ES2962449T3

ES2962449T3 - Expresión recombinante de la proteína ORF2 del PCV2b en células de insecto

Info

Publication number: ES2962449T3
Application number: ES18783522T
Authority: ES
Inventors: Paulus Sondermeijer; Lisette Sanders; Der Heijden - Liefkens Karin Van
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2017-10-17
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: JP7062760B2; DK3697804T3; CN111212847A; JP7422795B2; RU2020115868A; JP2020537651A; KR20200066700A; JP2022065059A; KR102480771B1; RU2020115868A3; PL3697804T3; EP3697804A1; CN111212847B; CA3078281A1; US11279952B2; US20200299726A1; WO2019076864A1; HUE064720T2; BR112020007498A2; EP3697804B1

Abstract

La presente invención se refiere al campo de las vacunas veterinarias, en particular a las vacunas porcinas contra PCV2 y enfermedades asociadas. Específicamente, la invención se refiere al hallazgo de que se requiere una mutación en la proteína ORF2 de PCV2b, para evitar su acumulación nuclear tras su expresión en células de insecto; la mutación introduce una prolina en la posición del aminoácido 131. Esto permite una expresión eficiente en células de insectos, una fácil recolección y genera grandes cantidades de partículas similares a virus. Las VLP son muy eficaces en vacunas para porcinos para reducir la infección por PCV2 o los signos de enfermedad asociados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Expresión recombinante de la proteína ORF2 del PCV2b en células de insecto

La presente invención se refiere al campo de las vacunas veterinarias, en particular a las vacunas porcinas contra el PCV2. Específicamente, la invención se refiere a células de insecto que comprenden una secuencia de ácido nucleico heteróloga que expresa una proteína ORF2 del PCV2b mutante, a partículas similivíricas de la proteína ORF2 del PCV2b mutante, a métodos de producción o uso de las células de insecto o de la proteína ORF2 del PCV2b mutante, y a vacunas para animales porcinos.

El circovirus porcino 2 (PCV2, del inglésPorcine circovirus 2)es un patógeno de animales porcinos, que se produce en todo el mundo y provoca mucho sufrimiento a los animales y graves pérdidas económicas al sector agrícola. Para una revisión, véase Gillespieet al.(2009, J. Vet. Intern. Med., vol. 23, pág. 1151-1163).

PCV2 pertenece a la familiaCircoviridaey tiene un pequeño virión icosaédrico sin envoltura (17 nm), que contiene un genoma de ADN monocatenario circular de aproximadamente 1,76 kb. El genoma contiene sólo unos pocos marcos de lectura abiertos, de los cuales el ORF2 codifica la proteína de la cápside vírica que contiene los principales epítopos neutralizantes del virus.

El PCV2 es relativamente estable y altamente infeccioso. Se elimina a través de diferentes tipos de secreciones corporales y puede propagarse tanto horizontal como verticalmente en una piara de cerdos. Las principales lesiones causadas por la infección por PCV2 son el empobrecimiento linfoide; la inmunosupresión resultante también hace que un animal infectado sea susceptible a infecciones secundarias o concurrentes. En consecuencia, el PCV2 está implicado en una serie de síndromes de enfermedades porcinas que se denominan colectivamente: enfermedad asociada al circovirus porcino (PCVAD, del inglésporcine circovirus associated disease).La PCVAD más pronunciada es el "síndrome multisistémico de emaciación posdestete" (PMWS, del ingléspostweaning multisystemic wasting syndrome),observado en cerdos jóvenes. Los signos clínicos y la patología del PMWS incluyen emaciación progresiva, disnea, taquipnea y ocasionalmente ictericia y hepatitis. Otros PCVAD son: Complejo de enfermedades respiratorias porcinas, Síndrome de dermatitis y nefropatía porcina, fallo reproductivo, enteritis granulomatosa, temblores congénitos y epidermitis exudativa. Para reseñas véase: el Merck Veterinary Manual, 11a ed., 2016, ISBN: 9780911910933; y: "Diseases of Swine", 10a ed., 2012, ISBN: 9780813822679.

Sin embargo, sin una infección secundaria, la mayoría de los cerdos infectados con PCV2 pueden no mostrar síntomas clínicos claros de la enfermedad, excepto por el deficiente crecimiento y desempeño en cerdos aparentemente sanos. Los síntomas (sub)clínicos de la PCVAD causados por el PCV2 se pueden observar en cerdos generalmente a partir de las 3 o 4 semanas de edad, que es el momento en el que los lechones son destetados y los anticuerpos protectores maternos comienzan a disminuir.

Para protegerse contra la infección por el PCV2 y sus signos de enfermedad asociados, hay varias vacunas comerciales disponibles y se están utilizando en grandes cantidades en todo el mundo. Los diferentes tipos de vacunas para el PCV2 son, por ejemplo: una vacuna basada en el virus PCV2 entero inactivado (Circovac™, Merial), o en el virus quimérico PCV1/PCV2 inactivado (Suvaxyn™ PCV, Fostera™ PCV, Zoetis). Sin embargo, la más común es una vacuna de subunidades basada en la proteína de la cápside del PCV2 expresada de forma recombinante, llamada comúnmente: Proteína ORF2 (Ingelvac™ CircoFLEX, Boehringer Ingelheim; y: Circumvent™ PCV, Porcilis™ PCV, MSD AH). La vacuna de subunidades de la proteína ORF2 se produce comúnmente mediante la expresión del gen de ORF2 del PCV2 en un sistema de expresión recombinante; el más utilizado es el sistema de expresión de células de insectobaculovirus. La proteína ORF2 expresada se autoensambla en partículas similivíricas (VLP), que se asemejan a un virión de PCV2 nativo, excepto que carece del contenido del genoma vírico y, por lo tanto, no es replicativo. Las vacunas basadas en dichas VLP de ORF2 de PCV2 son muy estables, son altamente inmunogénicas cuando se formulan con un adyuvante y han demostrado ser seguras para cerdos de todas las edades, ya sea seropositivos para anticuerpos para PCV2 o no. Una dosis completa típica de vacuna basada en la proteína ORF2 de PCV2 contiene aproximadamente 80 |jg de proteína ORF2, en un volumen de dosis de 2 ml/animal. Sin embargo, estas vacunas de subunidades ya son eficaces con aproximadamente 20 microgramos de ORF2 por dosis para animales, véase el documento EP 1.926.496. También se pueden proporcionar como vacuna de una sola inyección y se pueden administrar por diferentes vías de administración, tales como la intramuscular (i.m.), la subcutánea (s.c.) o la intradérmica (i.d.).

Dentro de la especie PCV2 existen diferentes genotipos del virus. Estos se pueden distinguir por la distancia genética entre sus genes de ORF2, y en el pasado se han utilizado una variedad de convenciones de nomenclatura. Sin embargo, Segaleset al.(2008, Vet. Rec., vol. 162, pág. 867-868) publicaron un método que se ha convertido en el criterio actualmente adoptado para determinar y nombrar los genotipos del PCV2. De los 5 genotipos diferentes del PCV2 que se reconocen en la actualidad, actualmente sólo tres tienen relevancia veterinaria en este campo: PCV2a, PCV2b y PCV2d.

Si bien todas las vacunas comerciales para el PCV2 se basan actualmente en el PCV2a, la prevalencia de los genotipos PCV2b y 2d parece estar aumentando en el campo. Para una revisión véase: Karuppannan y Opriessnig, 2017, Viruses, vol. 9, pág. 9, doi: 10.3390/v9050099. Aunque estos autores concluyen que existe un nivel adecuado de protección cruzada entre estos genotipos, generalmente se prefiere aplicar vacunas de tipo homólogo. En consecuencia, existe la necesidad en el campo de producir vacunas seguras, baratas y eficaces también para genotipos del PCV2 distintos del PCV2a.

El documento WO 2009/000459 (University Gent) describe diagnósticos para identificar variantes antigénicas o patogénicas del PCV2, basado en la proteína ORF2; específicamente métodos y anticuerpos útiles para ese fin. Se describen secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de ORF2 de dos cepas de PCV2b. Se sugieren varias mutaciones de la proteína ORF2, para cambiar el perfil de reconocimiento por anticuerpos monoclonales. Entre las muchas mutaciones sugeridas, uno es la de treonina en la posición del aminoácido 131 a prolina. Sin embargo, el documento WO 2009/000459 solo divulga suficientemente las pruebas serológicas de cepas no mutadas (de tipo silvestre) de PCV2a (Stoon 1010, 1121) y PCV2b (48285), y solo divulga la expresión de<o>R<f>2 no mutada de una de las cepas de PCV2a de tipo silvestre (Stoon 1010) en células de insectos.

Posteriormente Sahaet al.,2012 (J. of Gen. Virol., vol. 93, pág. 1548-1555), describen entre otros la expresión de la proteína ORF2 del PCV2a con la mutación T131P en células PK-15, mediante la transfección de clones infecciosos del genoma de PCV2 mutado.

El documento WO 2010/068969 (Vectogen) describe métodos de vacunación contra el PCV2 mediante el suministro de ORF2 a través de un vector vírico, mediante el cual la proteína ORF2 se ha mutado reemplazando o eliminando la "señal de localización nuclear", es decir, los 41 aminoácidos aminoterminales de ORF2. Como resultado, ORF2 se expresa en el citoplasma o se secreta a partir de células infectadas con el vector. El vector vírico preferido es el adenovirus porcino.

El documento WO 2015/051099 (Boehringer-Ingelheim) describe métodos para aumentar el nivel de expresión de la proteína ORF2 del PCV2b y sus partículas similivíricas en un sistema de expresión de células de insecto-baculovirus, introduciendo una mutación en la secuencia codificante de ORF2 del PCV2b: la mutación divulgada es una sustitución de la arginina en la posición del aminoácido 63, preferentemente a treonina. No se menciona ninguna mutación en la posición del aminoácido 131 de ORF2 del PCV2b, ni información sobre ningún problema con la expresión de esta proteína en células de insecto.

El documento EP 17184630 (Intervet Int. BV) divulga que en una vacuna para el PCV2, se descubrió que la proteína ORF2 del genotipo PCV2b proporciona no sólo protección homóloga, sino también una buena protección cruzada contra los genotipos heterólogos PCV2a y PCV2d. Además, este efecto se obtuvo -inesperadamente- incluso en cantidades muy bajas, de menos de 20 |jg de proteína ORF2 del PCV2b por dosis para animales. En consecuencia, será suficiente vacunar a los cerdos con una dosis baja de proteína ORF2 del PCV2b, para proporcionar una protección inmunitaria eficaz contra todas las cepas actuales de PCV2.

El uso de células de insecto para la expresión recombinante de proteínas es bien conocido y se aplica de diferentes formas: expresión en insectos vivos, en células primarias de insectos o en líneas celulares de insectos inmortalizadas en cultivo. Las células de insecto más utilizadas son de origen de lepidóptero, tales como las de los génerosSpodopteraoTrichoplusia.El uso de estas células suele realizarse en el contexto del popular sistema de expresión de células de insecto-baculovirus, en donde se usa un baculovirus recombinante para infectar células de lepidóptero en cultivo. Un baculovirus contiene varios promotores fuertes que no son necesarios cuando el virus se replica en un cultivo celular; estos pueden luego usarse para dirigir la expresión de un gen heterólogo.

Un objeto de la presente invención es superar una desventaja de la técnica anterior y adaptarse a una necesidad en el campo, proporcionando una forma de optimizar la expresión recombinante de la proteína ORF2 del PCV2 en células de insectos.

Al investigar la preparación de vacunas para el PCV2 basadas en subunidades de la proteína ORF2, los inventores descubrieron que la expresión recombinante de la proteína ORF2 de cepas virales del genotipo PCV2b, en células de insecto, no era tan sencillo como para la proteína ORF2 del genotipo PCV2a. Se descubrió que la proteína ORF2 del PCV2b expresada tenía una tendencia natural a acumularse en el núcleo de las células de insecto en las que se expresaba. En esta forma, los niveles de expresión total de la proteína ORF2 del PCV2b se redujeron mucho y la proteína resultó ser muy difícil de recoger y purificar mediante procesamiento posterior; incluso cuando se utilizó una disociación agresiva, sólo se pudieron aislar cantidades muy pequeñas de proteína ORF2. Además, en las pequeñas cantidades de proteína que se pudieron aislar, la cantidad de VLP era muy baja; aparentemente, la localización nuclear impidió que la proteína ORF2 se autoensamblara en VLP en un grado significativo. Como resultado, la inmunogenicidad de esta proteína expresada se redujo mucho.

Sorprendentemente, se descubrió que cuando se introducía una sustitución de aminoácido muy específica en la proteína ORF2 del PCV2b, podía impedirse en gran medida la acumulación nuclear tras la expresión en células de insectos.

La sustitución de aminoácido específica implicó el cambio del aminoácido que se produce de forma natural en la posición 131 de la proteína ORF2 del PCV2b de longitud completa, a un aminoácido de prolina. Con una prolina en la posición 131, la mayor parte de la proteína ORF2 del PCV2b mutante expresada ("ORF2b-131 P") se produjo en el citoplasma de la célula de insecto, en lugar de acumularse en el núcleo. Se descubrió que esto aumenta los niveles totales de expresión, además de facilitar en gran medida la recogida de la proteína ORF2 del PCV2b mutante de estas células de insecto; en este estado citoplásmico, podrían utilizarse procedimientos de aislamiento convencionales de bajo impacto, de modo que se pudieran aislar fácilmente grandes cantidades de proteína. Además, se descubrió que la mayor parte de ORF2b-131P se había ensamblado efectivamente en VLP, que son muy eficaces en una vacuna para PCV2 para animales porcinos.

Esto fue inesperado, especialmente en comparación con la situación con la proteína ORF2 de PCV2a: mientras que en la proteína ORF2 del virus PCV2b el aminoácido natural en la posición 131 suele ser una treonina; en los virus PCV2a, algunos tienen una treonina en 131 y otros tienen una prolina. Sin embargo, cuando se expresa en células de insectos, ninguna de las dos variantes de ORF2 del PCV2a se acumula en el núcleo. En consecuencia, no había indicios para sospechar que esta posición particular de aminoácido sería la causa de la acumulación nuclear observada para la proteína ORF2 del PCV2b cuando se expresa en células de insecto.

Aún más notable fue que la proteína ORF2 del PCV2d, que también muestra acumulación nuclear tras la expresión en células de insectos, no se pudo invertir a un patrón de expresión citoplásmico después de la sustitución de su treonina natural en la posición 131 a prolina.

Aparentemente, la situación en torno a la expresión de la proteína ORF2 del PCV2 en células de insecto es única para cada uno de los genotipos.

No se sabe cómo la sustitución del aminoácido 131P impide la acumulación de la proteína ORF2 del PCV2b en el núcleo, tras su expresión en células de insecto. Aunque los inventores no pretenden quedar ligados a teoría alguna o modelo que pueda explicar estos hallazgos, especulan que tener un aminoácido prolina en esta posición particular en la proteína ORF2 del genotipo PCV2b, induce un cambio en las propiedades de esta proteína ORF2. El cambio puede afectar, por ejemplo, al plegamiento tridimensional o al perfil de hidrofobicidad de la proteína ORF2, lo que puede afectar su ruta dentro de la célula de insecto.

Este descubrimiento abre el camino a una serie de usos ventajosos, mejorando la disponibilidad y la calidad antigénica de la proteína ORF2 del PCV2b expresada de forma recombinante. A su vez, esto permite la fabricación conveniente a gran escala de vacunas de subunidades eficaces para PCV2 para animales porcinos; porque no se precisan compuestos disociativos agresivos ni técnicas complicadas para su aislamiento, la proteína expresada se puede producir de forma barata, segura y eficaz.

De esta manera se pueden cumplir uno o más objetos de la presente invención y, en consecuencia, se pueden superar una o más desventajas de la técnica anterior.

Por lo tanto, en un aspecto la invención se refiere a células de insecto que comprenden un ácido nucleico heterólogo que comprende:

a. una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína ORF2 del circovirus porcino 2 de genotipo 2b (PCV2b), y

b. una secuencia de control de la transcripción que está unida operativamente a dicha secuencia de nucleótidos, caracterizado por que la secuencia de nucleótidos codifica una proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131.

Para la invención, las "células de insecto" son células obtenidas de un organismo de la claseInsecta.Las células son viables (es decir, capaces de multiplicarse) y suficientemente intactas para ser capaces de expresar proteínas. Las células pueden estar en reposo o activas y pueden estar en cualquier fase del ciclo celular. Las células de insecto se pueden utilizar para la invención de diferentes maneras: ya sea utilizando un insecto entero; mediante el uso de un extracto o parte de un insecto; mediante el uso de células primarias obtenidas de un insecto; utilizando el tejido u órgano de un insecto; o mediante el uso de una línea celular de insecto inmortalizada.

Las células de insecto de la invención normalmente estarán contenidas en un transportador adecuado. Dicho transportador es una composición que mantiene la viabilidad de las células de insecto y es, por ejemplo, un líquido, tal como una solución tamponada o un medio de cultivo. En el contexto del uso de insectos enteros, el propio cuerpo del organismo insecto funciona como transportador.

La expresión "que comprende" (así como las variaciones, tales como "comprenden", "comprende" y "comprendido"), como se utiliza en el presente documento, pretende referirse a todos los elementos y en cualquier combinación posible concebible para la invención, que están cubiertos por o incluidos en el apartado, párrafo, reivindicación del texto, etc., en la que se aplica esta expresión, incluso si tales elementos o combinaciones no se citan explícitamente; y no a la exclusión de cualquiera de tal elemento o elementos o combinaciones.

Por tanto, cualquier apartado, párrafo, reivindicación del texto, etc., también puede referirse también a una o más realizaciones en donde la expresión "que comprende" (o sus variantes) se sustituye por expresiones tales como "consiste en", "que consiste en" o "consiste esencialmente en".

Para la invención, un ácido nucleico es "heterólogo" con respecto a las células de insecto que lo componen, si el ácido nucleico no estaba presente en los ácidos nucleicos de las células de insecto parentales de las que se obtuvieron las células. El ácido nucleico puede ser de cualquier tipo, por ejemplo, ADN o ARN.

El ácido nucleico heterólogo para la invención se puede introducir de diferentes maneras en las células de insecto de acuerdo con la invención, tal como por transfección o electroporación del ácido nucleico, posiblemente en un transportador; alternativamente mediante infección por un microorganismo recombinante, por ejemplo, un virus.

Una secuencia de nucleótidos "está codificando", o el similar "codifica", una proteína cuando su transcripción y/o traducción da como resultado que esa proteína se exprese. Normalmente, una secuencia de nucleótidos capaz de codificar una proteína se denomina marco de lectura abierto (ORF), lo que indica que no están presentes codones de terminación no deseados que terminaran prematuramente la traducción de la proteína. Tal secuencia de nucleótidos puede ser un gen que codifica una proteína completa, o puede ser un fragmento de gen, que codifique una parte de una proteína, por ejemplo, que codifique sólo la forma madura o secretada de una proteína, es decir, sin un "líder'', "anclaje" o "secuencia señal". La secuencia de nucleótidos puede ser de origen natural o sintético.

Para la invención, una "proteína" es una cadena molecular de aminoácidos. Una proteína puede ser una proteína nativa o madura, una pre- o proproteína, o una parte de una proteína. Entre otros: los péptidos, oligopéptidos y polipéptidos están incluidos dentro de la definición de proteína.

La proteína "ORF2" para la invención se refiere a una proteína codificada por el marco de lectura abierto 2 (ORF2) en el genoma de PCV, o por una parte de ORF2. La proteína ORF2 del PCV2 de longitud completa suele tener una longitud de 233 aminoácidos y, cuando se analiza en una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE), presenta un peso molecular relativo de aproximadamente 26 kDa. Sin embargo, las formas truncadas de la proteína ORF2 son bien conocidas y pueden usarse ventajosamente para la invención, por ejemplo, la forma truncada de la proteína ORF2 del PCV2 a la que le faltan 30 aminoácidos en su lado aminoterminal. La proteína ORF2 también se llama cápside y la secuencia de ácido nucleico codificante se llama gen de ORF2 o gen de la cápside.

Diversos proveedores ofrecen programas informáticos en el mercado que pueden ayudar en el análisis de regiones codificantes y representar dicha información de forma conveniente.

"Circovirus porcino 2" o PCV2 se refiere al circovirus de esa especie, que tiene los rasgos característicos de los miembros de su grupo taxonómico, tales como las características morfológicas, genómicas y bioquímicas, así como las características biológicas, tales como el comportamiento fisiológico, inmunológico o patológico.

Como es conocido en el campo, la clasificación de un microorganismo como una especie particular se basa en una combinación de tales rasgos. Por lo tanto, la invención incluye también PCV2 que están subclasificados a partir de los mismos de alguna forma, por ejemplo, como una subespecie, cepa, aislado, genotipo, variante, subtipo o subgrupo, y similares.

Será evidente para una persona experta en campo de la invención que, si bien actualmente se puede asignar un PCV2 particular para la invención a esa especie, esa es una clasificación taxonómica, ni obstante, que podría cambiar con el tiempo según los nuevos conocimientos puedan conducir a la reclasificación en un grupo taxonómico nuevo o diferente. Sin embargo, como esto no cambia al propio microorganismo o su repertorio antigénico, sino solo su nombre científico o clasificación, tales microorganismos reclasificados permanecen dentro del alcance de la invención.

El PCV2 para su uso en la invención pueden obtenerse a partir de diversas fuentes, por ejemplo, como aislado de campo de un porcino en la naturaleza o en una granja o de varios laboratorios, instituciones (de depósito) o universidades (veterinarias). Alternativamente, se puede reconstituir un PCV2 a partir de información de secuencia digital, sintetizando su ácido nucleico genómico y transfectándolo en células apropiadas.

El genotipado del PCV2 se realiza comparando secuencias de nucleótidos. Para la invención un "PCV2 de genotipo 2b", o un "PCV2b", es un virus PCV2 que se clasifica en el genotipo de grupo b mediante el método de Segaleset al.(2008, Vet. rec. vol. 162, pág. 867-868). Este método aplica el genotipado de PCV2 basado en la distancia P entre los genes ORF2 del PCV2, es decir, la relación de nucleótidos que difieren entre dos genes ORF2 del PCV2, por número total de nucleótidos de su gen de ORF2 del PCV2. El corte para los diferentes genotipos del PCV2 identificados por Segaleset al.está a una distancia P de ORF2 de 0,035; entonces, cuando la diferencia de P es menor, entonces las dos secuencias pertenecen al mismo genotipo.

Para la invención, el virus de referencia de un PCV2 de genotipo 2b es el aislado "Imp. 1011", también conocido como cepa 48285, cuya secuencia genómica está publicada en GenBank™ bajo el número de referencia: AF055394.

En consecuencia, cualquier virus PCV2 que tenga una distancia P del gen de ORF2 inferior a 0,035 con el gen de ORF2 de la cepa 48285, calculado utilizando el método de Segaleset al.(citado anteriormente), es un virus PCV2b para la invención.

Sin embargo, y como apreciará el experto en la materia, dado que el genoma del PCV es monocatenario y circular, la región codificante del gen de ORF2 puede no ser evidente inmediatamente a partir de una secuencia de nucleótidos lineal particular, y puede precisar que la secuencia de nucleótidos se invierta, complemente y/o rote. Por ejemplo: en la secuencia genómica de la cepa 48285 del PCV2b en el número de referencia de GenBank: AF055394, el gen de ORF2 se encuentra en la cadena lineal publicada desde el nucleótido número 314 hasta el nt. 1 y continúa desde el nt. 1767 hasta el inclusive el nt. 1383; en conjunto, esto representa los 699 nucleótidos del gen de ORF2 (sin incluir el codón de terminación) y está codificado por la cadena complementaria a esta región de la cadena publicada. De nuevo, dicho análisis y representación de regiones codificantes se pueden realizar convenientemente usando un programa informático disponible en el mercado.

Se aplica un enfoque similar para el "genotipo 2a del PCV2" (PCV2a) y el "genotipo 2d del PCV2" (PCV2d), como se usa en el presente documento; el virus de referencia para PCV2a es el aislado "Imp.1010", también conocido como "Stoon 1010", número de referencia: AF055392; y el virus de referencia para PCV2d es el aislado "S99-1542/3a", número de ref.: JX512856.

Los métodos para identificar un virus tal como el virus PCV2, determinar la secuencia de nucleótidos de su gen de ORF2 y calcular una distancia P en comparación con el gen de ORF2 de la cepa 48285 son bien conocidos y fácilmente disponibles para el experto en la materia de la presente invención.

Una "secuencia de control de la transcripción" es una región funcional de un ácido nucleico, normalmente en el ADN, que, a través de la unión de factores de control, induce la maquinaria de expresión de proteínas de una célula para iniciar y realizar la transcripción de ADN en ARN de una región codificante secuencia abajo. Dicha región de control de la transcripción (TCR), también puede denominarse promotor y comúnmente contiene varias regiones reguladoras, tales como el "sitio de inicio de la transcripción", ubicado aproximadamente 30-40 nucleótidos secuencia arriba del primer codón de inicio. Otros elementos conservados muy conocidos son la caja TATA, la caja CAAT y la caja GC. El TCR también puede comprender un denominado potenciador que interviene en la unión de factores reguladores que pueden influir en el tiempo, la duración, las condiciones y el nivel de transcripción.

En consecuencia, la transcripción (y posterior traducción) puede ser de carácter temporal o permanente, es decir, ser una expresión transitoria o estable, dependiendo de los detalles del TCR utilizado y de la construcción genética en su conjunto.

Un TCR para la expresión de un gen (heterólogo) debe poder impulsar eficazmente la transcripción de esa región codificante secuencia abajo. Esto se conoce comúnmente como que el TCR está "unido operativamente" a un gen, de modo que el gen esté "bajo el control" o "impulsado por" el TCR. Esto comúnmente significa que el TCR y la región codificante están conectados en la misma molécula, en proximidad eficaz y sin señales o secuencias entre ellos que interfieran con una transcripción eficaz.

Las expresiones "proteína ORF2 del PCV2b mutante", sirven para indicar que la proteína ORF2 del PCV2b expresada no es idéntica a la versión de tipo silvestre de esa proteína, pero comprende una mutación. Dicha mutación se puede introducir de diferentes maneras, usando técnicasin vivooin vitro.Sin embargo, lo más eficaz es el uso de tecnología del ADN recombinante para subclonar un gen de ORF2 del PCV2b en un plásmido bacteriano y emplear, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y cebadores sintéticos para introducir una mutación deseada en una ubicación deseada. Los detalles se presentan en los Ejemplos a continuación en el presente documento. De esta manera, por ejemplo, la secuencia de ADN del gen de ORF2 del PCV2b parental, de número de ref. de GenBank AF055394 se manipuló, de modo que el triplete de nucleótidos de tipo silvestre que codifica treonina en la posición de aminoácido 131: 5'- aca -3', se mutó al triplete: 5'- ccc -3', que codifica prolina.

Se puede aplicar una manipulación adicional mediante la optimización de codones del gen de ORF2, para que se ajuste mejor a la preferencia de codificación de células de insecto y/o de un baculovirus. Por ejemplo, utilizando la preferencia de codones del gen de la polihedrina del baculovirus AcMNPV como se publica en: Hooft van Iddekingeet al.,1983, Virology, vol. 131, págs. 561-565. El concepto de optimización de codones de un gen para expresión heteróloga es bien conocido; normalmente, todas estas mutaciones son silenciosas, lo que significa que si bien esto cambia la secuencia de nucleótidos codificante, no cambia la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Se proporcionan detalles en los Ejemplos.

Se descubrió que la optimización de codones aumenta el nivel de expresión de la proteína ORF2 en células de insectos. En un grado mínimo, esto también cambió la localización nuclear de la proteína ORF2 del PCV2b de tipo silvestre cuando se expresaba en células de insectos. Sin embargo, mediante la sustitución del aminoácido en la posición 131 por prolina sólo se pudo obtener una prevención sustancial de la acumulación nuclear en células de insecto para la proteína ORF2 del PCV2b.

Para la invención, "tipo silvestre" se refiere a la forma de un (microorganismo en la que se presenta en su forma natural en la naturaleza, por ejemplo: la forma del organismo parental antes de que fuera modificado por la intervención humana.

La generación, construcción y ensamblaje del ácido nucleico heterólogo que expresa la proteína ORF2 del PCV2b mutante para la invención, puede realizarse mediante técnicas de biología molecular bien conocidas, que implica clonación, transfección, recombinación, selección y amplificación. Estas y otras técnicas se explican con gran detalle en libros de texto convencionales como Sambrook y Russell: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773); Ausubelet al.,en: Current Protocols in Molecular Biology (J. Wiley and Sons Inc., NY, 2003, ISBN: 047150338X); C. Dieffenbach y G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (C<s>H<l>Press, ISBN 0879696540); y "PCR protocols", por: J. Bartlett y D. Stirling (Humana press, ISBN: 0896036421).

Para la invención, una "posición de aminoácido" particular se numera basándose en la numeración de los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF2 de longitud completa de la cepa de referencia para ese genotipo de PCV2. Para el PCV2b, la cepa de referencia es 48285, y la secuencia de aminoácidos de longitud completa de su proteína ORF2 está publicada en GenBank con el número de referencia AAC35331.

Las células de insecto de acuerdo con la invención pueden expresar ORF2b-131P; la proteína ORF2 del PCV2b mutante (en su mayor parte) ya no se acumula en el núcleo, pero se encuentra dispersa por todo el citoplasma de la célula de insecto. Esta diferencia en la ubicación celular de la proteína ORF2 del PCV2b mutante, en comparación con su contraparte no mutada, se puede detectar fácilmente, entre otros mediante microscopía (óptica) y visualización mediante la técnica de inmunofluorescencia. Los detalles se presentan en el apartado de Ejemplos.

Se descubrió que el nivel residual de acumulación nuclear de la proteína ORF2b-131P difiere algo dependiendo de la construcción genética utilizada para expresar la proteína ORF2 del PCV2b mutante en células de insecto: la expresión mediante baculovirus recombinante fabricado utilizando el sistema Bac-to-Bac, todavía mostraba algo de acumulación nuclear, por ejemplo, aproximadamente el 10 % del nivel observado para la proteína ORF2 del PCV2b de tipo silvestre. Sin embargo, cuando la proteína mutante se produjo a partir de un baculovirus recombinante construido mediante el sistema ProEasy, ya no se observó ninguna acumulación nuclear detectable. Además, el nivel de expresión de proteínas fue mayor que el producido por el baculovirus recombinante Bac-to-Bac.

Probablemente esto pueda explicarse por la constitución de la construcción genética utilizada: los baculovirus recombinantes preparados a partir de construcciones de Bac-to-Bac, todavía llevan elementos del casete de expresión del vector de transferencia en su genoma, tales como un transposón y un gen de resistencia a antibiótico. Estos pueden influir en el nivel de replicación y expresión. Sin embargo, los recombinantes de ProEasy ya no portan dichos elementos genéticos adicionales.

A continuación, se describirán detalles de realizaciones preferidas y otros aspectos de la invención.

En una realización, se han optimizado los codones de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Orf2 del PCV2b mutante. Más preferentemente: se ha optimizado el codón para que coincida con la preferencia de codón del gen de la polihedrina del baculovirus AcMNPV.

Muy preferentemente, la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Orf2 del PCV2b mutante es la SEQ ID NO: 1. Esta representa la secuencia de ORF2 de la cepa del PCV2b 48285, en donde el triplete que codifica la posición de aminoácido número 131 se ha mutado a 5'- ccc -3', que codifica prolina. Además, el uso de codones se ha adaptado para ajustarse a la preferencia de codones del gen de la polihedrina de AcMNPV. La SEQ ID NO: 2 a su vez enumera la secuencia de la proteína ORF2b-131P que está codificada por la SEQ ID NO: 1.

Como consecuencia de las mutaciones aplicadas al gen de ORF2 del PCV2b, en particular debido a la optimización de codones, la identidad de la secuencia de nucleótidos entre la SEQ ID NO: 1 y la región correspondiente de AF055394, el gen de ORF2b de tipo silvestre, es del 77,2 %. Sin embargo, debido a que las mutaciones que optimizan los codones son silenciosas, la identidad de secuencia de aminoácidos entre la SEQ ID NO: 2 y AAC35331 (que es la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF2 del PCV2b de tipo silvestre de la cepa 48285) es del 99,6 %, es decir, solo difieren en el aminoácido de la posición 131.

Es bien conocido el uso de células de una diversidad de insectos. Varios de estas también pueden usarse en el contexto del sistema de expresión de células de insecto-baculovirus, ya que pueden infectarse con un baculovirus. Véase, por ejemplo: Chenet al.,2005,In vitroCell. Dev. Biol. Anim., vol. 41, págs. 43-49.

Por lo tanto, en una realización, las células de insecto de acuerdo con la invención proceden de un insecto seleccionado del grupo que consiste en:Autographa californica(oruga de la alfalfa),Spodoptera frugiperda(gusano cogollero),Spodoptera exigua(gusano cogollero de la remolacha),Trichoplusia ni(falso medidor),Lymantria dispar(oruga lagarta),Bombyxmori(gusano de la seda),Anticarsia gemmatalis(oruga terciopelo),Heliothis virescens(oruga del brote del tabaco),Heliothis subflexa(gusano del fruto),Mamestra brassicae(oruga nocturna de la col),Helicoverpa armigera(oruga de las cápsulas del algodón),Helicoverpa zea(oruga de la espiga del maíz),Agrotis ipsilon(gusano grasiento),Anagrapha falcifera(garfio del apio),Gallería mellonella(gusano de la cera),Rachiplusia ou(oruga gris),Plutella xylostella(polilla de la col),Drosophila melanogaster(mosca de la fruta) yAedes aegypti(mosquito).

En una realización, las células de insecto de acuerdo con la invención proceden de un insecto del ordenLepidoptera;más preferido de la familiaNoctuidae;aún más preferido de uno de los géneros:SpodopteraoTrichoplusia.

En una realización, las células de insecto de acuerdo con la invención proceden de un insecto de la especieSpodoptera frugiperda.

En una realización, las células de insecto de acuerdo con la invención proceden de un insecto de la especieTrichoplusia ni.

Es conocido y factible criar insectos completos para la expresión de proteínas heterólogas y aplicar de este modo las células de insecto de acuerdo con la invención. Sin embargo, será más conveniente utilizar células de insecto en forma de una línea celular de insecto inmortalizada, ya que esto permitirá una producción más flexible y un aumento de la escala en condiciones controladas. Estas líneas celulares de insectos establecidas pueden usarse después para construir células de insecto de acuerdo con la invención, utilizando métodos de rutina como se describe en el presente documento.

Las líneas celulares de insecto muy conocidas que son adecuadas para tal uso son: Sf9 y Sf21, ambas obtenidas de S.frugiperda;High Five™ (Hi-5), obtenida deT. ni;Bm5, obtenida deB. mori;y Ld652Y y LdElta, obtenidas deL. dispar.

Por lo tanto, en una realización, las células de insecto de acuerdo con la invención se preparan a partir de células de una línea celular de insecto seleccionada del grupo que consiste en Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y y LdElta, o una línea celular obtenida de una de estas.

Preferentemente, las células de insecto de acuerdo con la invención se preparan a partir de una línea celular de insecto de Sf9 o Sf21.

Los procedimientos, equipos y materiales para el cultivo de líneas celulares de insecto son bien conocidos y pueden aplicarse a cualquier escala deseada, por ejemplo, desde 5 ml hasta 5000 litros. En particular, se encuentran disponibles medios de cultivo de células de insecto especializados, por ejemplo: Sf-900™ (Thermo Fisher Scientific); las series Ex-Cell™ 400 (Sigma Aldrich); e Insect-XPRESS™ (Lonza).

Dependiendo de las características de estos medios, o necesitan la adición de un determinado porcentaje de suero, tal como suero fetal de ternera, o se pueden utilizar sin suero. Se pueden añadir más aditivos, tal como glutamina, antibióticos, agente antiespumante, etc.

Hay varias formas en las que una célula de insecto de acuerdo con la invención puede comprender un ácido nucleico heterólogo para la invención, un ejemplo es la integración estable en el genoma de la célula de insecto. Las formas de lograr la integración genómica son, por ejemplo: mediante inserciones aleatorias tales como mediante la técnica de transposones o mediante inserciones dirigidas usando, por ejemplo, recombinación homóloga o tecnología CRISPR-Cas.

Como alternativa, las células de insecto pueden transfectarse mediante productos químicos (por ejemplo, Lipofectin™) o medios físicos (por ejemplo, electroporación) con un ácido nucleico heterólogo, que a su vez puede estar en un transportador tal como un plásmido. La célula de insecto puede expresar el ácido nucleico heterólogo de forma transitoria o estable.

Sin embargo, la forma preferida de introducir dicho ácido nucleico heterólogo en células de insecto de acuerdo con la invención, es mediante el uso de un baculovirus recombinante. Un baculovirus de este tipo contendrá, por ejemplo, un gen heterólogo de interés integrado de forma estable en su genoma vírico y unido operativamente a un fuerte promotor de baculovirus, tales como los promotores de los genes muy tardíos p10 o de la poliedrina.

Por lo tanto, en una realización de las células de insecto de acuerdo con la invención, la secuencia de control de la transcripción es un promotor del gen p10 de baculovirus o un promotor del gen de la polihedrina de baculovirus.

A continuación, se hace que el baculovirus recombinante entre en la célula de insecto; esto se puede hacer pasivamente, por ejemplo, mediante transfección del genoma del baculovirus recombinante, o activamente mediante la infección de una célula de insecto susceptible por un baculovirus recombinante infeccioso. La célula de insecto, al comprender el baculovirus recombinante o su genoma en su interior, comprenderá entonces además el ácido nucleico heterólogo para la invención. Para la invención "dentro de la célula" simplemente se refiere a la ubicación del genoma del baculovirus recombinante, que está en el lado interno de la membrana celular de la célula de insecto, por ejemplo, en el citoplasma.

Dentro de la célula de insecto, se replicará el baculovirus recombinante o su genoma, llevando a la expresión del gen heterólogo en la célula de insecto. A continuación, se puede recoger el producto de expresión heterólogo, ya sea de las células de insecto o del entorno de la célula, tal como el medio de cultivo celular.

Por lo tanto, en una realización de las células de insecto de acuerdo con la invención, el ácido nucleico heterólogo está comprendido en un genoma de baculovirus recombinante.

Un "baculovirus" es un miembro de la familiaBaculoviridae;preferentemente un miembro del géneroAlphabaculovirus.

Un baculovirus para la invención es "recombinante" si se ha alterado por intervención humana en comparación con su forma de tipo silvestre, para comprender un ácido nucleico heterólogo. Preferentemente, dicho baculovirus recombinante se crea mediante métodos de manipulación genética.

Como apreciará el experto al considerar las células de insecto de acuerdo con la invención en un recipiente de cultivo particular, o en un pocillo de una placa de cultivo, el número de células que realmente comprenden el ácido nucleico heterólogo para la invención será dinámico. Esto se debe a una serie de razones biológicas, tales como el estado del ciclo de vida de la célula o el nivel de infección o transfección. Si bien se prefiere tener tantas células como sea posible que comprendan y expresen el ácido nucleico heterólogo, no es necesario que en un punto de tiempo determinado, todas y cada una de las células de insecto individuales de ese grupo comprendan el ácido nucleico heterólogo.

El uso combinado de células de insecto y baculovirus recombinantes, para la expresión de una proteína heteróloga, se conoce comúnmente como "sistema de expresión de células de insecto-baculovirus". Los ejemplos de artículos, libros de texto y revisiones sobre este sistema son: Luckowet al.,1988, Bio-technology, vol. 6, pág. 47; Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual by David R. O'Reilly, Oxford University press, 1993, ISBN: 0716770172; The Baculovirus Expression System: A laboratory guide, ed. King & Possee, 1992, ISBN: 9401050473; y una revisión es: van Oerset al.,2015, J. of Gen. Virology, vol. 96, págs. 6-23.

La expresión eficaz utilizando el sistema de expresión de células de insecto-baculovirus se puede aplicar desde la escala de laboratorio hasta la producción a escala industrial a muy gran escala. En los 30 años que hace que se conoce el sistema de expresión de células de insecto-baculovirus se han expresado genes heterólogos de origen variado, y existen muchas herramientas disponibles en el mercado para aplicar esta técnica.

Se han utilizado varias especies de baculovirus como vectores convenientes para la expresión de proteínas heterólogas en células de insectos. Los ejemplos de baculovirus utilizados en el sistema de expresión de células de insecto-baculovirus son los nucleopoliedrovirus (multicápside) deAutographa californica(oruga de la alfalfa): AcMNPV o deBombyx mori:BmNPV.

En una realización del baculovirus recombinante que comprende el ácido nucleico heterólogo para la invención, dicho baculovirus es un AcMNPV o un BmNPV.

En el mercado hay disponibles muchas herramientas y kits para generar y seleccionar eficazmente baculovirus recombinantes para su uso en la invención. Por ejemplo: Bac-to-Bac™ (Thermo Fisher Sci., Waltham, MA., EE. UU.); ProEasy™ (AB Vector, San Diego, CA., EE. UU.); y flashBAC™ (Oxford Expression Technologies, Oxford, RU).

Para optimizar los niveles de replicación y expresión de proteínas, el baculovirus recombinante que comprende el ácido nucleico heterólogo para la invención, es preferentemente lo más parecido posible a un baculovirus de tipo silvestre, excepto, por supuesto, la inserción del ácido nucleico heterólogo y la posterior alteración o eliminación en el locus de inserción. En la práctica, esto significa que el baculovirus recombinante preferentemente no contiene en su genoma elementos genéticos adicionales procedentes del proceso de recombinación, por ejemplo, elementos tales como: una etiqueta, marcador, genes marcadores, elemento transposón, genes de resistencia a antibióticos, etc.

Por lo tanto, en una realización, el baculovirus recombinante que comprende el ácido nucleico heterólogo par la invención no contiene elementos genéticos adicionales procedentes del proceso de recombinación en su genoma.

En una realización preferida, el baculovirus recombinante no comprende un gen de resistencia a antibióticos del vector de transferencia que se usó para la construcción del baculovirus recombinante.

En una realización de las células de insecto de acuerdo con la invención, se cumplen una, varias o todas las condiciones, seleccionadas del grupo que consiste en:

- se han optimizado los codones de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Orf2 del PCV2b mutante;

más preferentemente: se han optimizado los codones para que coincidan con la preferencia de codones del gen de la polihedrina del baculovirus AcMNPV;

- la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína ORF2 del PCV2b mutante es la SEQ ID NO: 1;

- las células de insecto de acuerdo con la invención proceden de un insecto del ordenLepidoptera;más preferido de la familiaNoctuidae;aún más preferido de uno de los géneros:SpodopteraoTrichoplusia;

- las células de insecto de acuerdo con la invención proceden de un insecto de la especieSpodoptera frugiperda;- las células de insecto de acuerdo con la invención proceden de un insecto de la especieTrichoplusia ni;

- las células de insecto de acuerdo con la invención se preparan a partir de células de una línea celular de insecto seleccionada del grupo que consiste en Sf9, Sf21, Hi-5, Bm5, Ld652Y y LdElta, o una línea celular obtenida de una de estas.

- las células de insecto de acuerdo con la invención se preparan a partir de una línea celular de insecto de Sf9 o Sf21.

- la secuencia de control de la transcripción es un promotor del gen p10 de baculovirus o un promotor del gen de la polihedrina de baculovirus;

- el ácido nucleico heterólogo está comprendido en un genoma de baculovirus recombinante que se encuentra en el interior de la célula de insecto;

- el baculovirus recombinante que comprende el ácido nucleico heterólogo para la invención es un AcMNPV o un BmNPV; y

- el baculovirus recombinante que comprende el ácido nucleico heterólogo par la invención no contiene elementos genéticos adicionales procedentes del proceso de recombinación en su genoma.

Como se describe en el presente documento, la mutación en la proteína ORF2 del PCV2b como se describe para la invención, permite una expresión aumentada de la proteína ORF2b-131P a partir de las células de insecto de acuerdo con la invención. Especialmente, esto permite la generación de VLP que comprenden la proteína ORF2 del PCV2b en una medida mucho mayor de lo que es posible sin esta mutación.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a partículas similivíricas (las VLP) de una proteína ORF2 del PCV2b mutante, caracterizadas por que la proteína ORF2 del PCV2b mutante tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131.

Los materiales y métodos para caracterizar y utilizar las VLP de la proteína ORF2b-131P son bien conocidos en la técnica.

Preferentemente, la expresión de la proteína ORF2 del PCV2b mutante para la invención en células de insecto se logra mediante el uso del sistema de expresión de células de insecto-baculovirus, como se ha descrito anteriormente.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para la expresión de una proteína ORF2 del PCV2b mutante en células de insecto de acuerdo con la invención, empleando el método el uso del sistema de expresión de células de insecto-baculovirus.

En particular, cuando las células de insecto de acuerdo con la invención que se utilizan para la expresión de la proteína ORF2 del PCV2b mutante para la invención son células de una línea celular de insecto, se pueden cultivar convenientemente utilizando equipos de cultivo celular convencionales, lo que da como resultado la expresión de la proteína ORF2 del PCV2b mutante. Existen equipos de cultivo de células de insecto disponibles a cualquier escala; desde un simple matraz T o un matraz giratorio colocado en una cabina de incubación a la temperatura adecuada; hasta llegar a un fermentador industrial de gran tamaño con manta calentada, agitador y rociador, con control automatizado de parámetros del procedimiento tales como temperatura, pH y oxígeno disuelto.

Después del cultivo de las células de insecto de acuerdo con la invención, la proteína ORF2 del PCV2b mutante expresada se recolecta del cultivo de células de insecto para su uso posterior. Al igual que el cultivo, dicha recolección se puede realizar usando procedimientos convencionales muy conocidos en la técnica. Además, cuando sea necesario, el cultivo puede primero inactivarse (es decir, esterilizarse) por medios físicos (por ejemplo, calor, radiación) o químicos (por ejemplo, bromoetilenimina (BEI)).

Dependiendo de las características de la célula de insecto utilizada y del tipo de expresión aplicada, la proteína ORF2 del PCV2b mutante expresada se acumula dentro de las células de insecto, o en su membrana, o se secreta fuera de la célula. Incluso cuando no se secreta activamente, la proteína puede acabar hasta cierto punto en el medio de cultivo de las células cuando las células se rompen.

Luego se puede seleccionar un método para recolectar la proteína expresada:

Cuando la proteína expresada está presente principalmente en el medio de cultivo, este se puede recolectar, por ejemplo, como sobrenadante después de la centrifugación del cultivo. Luego se puede reducir la mayor parte del volumen del cultivo hasta el grado deseado, por ejemplo, usando la concentración, convenientemente mediante algún método de ultrafiltración, todos muy conocidos en la técnica.

Cuando la proteína se encuentra principalmente en las células, éstas pueden aislarse del grueso del volumen de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación del cultivo y resuspensión del sedimento celular en un volumen más pequeño. A continuación, las células pueden romperse mediante técnicas más o menos invasivas.

A continuación, la proteína expresada se puede obtener usando algún método de extracción y/o purificación.

Todo esto puede realizarlo un experto utilizando únicamente métodos y materiales muy conocidos.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a un método para la producción de una proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, comprendiendo la producción una o ambas etapas seleccionadas de:

- cultivo de las células de insecto de acuerdo con la invención; y

- recolección de la proteína ORF2 del PCV2b mutante del cultivo de células de insecto.

Un resultado especialmente ventajoso de la invención es que la proteína ORF2 del PCV2b mutante ya no se acumula en el núcleo de las células de insecto en las que se expresa. Esto no sólo aumentó el nivel total de expresión, sino que también facilitó enormemente la recolección de la proteína ORF2 del PCV2b mutante a partir de estas células de insecto. Esto se debe a que en este estado citoplásmico, se podrían utilizar procedimientos de aislamiento convencionales y de muy bajo impacto, produciendo cantidades relativamente grandes de la proteína ORF2 del PCV2b mutante. Además, la proteína recolectada era de excelente calidad inmunológica ya que se descubrió que la mayor parte de la ORF2b-131P se había ensamblado eficazmente en las VLP.

Más específicamente: la recolección de proteína ORF2 del PCV2b no mutada en cantidades sustanciales requeriría extracción mediante el uso de productos químicos tales como detergentes o agentes caotrópicos, por ejemplo, SDS, urea, desoxicolato o guanidina-HCl, etcétera. Posteriormente sería necesario eliminarlos nuevamente. Por supuesto, el uso de productos químicos tan agresivos a gran escala no es conveniente.

Sin embargo, la recolección de la proteína ORF2 del PCV2b mutante se puede lograr de forma segura, conveniente y mediante prácticas muy suaves sin el uso de productos químicos, aplicando, por ejemplo, tratamiento con ultrasonidos o congelación-descongelación de las células de insecto.

Por lo tanto, en una realización del método para la producción de la proteína ORF2 del PCV2b mutante de acuerdo con la invención, la etapa de recolectar la proteína ORF2 del PCV2b mutante del cultivo de células de insecto no emplea un detergente ni un agente caotrópico.

En una realización, la recolección emplea un método físico y no químico para la lisis de las células de insecto; los ejemplos de un método físico de lisis celular son: tratamiento con ultrasonidos, congelación-descongelación y prensa francesa.

Para la invención, un "cultivo" de células de insecto, o un "cultivo" similar, se refiere a la incubación de células de insecto en condiciones apropiadas, que permiten que las células crezcan y se dividan, y expresen el inserto heterólogo.

Dicho cultivo de células de insecto implicará normalmente el uso de un medio de cultivo celular apropiado y un equipo conveniente; todos son muy conocidos en la técnica y están disponibles en el mercado. Por ejemplo, los cultivos de líneas celulares de insectos de los génerosSpodopteraoTrichoplusiase cultivan habitualmente en condiciones aeróbicas, en monocapa o en suspensión, a 26-28 °C.

En condiciones prácticas será conveniente disponer de un recipiente de cultivo distinto para la generación de células de insecto limpias, mantenido alejado de los equipos utilizados para el cultivo de células de insecto que se van a infectar o transfectar. Normalmente, las células de insecto se preparan como reserva de células maestra y como reserva de células de trabajo. Este enfoque permite el nivel de control de calidad que se requiere para la preparación de proteínas recombinantes para uso farmacéutico.

En una realización del método para la producción de la proteína ORF2 del PCV2b mutante de acuerdo con la invención, la proteína producida está en forma de VLP.

Aplicando los métodos para la preparación de la proteína ORF2 del PCV2b mutante de acuerdo con la invención, la proteína ORF2 del PCV2b mutante puede prepararse en cantidades suficientes y con la eficacia inmunológica necesaria, para fabricar una vacuna contra el PCV2 o los signos de la enfermedad asociados.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una vacuna para animales porcinos para la reducción de la infección por PCV2 o de los signos de enfermedad asociados, comprendiendo la vacuna una proteína ORF2 del PCV2b mutante en un transportador farmacéuticamente aceptable, caracterizada por que dicha proteína ORF2 del PCV2b mutante tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131.

En una realización, la vacuna de acuerdo con la invención es para la reducción de la infección por PCV2 de genotipo 2a, 2b y/o 2d.

La vacuna más preferida es para la reducción de la infección por PCV2b.

Es bien sabido que una "vacuna" es una composición que comprende un compuesto inmunológicamente activo, en un transportador farmacéuticamente aceptable. El "compuesto inmunológicamente activo" -cuando esté en forma de un "antígeno"- será reconocido por el sistema inmunitario de la diana inoculada, induciendo una respuesta inmunológica. La respuesta puede originarse en el sistema inmunitario innato o adquirido, y puede ser de tipo celular y/o humoral.

Para la invención "porcino" se refiere a animales de la familia de losSuidae,y preferentemente a animales del géneroSus,por ejemplo: un cerdo silvestre o doméstico, jabalí salvaje, babirusa o facocero. Se incluyen también los porcinos indicados con un nombre arbitrario que haga referencia a su sexo o edad como por ejemplo: cerda, verracos, puerco, lechona, cerda primeriza o lechón.

La vacuna de acuerdo con la invención puede proporcionar una "reducción de la infección por PCV2", lo que se refiere a prevenir o reducir el establecimiento o la proliferación de una infección productiva por PCV2 en un animal diana. Esto se consigue, por ejemplo, reduciendo la carga vírica o acortando la duración de la replicación vírica. A su vez, esto conduce, en el animal diana, a una reducción del número, la intensidad o gravedad de las lesiones y los signos clínicos consiguientes de la enfermedad causada por la infección vírica. Esta vacuna se denomina coloquialmente: vacuna "contra" el PCV2, o una "vacuna para el PCV2".

En una realización preferida, la vacuna de acuerdo con la invención actúa como ayuda en la prevención de la viremia del PCV2 y/o como ayuda en la prevención de la propagación de PCV2 por los animales infectados.

Además de la eficacia de la vacuna contra la infección por PCV2, la vacuna de acuerdo con la invención también puede proporcionar una "reducción... de signos de enfermedad asociados", lo que se refiere a la enfermedad asociada al circovirus porcino (PCVAD) que puede producirse como enfermedad secundaria o concurrente. Como para el PCV2, la vacuna de acuerdo con la invención puede proporcionar una reducción de la gravedad y/o la duración de los síntomas o consecuencias de dicha PCVAd .

Las vacunas para el PCV2 reducen la replicación y propagación del virus PCV2. Esto reduce la carga vírica del PCV2 en la sangre, pulmón y tejidos linfoides (por ejemplo, amígdalas, bazo y ganglios linfáticos) y protege contra el empobrecimiento linfoide, la propagación de infecciones y contra enfermedades asociadas al PCV2. En consecuencia, esto restablece la salud general y el rendimiento de las piaras de porcinos vacunados, como se refleja en uno o más de los parámetros: reducción de la mortalidad, mejor aumento de peso diario promedio, mejor conversión alimenticia y mejores rendimientos reproductivos.

La determinación general de la eficacia de una vacuna para el PCV2 está dentro de las habilidades del médico habitual. Esto se puede hacer, por ejemplo, controlando la respuesta inmunológica después de la vacunación o probando la aparición de síntomas clínicos o la mortalidad después de una infección de exposición, por ejemplo, mediante el control de los signos de enfermedad de las dianas, la puntuación clínica, los parámetros serológicos o volviendo a aislar el patógeno de exposición, y comparando estos resultados con una respuesta a las vacunación-exposición observada en animales vacunados de forma simulada. Específicamente, la eficacia y la protección de la vacuna se pueden medir mediante la determinación serológica de los niveles de anticuerpos específicos para el PCV2; mediante la detección del virus en suero o en secreciones de los animales (oral, nasal, fecal, urinaria); o detectando otros patógenos implicados en la PCVAD, mediante PCR, (inmuno)histología, hibridación o serológicamente.

Para las vacunas para el PCV2 de acuerdo con la invención, la eficacia se determina preferentemente evaluando el nivel de reducción de la infección por PCV2 en grupos vacunados frente a no vacunados, en los que dicha infección puede adquirirse de forma natural, por ejemplo, en condiciones de campo, o puede ser deliberada, por ejemplo, resultante de una exposición en condiciones experimentales.

Dependiendo del tipo de adyuvante utilizado, la eficacia de la vacuna para PCV2 puede basarse más en la inmunidad humoral o en la celular. Los títulos de anticuerpos inducidos se pueden medir, por ejemplo, utilizando uno de los muchos kits de ELISA comerciales específicos para PCV disponibles.

A continuación, se describirán diversas realizaciones, preferencias y ejemplos de una vacuna de acuerdo con la invención.

En una realización de la vacuna de acuerdo con la invención que comprende la proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, la proteína ORF2 del PCV2b mutante se encuentra en forma de partículas similivíricas.

Normalmente, una vacuna comprende un "vehículo farmacéuticamente aceptable" que comprende el antígeno y puede ayudar en la fabricación, aplicación o conservación de una vacuna, sin causar efectos adversos (graves). Un transportador de este tipo puede ser una solución acuosa, por ejemplo, un tampón o un medio de cultivo.

Un transportador farmacéuticamente aceptable preferido para la vacuna de acuerdo con la invención es un medio de cultivo de células de insecto, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o una combinación de los mismos.

Además, el transportador farmacéuticamente aceptable puede comprender otros aditivos y excipientes, tales como un relleno, estabilizante, conservante, tensoactivo o adyuvante. Los detalles y ejemplos son muy conocidos, por ejemplo, como se describe en manuales tales como: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, EE. UU., ISBN: 683306472) y: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoretet al.ed., 1997, Elsevier, Ámsterdam, ISBN 0444819681).

Además, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender un adyuvante. Especialmente, en el caso de vacunas de subunidades de este tipo, esto puede aumentar significativamente la respuesta inmunitaria de la diana contra el antígeno de subunidades.

Por lo tanto, en una realización, la vacuna de acuerdo con la invención comprende un adyuvante.

Un "adyuvante" es un ingrediente de una vacuna muy conocido que estimula la respuesta inmunitaria de una diana de manera no específica. Se conocen en la técnica muchos adyuvantes diferentes. Los ejemplos de adyuvantes son: adyuvante completo e incompleto de Freund, vitamina E o alfa-tocoferol, polímeros en bloque no iónicos y poliaminas tales como el sulfato de dextrano, Carbopol™, pirano, Saponina, tal como: Quil A™ o Q-vac™. La saponina y los componentes de la vacuna se pueden combinar en un ISCO<m>™.

Adicionalmente, los péptidos como muramildipéptidos, dimetilglicina, tuftsina, se utilizan a menudo como adyuvante, y el aceite mineral, por ejemplo, Bayol™, Drakeol™, Klearol™ o Marcol™, Montanide™ o el aceite mineral ligero (parafina); aceite no mineral tal como el escualeno, escualano; aceites vegetales o derivados de los mismos, por ejemplo, oleato de etilo. También pueden utilizarse ventajosamente productos combinados tales como ISA™ (Seppic) o DiluvacForte™ y Xsolve™ (ambos de MSD Animal Health). Una opción adicional es el uso de adyuvante SVEA (que comprende escualano y acetato de vitamina E) como se describe en el documento EP 16206789.

Un manual sobre adyuvantes y sus usos y efectos es: "Vaccine adjuvants" (Methods in molecular medicine, vol. 42, D. O'Hagan ed., 2000, Humana press, NJ, ISBN: 0896037355).

Se puede utilizar un adyuvante en diferentes formulaciones de una vacuna de acuerdo con la invención, para potenciar la respuesta inmunitaria a la proteína ORF2 del PCV2b mutante. Por ejemplo, cuando el adyuvante es una sustancia oleosa, la fase oleosa puede proporcionar un efecto prolongado en el animal vacunado liberando lentamente el antígeno, proporcionando así una estimulación prolongada del sistema inmunitario de la diana.

La sustancia oleosa se puede combinar de diferentes maneras con la fase acuosa que comprende la proteína ORF2. En una realización, la vacuna de acuerdo con la invención, puede formularse como una emulsión de una fase acuosa y una fase oleosa; preferentemente la emulsión es del tipo: agua en aceite (w/o, del ingléswater-in-oil),aceite en agua (o/w, del inglésoil-in-water),agua en aceite en agua (w/o/w, del ingléswater-in-oil-in-water),o es una doble emulsión de aceite.

Más preferida es una vacuna de acuerdo con la invención que está tratada con adyuvante con un aceite y está formulada como una emulsión de aceite en agua. Una vacuna de este tipo presenta ventajosamente propiedades tanto de estimulación inmunitaria directa procedente de la fase acuosa como de estimulación inmunitaria prolongada procedente del efecto prolongado de la fase oleosa.

Por lo tanto, en una realización de la vacuna de acuerdo con la invención, la vacuna está formulada como una emulsión de aceite en agua.

Se encuentran disponibles comercialmente métodos y equipos para la preparación de una emulsión de vacuna con adyuvante a cualquier escala deseada, por ejemplo, para la homogeneización utilizando equipos tales como: Silverson, Ultra Turrax™, un reactor Dispax (IKA), o un Microfluidizador (Microfluidics).

La emulsión de aceite en agua de la vacuna de acuerdo con la invención tiene preferentemente un tamaño de partículas de la fase dispersa que es bastante pequeño, preferentemente por debajo de 1 micrómetro; tales emulsiones se denominan comúnmente "emulsiones submicrométricas".

En una realización de la emulsión de aceite en agua de la vacuna de acuerdo con la invención, la emulsión es una emulsión submicrométrica.

En una realización de la vacuna de acuerdo con la invención, el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en: un aceite mineral ligero, un Montanide, Emunade y SVEA.

Se sabe que dichos adyuvantes tienen efectos favorables sobre la inmunogenicidad de las vacunas porcinas.

En una realización de una vacuna de acuerdo con la invención, la vacuna es una emulsión de aceite en agua y el adyuvante es un aceite mineral.

En una realización preferida de la vacuna de acuerdo con la invención, el aceite mineral es un aceite mineral ligero o blanco o un aceite de parafina, disponible en el mercado con nombres comerciales tales como: Marcol™ (ExxonMobil), Klearol™ (Sonneborn) o Drakeol™ (Penreco).

Más preferido es el uso de un adyuvante adicional, específicamente: una vitamina E, por ejemplo, alfa tocoferol o acetato de alfa tocoferol.

En una realización preferida, una formulación de vacuna para la invención comprende una emulsión de aceite en agua con tensioactivo, aceite de parafina ligero y acetato de alfa tocoferol. Más preferida es una formulación en donde el tensioactivo es polisorbato 80 (Tween™ 80), y/o el aceite de parafina es Marcol™ 52, y/o la vitamina E es acetato de alfa tocoferol. La más preferida es una formulación con Microsol Diluvac Forte™, o con Xsolve™ (ambos: MSD Animal Health).

Otro efecto ventajoso de la vacuna de acuerdo con la invención, es la prevención o reducción de la propagación del PCV2 en una piara porcina: verticalmente a la descendencia, y/u horizontalmente dentro de la piara o población y dentro de un área geográfica. En consecuencia, el uso de una vacuna de acuerdo con la invención conduce a una reducción de la prevalencia del PCV2.

Por lo tanto, en una realización preferida de la vacuna de acuerdo con la invención, la vacuna es para reducir la prevalencia del PCV2 en una población porcina o en un área geográfica.

En una realización, la vacuna de acuerdo con la invención también puede comprender un estabilizante. Esto puede servir para mejorar las características de la emulsión de la vacuna, para proteger los componentes propensos a la degradación y/o para mejorar la vida útil de la vacuna. Generalmente, tales estabilizantes son moléculas grandes de alto peso molecular, tales como lípidos, carbohidratos o proteínas; por ejemplo, leche en polvo, gelatina, seroalbúmina, sorbitol, sacarosa, trehalosa, espermidina, un hidrolizado de proteína, Dextrano o polivinilpirrolidona, y tampones, tales como fosfatos de metales alcalinos.

Preferentemente, el estabilizante no tiene compuestos de origen animal (sin compuesto animales, ACF, del inglésanimal compound free),o incluso: está definido químicamente, por ejemplo, como se describe en el documento WO 2006/094974.

Una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender un conservante, tal como timerosal, mertiolato, compuestos fenólicos y/o gentamicina. Preferentemente, no se emplea ningún conservante.

No hace falta decir que la mezcla de otros aditivos, que son necesarios o beneficiosos para la estabilidad farmacéutica o para la eficacia de la vacuna de acuerdo con la invención, está dentro de las capacidades rutinarias del experto y, por lo tanto, está dentro del alcance de la invención.

Los animales diana para la vacuna de acuerdo con la invención son los porcinos. La edad, el peso, el sexo, el estado inmunológico y otros parámetros de la diana a vacunar no son cruciales, aunque es evidentemente favorable vacunar a los animales sanos y no infectados, y vacunar lo antes posible para prevenir cualquier infección de campo con PCV2. Porque tal infección puede desarrollarse ya a una edad temprana.

Por lo tanto, en una realización de la vacuna de acuerdo con la invención, la vacuna se aplica a los porcinos jóvenes poco después del nacimiento, preferentemente dentro de los 28 días después del nacimiento, más preferentemente dentro de los 21, 14, 12, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o incluso dentro de 1 día después del nacimiento, en este orden de preferencia.

Alternativamente, la vacuna de acuerdo con la invención se puede administrar a una cerda preñada, para proporcionar a los lechones anticuerpos específicos contra el PCV2 de origen materno, ya sea por paso transplacentario y/o por transferencia a través del calostro.

Ventajosamente, la eficacia de la vacuna de acuerdo con la invención no se ve influida en gran medida por el nivel de anticuerpos maternos contra el PCV2 que los animales porcinos jóvenes puedan haber adquirido de su madre; "joven" se refiere a una edad de 4 semanas o menos.

Por lo tanto, en una realización de la vacuna de acuerdo con la invención, la vacuna se aplica a animales porcinos jóvenes que portan anticuerpos maternos contra el PCV2.

La vacuna de acuerdo con la invención puede servir también como una primovacunación eficaz, que más tarde puede ser seguida y amplificada por una vacunación de refuerzo. Por ejemplo, la vacuna de acuerdo con la invención se puede administrar a un lechón de aproximadamente 2 a 10 días de edad, y nuevamente aproximadamente 3 semanas más tarde, con cada vacunación en un volumen de aproximadamente 1 ml.

Sin embargo, dado que la vacuna de acuerdo con la invención ya es eficaz después de una única administración, una realización preferida es la administración de una dosis única, por ejemplo, de aproximadamente 2 ml, a partir de aproximadamente las 3 semanas de edad. Esta vacunación protege a los cerdos durante todo el período de engorde, hasta aproximadamente los 5-6 meses de edad.

Cuando el porcino diana de la vacuna de acuerdo con la invención esté destinada a conservarse durante más de 6 meses, tales como cerdas para reproducción o verracos para producir esperma, a estos se les puede administrar una vacuna de refuerzo regular, 1, 2 o 3 veces al año, por ejemplo, para cerdas: una vacuna de refuerzo antes de cada parto, que es en promedio aproximadamente 2,2 veces/año.

Para la invención "aproximadamente" indica que un número puede variar ± 25 % alrededor de su valor indicado. Preferentemente, "aproximadamente" significa ± 20 % alrededor de su valor, más preferentemente "aproximadamente" significa ± 15, 12, 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2 % alrededor de su valor o incluso "aproximadamente" significa ± 1 % alrededor de su valor, en ese orden de preferencia.

Una vacuna de acuerdo con la invención puede utilizarse como tratamiento profiláctico o terapéutico, o ambos, ya que interfiere tanto en el establecimiento como en la progresión de una infección por PCV2 o enfermedades asociadas. Preferentemente, una vacuna de acuerdo con la invención se formula en una forma que sea adecuada para inyección parenteral, es decir, como un líquido inyectable tal como: una suspensión, solución, dispersión o emulsión.

La pauta de administración de una vacuna de acuerdo con la invención se integra preferentemente en los calendarios de vacunación existentes de otras vacunas que el porcino diana pueda necesitar, para reducir el estrés de los animales y los costes de mano de obra. Estas otras vacunas pueden administrarse de forma simultánea, coincidente o secuencial, de manera compatible con su uso registrado.

La vacuna de acuerdo con la invención comprende entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1000 microgramos de proteína ORF2 del PCV2bb-131P por dosis para animales. Preferentemente la vacuna comprende entre 0,5 y 500 |jg, entre 1 y 250, o incluso entre 2 y 200 |jg de proteína ORF2b-131P del PCV por dosis para animales, en este orden de preferencia. La selección de la cantidad de proteína por dosis la puede realizar el experto en la materia, basándose en las características de la vacuna y del animal diana.

La cantidad de proteína ORF2b-131P por dosis para animales se puede determinar en la emulsión de vacuna preparada, utilizando procedimientos convencionales de laboratorio bioquímico, por ejemplo, rompiendo la emulsión y probando la fase acuosa usando SDS-PAGE. Luego, la determinación de las cantidades se realiza comparándolas con cantidades conocidas de una proteína de referencia, por ejemplo, seroalbúmina bovina. Véase, por ejemplo: The Protein Protocols Handbook, 2.a edición, septiembre de 2002, ed. J.M. Walker, Humana Press Inc., Totowa, NJ; capítulo 29, págs. 237-242.

Alternativamente, la cuantificación de la proteína ORF2 se puede realizar mediante espectrometría de masas.

Preferentemente, la cantidad de proteína ORF2b-131P del PCV por dosis para animales se determina en una masa acuosa de la fase antigénica, antes de mezclar y/o emulsionar con una fase oleosa.

Una vacuna de acuerdo con la invención, puede administrarse en un volumen que sea aceptable para el animal diana y puede estar, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 ml en volumen. Preferentemente, una dosis está en un volumen entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 5 ml, más preferentemente una dosis para animales está entre 0,2 y 3 ml.

Cuando se administra por vía intramuscular, el volumen de una dosis está preferentemente entre aproximadamente 1 y aproximadamente 3 ml, más preferentemente aproximadamente 2 ml; Cuando se administra por vía intradérmica, el volumen de una dosis está preferentemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,5 ml, más preferentemente aproximadamente 0,2 ml.

La vacuna de acuerdo con la invención se puede administrar a un porcino diana de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. La aplicación preferida es por vía parenteral, es decir, a través de la piel, por ejemplo: intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, submucosa o subcutánea. La vía de administración más preferida de la vacuna de acuerdo con la invención es mediante inyección intramuscular o subcutánea. Aún más preferida es la administración por vía intramuscular en la pata trasera o en el cuello.

Huelga decir que la vía óptima de aplicación dependerá de las especificidades de la vacuna que se utilice y de las características particulares de la diana.

En una realización, la vacuna de acuerdo con la invención se administra por vía intramuscular a un porcino de aproximadamente 3 semanas de edad, como una dosis única de aproximadamente 2 ml.

El sitio preferido para la administración intramuscular es el cuello.

En una realización, el volumen de dosis de la administración de la vacuna de acuerdo con la invención por vía intramuscular es flexible, es decir, la vacuna se administra como una dosis única de 2 ml/animal o como dos dosis consecutivas de 1 ml/animal. Cuando se administra en dos dosis, ambas están preferentemente separadas en el tiempo por al menos 1 semana, preferentemente entre 2 y 5 semanas, más preferentemente aproximadamente 3 semanas.

En una realización, la vacuna de acuerdo con la invención se administra por vía intradérmica a un porcino de aproximadamente 3 semanas de edad, como una dosis única de aproximadamente 0,2 ml.

El sitio preferido para la administración intradérmica se selecciona de: el cuello, el lomo y la pata trasera.

Está bien al alcance del experto en la materia optimizar aún más una vacuna de acuerdo con la invención. Generalmente, esto implica ajustar la eficacia de la vacuna para mejorar aún más la protección inmunitaria proporcionada. Esto se puede hacer adaptando la dosis, el volumen o el contenido de antígeno de la vacuna; utilizando la vacuna en otra forma o formulación; adaptando los demás componentes de la vacuna (por ejemplo, el estabilizante o el adyuvante); o mediante aplicación por otra vía, método o pauta. Todos estos están dentro del alcance de la invención.

Una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender adicionalmente otros compuestos, tales como un antígeno adicional, una citocina o un ácido nucleico inmunoestimulante que comprende un CpG no metilado, etc. Como alternativa, una vacuna de acuerdo con la invención puede combinarse ventajosamente con un componente farmacéutico, tal como un antibiótico, una hormona, un fármaco antiinflamatorio o antiparasitario. O bien, la vacuna de acuerdo con la invención, puede ella misma añadirse a una vacuna.

La vacuna de acuerdo con la invención puede combinarse ventajosamente con uno o más antígenos adicionales, por ejemplo, procedentes de otro patógeno porcino. La ventaja de esta vacuna combinada es que no sólo induce una respuesta inmunitaria contra el PCV2, sino también contra otros patógenos, mientras que sólo se requiere una única manipulación del animal diana para la vacunación, reduciendo así el estrés de la vacunación en el animal, así como reduciendo los costes de tiempo y mano de obra.

Por lo tanto, en una realización preferida, la vacuna de acuerdo con la invención comprende un antígeno adicional de un microorganismo patógeno para los animales porcinos.

El "antígeno adicional" puede ser en sí mismo un microorganismo infeccioso, o estar inactivado, o una subunidad, y puede estar con o sin adyuvante. El antígeno adicional puede consistir en una molécula biológica o sintética tal como una proteína, un carbohidrato, un lipopolisacárido, un lípido o una molécula de ácido nucleico. Alternativamente, puede ser un producto de expresión de un ácido nucleico de ese otro microorganismo, o un vector que comprenda dicho ácido nucleico; el vector puede ser en sí mismo un microorganismo o una célula hospedadora eucariota.

El antígeno adicional puede "obtenerse del" otro microorganismo patógeno para el porcino en cualquier forma, por ejemplo, como extracto, fracción, lisado, homogeneizado o tratado con ultrasonidos.

Un "microorganismo patógeno de los animales porcinos" para la invención, es muy conocido en la técnica. Por lo tanto, el antígeno adicional puede obtenerse en principio de cualquier virus, bacteria, parásito, hongo, rickettsia, protozoo y/o parásito que sea patógeno para los porcinos.

Los ejemplos de tales microorganismos patógenos para los animales porcinos son: virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV), virus de la pseudorrabia, parvovirus porcino, virus de la fiebre porcina clásica, virus de la gripe porcina, virus de la fiebre aftosa, virus de la diarrea epidémica porcina, virus de la gastroenteritis transmisible, virus de la estomatitis vesicular,Mycoplasma hyopneumoniae, Lawsonia intracellularis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Escherichia coli, Streptococcus suiso unaSalmonella, Brachyspira, Clostridia, Pasteurella, Erysipelothrix, Bordetella, Toxoplasma, IsosporaoTrichinella.

En una realización preferida de la vacuna de acuerdo con la invención, la vacuna comprende -junto al antígeno del PCV2- uno o más antígenos de un microorganismo patógeno para los animales porcinos seleccionados del grupo que consiste enM. hyopneumoniae, L. intracellularisy PRRSV.

Dado que estos son actualmente los patógenos porcinos más destacados, por lo que su combinación en una vacuna de una sola inyección, lista para su uso, es muy favorable, tanto desde el punto de vista económico como veterinario.

En una realización preferida, los uno o más antígenos adicionales se añaden a una vacuna de acuerdo con la invención como una preparación liofilizada, mediante lo cual la vacuna combinada se prepara mediante reconstitución con la emulsión de vacuna de la invención. Esto se describe, por ejemplo, en el documento WO 2010/106095.

En una realización preferida, la vacuna de acuerdo con la invención es una vacuna combinada que comprende la proteína ORF2 del PCV2b mutante y un antígeno deM. hyopneumoniae,y dicha vacuna combinada se usa para reconstituir una preparación liofilizada de un antígeno deL. intracellularisy/o del PRRSV.

En una realización preferida, la vacuna de acuerdo con la invención es una vacuna combinada que comprende la proteína ORF2 del PCV2b mutante, un antígeno deM. hyopneumoniaey un antígeno deL. intracelullaris,y dicha vacuna combinada se usa para reconstituir una preparación liofilizada de un antígeno del PRRSV.

Una vacuna de acuerdo con la invención se puede preparar por medios muy conocidos por el experto. Como se describe, el uso de una proteína ORF2 del PCV2b mutante como se describe para la invención, o de las células de insecto como se describe para la invención, permite la fabricación de una vacuna para porcinos, como se describe para la invención. A este respecto, la proteína ORF2 del PCV2b mutante también se puede obtener mediante un método de acuerdo con la invención.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención se refiere al uso de la proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, para la fabricación de una vacuna para animales porcinos para la reducción de la infección por PCV2 o de los signos de enfermedad asociados.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, para su uso en una vacuna para animales porcinos para la reducción de la infección por PCV2 o de los signos de enfermedad asociados.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una vacuna de acuerdo con la invención, comprendiendo el procedimiento una o más etapas seleccionadas de:

- mezclar la proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, con un transportador farmacéuticamente aceptable; y

- formular dicha mezcla de proteína ORF2 del PCV2b mutante y transportador farmacéuticamente aceptable con un adyuvante.

Para el uso en el procedimiento de preparación de una vacuna de acuerdo con la invención, la proteína ORF2 del PCV2b mutante se puede obtener mediante un método para la expresión de la proteína ORF2 del PCV2b mutante en las células de insecto de acuerdo con la invención, y/o se puede obtener mediante un método para la producción de la proteína ORF2 del PCV2b mutante de acuerdo con la invención.

En una realización del procedimiento para preparar una vacuna de acuerdo con la invención, la proteína ORF2 mutante está en forma de VLP.

Un experto puede preparar una vacuna de acuerdo con la invención, en una forma que sea adecuada para la administración a un porcino diana y que coincida con la vía de aplicación deseada y con el efecto deseado. Normalmente, estas vacunas se preparan estériles y a pH fisiológico.

Los detalles y ejemplos de un método, un uso, o un procedimiento para preparar una vacuna de acuerdo con la invención, se describen en el presente documento, y dichos procedimientos son fácilmente aplicables por un experto en la materia utilizando materiales y métodos rutinarios. Por ejemplo, la proteína ORF2 del PCV2b mutante como se describe para la invención se puede producir en células de insecto a escala industrial y luego combinarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, se formula en una vacuna, por ejemplo, mediante emulsificación con un adyuvante oleoso y se rellena en recipientes de tamaño apropiado. Las diversas fases del procedimiento de fabricación deberán controlarse mediante pruebas adecuadas, por ejemplo, mediante pruebas inmunológicas en cuanto a la calidad y cantidad de los antígenos; mediante pruebas microbiológicas en cuanto a la inactivación, esterilidad y ausencia de agentes extraños; y, en última instancia, mediante estudios de vacunación en animales para confirmar la eficacia y la seguridad. Una vez finalizadas las pruebas de calidad, cantidad y esterilidad, el producto vacunal se puede comercializar.

Todo esto es bien conocido por un experto, y las técnicas y consideraciones generales que se aplican a la preparación de vacunas se describen, por ejemplo, en directivas y regulaciones gubernamentales (Pharmacopoeia, 9CFR) y en manuales bien conocidos (Pastoret, Lippincot, citado anteriormente).

La invención se describirá adicionalmente a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Ensamblaje de diferentes construcciones recombinantes que expresan ORF2 del PCV2

Para la expresión de proteínas ORF2 del PCV2 en células de insecto, se generaron baculovirus recombinantes, utilizando procedimientos convencionales. En resumen:

Los genes de ORF2 de PCV2 de tipo silvestre utilizados en estos experimentos se obtuvieron de diferentes fuentes: el virus parental PCV2a procedía de una cepa vacunal de EE. UU.; PCV2b procedía del aislado francés lmp1011, número de ref. de GenBank AF055394; el PCV2d era de China, cepa BDH, número de ref. de GenBank: HM038017.

El gen de ORF2 se subclonó mediante amplificación mediante PCR e inserción en un plásmido de clonación. A continuación, algunos se mutaron de los genes de ORF2, ya sea para una prolina en la posición de aminoácido 131, mediante el uso de mutación dirigida por PCR. Como alternativa, o adicionalmente, se optimizaron los codones de los genes de ORF2 para parecerse a la tabla de uso de codones del gen de la polihedrina de AcMNPV. Las secuencias mutadas usadas en el presente documento para el PCV2b se presentan en el listado de secuencias adjunto, como se ha descrito.

Se encargaron construcciones sintéticas de insertos del gen de ORF2 mutado a un proveedor comercial (BaseClear, Países Bajos; o Genscript, Piscataway, NJ, EE. UU.).

Para su uso con el sistema Bac-to-Bac, estos se subclonaron en el vector de clonación pFastBac1 y para su uso con el sistema ProEasy en el vector de transferencia pVL1393. En ambos casos, el inserto estaba detrás del promotor de la polihedrina. La generación y selección de baculovirus recombinantes se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Algunas de las construcciones de baculovirus recombinantes de PCV2a se construyeron utilizando la técnica de selección clásica de transfección y aislamiento de recombinantes mediante siembra en placas de células de insecto infectadas bajo agar blando y toma de placas.

Todos los baculovirus recombinantes se amplificaron en células Sf9, se recolectaron, se almacenaron refrigerados o congelados y se titularon. Las reservas de virus utilizadas para experimentos adicionales estaban normalmente entre 7,5 y 8,5 Log10 DICT50/ml.

En el siguiente esquema se incluye una selección de los baculovirus recombinantes utilizados para la expresión de la proteína ORF2 del PCV2 en células de insecto:

Obsérvese: Todos los insertos se insertaron detrás del promotor de la polihedrina. La optimización de codones (cuando se aplicó) se centró en el uso de codones del gen de la polihedrina del AcMNPV.

Ejemplo 2: Expresión en células de insecto

Las diferentes construcciones de baculovirus recombinantes, como se describe anteriormente, se utilizaron para infectar células de insecto y expresar varias variantes de la proteína ORF2 del PCV2. La proteína producida se visualizó y analizó para evaluar el efecto de las diversas mutaciones realizadas, comparándola con la proteína no modificada o con la proteína de otro genotipo del PCV2. Se aumentó la escala de algunos baculovirus recombinantes, producir proteína para la formulación de la vacuna de subunidades para el PCV2 para su prueba en cerdos.

2.1 CULTIVOS DE CÉLULAS DE INSECTO

Los experimentos convencionales de infección y expresión se realizaron a pequeña escala, usando células de insecto Sf9, que se tomaron de un cultivo giratorio de células limpias que se dividieron regularmente para mantener un crecimiento exponencial. Las tasas de infección típicas estuvieron entre una mi de 0,01 y 0,1, y las duraciones de los cultivos fueron de entre 3 y 5 días. Los cultivos se controlaron periódicamente mediante microscopía óptica para comprobar la salud de las células no infectadas o para controlar el progreso de la replicación vírica en los cultivos infectados.

Los recipientes de cultivo utilizados fueron matraces T25 o T75 (Falcon) con cultivos en monocapa de 5 o 15 ml, respectivamente. Alternativamente, se procesaron 100 ml de cultivos en suspensión en matraces giratorios (Corning). Los matraces se incubaron a 27 °C y el medio de cultivo utilizado fue Sf-900™ II (Termo Fisher científico). No se añadió suero, sino una mezcla de antibióticos: gentamicina 50 pg/ml y natamicina al 0,25 %.

Cuando la mayoría de las células mostraron efecto citopatógeno (ecp), se recolectaron los cultivos: los cultivos en matraz T precisaron golpecitos firmes para soltar las células. Luego se centrifugaron los cultivos y se descartó el sobrenadante del cultivo, ya que la proteína ORF2 producida estaba contenida principalmente dentro de las células de insecto. Dependiendo del uso posterior previsto, el sedimento celular podía resuspenderse luego en un líquido requerido a una concentración deseada.

Los cultivos a pequeña escala no se inactivaron de forma rutinaria; las muestras se utilizaron en instalaciones de contención o se trataron con un tampón de muestra de electroforesis desnaturalizante y luego se consideraron inactivadas.

Los cultivos a gran escala siguieron esencialmente el mismo esquema, con adaptaciones de volumen y equipamiento. En un contexto experimental, se realizaron cultivos en suspensión de células de insecto a escala intermedia grande con un volumen de 2 a 10 litros, en fermentadores industriales con controles de proceso automatizados. Se obtuvieron células de insecto Sf9 limpias a partir de un precultivo. La mi estuvo entre 0,01 y 0,1 y el cultivo duró durante 5 - 7 días. Cuando la infección había progresado lo suficiente, se dejó que las células se asentaran por gravedad. Luego se eliminó el 90 % superior del volumen de cultivo, las células se recogieron en 1/10 del volumen de cultivo original y se lisaron mediante tratamiento con ultrasonidos. A mediana escala, el tratamiento con ultrasonido se realizó por lotes, en hielo, utilizando un sonificador de punta (Vibra Cell™, Sonics, CT, EE. UU.). A escalas mayores (volúmenes de 100 I o más), el tratamiento con ultrasonidos se realizó pasando a través de una celda de tratamiento con ultrasonidos de flujo continuo (Sonobloc™, Bandelin)

A continuación, se inactivó el material tratado con ultrasonido utilizando BEI. A continuación, se neutralizó con tiosulfato de sodio. A continuación, la recolección inactivada se clarificó mediante centrifugación y el sobrenadante que contenía la proteína ORF2, se mantuvo como la fase acuosa del grueso del antígeno. Este se almacenó a 2 - 8 °C para control de calidad y procesamiento posterior. En estos productos, el transportador farmacéuticamente aceptable para el antígeno es, por tanto, medio agotado procedente del cultivo de células de insecto. Cuando fuera necesario, se podría concentrar el grueso del antígeno, o podría ser dializado contra PBS. Alternativamente, el antígeno podría diluirse con medio de cultivo de células de insecto recién preparado o con PBS.

2.2 ELISA

2.2.1 Esquema de ELISA

Los cultivos de células de insecto se infectaron con el baculovirus recombinante número 6 (treonina en 131) o el virus número 8 (sustitución T131P), para probar el efecto de la sustitución T131P sobre la proteína ORF2 del PCV2b. Ambas son construcciones en formato Bac-2-Bac y no tenían codones optimizados. Del virus 6, se probaron dos aislados.

Se infectaron cultivos en matraces T175 de células Sf9, se incubó y se recolectó por centrifugación del cultivo completo. Los sedimentos celulares se recogieron en 10 ml de agua para inyección, que lisa de forma eficaz todas las células. Luego se analizó la masa antigénica de los lisados celulares en un ELISA de tipo sándwich, brevemente de la siguiente manera:

Los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno se recubrieron con un anticuerpo monoclonal dirigido contra ORF2 del PCV2a. Se incubaron diluciones en serie de muestras de lisados junto con una serie de diluciones de un patrón de referencia conocido de ORF2 de PCV2a. A continuación, las placas se incubaron con una cantidad fija de un anticuerpo secundario también dirigido contra ORF2 del PCV2a, que estaba conjugado con biotina. Finalmente, la cantidad de conjugado unido se cuantificó mediante incubación con estreptavidina conjugada con peroxidasa, seguido de detección cromófora mediante un lector de placas automático.

La cantidad de antígeno en los lisados se calculó frente al patrón de referencia, del que la cantidad de antígeno se fijó arbitrariamente en 100 unidades antigénicas (UA)/ml.

2.2.2 Resultados y conclusiones del ELISA

La cantidad de proteína ORF2 detectada en los lisados fue la siguiente:

- células infectadas con el virus 6 (dos variantes): 5,5 y 7,4 UA/ml,

- células infectadas con el virus 8: 68 UA/ml.

Un lisado preparado en agua pura a partir de células infectadas con el virus recombinante que expresa la proteína ORF2 del PCV2b sin mutación en 131, contenía sólo muy poca proteína ORF2 detectada por ELISA. Sin embargo, dicho lisado de células infectadas con baculovirus recombinante que expresa ORF2 con la sustitución T131P, contenía aproximadamente 10 veces más de proteína.

Estos resultados de ELISA ilustraron la gran diferencia en la cantidad de proteína ORF2 que podría aislarse fácilmente a partir de células de insecto infectadas, con o sin la sustitución del aminoácido número 131 de ORF2. Por un lado, esto se relacionaba con la facilidad con la que se liberaba la proteína en un lisado no desnaturalizante. Por otro lado, esto también reflejó la diferencia en la producción global de la proteína ORF2 del PCV2b en células de insectos, sin, o sin mutación del aminoácido en la posición 131.

2.3 ENSAYOS DE INMUNOFLUORESCENCIA

2.3.1 Esquema de los ensayos de PIF

Para las pruebas de inmunofluorescencia (PIF), se sembraron células de insecto limpias en los pocillos de una placa de microtitulación de 96 pocillos, normalmente a 2,5 x 10A4 células por pocillo, en 100 pl de medio. Después de la unión, las células se infectaron con el baculovirus recombinante particular a investigar. Normalmente, se inocularon intervalos de dilución del virus para permitir la observación a diferentes mi. Las placas se analizaron después de 4-5 días de incubación, cuando las células de insecto se habían infectado adecuadamente pero aún no estaban lisadas. Se retiró el medio, las células se fijaron con etanol frío y se tiñeron con anticuerpos apropiados de acuerdo con los procedimientos convencionales. Para la visualización se utilizó un segundo anticuerpo conjugado con FITC. Las células de insecto se contratiñeron con azul de Evans para potenciar el contraste con el fondo.

Para estos estudios de PIF, el anticuerpo primario utilizado fue un antisuero policlonal porcino anti-PCV2a, esto fue lo suficientemente potente como para teñir también la proteína ORF2 de los genotipos PCV2b y PCV2d.

2.3.2 Resultados de los ensayos de PIF

Al comparar los resultados de PIF observados para los diferentes productos de expresión de la proteína ORF2, se hicieron varias observaciones:

- Los virus recombinantes 1-5 como se describe anteriormente, que expresaban todos la proteína ORF2 de PCV2a, causaban todos invariablemente un patrón de tinción citoplásmica por el cual esencialmente toda la célula de insecto mostraba una coloración brillante.

- Sin embargo, las células de insecto infectadas con el baculovirus recombinante número 6, que expresaba la proteína ORF2 del PCV2b de tipo silvestre, presentó un patrón esencialmente diferente, donde la tinción se localizó exclusivamente alrededor del núcleo de las células de insecto. No se observó tinción citoplásmica.

- Este patrón de PIF fue en gran medida el mismo para las células de insecto infectadas con el virus número 7, que también expresa la proteína ORF2 del PCV2b pero a partir de un gen con codones optimizados. La única diferencia fue que una pequeña cantidad (aproximadamente el 10 % de las células de insecto) mostró tinción citoplásmica, mientras que la mayoría de las células todavía presentaban tinción nuclear.

- Sorprendentemente, las células de insecto infectadas con el virus número 8 dieron un patrón de PIF donde el patrón de fluorescencia era el inverso al del virus recombinante número 7: la mayoría de las células de insecto mostraron tinción citoplásmica, y algunas células todavía mostraban tinción nuclear. El virus número 8 portaba un gen de ORF2 del PCV2b en donde el codón que codifica el aminoácido número 131 había sido mutado de treonina a prolina (T131P).

- Finalmente, las células de insecto infectadas con el virus número 9 (gen de ORF2 del PCV2b con optimización de codones y que porta la sustitución T131P, en una construcción limpia) mostraron todos exclusivamente tinción citoplásmica.

- Notablemente, las células de insecto infectadas con el baculovirus recombinante número 10 (que codifica la proteína ORF2 del PCV2d con la sustitución T131P, con optimización de codones y en una construcción limpia) todavía mostraban todos un patrón de tinción nuclear.

2.3.3 Conclusiones de los ensayos PIF

Se concluyó que la expresión eficaz de la proteína ORF2 del PCV2b en células de insectos, precisaba la sustitución del aminoácido en la posición número 131 por prolina, presentando un patrón de tinción citoplásmica, en un PIF con un anticuerpo anti-PCV2a. Sin tal mutación, la proteína ORF2 del PCV2b presentaba una tinción exclusivamente en o alrededor del núcleo de la célula de insecto que expresaba la proteína.

La mutación del gen de ORF2 únicamente mediante optimización de codones, proporcionó un ligero cambio en el patrón de tinción de la PIF, probablemente como resultado de la mayor eficacia de la expresión.

El patrón de tinción nuclear podía invertirse aún más cuando el baculovirus recombinante no se basaba en una construcción que contenía elementos residuales del vector de clonación (como en un recombinante producido utilizando el sistema Bac-to-Bac), sino una construcción de baculovirus "limpia", es decir, que no contenía elementos genéticos adicionales procedentes del proceso de recombinación en su genoma. Estos baculovirus recombinantes limpios se pueden obtener utilizando recombinación homóloga clásica y purificación por placas, o más convenientemente utilizando un kit comercial como el sistema ProEasy.

Por tanto: se puede obtener una inversión del patrón de tinción nuclear por PIF observado en células de insecto que expresan la proteína ORF2 del PCV2b mediante la mutación del triplete que codifica el aminoácido número 131 de<o>RF2 para codificar prolina. Se puede alcanzar una optimización adicional de la expresión de la proteína ORF2 citoplásmica optimizando los codones del gen codificante y utilizando una construcción de baculovirus recombinante limpia.

2.4 CUANTIFICACIÓN MEDIANTE ELECTROFORESIS EN GEL

2.4.1 Esquema de los ensayos de electroforesis en gel

Para permitir una cuantificación del nivel de expresión de las diferentes proteínas ORF2, se corrieron muestras de cultivos de células de insecto infectadas en SDS-PAGE, junto a carriles con cantidades conocidas de seroalbúmina bovina (BSA) como proteína marcadora. Después de la tinción, los geles se exploraron y analizaron. Mediante el uso de un tampón de muestras fuertemente desnaturalizante, este experimento reveló la capacidad de expresión total de las células de insecto infectadas con diversas construcciones de baculovirus recombinantes

Los diferentes baculovirus recombinantes a probar se cultivaron en matraces T75 como se describe, se recolectaron, se centrifugaron, y los sedimentos celulares se recogieron en 7,5 ml de PBS. Luego se recogieron muestras del sobrenadante y de las células resuspendidas en un tampón de muestras desnaturalizante convencional Laemmli SDS-PAGE (que contiene indicador azul de bromofenol y beta-mercaptoetanol).

Las muestras se corrieron en geles de poliacrilamida convencionales (Criterion TGX ™ prefabricado, Any kD (15 %), Bio-Rad), en tampón de corrida convencional de Tris-Glicina-SDS. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con Instant Blue™ (Expedeón). Finalmente, los geles se digitalizaron y analizaron con un densitómetro calibrado Bio-Rad GS-900 utilizando el programa informático Image Lab™, versión 5.2.1, para asignar una cantidad de proteína a bandas individuales en el gel.

2.4.2 Resultados de los ensayos de electroforesis en gel

En las Figuras 1 y 2 se presentan algunas imágenes representativas del gel utilizado en estos experimentos: Figura 1: muestras de cultivos de células de insecto infectadas con los virus n.° 3, 6 o 7; y la Figura 2: muestras de cultivos con los virus n.° 8 o 9. Por tipo de virus, el primer carril contiene una muestra de sobrenadante de cultivo, los siguientes tres carriles contienen muestras de las células concentradas 2x, con 30, 20 y 10 pml de izquierda a derecha. Carriles más a la izquierda y más a la derecha: marcadores de peso molecular 10 - 25o kDa (patrones Precision Plus Protein™, Bio-Rad), los tamaños de banda se indican en las Figuras.

Cada gel también contenía un intervalo de dilución de BSA (Patrón de Albúmina de alta calidad, Thermo Fisher Scientific), que se utilizó como una solución de 100 ng/pl. Las cantidades utilizadas fueron: Figura 1: en los carriles 14 -17: 0,25, 0,5, 1 y 2 pg de BSA; Figura 2: en los carriles 11 -15: 0,25, 0,5, 1, 2 y 3 pg de BSA.

Los análisis por densitómetro se centraron en las bandas de la proteína ORF2 del PCV2, a 26 kDa. Todas las muestras se analizaron en geles dos veces, los resultados de rendimiento calculados son promedios de los duplicados.

Los rendimientos de proteína ORF2 de PCV2 se expresan en microgramos de proteína por ml del cultivo T75 original volumen de 15 ml . Se encontró ue los rendimientos fueron los si uientes:

Se podrían hacer varias observaciones:

- Para las infecciones víricas con los virus números 8 y 9, las dos construcciones de ORF2 del PCV2b con sustitución T131P, los carriles del gel (véase la Figura 2) parecían ligeramente más oscuros que los de los otros virus probados, aunque para todos los cultivos comparados mediante SDS-PAGE la mi (0,1), el tiempo de cultivo (4 días) y otras condiciones fueron todos iguales. Esto podría indicar que es posible que la infección no haya progresado tanto como para los otros virus, dando como resultado más material celular en la muestra. Quizás la sustitución de la prolina provocó una ligera atenuación del baculovirus recombinante. Sin embargo, los niveles de expresión de proteínas no parecieron verse afectados y fueron mejores que los del ORF2 del PCV2b sin esta mutación.

- Ninguna de las muestras de sobrenadante mostró una cantidad de proteína ORF2 que pudiera visualizarse mediante la tinción de CBB utilizada. En consecuencia, en las condiciones aplicadas en estos experimentos, efectivamente, toda la proteína ORF2 expresada estaba contenida en las células de insecto.

- El nivel de expresión de la proteína ORF2 del PCV2b no mutada (virus 6) fue inferior al de ORF2 del PCV2a (virus 3), con 26 frente a 32 pg/ml. Se recuerda que estas muestras presentan el total de todas las proteínas producidas, debido a la desnaturalización agresiva empleada (hirviendo en SDS y beta-mercaptoetanol). Esto indica que la expresión proteica total del gen de ORF2 del PCV2b no mutado es en realidad menor en general en las células de insecto.

Obsérvese: Esta diferencia de rendimiento es mucho peor en la práctica, cuando la recolección se realiza sin (fuerte) desnaturalización. En ese caso, los lisados de células de insecto que expresaban ORF2 del PCV2b no mutada apenas mostraron ninguna proteína ORF2 detectable.

- El rendimiento de la proteína ORF2 del PCV2b no mutada podría aumentar ligeramente mediante el uso de un gen de ORF2 con codones optimizados: compárense los rendimientos de los cultivos de los virus 6 y 7, con los rendimientos totales de 26 y 36 pg/ml, respectivamente.

- Sin embargo, el aumento más significativo se logró mediante la introducción de la sustitución T131P en la proteína ORF PCV2b, véase los rendimientos de los cultivos de los virus 6 y 8, con 26 frente a 56 pg/ml. Por tanto, la sustitución T131P pudo provocar más del doble del rendimiento total de la proteína ORF2, incluso en estos cultivos a pequeña escala sin ninguna optimización.

- Se podrían alcanzar rendimientos aún mejores de la proteína ORF2 del PCV2b cuando se combinaran todas las mutaciones: sustitución T131P, optimización de codones y uso de una construcción de baculovirus limpia: la comparación de los rendimientos de los cultivos de los virus 6 y 9, muestra el triple del rendimiento proteico, de 26 a 76 pg/ml.

También se realizó un análisis similar del rendimiento proteico en muestras que se habían producido en cultivos a escala intermedia grande de 2 litros. Las recolecciones se obtuvieron en una concentración de 7,7x en comparación con el volumen total de cultivo. La proteína ORF2 de estos cultivos también se usó para producir las vacunas experimentales para PCV2 que se describen en lo sucesivo en el presente documento.

Los rendimientos de proteína ORF2 obtenidos fueron los siguientes, indicado en pg/ml del volumen de cultivo original de 2 litros:

Las condiciones de cultivo en los fermentadores fueron claramente más óptimas que en el cultivo a pequeña escala en matraces T. No sólo por el control automatizado de la temperatura, el pH y el oxígeno disuelto, sino también porque se trataba de cultivos en suspensión, que permiten mayores densidades celulares por ml de cultivo.

Los baculovirus recombinantes utilizados también se construyeron de forma óptima, en el sentido de que tenían un gen de ORF2 con codones optimizados, en una construcción de baculovirus limpia (producida utilizando el sistema ProEasy).

Esto dio como resultado un rendimiento proteico para las células de insecto infectadas con el virus n.° 9 de más de 100 pg/ml de cultivo, mientras que en los matraces T esto fue de 76 pg/ml.

Cabe destacar que el rendimiento de proteína de células de insecto que expresan la proteína ORF2 del PCV2b mutante con la sustitución del aminoácido número 131 por prolina, fue sustancialmente mayor que el de la proteína ORF2 del PCV2a no modificada, a pesar de que se utilizaron las mismas construcciones y condiciones de cultivo. En particular porque el gen de ORF2 del PCV2a utilizado en este caso también tenía una prolina en la posición de aminoácido 131 de su secuencia nativa. No es evidente a primera vista cuál podría ser la causa de esta diferencia, aunque evidentemente es muy favorable para la producción de la proteína ORF2 del PCV2b para la fabricación de vacunas de subunidades contra el PCV2.

2.4.3 Conclusiones de los ensayos de electroforesis en gel

Aunque por el momento no todos los efectos observados pueden explicarse, el análisis mediante electroforesis en gel dejó explícitamente claro que la expresión en células de insecto de la proteína ORF2 del PCV2b sin ninguna adaptación, en el mejor de los casos produjo cantidades de proteína inferiores que para la expresión de ORF2 del PCV2a. Esta diferencia es aún peor cuando las células se recolectan en condiciones no desnaturalizantes.

Sin embargo, la falta de rendimiento puede compensarse con creces sustituyendo el aminoácido de la posición 131 en ORF2 del PCV2b por prolina, lo que al menos duplica el rendimiento en comparación con el de la proteína ORF2 del PCV2b no mutada.

Se pueden alcanzar incluso mayores aumentos en el rendimiento expresando la mutación 131P a partir de un gen de ORF2 con codones optimizados y utilizando una construcción de baculovirus limpia. Aún se pueden lograr mejoras adicionales en los rendimientos en cultivos en suspensión a gran escala.

En conjunto, estos resultados permiten por primera vez la producción comercial y a gran escala de la proteína ORF2 a partir del genotipo del PCV2b, mediante un sistema de expresión recombinante.

Ejemplo 3: Experimentos de vacunación-exposición en cerdos

3.1 INTRODUCCIÓN

3.1.1 Objetivo

Este estudio se realizó para comparar y evaluar la eficacia de vacunas porcinas basadas en proteínas ORF2 del PCV2 mutantes expresadas en células de insecto de acuerdo con la invención. Para proporcionar una prueba exhaustiva de su capacidad protectora, las proteínas ORF2 de diferentes genotipos se utilizaron no sólo contra una infección de exposición por un PCV2 homólogo, sino también contra uno heterólogo. Además, las dosis de vacuna utilizadas contenían cantidades relativamente bajas de proteína ORF2.

3.1.2 Esquema del estudio

Para este estudio se utilizaron 140 lechones, asignado a 2 conjuntos de 7 grupos de tratamiento con 10 animales cada uno, un conjunto para cada una de las dos exposiciones. Los 140 animales procedían de 14 cerdas. Los lechones tenían niveles detectables de anticuerpos anti-ORF2 del PCV2 que variaban de títulos bajos a muy altos; el título medio de los AOM para todos los animales fue de 5,8 Log2 mediante ELISA de anticuerpos

Los lechones se vacunaron por vía intramuscular en el cuello con 2 ml cada uno, cuando tenían aproximadamente tres semanas de edad. Las vacunas utilizadas comprendían diferentes cantidades de proteína ORF2 del PCV2 producida mediante el sistema de expresión de células de insecto-baculovirus, de uno de tres genotipos: PCV2a, 2b o 2d. Los baculovirus recombinantes utilizados fueron los números 5, 9 y 10, como se describe anteriormente, que tenían una prolina en la posición del aminoácido 131, expresado a partir de un gen codificante de ORF2 al que se le optimizaron los codones hacia los del gen de la polihedrina del AcMNPV, y usando una construcción de baculovirus limpia. Las vacunas se formularon como emulsiones de aceite en agua con adyuvante Emunade™. La vacuna contenía adicionalmente un antígeno deMycoplasma hyopneumoniae(cepa J), para parecerse a la vacuna comercial: Porcilis™ PCV M Hyo. Con respecto al antígeno ORF2 del PCV2, la vacuna probada comprendía un cuarto o un decimosexto de una dosis completa convencional por animal.

Para ambos conjuntos, la división de los tratamientos de vacuna entre los grupos fue como se indica en el siguiente esquema.

Obsérvese: Los animales del grupo 7 de ambos conjuntos no fueron vacunados, para que actuaran como controles de la exposición.

Dos semanas posvacunación, todos los animales se transportaron a las instalaciones para la exposición. A las 3 semanas posvacunación (aproximadamente 6 semanas de edad), todos los animales recibieron una infección de exposición con PCV2 virulento, ya sea del genotipo 2b o del 2d. La exposición se realizó mediante la administración intranasal de 6 ml (3 ml por narina) de PCV2 en PBS, a 5 Log10 de DICT50/ml; usando para el conjunto 1: un virus de exposición PCV2b (aislado holandés, 2003), y para el conjunto 2: un virus de exposición PCV2d (aislado alemán, 2015). Los virus de exposición se produjeron en células PK15 sin PCV y se comprobó su esterilidad bacteriana y fúngica.

Tres semanas después de la exposición (a las 9 semanas de edad), todos los animales se sacrificaron y examinaron: las vísceras fueron inspeccionadasin situ,prestando especial atención a: pulmones, ganglios linfáticos inguinales y mesentéricos, amígdalas, timo, bazo, hígado y riñones. A continuación, se extrajeron y fijaron muestras de amígdala, pulmón, ganglio linfático mesentérico y ganglio linfático inguinal para la detección del virus de exposición PCV2, mediante inmunohistoquímica (IHQ).

También se realizaron otros análisis, como serología en muestras de sangre y qPCR en muestras de tejido e hisopados. Sin embargo, los datos de IHQ dieron los resultados más explícitos.

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.1 Proteínas ORF2 de PCV2:

Las secuencias del gen de ORF2 del PCV2 de PCV2a, 2b y 2d se produjeron en cultivos a escala intermedia grande como se describe en la sección 2.1 anterior. Su cuantificación mediante electroforesis en gel se describe en el apartado 2.3.2 anterior.

3.2.2 Animales de prueba

Los animales de prueba dieron resultados negativos para la carga vírica de PCV2 y tenían niveles moderados de anticuerpos anti-PCV2. La prueba se habría rechazado si alguno de los animales hubiera desarrollado signos clínicos de infección por PCV2 antes de la exposición.

En el ensayo sólo se incluyeron animales sanos. Todos los lechones se observaron a diario en cuanto a su salud general y en cuanto signos clínicos o sistémicos de enfermedad, tales como pérdida de apetito, renuencia a moverse, tendencia a acostarse, apatía o somnolencia, escalofríos, erizado, edema (especialmente alrededor de los ojos), vómitos, y diarrea y disnea.

Los lechones se marcaron individualmente mediante marcas auriculares, dividiéndose equitativamente los lechones de las 14 camadas en los grupos de prueba. Después del destete, el agua del grifo estuvo disponible a demanda y la alimentación se realizó de acuerdo con los procedimientos convencionales.

La vacunación se realizó en la paridera. Después del transporte a las instalaciones para la exposición se incluyó una semana de aclimatación.

3.2.3 Procedimientos experimentales de laboratorio

3.2.3.1 Inmunohistoquímica

Se prepararon muestras de tejido para examen histológico fijándolas en formalina al 10 % e incluyéndolas en parafina. Se prepararon portaobjetos de microscopía. Estos se incubaron con un suero policlonal de conejo anti-PCV2 como anticuerpo primario y se visualizaron con tinción con peroxidasa (Envision+™, DAKO). Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina. En el examen microscópico de amígdalas y ganglios linfáticos, a la tinción marrón característica se le dio una puntuación dependiendo del grado de coloración:

- puntuación 0: los folículos linfoides no mostraron tinción positiva específica;

- puntuación 1: menos del 10 % de los folículos linfoides contenían hasta 15 células con tinción específica positiva; - puntuación 2: 10 -50 % de los folículos linfoides contenían hasta 15 células con tinción positiva específica, o menos del 10 % de los folículos linfoides contenían más de 15 células con tinción positiva específica;

- puntuación 3: > 50 % de los folículos linfoides contenían células con tinción positiva específica.

La suma de las puntuaciones de los tejidos individuales se registró como la puntuación de IHQ total por animal y esta se combinó para todos los animales de un grupo.

3.2.3.2 Formulaciones de vacunas

Las vacunas de prueba se formularon como emulsiones de aceite en agua con Emunade™, se trata de un adyuvante doble con aceite mineral disperso en una fase acuosa que contiene los antígenos vacunales así como hidróxido de aluminio. La preparación, con antígeno de Mhyo al 9 %, fue de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento WO 2016/091998.

Además, la vacuna se preparó de acuerdo con el documento EP 1.926.496, de modo que el 25% de una dosis completa (2 ml/animal) comprendía aproximadamente 20 |jg de proteína ORF2, y una dosis del 6,25 % comprendía 5 |jg de proteína ORF2/dosis para animales.

3.3 RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Mediante inmunohistoquímica, las muestras de tejido de amígdala, ganglios linfáticos mesentéricos e inguinales recogidos después de la muerte, se analizaron para evaluar la cantidad de virus de exposición detectable. En las Figuras 3 y 4 se presenta una descripción gráfica de estos resultados: La Figura 3 representa los resultados para los animales de los grupos 1-7 del conjunto 1, que reciben una infección de exposición con el virus PCV2b virulento; La Figura 4 representa los datos de IHQ para todos los animales del conjunto 2, en que los animales se expusieron al virus PCV2d virulento.

El eje vertical presenta la puntuación de intensidad de IHQ de acuerdo con la escala descrita anteriormente. Los resultados de la IHQ se pueden utilizar para determinar la eficacia de las vacunas basadas en la proteína ORF2 del PCV2, comparando el nivel de reducción de la infección por PCV2 en grupos vacunados frente a no vacunados.

Se podrían hacer varias observaciones:

- Los animales no vacunados mostraron puntuaciones de IHQ considerablemente más altas que los grupos de vacunados, indicando que la dosis de la exposición era suficientemente alta, y que la infección de la exposición fue eficaz, incluso en el contexto de niveles moderados de anticuerpos maternos anti-PCV2 en los lechones. - Como puede observarse: las dosis de vacuna que comprenden 5 o 20 |jg de proteína ORF2 proporcionaron una fuerte protección contra la replicación del virus de exposición, alcanzando una reducción de las puntuaciones de IHQ de hasta el 90 %. Por lo tanto, estas vacunas para PCV2 fueron muy eficaces.

- Se observó una protección algo menor con la dosis más baja de proteína ORF2 del PCV2a frente a la exposición a PCV2d. Esto indica que las vacunas para el PCV2 basadas en la proteína ORF2 mutante expresada en células de insecto de PCV2b o de PCV2d de acuerdo con la presente invención son muy eficaces como vacuna contra la infección por PCV2, incluso con una dosis única, e incluso en el contexto de anticuerpos de origen materno. Con dosis iguales, estas vacunas basadas en la proteína ORF2 mutante de PCV2b o de PCV2d incluso parecieron ser más eficaces que la vacuna tradicional basada en la proteína ORF2 de PCV2a.

- Si bien la protección homóloga fue en general mejor que la protección heteróloga, hubo un claro nivel de protección cruzada contra los virus de exposición PCV2b y PCV2d, por los tres genotipos de vacuna probados: las vacunas de proteína ORF2 de PCV2a y PCV2d fueron comparables en cuanto a su efecto protector en su dosis más baja contra la exposición a PCV2b, mientras que la proteína ORF2 del PCV2a fue mejor con la dosis más alta. Sin embargo, la vacuna basada en la proteína ORF2 del PCV2b mutante fue mejor que la proteína ORF2 del PCV2a frente a la exposición a PCV2d en ambas dosis.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1:

Exploración del gel SDS-PAGE con muestras de cultivos de células de insecto que expresan diferentes proteínas ORF de PCV2 mediante infección con baculovirus recombinantes.

Los números de los carriles y una indicación del contenido de los carriles se representan encima de la imagen del gel.

- Carriles 1 y 18: Marcadores de peso molecular; las indicaciones de los pesos moleculares en kDa se indican a la izquierda de la imagen

- Carriles 2-5: células infectadas con el virus 3; Carril 2: sobrenadante; Carriles 3-5 sedimento celular, respectivamente 30, 20 y 10 jl

- Carriles 6 - 9: células infectadas con el virus 6; Carril 6: sobrenadante; Carriles 7-9 sedimento celular, respectivamente 30, 20 y 10 jl

- Carriles 10 -13: células infectadas con el virus 7; Carril 10: sobrenadante; Carriles 11 -13 sedimento celular, respectivamente 30, 20 y 10 jl

- Carriles 14 -17: muestras de referencia de proteína BSA, respectivamente: 0,25, 0,5, 1 y 2 jg .

Figura 2:

- Carriles 1 y 16: Marcadores de peso molecular; las indicaciones de los pesos moleculares en kDa se indican a la izquierda de la imagen

- Carriles 2-5: células infectadas con el virus 8; Carril 2: sobrenadante; Carriles 3-5 sedimento celular, respectivamente 30, 20 y 10 jl

- Carriles 6 - 9: células infectadas con el virus 9; Carril 6: sobrenadante; Carriles 7-9 sedimento celular, respectivamente 30, 20 y 10 jl

- Carril 10: vacío

- Carriles 11 -15: muestras de referencia de proteína BSA, respectivamente: 0,25, 0,5, 1, 2 y 3 jg .

Figuras 3 y 4:

Representaciones gráficas de los resultados de la inmunohistoquímica en diferentes tejidos de cerdos que recibieron una exposición infectados con PCV2, después de recibir una vacuna preparada a partir de la proteína ORF2 del PCV2 expresada en células de insecto. Se presentan resultados de tejidos para amígdala, ganglios linfáticos mesentéricos ("Gl. Mes.") y ganglios linfáticos inguinales ("Gl. Ing.")

En el eje horizontal se indican las diversas vacunas aplicadas (o no); el eje vertical presenta la puntuación arbitraria de la intensidad de IHQ de acuerdo con un grado de puntuación particular.

La Figura 3 representa los resultados de IHQ para los animales de los grupos 1-7 del conjunto 1, que reciben una infección de exposición con el virus PCV2b virulento;

La Figura 4 representa los resultados de IHQ para los animales de los grupos 1-7 del conjunto 2, en que los animales se expusieron al virus PCV2d virulento.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Células de insecto que comprenden un ácido nucleico heterólogo que comprende:

b. una secuencia de control de la transcripción que está unida operativamente a dicha secuencia de nucleótidos,caracterizadas por quela secuencia de nucleótidos codifica una proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, en donde la posición de aminoácido está numerada basándose en la numeración de los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de la proteína ORF2 del PCV2b de longitud completa publicada en GenBank con el número de referencia AAC35331.

2. Las células de insecto de acuerdo con la reivindicación 1,caracterizadas por quela secuencia de control de la transcripción es un promotor del gen p10 de baculovirus o un promotor del gen de la polihedrina de baculovirus.

3. Las células de insecto de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2,caracterizadas por queel ácido nucleico heterólogo está comprendido en un genoma de baculovirus recombinante.

4. Partículas similivíricas (las VLP) de la proteína ORF2 del PCV2b mutante,caracterizadas por quela proteína ORF2 del PCV2b mutante tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, en donde la posición de aminoácido es como se define en la reivindicación 1.

5. Método para la expresión de una proteína ORF2 del PCV2b mutante en células de insecto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, empleando el método el sistema de expresión de células de insectobaculovirus.

6. Método para la producción de una proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, en donde la posición de aminoácido es como se define en la reivindicación 1, comprendiendo la producción una o ambas etapas seleccionadas de:

- cultivo de las células de insecto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3; y

7. Vacuna para animales porcinos para la reducción de la infección por PCV2 o de los signos de enfermedad asociados, comprendiendo la vacuna una proteína ORF2 del PCV2b mutante en un transportador farmacéuticamente aceptable,caracterizada por quela proteína ORF2 del PCV2b mutante tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, en donde la posición de aminoácido es como se define en la reivindicación 1.

8. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 7,caracterizada por quela proteína ORF2 del PCV2b mutante está en forma de VLP.

9. La vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 7 u 8 que comprende un adyuvante.

10. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 - 9, que comprende un antígeno adicional de un microorganismo patógeno para animales porcinos.

11. Uso de la proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, en donde la posición de aminoácido es como se define en la reivindicación 1, para la fabricación de una vacuna para animales porcinos para la reducción de la infección por PCV2 o de los signos de enfermedad asociados.

12. Proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, en donde la posición de aminoácido es como se define en la reivindicación 1, para su uso en una vacuna para animales porcinos para la reducción de la infección por PCV2 o de los signos de enfermedad asociados.

13. Procedimiento para la preparación de una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 - 10, comprendiendo el procedimiento una o más etapas seleccionadas de:

- mezclar la proteína ORF2 del PCV2b mutante que tiene una prolina en la posición de aminoácido número 131, en donde la posición de aminoácido es como se define en la reivindicación 1, con un transportador farmacéuticamente aceptable; y