 105 110
Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn
115 120 125
Phe Val Pro Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr
130 135 140
Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr
145 150 155 160
Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro
165 170 175
Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn
180 185 190
Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp
195 200 205
Gln Glu Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe
210 215 220
Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro
225 230

Claims (11)

1.包含异源核酸的昆虫细胞，所述异源核酸包含：
a. 编码来自基因型2b的猪圆环病毒2(PCV2b)的ORF2蛋白的核苷酸序列，和
b. 与所述核苷酸序列可操作连接的转录控制序列，
所述昆虫细胞的特征在于所述核苷酸序列编码如SEQ ID NO:2所示的突变型PCV2bORF2蛋白。
2.根据权利要求1所述的昆虫细胞，其特征在于所述转录控制序列是杆状病毒p10基因启动子或杆状病毒多角体蛋白基因启动子。
3.根据权利要求1或2所述的昆虫细胞，其特征在于所述异源核酸包含在重组杆状病毒基因组中。
4.用于在根据权利要求1-3中任一项所述的昆虫细胞中表达突变型PCV2b ORF2蛋白的方法，所述方法采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统。
5.用于产生如SEQ ID NO:2所示的突变型PCV2b ORF2蛋白的方法，所述产生包括以下步骤：
- 培养根据权利要求1-3中任一项所述的昆虫细胞；和
- 从昆虫细胞培养物收获所述突变型PCV2b ORF2蛋白。
6.用于减少PCV2的感染或相关疾病体征的猪动物的疫苗，所述疫苗包含在药学上可接受的载体中的突变型PCV2b ORF2蛋白，其特征在于所述突变型PCV2b ORF2蛋白如SEQ IDNO:2所示。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于所述突变型PCV2b ORF2蛋白呈VLP的形式。
8.根据权利要求6或7所述的疫苗，其包含佐剂。
9.根据权利要求6或7所述的疫苗，其包含对猪动物致病性的微生物的另外的抗原。
10.如SEQ ID NO:2所示的突变型PCV2b ORF2蛋白用于制造猪动物的疫苗的用途，所述猪动物的疫苗用于减少PCV2的感染或相关疾病体征。
11.用于制备根据权利要求6-9中任一项所述的疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
- 将如SEQ ID NO:2所示的突变型PCV2b ORF2蛋白与药学上可接受的载体混合；或
- 将如SEQ ID NO:2所示的突变型PCV2b ORF2蛋白和药学上可接受的载体的所述混合物与佐剂一起配制。
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EP17196768.0 2017-10-17
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2020003626A (es) * 2017-10-17 2021-08-12 Intervet Int Bv Expresión recombinante de la proteína orf2 de pcv2b en células de insecto.
CN115960259B (zh) * 2022-10-07 2023-11-24 浙江大学 一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用
CN115645417A (zh) * 2022-10-17 2023-01-31 武汉轻工大学 鹅去氧胆酸在制备治疗或预防猪病毒性腹泻的药物或饲料添加剂中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009000459A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Ghent University Methods and compositions in the treatment of porcine circoviral infection
WO2015048115A1 (en) * 2013-09-25 2015-04-02 Zoetis Llc Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use
WO2015051099A1 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof
CN104984335A (zh) * 2015-07-14 2015-10-21 浙江诺倍威生物技术有限公司 猪圆环病毒双亚型orf2共表达载体构建及疫苗制备

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
US7833707B2 (en) * 2004-12-30 2010-11-16 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2
TWI398272B (zh) 2005-03-08 2013-06-11 Intervet Int Bv 化學定義的安定劑
KR101347503B1 (ko) 2005-09-09 2014-01-02 인터벳 인터내셔널 비.브이. Ｐｃｖ-2 백신
US20100150959A1 (en) 2008-12-15 2010-06-17 Vectogen Pty Ltd. PCV 2-Based Methods and Compositions for the Treatment of Pigs
TW201043267A (en) 2009-03-19 2010-12-16 Intervet Int Bv In situ constituting a vaccine for administration to a predetermined herd of animals
DK2961766T3 (da) * 2013-03-01 2019-07-15 Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc Kvantificering af vaccinesammensætninger
JP6648138B2 (ja) 2014-12-11 2020-02-14 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 即時使用型ＰＣＶ２／Ｍ．ハイオ（Ｍ．ｈｙｏ）混合ワクチンのための工程
JP7248650B2 (ja) 2017-08-03 2023-03-29 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 遺伝子型２ｂのｐｃｖ２ ｏｒｆ２タンパク質を含むワクチン
MX2020003626A (es) * 2017-10-17 2021-08-12 Intervet Int Bv Expresión recombinante de la proteína orf2 de pcv2b en células de insecto.

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009000459A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Ghent University Methods and compositions in the treatment of porcine circoviral infection
WO2015048115A1 (en) * 2013-09-25 2015-04-02 Zoetis Llc Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use
WO2015051099A1 (en) * 2013-10-02 2015-04-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 orf2 protein variant and virus like particles composed thereof
CN105658660A (zh) * 2013-10-02 2016-06-08 勃林格殷格翰动物保健公司 Pcv2 orf2蛋白变体和由其组成的病毒样颗粒
CN104984335A (zh) * 2015-07-14 2015-10-21 浙江诺倍威生物技术有限公司 猪圆环病毒双亚型orf2共表达载体构建及疫苗制备

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Giovanni Franzo等.Porcine circovirus type 2 (PCV2) evolution before and after the vaccination introduction: A large scale epidemiological study.SCIENTIFIC REPORTS.2016,第6卷(第1期),摘要，第6页表3，第7页第2，5段. *
Hui-Gang SheN等.Prevalence and phylogenetic analysis of the current porcinecircovirus 2 genotypes after implementation of widespreadvaccination programmes in the USA.JOURNAL OF GENERAL VIROLOGY.2012,第93卷第1345-1355页. *
ORF2 [Porcine circovirus 2];NCBI;Genbank database;GenBank: AAC35331.1 *
李玲 ; 李国新 ; 徐彦召 ; 高景鹏 ; 周艳君 ; 童光志 ; .猪圆环病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中表达形成病毒样颗粒的研究.中国动物传染病学报.2011,19(05),第15-20页. *
猪圆环病毒2a/2b亚型病毒株毒力分析;刘健等;中国畜牧兽医;第40卷(第2期);23-27 *

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