RU2662685C2 - Pcv2b дивергентная вакцинная композиция и способы её применения - Google Patents
Pcv2b дивергентная вакцинная композиция и способы её применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2662685C2 RU2662685C2 RU2016110430A RU2016110430A RU2662685C2 RU 2662685 C2 RU2662685 C2 RU 2662685C2 RU 2016110430 A RU2016110430 A RU 2016110430A RU 2016110430 A RU2016110430 A RU 2016110430A RU 2662685 C2 RU2662685 C2 RU 2662685C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pcv2b
- seq
- residue
- pcv2
- composition
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 155
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 114
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 claims abstract description 121
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 93
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 93
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 93
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims abstract description 70
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 70
- 241000282887 Suidae Species 0.000 claims abstract description 51
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims abstract description 28
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims abstract description 28
- 241001533384 Circovirus Species 0.000 claims abstract description 27
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 27
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims abstract description 27
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 16
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 230000004224 protection Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 claims abstract description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims abstract 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 141
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 79
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 74
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 31
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 24
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 24
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 13
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 12
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 claims description 3
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 claims description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 241001673668 Porcine circovirus type 2-B Species 0.000 abstract 3
- 241001673669 Porcine circovirus 2 Species 0.000 description 197
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 75
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 70
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 56
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 36
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 36
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 32
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 29
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 27
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 27
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 26
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 25
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 20
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 20
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 19
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 18
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 16
- 101150009852 ORF2 gene Proteins 0.000 description 16
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 15
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 15
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 description 14
- 101710113540 ORF2 protein Proteins 0.000 description 14
- 101710090523 Putative movement protein Proteins 0.000 description 14
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 13
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 7
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 7
- 238000011887 Necropsy Methods 0.000 description 6
- 101100382437 Porcine circovirus 2 Cap gene Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 6
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 5
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 5
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 5
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 5
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 102100037364 Craniofacial development protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 4
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 4
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 4
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 4
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 4
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 4
- 241000702619 Porcine parvovirus Species 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000000713 mesentery Anatomy 0.000 description 4
- 238000002161 passivation Methods 0.000 description 4
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 4
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 4
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000001726 Classical Swine Fever Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 206010024264 Lethargy Diseases 0.000 description 3
- 241000204045 Mycoplasma hyopneumoniae Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 3
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- -1 but not limited to Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 208000018879 impaired coordination Diseases 0.000 description 3
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 3
- 238000013081 phylogenetic analysis Methods 0.000 description 3
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 3
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 3
- RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(1-aminoethyl)oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol;(2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2r,3r,6s)-3-amino-6-(aminomethyl)oxan-2-yl]o Chemical compound OS(O)(=O)=O.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@@H](CN)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H](CC[C@H](O2)C(C)N)N)[C@@H](N)C[C@H]1N.O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N RDEIXVOBVLKYNT-VQBXQJRRSA-N 0.000 description 2
- HNXRLRRQDUXQEE-ALURDMBKSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[[(2r,3s,4r)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-3,4-dihydro-2h-pyran-3-yl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC=C[C@H]1O HNXRLRRQDUXQEE-ALURDMBKSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- 241000589893 Brachyspira hyodysenteriae Species 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 2
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 2
- 241000186810 Erysipelothrix rhusiopathiae Species 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 241000606807 Glaesserella parasuis Species 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N Iron oxide Chemical compound [Fe]=O UQSXHKLRYXJYBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241001148567 Lawsonia intracellularis Species 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 241001148549 Mycoplasma hyosynoviae Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 229940087586 escherichia coli antigen Drugs 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229920002503 polyoxyethylene-polyoxypropylene Polymers 0.000 description 2
- 230000005195 poor health Effects 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 208000009305 pseudorabies Diseases 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 238000001881 scanning electron acoustic microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 2
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 2
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LYFYWXLKKQIOKO-UHFFFAOYSA-N 3,3-diaminopentan-1-ol Chemical compound CCC(N)(N)CCO LYFYWXLKKQIOKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical group OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 201000004813 Bronchopneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 241001533399 Circoviridae Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000606831 Histophilus somni Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010023126 Jaundice Diseases 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000710788 Lelystad virus Species 0.000 description 1
- 241000208202 Linaceae Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010027256 Meningitis streptococcal Diseases 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033546 Pallor Diseases 0.000 description 1
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 description 1
- 241000700639 Parapoxvirus Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical group C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000711493 Porcine respiratory coronavirus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038687 Respiratory distress Diseases 0.000 description 1
- 108010073443 Ribi adjuvant Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 241001485053 Suid betaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 102400000368 Surface protein Human genes 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000037063 Thinness Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 235000021052 average daily weight gain Nutrition 0.000 description 1
- WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N avridine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CCCN(CCO)CCO)CCCCCCCCCCCCCCCCCC WXNRAKRZUCLRBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950010555 avridine Drugs 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 208000026500 emaciation Diseases 0.000 description 1
- UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N ethenamine Chemical compound NC=C UYMKPFRHYYNDTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 229960005191 ferric oxide Drugs 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 230000007614 genetic variation Effects 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940031689 heterologous vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000017555 immunoglobulin mediated immune response Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 1
- 229940057995 liquid paraffin Drugs 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 210000004777 protein coat Anatomy 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 1
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical class O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 1
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 201000001739 streptococcal meningitis Diseases 0.000 description 1
- 230000036435 stunted growth Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 210000000605 viral structure Anatomy 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
- C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
- C12N7/045—Pseudoviral particles; Non infectious pseudovirions, e.g. genetically engineered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vectore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/10044—Chimeric viral vector comprising heterologous viral elements for production of another viral vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/10011—Circoviridae
- C12N2750/10071—Demonstrated in vivo effect
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретения относятся к области биотехнологии и касаются вакцинной композиции, способа иммунизации при использовании указанной композиции и набора для осуществления такого способа. Представленная вакцинная композиция содержит эффективное количество ORF2 полипептида высоковирулентного дивергентного штамма цирковируса свиней типа 2b (PCV2b), кодированного геномной последовательностью, которая имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66, где кодированный ORF2 полипептид содержит лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1; и эмульсионный адъювант масло-в-воде. Изобретения могут быть использованы для обеспечения защиты свиней от цирковируса свиней типа 2 (PCV2), включая защиту от PCV2b. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 23 табл., 7 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Представленное изобретение касается цирковируса свиней. Более конкретно, настоящее изобретение касается вакцинной композиции, включающей PCV2b дивергентный ORF2 антиген, и его применение в вакцине для защиты свиней против PCV2, включая высоковирулентный дивергентный штамм цирковируса свиней типа 2b (PCV2b) и мультисистемный синдром истощения после отъема (PMWS).
Предпосылки создания изобретения
Цирковирус свиней типа 2 (PCV2), член семейства Circoviridae, рода Circovirus, представляет собой небольшой круговой безоболочечный вирус, который впервые был открыт в 1998. PCV2 является одним из двух наиболее распространенных патогенов, встречающихся в свиноводстве, где другим является Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo). Свинья, инфицированная PCV2, демонстрирует синдром, который обычно называют как мультисистемный синдром истощения после отъема (PMWS). PMWS клинически характеризуется истощением, бледностью кожных покровов, худосочностью, респираторным дистрессом, диареей, иктеричностью и желтухой. В дополнение к PMWS, PCV2 связывают с несколькими другими заболеваниями, включая псевдобешенство, репродуктивный и респираторный синдром свиней (PRRS), энзоотическую пневмонию, болезнь Глассера, стрептококковый менингит, сальмонеллез, после отъемный колибактериоз, диетический гепатоз и гнойную бронхопневмонию. Различные клинические проявления инфекции PCV2 у свиней по всем возрастным группам стали известными как заболевания, связанные с цирковирусом свиней (PCVAD), и характеризуются слабостью и задержкой роста. PRRS вирус, вирус свиного гриппа (SIV), M. hyo и другие бактерии участвуют в качестве основных сопутствующих факторов в развитии PCVAD. PCVAD постоянно был угрозой для свиноводства во всем мире, что вызывало большие экономические потери.
Изоляты PCV2 в настоящее время подразделяются на три генотипа: PCV2a, PCV2b и PCV2c. PCV2 содержит две основных открытых рамки считывания (ORF), которые кодируют белок, связанный с репликацией (ORF1, 945 nt), и вирусный капсид (ORF2, 702 nt). PCV2 претерпел значительные генетические вариации в последние годы. По-новому эмергентный PCV2 мутант с дополнительным лизином (K) на С-конце ORF2-кодированного капсидного белка, который сравнивали с классическими PCV2a и PCV2b генотипами, был выделен в 2008 из образца сыворотки от абортированный свиньи (Guo et al., 2010, Virology Journal 7: 273). В данном по-новому эмергентном PCV2 мутанте одна базовая делеция в положении 1039 в геномной последовательности в результате приводила к мутации стоп-кодона (от UAA до AAG) в ORF2, что дает ORF2 ген 705 nt и новый стоп-кодон (Guo et al., 2011, Virology Journal 8: 291). Кроме того, Knell et al. ранее сообщали, что мутации могли происходить в ORF2 гене, поскольку делеция (Т) была найдена в положении 1042 в 1767 nt генома одного штамма (GenBank no. AY713470), что привело к удлинению на одну аминокислоту (лизин) на С-конце ORF2-кодированного капсидного белка (Knell et al., 2005, Veterinary Microbiology 109: 169-177). Olvera et al. также сообщали относительно удлинения на один лизиновый остаток на С-конце капсидного белка из-за мутации в стоп-кодоне ORF2 (Olvera et al., 2007, Virology 357: 175-185). Кроме того, штамм PCV2, называемый "JSTZ", с GenBank номером доступа No. JQ413808, был обнаружен и идентифицирован в образцах кала поросенка с тяжелой диареей в Китае, и его полный 1767 nt геном секвенировали (Li et al., 2012, Journal of Virology (jvi.asm.org), p. 4716). Филогенетический анализ на основе генома штамма PCV2 JSTZ и ORF других китайских штаммов PCV2 показали, что штамм PCV2 JSTZ принадлежал к новому генотипу в Китае (Li et al., 2012, выше).
Guo et al. оценивали относительную вирулентность мутантного штамма PCV2, названного PCV2b/rBDHor BDH (Gen Bank номер доступа №НМ038017), который был выделен в 2008 из образца от абортированной свиньи с PMWS и подтвердил большую вирулентность мутантного штамма PCV2 у поросят, чем у того, что связан с классическими PCV2a и PCV2b генотипами (Guo et al., 2012, PLoS ONE (plosone.org), Vol. 7, Issue 7, e41463, 1-10). Данный мутантный штамм PCV2 продемонстрировал более серьезные признаки сходные с PMWS, которые характеризуются слабостью, кашлем, одышкой, диареей, всколоченной шерстью покрытия и депрессией. Более того, патологические повреждения и виремии, а также, вирусные нагрузки в лимфатических узлах, миндалинах и селезенке, были значительно более тяжелыми для поросят, вызванные мутантным штаммом PCV2 по сравнению с теми, которые в группах, инфицированных классическим PCV2a и PCV2b. Кроме того, значительно более низкий средний дневной прирост массы был зафиксирован в группе, инфицированной мутантным штаммом PCV2, чем в группах, инфицированных преобладающими генотипами PCV2a и PCV2b (Guo et al., 2012, выше).
Два PCV2 штамма, US 22625-33 и US 22664-35, недавно были идентифицированы в случаях неудачи с предполагаемой вакциной у PMWS-пострадавших свиней в системе производства, расположенной в Соединенных Штатах (Xiao et al., 2012, Journal of Virology (jvi.asm.org), Vol. 86, No. 22, p. 12469). Полный геном данных двух штаммов США, как было обнаружено, был в составе 1767 nt, и размер его ORF2 гена составлял 705 nt, кодирующий ORF2 белок 234 аа, который был на одну аминокислоту длиннее, чем у общего PCV2. Филогенетический анализ с нуклеотидными последовательностями ORF2 классических PCV2a и PCV2b штаммов предположил, что как U.S. PCV2 штаммы US 22625-33, так и US 22664-35 тесно связаны с PCV2b. По сравнению с классическим PCV2b одна базовая делеция в пределах ORF2 гена в результате приводила к добавлению одной аминокислоты (лизина) в С-конец ORF2 белка. Кроме того, последовательность BLAST и сравнение показало, что оба штамма PCV2 США имели высокий уровень идентичности (99,9%) с PCV2 штаммом, BDH, обнаруженным в Китае, и, как сообщалось, имели повышенную вирулентность. Одна молчащая мутация (1677А→1677Т) в ORF1 была найдена между BDH двумя мутантными U.S. PCV2. В соответствии с новым определением PCV2 генотипа и номенклатурными критериями (Cortey, et al., 2011, Vet. Microbiol. 149:522-523; Segales, et al., 2008, Vet. Rec. 162: 867-868) все из данных новых мутантных PCV2 штаммов могли быть классифицированы как генотип PCV2b, на основании филогенетического анализа нуклеотидной последовательности гена ORF2 (Xiao et al., 2012, выше).
Ввиду сообщений о повышении вирулентности нового дивергента PCV2b, а также его присутствие в случаях неудачи с предполагаемой вакциной в Соединенных Штатах, что необходимо, является эффективной вакцина против данного нового PCV2b дивергента. Предпочтительно то, что данная вакцина будет совместима с другими антигенами свиней, такими как M. hyo и PRRS вирус.
Сущность изобретения
Представленное изобретение предусматривает вакцинную композицию для защиты свиней против PCV2, включая высоковирулентный дивергентный штамм цирковируса свиней типа 2b (PCV2b), где композиция включает PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, где ORF2 полипептид содержит лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления композиция также предусматривает гетерологическую защиту против классических штаммов PCV2a и PCV2b.
В одном варианте осуществления композиция находится в форме инактивированного, PCV2b дивергентного целого вируса, который содержит и/или экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид.
В другом варианте осуществления композиция находится в форме инактивированного химерного вируса, где химерный вирус содержит инактивированный рекомбинантный цирковирус свиней типа 1, который содержит и/или экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид.
В еще другом варианте осуществления композиция находится в форме выделенного рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида. В одном варианте осуществления выделенный рекомбинантный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид экспрессируется из вектора. В другом варианте осуществления вектор представляет собой бакуловирус или парапоксвирус. В следующем варианте осуществления вектор представляет собой живой или инактивированный вектор.
В одном варианте осуществления PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, который включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1, дополнительно включает, по меньшей мере, один остаток, выбранный из группы, состоящей из: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцина (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В другом варианте осуществления PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, который включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1, дополнительно включает лизин (K) в остатке 59 и лизин (K) в остатке 234, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В следующем варианте осуществления PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, который включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90, аспарагин (N) в положении 134, лизин (K) в остатке 59 и лизин (K) в остатке 234, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1, дополнительно включает треонин (Т) в остатке 190, изолейцин (I) в остатке 53, аспарагин (N) в остатке 68, аргинин (R) или глицин (G) в остатке 169 и изолейцин (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления PCV2 дивергентный ORF2 полипептид представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или ее фрагментом.
В другом варианте осуществления композиция, которая включает PCV2 дивергентный ORF2 полипептид, дополнительно включает, по меньшей мере, один дополнительный свиной антиген. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один дополнительный антиген является защитным против заболевания у свиней, вызванного микроорганизмом.
В одном варианте осуществления микроорганизм включает бактерию, вирус, или простейшее. В другом варианте осуществления микроорганизм выбирают из, но не ограничиваются этим, следующего: вируса свиного репродуктивного и респираторного синдрома (PRRSV), свиного парвовируса (PPV), Haemophilusparasuis, Pasteurellamultocida, Streptococcumsuis, Staphylococcus hyicus, Actinobacillluspleuropneumoniae, Bordetellabronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrixrhusiopathiae, Mycoplamahyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, бактерий липтоспиры, Lawsoniaintracellularis, вируса свиного гриппа (SIV), антигена Escherichia coli, Brachyspirahyodysenteriae, свиного респираторного коронавируса, вируса эпизоотической диареи свиней (PED), ротавируса, вируса гепатита (TTV), свиного цитомегаловируса, свиных энтеровирусов, вируса энцефаломиокардита, патогена, вызывающего заболевание Ауески, классической свиной лихорадки (CSF) и патогена, вызывающий свиной трансмиссивный гастроэнтерит, или их комбинаций.
В некоторых вариантах осуществления композиция согласно представленному изобретению дополнительно включает адъювант. В одном варианте осуществления адъювант выбирают из, но не ограничиваются этим, адъюванта масло-в-воде, полимерного и водного адъюванта, адъюванта вода-в-масле, гидроксидалюминиевого адъюванта, адъюванта витамина E и/или их комбинаций. В другом варианте осуществления композиция согласно представленному изобретению дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель.
Представленное изобретение также предусматривает способ иммунизации свиньи против PCV2, включая дивергентный штамм PCV2b, где способ включает введение свинье композиции согласно представленному изобретению, как описано выше. Данная композиция для введения включает PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, где ORF2 полипептид включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. Как описано выше, данный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид может дополнительно включать, по меньшей мере, один остаток, выбранный из следующих: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцин (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления композиция для введения включает вирус, содержащий и/или экспрессирующий PCV2b дивергентный ORF2 полипептид. В другом варианте осуществления композиция для введения включает выделенный рекомбинантный PCV2b ORF2 полипептид.
В одном варианте осуществления способа согласно представленному изобретению композицию могут вводить внутримышечно, интрадермально, трансдермально, подкожно, интраназально или перорально, или другими способами, известными квалифицированному специалисту в данной области. В другом варианте осуществления композицию вводят одной дозой. В еще другом варианте осуществления композицию вводят двумя дозами.
В следующем варианте осуществления композицию вводят свиньям, имеющим материнские антитела против PCV2.
В одном варианте осуществления композицию вводят свиньям в возрасте 3 недель или старше.
Представленное изобретение, кроме того, предусматривает набор. Данный набор включает бутылочку, содержащую вакцинную композицию в соответствии с представленным изобретением для защиты свиней против высоковирулентного дивергентного штамма цирковируса свиней типа 2b (PCV2b). Данная вакцинная композиция включает PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, где ORF2 полипептид включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. Как описано выше, данный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид может дополнительно включать, по меньшей мере, один остаток, выбранный из следующих: лизин (K) в остатке 59, лизин (K) в остатке 234, треонин (Т) в остатке 190, изолейцин (I) в остатке 53, аспарагин (N) в остатке 68, аргинин (R) или глицин (G) в остатке 169 и изолейцин (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления набора вакцинная композиция находится в форме вируса, содержащего и/или экспрессирующего PCV2b дивергентный ORF2 полипептид. В другом варианте осуществления набора вакцинная композиция находится в форме выделенного рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида.
В одном варианте осуществления набора вакцинная композиция в бутылочке обеспечивается как готовая к применению жидкая композиция. В другом варианте осуществления набора вакцинная композиция в бутылочке обеспечивается в лиофилизированной форме. В следующем варианте осуществления набор может включать разбавитель. В еще другом варианте осуществления набор может дополнительно включать руководство пользователя, которое содержит информацию о введении вакцинной композиции.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает выравнивания аминокислотных последовательностей между капсидной последовательностью PCV2b дивергентного штамма, названного "PCV2B-DIV-MUT", и тем, что из классического PCV2A штамма (названного ISU-40895) и классического PCV2b штамма (названного NMB).
Фигура 2 представляет собой график, показывающий геометрическое среднее, рассчитанное методом наименьших квадратов, копий ДНК на день обработки. *Все "0" были превращены в 1 с целью получения графических изображений.
Фигура 3 представляет собой график, показывающий геометрическое среднее, рассчитанное методом наименьших квадратов, фекальных выделений (ДНК копии) на день обработки после контрольного заражения. *Все "0" были превращены в 1 с целью получения графических изображений.
Фигура 4 представляет собой график, показывающий титры PCV2 ИФА S/P по методу наименших квадратов (НК) на день обработки и обработку.
Фигура 5 представляет собой график обратно преобразованного геометрического среднего, рассчитанного по методу наименьших квадратов, копий ДНК на день обработки.
Фигура 6 представляет собой график обратно преобразованного геометрического среднего, рассчитанного методом наименьших квадратов, фекальных выделений (ДНК копии) на день обработки после контрольного заражения.
Фигура 7 представляет собой график, показывающий титры PCV2 ИФА S/P по методу НК на день исследования
Краткое описание последовательностей
Как используется в данном документе, изоляты PCV2, представленные SEQ ID NO: с 1 до 57 и 66, представляют собой типовые примеры PCV2b дивергентных штаммов.
SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2b дивергентного штамма, названного PCV2B-DIV-MUT в данном документе.
SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2b дивергентного штамма, названного PCV2B-DIV-MUT в данном документе.
SEQ ID NO: 3 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 штамма: 798-1, с номером доступа GenBank №AB462384.
SEQ ID NO: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 штамма: 798-1, с номером доступа GenBank №AB462384.
SEQ ID NO: 5 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 штамма: FF, с номером доступа GenBank №DQ231516.
SEQ ID NO: 6 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 штамма: FF, с номером доступа GenBank №DQ231516.
SEQ ID NO: 7 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 штамма: VC 2002-k2, с номером доступа GenBank №EF990645.
SEQ ID NO: 8 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 штамма: VC 2002-k2, с номером доступа GenBank №EF990645.
SEQ ID NO: 9 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: GY09, с номером доступа GenBank №GQ845025.
SEQ ID NO: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 штамма: GY09, с номером доступа GenBank №GQ845025.
SEQ ID NO: 11 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: XS09, с номером доступа GenBank №GQ845028.
SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 штамма: XS09, с номером доступа GenBank №GQ845028.
SEQ ID NO: 13 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: SDld01, с номером доступа GenBank №HM535640.
SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: SDld01, с номером доступа GenBank №HM535640.
SEQ ID NO: 15 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: SDld02, с номером доступа GenBank №HM755880.
SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: SDld02, с номером доступа GenBank №HM755880.
SEQ ID NO: 17 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: НМ01, с номером доступа GenBank №HM755881.
SEQ ID NO: 18 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: НМ01, с номером доступа GenBank №HM755881.
SEQ ID NO: 19 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 штамма: NIVS-1, с номером доступа GenBank №HQ378157.
SEQ ID NO: 20 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 штамма: NIVS-1, с номером доступа GenBank №HQ378157.
SEQ ID NO: 21 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: С/2010-2*, с номером доступа GenBank №JF683394.
SEQ ID NO: 22 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: С/2010-2*, с номером доступа GenBank №JF683394.
SEQ ID NO: 23 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: G/2009-2, с номером доступа GenBank №JF683408.
SEQ ID NO: 24 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: G/2009-2, с номером доступа GenBank №JF683408.
SEQ ID NO: 25 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: I/2010, с номером доступа GenBank №JF927984.
SEQ ID NO: 26 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: I/2010, с номером доступа GenBank №JF927984.
SEQ ID NO: 27 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: J/2010, с номером доступа GenBank №JF927985.
SEQ ID NO: 28 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: J/2010, с номером доступа GenBank №JF927985.
SEQ ID NO: 29 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: К/2010, с номером доступа GenBank №JF927986.
SEQ ID NO: 30 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: К/2010, с номером доступа GenBank №JF927986.
SEQ ID NO: 31 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: М/2010, с номером доступа GenBank №JF927988.
SEQ ID NO: 32 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: М/2010, с номером доступа GenBank №JF927988.
SEQ ID NO: 33 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду PCV2 изолята: WB/ROM89, с номером доступа GenBank №JN006445.
SEQ ID NO: 34 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид PCV2 изолята: WB/ROM89, с номером доступа GenBank №JN006445.
SEQ ID NO: 35 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: EU-RO-F4-3, с номером доступа GenBank №JN382188.
SEQ ID NO: 36 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: EU-RO-F4-3, с номером доступа GenBank №JN382188.
SEQ ID NO: 37 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: HNing09, с номером доступа GenBank №JN411096.
SEQ ID NO: 38 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: HNing09, с номером доступа GenBank №JN411096.
SEQ ID NO: 39 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: YWu09, с номером доступа GenBank №JN411099.
SEQ ID NO: 40 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: YWu09, с номером доступа GenBank №JN411099.
SEQ ID NO: 41 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: CH-IVT4, с номером доступа GenBank №JX984586.
SEQ ID NO: 42 представляет собой нуклеотидную последовательность гена капсида полной длины PCV2 изолята: CH-IVT4, с номером доступа GenBank №JX984586.
SEQ ID NO: 43 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: CH-IVT6, с номером доступа GenBank №JX984588.
SEQ ID NO: 44 представляет собой нуклеотидную последовательность гена капсида полной длины PCV2 изолята: CH-IVT6, с номером доступа GenBank №JX984588.
SEQ ID NO: 45 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: CH-IVT7, с номером доступа GenBank №JX984589.
SEQ ID NO: 46 представляет собой нуклеотидную последовательность гена капсида полной длины PCV2 изолята: CH-IVT7, с номером доступа GenBank №JX984589.
SEQ ID NO: 47 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята, с номером доступа GenBank №JX984590.
SEQ ID NO: 48 представляет собой нуклеотидную последовательность гена капсида полной длины PCV2 изолята, с номером доступа GenBank №JX984590.
SEQ ID NO: 49 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: CH-IVT9, с номером доступа GenBank №JX984591.
SEQ ID NO: 50 представляет собой нуклеотидную последовательность гена капсида полной длины PCV2 изолята: CH-IVT9, с номером доступа GenBank №JX984591.
SEQ ID NO: 51 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: CH-IVT10, с номером доступа GenBank №JX984592.
SEQ ID NO: 52 представляет собой нуклеотидную последовательность гена капсида полной длины PCV2 изолята: CH-IVT10, с номером доступа GenBank №JX984592.
SEQ ID NO: 53 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: CH-IVT11, с номером доступа GenBank №JX984593.
SEQ ID NO: 54 представляет собой нуклеотидную последовательность гена капсида полной длины PCV2 изолята: CH-IVT11, с номером доступа GenBank №JX984593.
SEQ ID NO: 55 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины PCV2 изолята: GDYX, с номером доступа GenBank №JX519293.
SEQ ID NO: 56 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2 изолята: GDYX, с номером доступа GenBank №JX519293.
SEQ ID NO: 57 представляет собой полную геномную последовательность PCV2 изолята: GDYX, с номером доступа GenBank №JX519293.
SEQ ID NO: 58 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины классического PCV2a изолята: ISU-40895, с номером доступа GenBank №AF264042.
SEQ ID NO: 59 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины PCV2a изолята: ISU-40895, с номером доступа GenBank №AF264042.
SEQ ID NO: 60 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины классического PCV2a изолята: Imp.1010-Stoon, с номером доступа GenBank №AF055392.
SEQ ID NO: 61 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины классического PCV2a изолята: Imp.1010-Stoon, с номером доступа GenBank №AF055392.
SEQ ID NO: 62 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины классического PCV2a штамма: NMB, с номером доступа GenBank №GU799576.
SEQ ID NO: 63 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины классического PCV2b изолята: NMB, с номером доступа GenBank №GU799576.
SEQ ID NO: 64 представляет собой аминокислотную последовательность, которая соответствует капсиду полной длины классического PCV2c штамма: DK1980PMWSfree, с номером доступа GenBank №EU148503.
SEQ ID NO: 65 представляет собой нуклеотидную последовательность, кодирующую капсид полной длины классического PCV2c штамма: DK1980PMWSfree, с номером доступа GenBank №EU148503.
SEQ ID NO: 66 представляет собой полную геномную последовательность PCV2 дивергента, названного "PCV2b-DIV-MUT".
Детальное описание изобретения
Как используется в описании и формуле изобретения, единственное число включает ссылки на множественное число, если контекст четко не указывает на иное. Например, термин "белковый антиген" включает множественность белковых антигенов, включая их смеси.
Как используется в данном документе, термин "содержащий" подразумевает, что композиции и способы включают перечисленные элементы, но не исключает других элементов.
Как используется в данном документе, термины "PCV2b дивергентный штамм", "PCV2b дивергент", "PCV2 мутант", "новый мутантный PCV2", "мутантный PCV2" и подобные относятся к высоковирулентному PCV2b штамму, который кодирует ORF2 капсидный полипептид, который включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. Кодированный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид может дополнительно включать, по меньшей мере, один остаток, выбранный из: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцина (I) в остатке 215 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
Как используется в данном документе, термин "PCV2b дивергентный ORF2 полипептид" предназначается для того, чтобы включать вирус, содержащий и/или экспрессирующий PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, таким образом, что ORF2 полипептид представляет собой компонент самого вируса (например, белковая оболочка вируса). Вирус может представлять собой PCV, но не должен истолковываться, чтобы ограничиваться такими, и может включать другие вирусы. Данный термин также предназначен для того, чтобы включать выделенный рекомбинантный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид.
Термин "антиген" касается соединения, композиции, или иммуногенного вещества которое может стимулировать продуцирование антительного или Т-клеточного ответа, или обоих, у животного, включая композиции, которые вводятся инъекционно или абсорбируются у животного. Иммунный ответ может быть сгенерирован к целой молекуле, или к части молекулы (например, эпитопу или гаптену). Термин "антиген" может включать целый вирус, полипептид, или его фрагмент.
Как используется в данном документе, термин "вакцинная композиция" включает, по меньшей мере, один антиген или иммуноген в фармацевтически приемлемом носителе, приемлемом для индуцирования иммунного ответа у хозяина. Вакцинные композиции могут вводить в дозах и способами, хорошо известными квалифицированному специалисту в области медицины и ветеринарии, принимая во внимание факторы, такие как возраст, пол, вес, вид и состояние животного-реципиента, и способ введения. Способ введения может быть чрескожным, посредством введения через слизистую оболочку (например, пероральный, назальный, анальный, вагинальный) или посредством парентерального способа (интрадермальный, трансдермальный, внутримышечный, подкожный, внутривенный или внутрибрюшинный). Вакцинные композиции могут вводиться самостоятельно, или могут совместно вводиться, или последовательно вводиться с другими лечениями или терапиями. Формы введения могут включать суспензии, сиропы или эликсиры и препараты для парентерального, подкожного, интрадермального, внутримышечного или внутривенного введения (например, инъекционного введения), такие как стерильные суспензии или эмульсии. Вакцинные композиции могут быть введены как спрей, или смешанные с едой и/или водой, или доставлены в смеси с приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический солевой раствор, глюкоза, или аналогичные. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН буферные агенты, адъюванты, желирующие или повышающие вязкость добавки, консерванты, ароматические агенты, красители и тому подобные, в зависимости от способа введения и желаемого препарата. Стандартные фармацевтические тексты, такие как "Remington's Pharmaceutical Sciences" (1990), могут давать консультацию по получению подходящих препаратов, без излишних экспериментов.
Как определено в данном документе, "иммуногенная или иммунологическая композиция", касается смеси химически связанных веществ, которая содержит, по меньшей мере, один антиген, который вызывает иммунологический ответ у хозяина клеточного и/или антитело-опосредованого иммунного ответа к композиции или вакцине, вызывающей интерес.
Термин "иммунный ответ", как используется в данном документе, касается ответа, вызванного у животных. Иммунный ответ у животных может касаться клеточного иммунитета (CMI), гуморального иммунитета, или может включать оба. Представленное изобретение также предусматривает ограниченный ответ к части иммунной системы. Как правило, "иммунологический ответ" включает, но не ограничиваются этим, один или больше из следующих эффектов: продуцирование или активацию антител, В клетки, хелпер-Т-клетки, супрессор-Т клетки, и/или цитотоксические T клетки и/или yd-T клетки, специфически направленных на антиген или антигены, включенные в композицию или вакцину, представляющей интерес. Предпочтительно хозяин будет демонстрировать или терапевтический, или защитный иммунологический ответ, таким образом, что устойчивость к новой инфекции будет расширяться, и/или клиническая тяжесть заболевания будет снижаться. Такая защита будет продемонстрирована или путем уменьшения или отсутствия симптомов, которые обычно демонстрируются инфицированным хозяином, более быстрым временем восстановления, и/или сниженным титром вируса у инфицированного хозяина.
Как используется в данном документе, термин "иммуногенность" означает способность продуцировать иммунный ответ у хозяина-животного против антигена или антигенов. Данный иммунный ответ формирует основу защитного иммунитета, вызванного вакциной против конкретного возбудителя инфекции.
"Адъювант", как используется в данном документе, означает композицию, состоящую из одного или больше веществ, которые усиливают иммунный ответ к антигену(ам). Механизм, по которому действует адъювант, полностью не известен. Считается, что некоторые адъюванты усиливают иммунный ответ за счет медленного высвобождения антигена, тогда как другие адъюванты являются сильно иммуногенными сами по себе, и считается, что функционируют синергетически.
Как используется в данном документе, термин "мультвалентный" означает вакцину, содержащую больше, чем один антиген, или из одних и тех же микробиологических видов (например, различные изоляты Mycoplasma hyopneumoniae или PCV), из различных видов (например, изоляты как из Pasteurellahemolytica, так и Pasteurellamultocida), или вакцину, содержащую комбинацию антигенов из различных родов (например, вакцина, содержащая антигены из Pasteurellamultocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilussomnus и Clostridium).
Термин "свинья" или "поросенок", как используется в данном документе, означает животное свиного происхождения, в то время как "свиноматка" касается самки свиньи репродуктивного возраста и способности. "Молодая свинья" представляет собой самку свиньи, которая никогда не была беременной.
Как используется в данном документе, термин "вирулентный" означает изолят, который сохраняет свою способность быть инфекционным у животного-хозяина и способен вызывать заболевание у животного-хозяина.
"Инактивированный вакцина" означает вакцинную композицию, содержащую возбудитель инфекции или патоген, который больше не способен к репликации или росту. Возбудитель может быть бактериальным, вирусным, протозойным или грибковым по происхождению. Инактивация может быть достигнута с помощью различных способов, включая замораживание-оттаивание, химическую обработку (например, обработку β-пропиолактоном (BPL) или формалином), обработку ультразвуком, излучением, теплом или какими-либо другими традиционными средствами, достаточными для предотвращения репликации или роста организма, сохраняя при этом его иммуногенность.
Термин "вариант", как используется в данном документе, касается полипептида или последовательности нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид, который имеет одну или больше консервативных аминокислотных вариаций или других незначительных модификаций, таким образом, что соответствующий полипептид имеет практически эквивалентную функцию по сравнению с немутантным типом полипептида. Термин "вариант" также может касаться микроорганизма, содержащего полипептид или последовательность нуклеиновых кислот, имеющую также указанные вариации или модификации.
"Консервативная вариация" означает замену аминокислотного остатка другим биологически аналогичным остатком, или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, таким образом, что кодированный аминокислотный остаток не изменится, или является другим биологически подобным остатком. Примеры консервативных вариаций включают замещение одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой гидрофобный остаток, или замещение одного полярного остатка на другой, такое как замещение аргинина на лизин, глютаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту, или глутамина на аспарагин и тому подобные. Термин "консервативная вариация" также включает замещенную аминокислоту вместо родительской аминокислоты, при условии, что антитела, индуцированные замещенным полипептидом также иммунореагируют с родительским (незамещенным) полипептидом.
Как используются в данном документе, термины "фармацевтически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый наполнитель" являются взаимозаменяемыми и касаются жидкого носителя, содержащего вакцинные антигены, который, может инъекционно вводится хозяину без побочных эффектов. Подходящие фармацевтически приемлемые носители, известные в данной области с уровня техники включают, но не ограничиваются этим, стерильную воду, солевой раствор, глюкозу, декстрозу, или буферные растворы. Носители могут включать вспомогательные вещества, включая, но не ограничиваются этим, разбавители, стабилизаторы (то есть сахара и аминокислоты), консерванты, увлажняющее агенты, эмульгирующие агенты, рН буферные агенты, добавки повышающие вязкость, окрашивающие добавки и тому подобные.
"Североамериканский PRRS вирус" означает какой-либо PRRS вирус, имеющий генетические характеристики, ассоциированные с изолятом североамериканского PRRS вируса, такие как, но не ограничиваются этим, PRRS вирус, который был впервые выделен в Соединенных Штатах приблизительно около 1990-х (смотри, например, Collins, J.E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest. 4: 117-126); изолят североамериканского PRRS вируса MN-1b (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest. 6: 293-296); Quebec LAF-exp91 штамм PRRS вируса (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140: 1405-1418); и изолят североамериканского PRRS вируса VR 2385 (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75: 1795-1801). Дополнительные примеры штаммов североамериканского PRRS вируса известны в данной области с уровня техники. Генетические характеристики относятся к подобности геномной нуклеотидной последовательности и подобности аминокислотной последовательность общедоступных штаммов североамериканского PRRS вируса. Китайские штаммы PRRS вирус, в целом фактически имеют подобность на приблизительно 80-93% нуклеотидной последовательности североамериканских штаммов.
"Европейский PRRS вирус" касается какого-либо штамма PRRS вируса, имеющего генетические характеристики, связанные с вирусом PRRS, который впервые был выделен в Европе около 1991 (смотри, например, Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q. 13: 121-130). "Европейский PRRS вирус" также иногда называют в данной области как "Лелистад вирус". Дополнительные примеры штаммов европейского PRRS вируса известны в данной области с уровня техники.
Как используется в данном документе, генетически модифицированный вирус является "ослабленным" если он является менее вирулентным, чем его немодифицированный родительский штамм. Штамм является "менее вирулентным" если он показывает статистически значительное снижение одного или больше параметров, определяющих тяжесть заболевания. Такие параметры могут включать уровень виремии, лихорадку, тяжесть дыхательной недостаточности, тяжесть репродуктивных симптомов, или количество или тяжесть патологических поражений и т.д.
"Инфекционный клон" представляет собой изолированный или клонированный геном возбудителя заболевания (например, вирусы), которые могут быть конкретно и целенаправленно модифицированы в лаборатории и затем использованы для повторного создания живого генетически модифицированного организма. Живой генетически модифицированный вирус, полученный из инфекционного клона, может быть использован в живой вирусной вакцине. Альтернативно инактивированные вирусные вакцины могут быть получены путем обработки живого вируса, полученного из инфекционного клона с инактивирующими агентами, такими как формалин, бета-пропиолактон, бинарный этиленамин или гидрофобные растворители, кислоты и т.д., путем облучения ультрафиолетовым светом или рентгеновскими лучами, путем нагревания и т.д.
Представленное изобретение предусматривает вакцинную композицию для защиты свиней против PCV2, которая включает высоковирулентный дивергентный штамм цирковируса свиней типа 2b (PCV2b), где композиция включает PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, где ORF2 полипептид содержит лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. Как описано выше, данный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид может дополнительно включать, по меньшей мере, один остаток, выбранный из следующих: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцина (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления PCV2b дивергентный ORF2 полипептид который включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1, дополнительно включает лизин (K) в остатке 59 и лизин (K) в остатке 234, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В следующем варианте осуществления PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, который включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90, аспарагин (N) в положении 134, лизин (K) в остатке 59 и лизин (K) в остатке 234, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1, дополнительно включает треонин (Т) в остатке 190, изолейцин (I) в остатке 53, аспарагин (N) в остатке 68, аргинин (R) или глицин (G) в остатке 169 и изолейцин (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления PCV2 дивергентный ORF2 полипептид представлен с помощью аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или ее фрагмента. Однако представленное изобретение не ограничивается данным вариантом осуществления. Например, в других вариантах осуществления PCV2 дивергентный ORF2 полипептид может быть выбран, но не ограничивается этим, из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 41 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 43 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 47 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 51 или ее фрагмента, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53 или ее фрагмента, или аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 55 или ее фрагмента.
В одном варианте осуществления вакцинные композиции согласно представленному изобретению включают, по меньшей мере, один дополнительный антиген. В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один дополнительный антиген защищает против заболевания у свиней, вызванного микроорганизмом.
В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один дополнительный антиген компонент защищает против заболевания у свиней, вызванного бактериями, вирусами или простейшими, которые, как известно, инфицируют свиней. Примеры таких микроорганизмов включают, но не ограничиваются этим, следующие: M. hyo, вирус свиного репродуктивного синдрома и вирус респираторного синдрома (PRRSV), свиной парвовирус (PPV), Haemophilusparasuis, Pasteurellamultocida, Streptococcumsuis, Staphylococcus hyicus, Actinobacillluspleuropneumoniae, Bordetellabronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrixrhusiopathiae, Mycoplamahyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, бактерии липтоспиры, Lawsoniaintracellularis, вирус свиного гриппа (SIV), антиген Escherichia coli, Brachyspirahyodysenteriae, свиной респираторный коронавирус, вирус эпизоотической диареи свиней (PED), свиной ротавирус (например, группы А, В и С), вирус гепатита (TTV), свиной цитомегаловирус, свиные энтеровирусы, вирус энцефаломиокардита, патоген, вызывающий заболевание Ауески, классическую свиную лихорадку (CSF) и патоген, вызывающий свиной трансмиссивный гастроэнтерит, или их комбинации.
В одном варианте осуществления, по меньшей мере, один дополнительный антиген представляет собой Mycoplasma hyopneumoniae (M. hyo). В другом варианте осуществления, по меньшей мере, один дополнительный антиген представляет собой PRRS вирус, такой как североамериканский штамм PRRS вируса, китайский штамм PRRS вируса, или европейский штамм PRRS вируса. Кроме того, ожидается, что, по меньшей мере, один дополнительный антиген может быть отличающимся изолятом PCV2, таким как классический PCV2a штамм, классический PCV2b штамм, или другие PCV2 генотипы.
В одном варианте осуществления композиция находится в форме инактивированного, PCV2b дивергентного целого вируса, который содержит и/или экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид.
В одном варианте осуществления ORF2 капсидный ген PCV2b дивергентного целого вируса соответствует SEQ ID NO: 2. В следующем варианте осуществления аминокислотная последовательность PCV2b дивергентного ORF2 полипептида, который экспрессируется с помощью PCV2b дивергентного целого вируса, соответствует SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту. Однако представленное изобретение не ограничивается данными вариантами осуществления. Например, в некоторых вариантах осуществления PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, экспрессированный PCV2b дивергентным целым вирусом, может быть выбранным из каких-либо следующих последовательностей или ее фрагментов: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, или SEQ ID NO: 55. Соответствующие последовательности ORF2 гена описаны в данном документе.
В другом варианте осуществления композиция находится в форме инактивированного химерного вируса, где химерный вирус содержит инактивированный рекомбинантный цирковирус свиней типа 1, который содержит и/или экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид (химерный PCV1-2b вирус). Химерные цирковирусы свиней и способы их получения описаны в WO 03/049703 А2 и также в патентах США №№7279166 и 7575752, которые включены в данный документ путем ссылки во всей их полноте.
В одном варианте осуществления ORF2 капсидный ген химерного PCV1-2 вируса соответствует SEQ ID NO: 2. В следующем варианте осуществления аминокислотная последовательность PCV2b дивергентного ORF2 полипептида, который экспрессируется химерным PCV1-2b вирусом, соответствует SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту. Однако представленное изобретение не ограничивается данными вариантами осуществления. Например, в некоторых вариантах осуществления PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, экспрессированный с помощью химерного PCV1-2b вируса, может быть выбран из каких-либо из следующих последовательностей или их фрагментов: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, или SEQ ID NO: 55.
В еще другом варианте осуществления композиция находится в форме выделенного рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида. В одном варианте осуществления выделенный рекомбинантный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид экспрессируется из вектора, такого как бакуловирус. Альтернативно другие известные векторы экспрессии могут быть использованы, такие как, включая, но не ограничиваются этим, парапокс-векторы. В одном варианте осуществления вектор может представлять собой живой или инактивированный вектор.
В следующем варианте осуществления рекомбинантно-экспрессированный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид соответствует SEQ ID NO: 1 или ее фрагменту. Альтернативно в некоторых вариантах осуществления рекомбинантно-экспрессированный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид может быть выбран из каких-либо из следующих последовательностей или ее фрагментов: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, или SEQ ID NO: 55.
В некоторых формах иммуногенные части PCV2 дивергентного ORF2 белка используют в качестве антигенного компонента в композиции. Например, усеченные и/или замещенные формы или фрагменты PCV2 дивергентного ORF2 белка могут быть использованы в композициях согласно представленному изобретению.
Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что варианты PCV2b дивергентных ORF2 полипептидов могут быть использованы в композициях согласно представленному изобретению, при условии, что они по-прежнему сохраняют антигенные характеристики, которые делают его полезным в вакцинных композициях согласно настоящему изобретению. Предпочтительно PCV2b дивергентные варианты имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с полноразмерной геномной последовательностью PCV2 изолята, названного PCV2B-DIV-MUT. Антигенные характеристики иммунологической композиции, например, могут быть установлены с помощью эксперимента контрольного заражения, как это предусмотрено в примерах. Кроме того, антигенная характеристика модифицированного PCV2b дивергентного ORF2 антигена все еще сохраняется, когда модифицированный антиген дает, по меньшей мере, 70%, предпочтительно 80%, более предпочтительно 90% защитного иммунитета по сравнению с немутантным типом PCV2b дивергентного ORF2 белка, имеющего SEQ ID NO: 1.
Компонент PCV2b дивергентного ORF2 антигена обеспечивается в иммуногенной/вакцинной композиции уровне включения антигена, эффективном для индукцирования желаемого иммунного ответа, а именно снижения заболеваемости или уменьшения тяжести клинических признаков в результате инфекции с высоковирулентным штаммом PCV2b, примером которого является вирус, названный PCV2B-DIV-MUT в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиция также предусматривает гетерологическую защиту против классических штаммов PCV2a и PCV2b.
В одном варианте осуществления вакцинная композиция в соответствии с представленным изобретением находится в форме инактивированного рекомбинантного цирковируса свиней типа 1, который содержит и/или экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид (химерный PCV1-2bDIV вирус). Данный химерный вирус включают в композиции согласно изобретению на уровне, по меньшей мере, 1,0≤RP≤5,0, где RP является единицей относительной эффективности, которая определяется путем количественного анализа антигена с помощью ИФА (исследование эффективности in vitro) по сравнению с эталонной вакциной. В другом варианте осуществления химерный PCV1-2bDIV вирус включают в композиции согласно изобретению с конечной концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% из 20-кратного (20Х) концентрированного объема PCV1-2bDIV антигена.
В другом варианте осуществления вакцинная композиция в соответствии с представленным изобретением находится в форме инактивированного, PCV2b дивергентного целого вируса, который содержит и/или экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид. Данный вирус включают в композиции согласно изобретению на уровне, по меньшей мере, 1,0≤RP≤5,0, где RP является единицей относительной эффективности, которая определяется путем количественного анализа антигена с помощью ИФА (исследование эффективности in vitro) по сравнению с эталонной вакциной. В другом варианте осуществления инактивированный PCV2b дивергентный целый вирус включают в композиции согласно изобретению с конечной концентрацией от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% из 20-кратного (20Х) концентрированного объема PCV2b дивергентного ORF2 антигена.
В еще другом варианте осуществления вакцинная композиция в соответствии с представленным изобретением находится в форме выделенного рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида. PCV2b дивергентный ORF2 рекомбинантный белок может быть включен в композиции согласно изобретению на уровне, по меньшей мере, 0.2 мкг антигена/мл конечной иммуногенной/вакцинной композиции (мкг/мл). В следующем варианте осуществления уровень включения рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 400 мкг/мл. В еще другом варианте осуществления уровень включения рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида составляет от приблизительно 0,3 до приблизительно 200 мкг/мл. В еще следующем варианте осуществления уровень включения рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида составляет от приблизительно 0,35 до приблизительно 100 мкг/мл. В еще другом варианте осуществления уровень включения рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида составляет от приблизительно 0,4 до приблизительно 50 мкг/мл.
В одном варианте осуществления вакцинная композиция согласно представленному изобретению включает комбинацию PCV2b дивергентного ORF2 полипептида, и, по меньшей мере, одного M. hyo растворимого антигена (например, два или больше). В одном варианте осуществления вакцинная композиция согласно изобретению включает PCV2b дивергентный ORF2 полипептид и один или больше из следующих M. hyo конкретных белковых антигенов: M. hyo белки с молекулярными массами приблизительно 46 кДа (р46), 64 кДа (р64) и 97кДа (р97). M. hyo белок приблизительно 64 кДа (р64) альтернативно может быть назван как р65 поверхностный антиген из M. hyo, описанный Kim et al. [Infect. Immun. 58(8): 2637-2643 (1990)], a также в патенте США №5788962. Futo et al. описали клонирование и характеристика поверхностного белка 46кДа M. hyo, который может быть использован в композициях согласно данному изобретению [J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]. Zhang et al. описали и охарактеризовали р97 адгезиновый белок M. hyo [Infect. Immun. 63: 1013-1019, 1995]. Дополнительно, King et al. описали белок 124 кДа, названный Mhp1 из Р-5722 штамма M. hyo и представили данные, подтверждающие, что Mhp1 и р97 представляет собой один и тот же белок [Vaccine 15: 25-35 (1997)]. Such р97 белки могут быть использованы в композициях согласно данному изобретению. Вакцинные композиции согласно представленному изобретению могут включать, кроме того, M. hyo специфические белковые антигены, такие как, но не ограничиваются этим, белки приблизительно 41 кДа (р41), 42 кДа (р42), 89 кДа (р89) и 65 кДа (р65). См. Okada et al., 2000, J. Vet. Med. В 47: 527-533 and Kim et al., 1990, Infect. Immun. 58(8): 2637-2643. Кроме того, компонент M. hyo может включать M. hyo специфические белковые антигены приблизительно 102 кДа (р102) и 216 кДа (р216). См. патенты США №№6162435 и 7419806 Minion et al.
В другом варианте осуществления вакцинная композиция согласно представленному изобретению включает комбинацию PCV2b дивергентного ORF2 полипептида, по меньшей мере, одного M. hyo растворимого антигена (например, два или больше), а также антигена PRRS вируса. Приемлемые антигены PRRS вируса для использования в PCV2b дивергентных/М. hyo/PRRS композициях согласно представленному изобретению включают изоляты североамериканского PRRS вируса, штаммы китайского PRRS вируса и штаммы европейского PRRS вируса, а также генетически модифицированные версии таких изолятов/штаммов. В одном варианте осуществления компонент антигена PRRS вируса, применяемый в композициях в соответствии с представленным изобретением, представляет собой североамериканский PRRS вирус.
В некоторых вариантах осуществления компонент антигена PRRS вируса, применяемый в композициях согласно данному изобретению, представляет собой изолят североамериканского PRRS вируса, обозначенный как P129, или его живая, генетически модифицированная версия. Предпочтительно генетически модифицированный PRRS вирус не способен продуцировать патогенную инфекцию, при этом способен вызывать эффективный иммунозащитный ответ против инфицирования немутантным типом PRRS вируса.
Генетически модифицированный PRRS вирус для применения в композициях согласно изобретению может быть получен из инфекционного клона. Получение инфекционного клона кДНК изолята североамериканскогой PRRS вируса, обозначенного Р129, описывается в патенте США №6500662, который включен в данное описание полностью в качестве ссылки. Последовательность P129 кДНК раскрывается в Genbank под номером доступа №AF494042 и в патенте США №6500662.
В одном варианте осуществления PCV2b дивергентная/М. hyo комбинированная вакцина обеспечивается в виде разовой дозы вакцины в 1-ой бутылочке. В другом варианте осуществления PCV2b дивергентная/М. hyo/PRRS вирус комбинированная вакцина обеспечивается в виде разовой дозы вакцины в 2-х бутылочках. Например, в некоторых вариантах осуществления PCV2b дивергентная/М. hyo комбинация обеспечивается в виде стабильной жидкой композиции в первой бутылочке, и PRRS вирус обеспечивается в лиофилизированном состоянии во второй бутылочке. В некоторых вариантах осуществления дополнительные свиные антигены могут быть добавлены или в первую, или во вторую бутылочку.
В одном варианте осуществления PRRS вирусный компонент обеспечивается в виде лиофилизированного, генетически модифицированного живого вируса. Перед введением PCV2b дивергентная/М. hyo жидкая форма из первой бутылочки может быть использована, чтобы повторно гидратировать PRRS вирус во второй бутылочке, таким образом, что все три антигена могут быть введены животному одной дозой.
Вакцины согласно представленному изобретению могут быть сформулированы, следуя общепринятому порядку включения фармацевтически приемлемых носителей для животных, включая людей (если приемлемо), таких как стандартные буферы, стабилизаторы, разбавители, консерванты и/или солюбилизаторы, и могут быть сформулированы, чтобы способствовать пролонгированному высвобождению. Разбавители включают вода, солевой раствор, декстрозу, этанол, глицерин и тому подобные. Добавки для изотоничности включают среди других хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. Стабилизаторы включают среди других альбумин. Другие приемлемые вакцинные носители и добавки, включая те, которые особенно полезны при формулировании модифицированных живых вакцин, известны или будут очевидны квалифицированному специалисту в данной области. Смотри, например, Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, которая включена в данный документ в виде ссылки.
Вакцины согласно представленному изобретению могут дополнительно включать один или больше дополнительных иммуномодулирующих компонентов, таких как, например, среди других адъювант или цитокин. Типы приемлемых адъювантов для применения в композициях согласно представленному изобретению включают следующие: адъювант масло-в-воде, полимерный и водный адъювант, адъювант вода-в-масле, адъювант гидроксид алюминия, адъювант витамин E и/или их комбинации. Некоторые конкретные примеры адъювантов включают, но не ограничиваются этим, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, Corynebacterium parvum, бацилла Кальмета-Герена, гель гидроксида алюминия, глюкан, сульфат декстрана, оксид железа, альгинат натрия, бакто-адъювант, определенные синтетические полимеры, такие как полиаминокислоты и сополимеры аминокислот, блок-сополимер (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), адъювант AMPHIGEN®, сапонин, Quil А или другие фракции сапонина, монофосфориллипид А и Avridine липид-аминный адъювант (N,N-диоктадецил-N',N'-бис(2-гидроксиэтил)пропандиамин), "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga.), парафиновое масло, адъювантная система RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), мурамилдипептид и тому подобные.
Неограничивающие примеры эмульсий масло-в-воде, используемых в вакцине согласно изобретению включают модифицированные SEAM62 и SEAM 1/2 препараты. Модифицированный SEAM62 представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую 5% (об./об.) сквалена (Sigma), 1% (об./об.) SPAN® 85 детергента (ICI Surfactants), 0,7% (об./об.) TWEEN® 80 детергента (ICI Surfactants), 2,5% (об./об.) этанола, 200 мкг/мл Quil А, 100 мкг/мл холестерина и 0,5% (об./об.) лецитина. Модифицированные SEAM 1/2 представляет собой эмульсию масло-в-воде, содержащую 5% (об./об.) сквалена, 1% (об./об.) SPAN® 85 детергента, 0,7% (об./об.) детергента Tween 80, 2,5% (об./об.) этанола, 100 мкг/мл Quil А и 50 мкг/мл холестерина.
Другой пример адъюванта, используемого в композициях согласно изобретению, представляет собой SP-масло. Как используется в описании и формуле изобретения, термин "SP масло" обозначает масляную эмульсию, содержащую полиоксиэтилен-полиоксипропиленовый блок-сополимер, сквален, полиоксиэтиленсорбитана моноолеат и буферный солевой раствор. Полиоксиэтилен-полиоксипропиленовые блок-сополимеры представляют собой поверхностно-активные вещества, которые помогают суспендированию твердых и жидких компонентов. Данные поверхностно-активные вещества являются коммерчески доступными как полимеры под торговым названием Pluronic®. Предпочтительное поверхностно-активное вещество представляет собой полоксамер 401, который коммерчески доступный под торговым названием Pluronic® L-121. Как правило, SP-масляная эмульсия представляет собой иммуностимулирующую адъювантную смесь, которая будет содержать от приблизительно 1 до 3% об./об. блок-сополимера, от приблизительно 2 до 6% об./об. сквалена, более конкретно от приблизительно 3 до 6% сквалена и от приблизительно 0,1 до 0,5% об./об. полиоксиэтиленсорбитана моноолеат, где оставшуюся часть составляет буферный солевой раствор. В одном варианте осуществления SP-масляная эмульсия присутствует в конечной композиции композиция в об./об. количествах от приблизительно 1% до 25%, предпочтительно от приблизительно 2% до 15%, более предпочтительно от приблизительно 5% до 12% об./об.
Еще другой пример приемлемого адъюванта для применения в композициях согласно изобретению представляет собой адъювант AMPHIGEN™, который состоит из обезжиренного лецитина, растворенного в масле, как правило, светлом жидком парафине.
Другие примеры адъювантов, используемых в композициях согласно изобретению, представляют собой следующие запатентованные адъюванты: MicrosolDiluvac Forte® двойная эмульсионная адъювантная система, адъювант Emunade и адъювант Xsolve. Адъюванты как Emunade, так и Xsolve представляют собой эмульсии светлого минерального масла в воде, но Emunade также содержит гидроксид алюминия и d,l-α- токоферола ацетат является частью адъюванта XSolve. Еще одним примером приемлемого адъюванта для применения в композициях согласно изобретению является адъювант ImpranFLEX™ (адъювант вода-в-масле). Еще одним примером приемлемого адъюванта является адъювант на основе карбомера (Carbopol®). Предпочтительные адъюванты Carbopol® включают полимер Carbopol® 934 и полимер Carbopol® 941.
В одном варианте осуществления адъювант или адъювантную смесь добавляют в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу. В другом варианте осуществления адъювант/адъювантную смесь добавляют в количестве от приблизительно 200 мкг до приблизительно 5 мг на дозу. В еще другом варианте осуществления адъювант/адъювантную смесь добавляют в количестве от приблизительно 300 мкг до приблизительно 1 мг/дозу.
Адъювант или адъювантная смесь, как правило, присутствует в вакцинной композиции согласно изобретению в об./об. количествах от приблизительно 1% до 25%, предпочтительно от приблизительно 2% до 15%, более предпочтительно от приблизительно 5% до 12% об./об.
Другие "иммуномодуляторы", которые могут быть включены в вакцину, включают, например, один или больше интерлейкинов, интерферонов или других известных цитокинов. В одном варианте осуществления адъювант может быть производным циклодекстрина или полианионным полимером, таким как те, которые описаны в патентах США №№6165995 и 6610310 соответственно.
Представленное изобретение также предусматривает способ иммунизации свиньи против дивергентного штамма PCV2b, где способ включает введение свинье композиции в соответствии с представленным изобретением, как описано выше. Данная композиция для введения включает PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, где ORF2 полипептид включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. Как описано выше, данный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид может дополнительно включать, по меньшей мере, один остаток, выбранный из следующих: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцина (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления композиция для введения включает вирус, содержащий и/или экспрессирующий PCV2b дивергентный ORF2 полипептид. В другом варианте осуществления композиция для введения включает выделенный рекомбинантный PCV2b ORF2 полипептид.
В одном варианте осуществления способ согласно представленному изобретению, по которому композицию вводят внутримышечно, интрадермально, трансдермально, подкожно или перорально. В другом варианте осуществления композицию вводят одной дозой. В еще другом варианте осуществления композицию вводят двумя дозами.
В следующем варианте осуществления композицию вводят свиньям, которые имеют материнские антитела против PCV2.
В одном варианте осуществления композицию вводят свиньям в возрасте 3 недели или старше.
Вакцинные композиции в соответствии с представленным изобретением могут вводить в дозах и способами хорошо известными квалифицированному специалисту в области медицины и ветеринарии, принимая во внимание такие факторы, как возраст, пол, массу, вид и состояние животного-реципиента и способ введения. Способ введения может быть чрескожным, посредством введения через слизистую оболочку (например, пероральный, назальный, анальный, вагинальный) или парентеральным путем (интрадермальный, трансдермальный, внутримышечный, подкожный, внутривенный, или внутрибрюшинный). Вакцинные композиции в соответствии с представленным изобретением могут вводиться самостоятельно, или могут совместно вводиться или последовательно вводиться вместе с другими лечениями или терапиями. Формы введение могут включать суспензии, сиропы или эликсиры и препараты для парентерального, подкожного, интрадермального, внутримышечного или внутривенного введения (например, инъекционного введения), такие как стерильные суспензии или эмульсии. Вакцинные композиции в соответствии с представленным изобретением могут быть введены как спреи, или смешанными с едой и/или водой, или доставлены в смеси с приемлемым носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильная вода, физиологический солевой раствор, глюкоза и тому подобные. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рН буферные агенты, адъюванты, гелеобразующие агенты или добавки повышающие вязкость, консерванты, ароматизирующие агенты, красители и тому подобные, в зависимости от способа введения и желаемого препарата.
Представленное изобретение, кроме того, предусматривает набор. Данный набор включает бутылочку, содержащую вакцинную композицию в соответствии с представленным изобретением для защиты свиней против высоковирулентного дивергентного штамма цирковируса свиней типа 2b (PCV2b). Данная вакцинная композиция включает PCV2b дивергентный ORF2 полипептид, где ORF2 полипептид включает лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1. Как описано выше, данный PCV2b дивергентный ORF2 полипептид может дополнительно включать, по меньшей мере, один остаток, выбранный из следующих: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцина (I) в остатке 215, в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
В одном варианте осуществления набора вакцинная композиция находится в форме вируса, содержащего и/или экспрессирующего PCV2b дивергентный ORF2 полипептид. В другом варианте осуществления набора вакцинная композиция находится в форме выделенного рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 полипептида.
В одном варианте осуществления набора согласно представленному изобретению вакцинная композиция в бутылочке обеспечивается как готовая к применению жидкая композиция. В другом варианте осуществления набора вакцинная композиция в бутылочке обеспечивается в лиофилизированной форме. В следующем варианте осуществления набор может включать разбавитель. В еще другом варианте осуществления набор может дополнительно включать руководство пользователя, которое содержит информацию касательно введения вакцинной композиции.
Другой аспект представленного изобретения предусматривает способы получения вакцинной композиции, которая находится в форме инактивированного химерного вируса, где химерный вирус включает инактивированный рекомбинантный цирковирус свиней типа 1, который экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид. Химерный цирковирус свиней и способы его получения описаны в WO 03/049703 А2 и также в патентах США №№7279166 и 7575752. Способы продуцирования химерного цирковируса свиней, включая инактивированный PCV1, который экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид описаны в примере 1 ниже. В одном варианте осуществления конечную композицию получают путем смешивания инактивированного cPCV1-2b вируса с приемлемым адъювантом и/или другим фармацевтически приемлемым носителем.
Следующий аспект представленного изобретения предусматривает способы получения вакцинной композиции, которая находится в форме инактивированного, PCV2b дивергентного целого вируса, который экспрессирует PCV2b дивергентный ORF2 полипептид. Такие способы описаны в примере 3 ниже. В одном варианте осуществления конечную композицию получают путем смешивания инактивированного PCV2B-DIV-MUT вируса с приемлемым адъювантом и/или другим фармацевтически приемлемым носителем.
Еще один аспект представленного изобретения предусматривает способы продуцирования рекомбинантного PCV2 дивергентного ORF2 белка, i) путем обеспечивания инфицирования чувствительных клеток в культуре рекомбинантным вирусным вектором, содержащим PCV2 дивергентный ORF2 кодирующий последовательности ДНК, где ORF2 белок экспрессируется рекомбинантным вирусным вектором, и ii) после этого выделение ORF2 белка в супернатанте. Как правило, высокие количества PCV2 дивергентного ORF2 белка может быть выделено в супернатант. Высокие количества PCV2 дивергентного ORF2 означает больше чем приблизительно 20 мкг/мл супернатанта, предпочтительно больше чем приблизительно 25 мкг/мл, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 30 мкг/мл, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 40 мкг/мл, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 50 мкг/мл, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 60 мкг/мл, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 80 мкг/мл, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 100 мкг/мл, еще более предпочтительно больше чем приблизительно 150 мкг/мл, наиболее предпочтительно больше чем приблизительно 190 мкг/мл.
Предпочтительные клеточные культуры имеют число клеток приблизительно 0,3-2,0×106 клеток/мл, более предпочтительно приблизительно 0,35-1,9×106 клеток/мл, еще более предпочтительно приблизительно 0,4-1,8×106 клеток/мл, еще более предпочтительно приблизительно 0,45-1,7×106 клеток/мл и наиболее предпочтительно приблизительно 0,5-1,5×106 клеток/мл. Предпочтительные клетки могут быть определены квалифицированным специалистом в данной области. Предпочтительные клетки представляют собой те, которые чувствительны к инфицированию соответствующим рекомбинантным вирусным вектором, содержащим PCV2 дивергентную ORF2 ДНК и экспрессирующий PCV2 дивергентный ORF2 белок. Предпочтительно клетки представляют собой клетки насекомого и более предпочтительно они включают клетки насекомого, продаваемые под торговым названием клетки насекомого Sf+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, Conn.).
Соответствующие питательные среды также могут быть определены квалифицированным специалистом в данной области, где предпочтительными питательными средами являются не содержащие сыворотки среды клеток насекомых, такие как Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, Kans.) и тому подобные. Предпочтительные вирусные векторы включают бакуловирус, такой как BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.), в частности, если продуцирующие клетки являются клетками насекомых. Хотя система экспрессии бакуловируса является предпочтительной, квалифицированному специалисту в данной области следует понимать, что другие системы экспрессии будут работать для целей представленного изобретения, а именно экспрессии PCV2 дивергентного ORF2 в супернатанте клеточной культуры. Такие другие системы экспрессии могут требовать использования сигнальной последовательности для того, чтобы вызвать экспрессию ORF2 в средах. Однако, когда ORF2 продуцируется системой экспрессии бакуловируса, тогда, как правило, не требуется какой-либо сигнальной последовательности или дополнительной модификации для того, чтобы вызвать экспрессию ORF2 в средах. Считается, что данный белок независимо может образовывать вирусоподобные частицы (Journal of General Virology 2000, Vol. 81, pp. 2281-2287), и секретироваться в культуральном супернатанте. Рекомбинантный вирусный вектор, содержащий PCV2 дивергентные ORF2 ДНК последовательности, предпочтительно имеет множественность заражения (MOI) приблизительно 0,03-1,5, более предпочтительно приблизительно 0,05-1,3, еще более предпочтительно приблизительно 0,09-1,1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,1-1,0, когда для инфицирования используются чувствительные клетки. Предпочтительно MOI, как указано выше, касается одного мл культуральной жидкости клеток. Предпочтительно способ, описанный в данном документе включает инфицирование 0,35-1,9×106 клеток/мл, еще более предпочтительно приблизительно 0,4-1,8×106 клеток/мл, еще более предпочтительно приблизительно 0,45-1,7×106 клеток/мл и наиболее предпочтительно приблизительно 0,5-1,5×106 клеток/мл рекомбинантным вирусным вектором, содержащим PCV2 дивергентную ORF2 ДНК и экспрессирующим PCV2 дивергентный ORF белок, имеющий MOI (множественность заражения) приблизительно 0,03-1,5, более предпочтительно приблизительно 0,05-1,3, еще более предпочтительно приблизительно 0,09-1,1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,1-1,0.
Инфицированные клетки затем инкубируют в течение периода вплоть до десяти дней, более предпочтительно от приблизительно двух дней до приблизительно десяти дней, еще более предпочтительно от приблизительно четырех дней до приблизительно девяти дней и наиболее предпочтительно от приблизительно пяти дней до приблизительно восьми дней. Предпочтительные условия инкубирования включают температуру приблизительно 22-32°С, более предпочтительно приблизительно 24-30°С, еще более предпочтительно приблизительно 25-29°С, еще более предпочтительно приблизительно 26-28°С и наиболее предпочтительно приблизительно 27°С. Предпочтительно клетки Sf+ наблюдаются после инокуляции для характеристики изменений, вызванных бакуловирусом. Такое наблюдение может включать контролирование тенденций плотности клеток и снижение жизнеспособности в период после инфицирования. Пик вирусного титра, как правило, наблюдается через 3-5 дней после инфицирования, и пик высвобождения ORF2 из клеток в супернатанте, как правило, получают с 5 по 8 день, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до меньше чем 10%.
Процесс выделение предпочтительно начинается с отделения клеточного дебриса от экспрессированного PCV2 дивергентного ORF2 полипептида в средах посредством стадии отделения. Предпочтительные стадии отделения включают фильтрацию, центрифугирование со скоростью вплоть до приблизительно 20000×g, непрерывное центрифугирование потока, хроматографическое разделение с использованием ионного обмена или гель-фильтрации, и традиционные способы иммуноаффинности. Данные способы известны квалифицированному специалисту в данной области (например, Harris and Angel (eds.), Protein purification methods--a practical approach, IRL press Oxford 1995). Предпочтительные способы фильтрации включают тупиковую микрофильтрацию и фильтрацию тангенциального потока (или поперечного потока), включая фильтрацию через полые волокна. Из них предпочтительной является тупиковая микрофильтрация. Предпочтительные размеры пор для тупиковой микрофильтрации составляют приблизительно 0,30-1,35 мкм, более предпочтительно приблизительно 0,35-1,25 мкм, еще более предпочтительно приблизительно 0,40-1,10 мкм и наиболее предпочтительно приблизительно 0,45-1,0 мкм.
Для выделения рекомбинантного PCV2 дивергентного ORF2 полипептида, который будут использовать в иммуногенной или иммунологической композиции, такой как вакцина, включение стадии инактивации является предпочтительным для того, чтобы инактивировать вирусный вектор. Предпочтительно данную инактивацию выполняют непосредственно перед или сразу после стадии фильтрации, где после стадии фильтрации является предпочтительным временем для инактивации. Какой-либо традиционный способ инактивации может быть использованы для целей представленного изобретения. Таким образом, инактивацию могут проводить с помощью химических и/или физических обработок. В предпочтительных формах определяется объем собранных жидкостей, и температуру доводят до приблизительно 32-42°С, более предпочтительно приблизительно 34-40°С и наиболее предпочтительно приблизительно 35-39°С. Предпочтительные способы инактивации включают добавление циклизованного бинарного этиленимина (BEI), предпочтительно в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 10 мМ, еще более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 8 мМ, еще более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 7 мМ, наиболее предпочтительно от приблизительно 5 мМ. Например инактивация включает добавление раствора 2-бромэтиленамина гидробромида, предпочтительно приблизительно 0,4 М, который был циклизован до 0,2 M бинарного этиленимина (BEI) в 0,3N NaOH, к жидкостям, чтобы получить конечную концентрацию приблизительно 5 мМ BEI. Предпочтительно такие жидкости затем непрерывно перемешивают в течение 72-96 часов, и инактивированные собираемые жидкости могут храниться в замороженном состоянии при -40°С или ниже, или приблизительно 1-7°С. После того как инактивация завершена, раствор тиосульфата натрия, предпочтительно 1,0 М, добавляют для нейтрализации какого-либо остаточного BEI. Предпочтительно тиосульфат натрия добавляют в эквивалентном количестве по сравнению с BEI, который добавляют перед инактивацией. Например, в случае когда BEI добавляют до конечной концентрации 5 мМ, 1,0 M раствор тиосульфата натрия добавляют для того, чтобы получить минимальную конечную концентрацию 5 мМ для нейтрализации какого-либо остаточного BEI.
Еще один аспект представленного изобретения касается способа получения композиции, содержащий PCV2 дивергентный ORF2 белок и инактивированный вирусный вектор. Данный способ включает стадии: i) клонирование амплифицированного PCV2 дивергентного ORF2 гена в вектор переноса; ii) трансфектирование части вектора переноса, содержащей рекомбинантный PCV2 дивергентный ORF2 ген в вирусе; iii) инфицирование клетки в средах с трансфектированным вирусным вектором; iv) инициирование трансфектированного вирусного вектора для экспрессии PCV2 дивергентного ORF2 рекомбинантного белка из PCV2 дивергентного ORF2 гена; v) отделение клеток от супернатанта; vi) выделение экспрессированного PCV2 дивергентного ORF2 белка из супернатанта; и vii) инактивирование рекомбинантного вирусного вектора. Предпочтительно рекомбинантный вирусный вектор представляет собой бакуловирус, содержащий ORF2 ДНК кодирующие последовательности, и клетки представляют собой клетки Sf+. Предпочтительные стадии отделения описаны выше, наиболее предпочтительно - это стадия фильтрации. Предпочтительные стадии инактивации описаны выше. Предпочтительно инактивацию выполняют при приблизительно 35-39°С и в присутствии от 2 до 8 мМ BEI, еще более предпочтительно в присутствии приблизительно 5 мМ BEI. Предпочтительно инактивацию выполняют в течение, по меньшей мере, 24 часов, еще более предпочтительно в течение 24-72 часов.
В соответствии со следующим аспектом способ получения композиции, содержащей PCV2 дивергентный ORF2 белок и инактивированный вирусный вектор, как описано выше, также включает стадию нейтрализации после стадии vii). Данная стадия viii) включает добавление эквивалентного количества агента, который нейтрализует агент инактивации в растворе. Предпочтительно, если агент инактивации представляет собой BEI, предпочтительным является добавление тиосульфата натрия в эквивалентном количестве. Таким образом, в соответствии с со следующим аспектом стадия viii) включает добавление раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 10 мМ, еще более предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 8 мМ, еще более предпочтительно от приблизительно 3 до приблизительно 7 мМ, наиболее предпочтительно от приблизительно 5 мМ, когда агентом инактивации является BEI.
В другом аспекте представленного изобретения предусматривается способ получения композиции, предпочтительно антигенной композиции, такой как, например, вакцина, для вызова иммунного ответа против PCV2 дивергентного штамма. Как правило, данный способ включает стадии трансфектирования конструкта в вирус, где конструкт содержит i) рекомбинантную ДНК из ORF2 PCV2 дивергентного штамма, ii) инфицирование клетки в питательных средах трансфектированным вирусом, iii) индуцирование вируса для экспрессии рекомбинантного белка из PCV2 дивергентного ORF2, iv) выделение экспрессированного ORF2 белка из супернатанта, v) и получение композиции путем смешивания выделенного белка с приемлемым адъювантом и/или другим фармацевтически приемлемым носителем.
Следующие примеры представляют предпочтительные материалы и процедуры в соответствии с представленным изобретением. Однако следует понимать, что данные примеры приведены только в качестве иллюстрации и ничто в них не должно рассматриваться как ограничение общего объема изобретения.
Пример 1: Способы продуцирования химерного цирковируса свиней (cPCV)1-2
cPCV1-2 конструируют путем клонирования иммуногенного капсидного гена патогенного дивергентного штамма цирковируса свиней типа 2b (названного "PCV2B-DIV-MUT") в геномном скелете непатогенного цирковируса свиней типа 1 (PCV1). Способ конструирования клона химерной ДНК описывается, например, в патенте США №7279166, который включен в данный документ в виде ссылки в полном своем объеме. Исходный инфекционный раствор химерного вируса используют для инфицирования клеток свиной почки (PK)-15, выращенных в минимально обогащенной среде (MEM), дополненной 0,05% лактальбумингидрозилата (LAH), 30 мкг/мл гентамицина сульфата и 5% фетальной телячьей сыворотки. Полученный в результате cPCV1-2 инфицированные PK-15 клетки дополнительно увеличивают в объеме путем серийного пассирования более четырех раз с использованием такой же питательной среды, за исключением с 2-3% фетальной телячьей сыворотки. Пятое пассирование замораживают, размораживают и фильтруют и полученные в результате лизаты используют для приготовления предварительного посевного материала и дальнейшего посевного материала.
Среда, которая используется для продуцирования вирусного посевного материала, является такой же, которую используют при получении вирусного исходного раствора. Для питательной среды, MEM, OptiMEM или эквивалент представляет собой базовую среду, которая может быть использована для посева клеточной линии PK-15 для выращивания. Питательная среда может быть дополнена вплоть до 10% сывороткой крупного рогатого скота, вплоть до 0,5% лактальбумингидрозилатом, вплоть до 0,5% бычьим сывороточным альбумином и вплоть до 30 мкг/мл гентамицином. Для среды распространения вируса используют MEM, OptiMEM или эквивалент. Среда распространения вируса может быть дополнена вплоть до 0,5% лактальбумингидрозилатом, вплоть до 2% сывороткой крупного рогатого скота, вплоть до 0,5% бычьим сывороточным альбумином и вплоть до 30 мкг/мл гентамицином. Вплоть до 5 г/л глюкозы и вплоть до 5 ммоль/л L-глутамина могут быть добавлены в питательную среду и/или среду распространения вируса по мере необходимости для поддержания клеток.
Исходный вакцинный вирус cPCV1-2 добавляют в клеточную суспензию PK-15 клеток и адсорбируют в течение вплоть до 3 часов. Посевной вирус разбавляют в базовой питательной среде, чтобы получить множественность заражения (MOI) от 0,1 до 0,2.
Культуры клеток PK-15 сначала инокулируют рабочим посевным вирусом во время посева клеток, или когда клетки достигают приблизительно 20%-50% конфлюентности. Данное исходное пассирование может быть названо как "Одностадийный способ инфицирования" для продуцирования исходного раствора антигена, или, кроме того, может использоваться для серийных пассирований. Для серийных пассирований, cPCV1-2 инфицированные клетки PK-15 дополнительно увеличивают в объеме вплоть до 7-го пассирования путем последовательных делений в соотношении 1:5-20 для размножения вируса. Культуральная среда, содержащая суспензию инфицированных клеток с предыдущего пассирования, может служить в качестве посевного материала для последующего пассирования. Инфицированные клетки cPCV1-2 инкубируют в течение от трех (3) до 14 дней для каждого пассирования при 36±2°С, когда клетки достигают ≥90% конфлюентности. Вирус cPCV1-2 вызывает наблюдаемые цитопатические изменения во время репликации вируса. В период сбора, наблюдается округления клеток и значительное количество флоатирующего дебриса. Кроме того, наблюдаются культуры, которые служат визуальным доказательством бактериальной или грибковой контаминации. Время инкубации между сборами для cPCV антигена приведены в таблице 1 ниже:
Культуральные жидкости cPCV1-2 собирают в стерильные емкости и отбирают образцы для микоплазменного загрязнения с использованием известных способов. Несколько сборов могут проводить из роллерного флакона, биореакторов и перфузионных емкостей.
Перед инактивацией собранного cPCV1-2 вируса одну или больше партий антигена могут концентрировать (например, вплоть до 60Х) с помощью ультрафильтрации. Концентраты могут промывать сбалансированным солевым раствором для снижения сывороточных белков.
Сейчас будет описан способ инактивации, ослабления или детоксификации вируса cPCV1-2. После концентрирования cPCV антигена β-пропиолактон (BPL) добавляют к объединенному cPCV1-2 вирусному материалу, чтобы получить приблизительную концентрацию 0,2% об./об. Объединенные вирусные жидкости затем перемешивают в течение минимум 15 минут и затем инактивирующие объемные антигенные жидкости переносят во вторую стерильную емкость. Перенесенные антигенные жидкости выдерживают при температуре 2-7°С при постоянном перемешивании в течение как минимум 24 часов. После как минимум 24 часов второе добавление 0,2% об./об. BPL добавляют к объединенной суспензии. Содержимое затем перемешивают, переносят в третью емкость и выдерживают при температуре 2-7°С при постоянном перемешивании в течение дополнительного времени не меньше чем 84 часов. Как правило, общее время инактивации составляет не меньше чем 108 часов и не больше чем 120 часов. Способ инактивации представлен в таблице 2 ниже.
Инактивацию завершают путем добавления конечной концентрации не больше чем 0,1 М раствор тиосульфата натрия. рН исходного раствора инактивированного антигена регулируют до приблизительно 6,8, используя NaOH или HCl. После инактивации типичный образец берут из пула и исследуют касательно завершения инактивации. Инактивированный антигеный продут cPCV1-2 стандартизируют до соответствия целевого параметра больше чем 1,0 RP, как измерено с помощью эффективного ИФА. В одном варианте осуществления конечную композицию получают за счет смешивания инактивированного cPCV1-2b вируса с приемлемым адъювантом и/или другим фармацевтически приемлемым носителем.
Пример 2: Способы получения рекомбинантного PCV2b дивергентного капсидного белка
Получение субъединичной вакцины является результатом двухстадийного процесса: во-первых, продуцирование ORF2 субъединичного антигена в системе экспрессии бакуловируса, и, во-вторых, формулирование/изготовление конечного продукта. Для начальных стадий (конструирование рекомбинантного бакуловируса и продуцирование ORF2 антигена) основной используемый технологическиц процесс сейчас будет описан. Систему экспрессии бакуловируса используют для экспрессии ORF2 гена из PCV2b дивергентного штамма. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий PCV2 ORF2 ген, формируется следующим образом: вирусный ДНК выделяют из PK-15 клеток, инфицированных дивергентным штаммом PCV2b, определенных в данном документе как "PCV2B-DIV-MUT". ORF2 ген из данного PCV2b дивергентного штамма ПЦР амплифицируют, чтобы содержать 5' последовательность Козака (ccgccatg) и 3' EcoR1 сайт (gaattc), и клонируют в pGEM-T-Easy вектор (Promega, Madison, Wis.). Затем его последовательно усекают и субклонируют в вектор переноса pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.). pVL1392 плазмиду, содержащую PCV2b дивергентный ORF2 ген затем сотрансфектируют с BaculoGold®. (BD Biosciences Pharmingen) бакуловирусной ДНК в клетках насекомого Spodopterafrugiperda (Sf+) (Protein Sciences, Meriden, Conn.), чтобы генерировать рекомбинантный бакуловирус, содержащий PCV2b дивергентный ORF2 ген. Рекомбинантный бакуловирус, содержащий данный PCV2b дивергентный ORF2 ген, представляет собой очищенную бляшку, и исходный вакцинный вирус (MSV) распространяется на клеточную линию SF+, отбирали аликвоты и хранили при -70°С. MSV положительно идентифицируют как PCV2 ORF2 бакуловирус по ПЦР-ПДРФ с использованием конкретных праймеров бакуловируса. Клетки насекомых инфицировали PCV2 ORF2 бакуловирусом, чтобы сгенерировать MSV или рабочий посевной вирус, экспрессирующий PCV2 ORF2 антиген. Экспрессия ORF2 гена PCV2B-DIV-MUT подтверждается иммуноанализом с использованием гипериммунной сыворотки, которая возникает против PCV2B-DIV-MUT у кроликов, или моноклональными антителами, в косвенном анализе флуоресцентных антител. Альтернативно экспрессия ORF2 гена из PCV2B-DIV-MUT подтверждается иммуноанализом с использованием антитела, которое возникает против классического PCV2a или PCV2b с дивергентным штаммом PCV2b. Дополнительно, идентичность PCV2b дивергентного ORF2 бакуловируса подтверждается N-терминальным аминокислотным секвенированием. PCV2b дивергентный ORF2 бакуловирус MSV также исследуется на чистоту в соответствии с 9 C.F.R. 113.27 (с), 113.28 и 113.55.
Рекомбинантный вирусный вектор, содержащий PCV2 ORF2 ДНК последовательности, имеет предпочтительную множественность заражения (MOI) приблизительно 0,03-1,5, более предпочтительно приблизительно 0,05-1,3, еще более предпочтительно приблизительно 0,09-1,1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,1-1,0, когда для инфицирования использовали чувствительные клетки. Предпочтительно способ, описанный в данном документе, включает инфицирование 0,35-1,9×106 клеток/мл, еще более предпочтительно приблизительно 0,4-1,8×106 клеток/мл, еще более предпочтительно приблизительно 0,45-1,7×106 клеток/мл и наиболее предпочтительно приблизительно 0,5-1,5×106 клеток/мл рекомбинантным вирусным вектором, содержащим PCV2 ORF2 ДНК и экспрессирующим PCV2 ORF белок, имеющий MOI (множественность заражения) приблизительно 0,03-1,5, более предпочтительно приблизительно 0,05-1,3, еще более предпочтительно приблизительно 0,09-1,1 и наиболее предпочтительно приблизительно 0,1-1,0.
Инфицированные клетки затем инкубируют в течение периода вплоть до десяти дней, более предпочтительно от приблизительно двух дней до приблизительно десяти дней, еще более предпочтительно от приблизительно четырех дней до приблизительно девяти дней и наиболее предпочтительно от приблизительно пяти дней до приблизительно восьми дней. Предпочтительные условия инкубирования включают температуру приблизительно 22-32°С, более предпочтительно приблизительно 24-30°С, еще более предпочтительно приблизительно 25-29°С, еще более предпочтительно приблизительно 26-28°С и наиболее предпочтительно приблизительно 27°С. Предпочтительно клетки Sf+ наблюдаются после инокулирования касательно характерных изменений, вызванных бакуловирусом. Такие наблюдения могут включать контроль тенденции плотности клеток и снижение жизнеспособности в период после инфицирования. Пик вирусного титра, как правило, наблюдается через 3-5 дней после инфицирования, и пик высвобождения ORF2 из клеток в супернатант, как правило, получают на 5-8 день, и/или когда жизнеспособность клеток снижается до меньше чем 10%.
В одном варианте осуществления 1000 мл роллерную колбу засевают приблизительно 1,0×106 Sf+ клеток/мл в 300 мл среды Excell 420. Затем колбу инкубируют при 27°С и перемешивают на 100 об/мин. Затем колбу засевают PCV2b дивергентным ORF2/Bac (рекомбинантным бакуловирусом, содержащим PCV2b дивергентный ORF2 ген) посевным вирусом с 0,1 MOI после 24 часов инкубирования.
Затем колбу инкубируют при 27°С в течение всего 6 дней. После инкубирования содержимое колбы центрифугируют и собирают полученный в результате супернатанте, микрофильтруют через мембрану с размером пор 0,45-1,0 мкм и затем инактивируют. Супернатант инактивируют поднятием его температуры до 37±2°С и добавлением 10 мМ бинарного этиленимина (BEI) в супернатант. Затем супернатант непрерывно перемешивают в течение 48 часов. Добавляют 1,0 M раствор тиосульфата натрия для получения конечной минимальной концентрация 5 мМ, чтобы нейтрализовать какой-либо остаточный BEI. Затем количественно определяют количество ORF2 в нейтрализованном супернатанте, используя количественный аналитический способ ИФА, такой как тот, что описан в примере 1 патента США №7700285 Eichmeyer et al. Детектированное антитело представляет собой моноклональное антитело к PCV2b дивергентному ORF2 капсидному белку.
Представленное изобретение является масштабируемым от небольших масштабов продуцирования рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2 до крупномасштабного производства рекомбинантного PCV2b дивергентного ORF2.
Вторая фаза получения вакцины представляет собой формулирование/производство конечного продукта. Стратегия смешивания основывается на: а) фиксированное содержание антигена на дозу, и b) фиксированное количество, по меньшей мере, одного адъюванта. В одном варианте осуществления фармацевтическая форма конечного продукта является эквивалентной эмульсии масло-в-воде. Для того чтобы получить окончательную вакцину, адъювант добавляют к антигенной фракции и перемешивают до тех пор пока однородная эмульсия не будет получена. Доказывается удовлетворительная однородность. Для того чтобы гарантировать, что партия вакцины приведет к заявленной эффективности, ее относительную эффективность определяют с помощью анализа in vivo, который был валидирован. На основании проведенного анализа, исследование эффективности способно обнаруживать субэффективные партии.
Пример 3: Способы получения инактивированного PCV2b дивергентного полного вируса
Инфекционный исходный раствор PCV2b дивергентного вируса:PCV2B-DIV-MUT используют для инфицирования клеток свиной почки (РК)-15, выращенных в минимально обогащенной среде (MEM), дополненной 0,05% лактальбумингидрозилатом (LAH), 30 мкг/мл гентамицина сульфатом и 5% фетальной бычьей сывороткой. Полученный в результате PCV2B-DIV-MUT, инфицированный PK-15 клетками дополнительно увеличивают в объеме путем серийного пассирования более четырех раз, используя такую же питательную среду, за исключением 0,5-3% фетальной бычьей сыворотки. Пятое пассирование замораживают, размораживают и фильтруют и полученные в результате лизаты используют для приготовления предварительного посевного материала и дальнейшего посевного материала.
Среда, которая используется для продуцирования вирусного посевного материала, является такой же, которую используют при получении вирусного исходного раствора. Для питательной среды MEM OptiMEM или эквивалент представляет собой базовую среду, которая может быть использована для посева клеточной линии PK-15 для выращивания. Питательная среда может быть дополнена вплоть до 10% сывороткой крупного рогатого скота, вплоть до 0,5% лактальбумингидрозилатом, вплоть до 0,5% бычьим сывороточным альбумином и вплоть до 30 мкг/мл гентамицином. Для среды распространения вируса используют MEM, OptiMEM или эквивалент. Среда распространения вируса может быть дополнена вплоть до 0,5% лактальбумингидрозилатом, вплоть до 2% сывороткой крупного рогатого скота, вплоть до 0,5% бычьим сывороточным альбумином и вплоть до 30 мкг/мл гентамицином. Вплоть до 5 г/л глюкозы и вплоть до 5 ммоль/л L-глутамина могут быть добавлены в питательную среду и/или среду распространения вируса по мере необходимости для поддержания клеток.
Исходный вакцинный вирус PCV2B-DIV-MUT исходный вакцинный вирус добавляют в клеточную суспензию PK-15 клеток и адсорбируют в течение вплоть до 3 часов. Посевной вирус разбавляют в базовой питательной среде, чтобы получить множественность заражения (MOI) от 0,1 до 0,2.
Культуры клеток PK-15 сначала инокулируют рабочим посевным вирусом во время посева клеток или когда клетки достигают приблизительно 20%-50% конфлюентности. Данное исходное пассирование может быть названо как "Одностадийный способ инфицирования" для продуцирования исходного раствора антигена, или, кроме того, может использоваться для серийных пассирований. Для серийных пассирований инфицированные PCV2B-DIV-MUTPK-15 клетки дополнительно увеличивают в объеме вплоть до 7-го пассирования путем последовательных делений в соотношении 1:5-20 для размножения вируса. Культуральная среда, содержащая суспензию инфицированных клеток с предыдущего пассирования, может служить в качестве посевного материала для последующего пассирования. Инфицированные клетки PCV2B-DIV-MUT инкубируют в течение от трех (3) до 14 дней для каждого пассирования при 36±2°С, когда клетки достигают ≥90% конфлюентности. PCV2B-DIV-MUT вирус может вызывать наблюдаемые цитопатические изменения во время репликации вируса. В период сбора наблюдается округления клеток и значительное количество флоатирующего дебриса. Кроме того, наблюдаются культуры, которые служат визуальным доказательством бактериальной или грибковой контаминации. Время инкубации между сборами для PCV2B-DIV-MUT антигена являются такими же, как приведены в таблице 1 выше.
Культуральные жидкости PCV2B-DIV-MUT собирают в стерильные емкости и отбирают образцы для микоплазменного загрязнения с использованием известных способов. Несколько сборов могут проводить из роллерного флакона, биореакторов и перфузионных емкостей.
Перед инактивацией собранного PCV2B-DIV-MUT вируса одну или больше партий антигена могут концентрировать (например, вплоть до 60Х) с помощью ультрафильтрации. Концентраты могут промывать сбалансированным солевым раствором для снижения сывороточных белков.
Способ инактивации, ослабления или детоксификации PCV2B-DIV-MUT вируса является таким же, как тот, что описан в примере 1 и таблице 2 выше. Инактивацию завершают добавлением конечной концентрации не больше чем 0,1 M раствор тиосульфата натрия. рН исходного раствора инактивированного антигена регулируют до приблизительно 6,8, используя NaOH или HCl. После инактивации типовой образец берут из пула и исследуют для завершения инактивации. Инактивированный PCV2B-DIV-MUT антигенный продукт стандартизируют до соответствия целевого параметра больше чем 1,0 RP, как измерено с помощью эффективного ИФА. В одном варианте осуществления конечную композицию получают за счет смешивания инактивированного PCV2B-DIV-MUT вируса с приемлемым адъювантом и/или другим фармацевтически приемлемым носителем.
Пример 4: Обоснование PCV2b принципа исследования
Цель исследования состояла в том, чтобы оценить PCV2b дивергентную вакцину-кандидата для гомологичной и гетерологичной защиты. Дизайн исследования приведен в таблице 3. IVP для Т04, Т08 и Т12 состоял из убитого PCV2b-дивергентного вируса, адъювантного 10% SP-масло. IVP для Т02, Т06 и Т10 состоял из убитого химерного PCV1:2a вируса, адъювантного 10% SP-масло. IVP для Т03, Т07 та Т11 состоял из убитого химерного PCV1:2b вируса, адъювантного 10% SP-масло.
Свиньи в возрасте 3-4 недели были вакцинированы в день 0. Единичная доза 2 мл предназначенной вакцины вводили внутримышечно (в.м.) в правую сторону шеи. Единичный 3 мл стерильный шприц с 1'' или ¾'' иглой использовали для каждой свиньи. Детальные сведения о вакцинации были записаны. Свиней наблюдали в течение 1 часа (±30 минут) после каждой вакцинации касательно ненормальных клинических признаков, включая, но не ограничиваются этим: вялость, затрудненное дыхание, рвота и нарушение координации. Какие-либо наблюдаемые клинические признаки были зафиксированы в общей медицинской форме о состоянии здоровья. Ветеринар был уведомлен следить за двумя свиньями, у которых присутствовали признаки общего плохого состояния и ухудшение здоровья. Этих животных гуманно подвергли эвтаназии.
Контрольное заражение проводили на 21 день, когда свиньи достигли возраста приблизительно 6-7 недель. Каждую свинью инокулировали общим объемом 3 мл соответствующего вируса контрольного заражения, предварительно разбавленного до 4,8-5,8 log10 TCID50 /мл, где 1 мл вводили интраназально (и.н.) в каждую ноздрю и 1 мл вводили внутримышечно (в.м.). Резервированную аликвоту вирусов контрольного заражения титровали после контрольного заражения, чтобы подтвердить фактическую дозу контрольного заражения.
Индивидуальные образцы крови (5-10 мл) собирали в пробирки для отделения сыворотки (SST) в 1 день (перед вакцинацией) и 7, 14, 20/21, 28, 35 и 42 день. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤ -65°С и затем исследовали касательно титров на PCV2 антитела с использованием ИФА и PCV2 виремии с использованием кПЦР.
Индивидуальные фекальные мазки также были взяты от каждой свиньи перед контрольным заражением (день 20/21) и еженедельно после контрольного заражения. Индивидуальные стерильные полиэфирные тампоны были использованы для сбора фекальных мазков и помещены в пробирку, содержащую 3 мл стерильной PBS среды. Мазки взбалтывали в течение 5 секунд в среде перед тем, как отбросить. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤ -65°С. Образцы фекальных мазков исследовали на выделение вируса, используя стандартные методики количественной ПЦР.
Во время некропсии трахеобронхиальная секция, брыжейка и поверхностные паховые лимфатические узлы и ткани миндалин также были собраны в двух экземплярах для каждой свиньи, индивидуально идентифицированы и фиксированы в 10% буферном формалине. Один набор был архивирован, тогда как другой был представлен для стандартного патоморфологического исследования на лимфоидное истощение (PCVAD) и гистиоцитарную замену. Вывод был записан как Да (+) или Нет (-). Считалось, что свинья имеет лимфоидное истощение или гистиоцитарную замену, если одна или несколько тканей были оценены "+". Кроме того, ткани также исследовали на PCV2 антиген с помощью IHC. Результаты регистрировали как 0 (отсутствие окрашивания) и 1-3 (разные уровни окрашивания). Балл 0 рассматривался как PCV2 IHC (-), и балл от 1 или выше рассматривался как PCV2 IHC (+). Свинья считалась IHC (+), если одна или больше тканей были IHC (+).
Первичные результаты представляли собой гомологичную и гетерологичные защиту кандидатной вакцины по сравнению с плацебо. Первичная переменная представляла собой виремии, и вторичные переменные представляли собой фекальные выделения и гистологические поражения.
Результаты показали, что перед контрольным заражением свиньи оставались отрицательными по PCV2 виремии и фекальным выделениям, как показано в таблицах 4 и 5. В течение всего исследования, однако все свиньи во всех группах лечения стали положительными в какой-то момент для PCV2, как определено с помощью количественной ПЦР касательно PCV2 виремии (таблица 4) и PCV2 фекальных выделений (таблица 5).
таблицах 4 и 5. В течение всего исследования, однако все свиньи во всех группах лечения стали положительными в какой-то момент для PCV2, как определено с помощью количественной ПЦР касательно PCV2 виремии (таблица 4) и PCV2 фекальных выделений (таблица 5).
Перед контрольным заражением титры, как измерено с помощью PCV2 ИФА, показали, что по методу наименьших квадратов (НК) титры всех лечебных групп были отрицательными на PCV2 антитела (Таблица 6). Считалось, что титры PCV2 ИФА антител >0,5 являются положительными на PCV2 антитела.
Обработка экспериментальной PCV2b дивергентной вакциной (Т04, Т08 и Т12) численно уменьшила PCV2 виремии (таблица 4) и фекальное выделение (таблица 5). Кроме того, это привело к уменьшению гистопатологичных поражений в большинстве точек времени по сравнению с плацебо, как продемонстрировано с помощью иммуногистохимической (IHC) оценки (таблица 7) и оценки лимфоидного истощения (таблица 8). После контрольного заражения наблюдался умеренный анамнестический ответ в титрах PCV2 ИФА антитела во всех группах контрольного заражения (таблица 6), потенциально предполагая, что доза вакцины антигена нуждалась в дальнейшей оптимизации. Несмотря на то что статистические сравнения были сделаны в этом исследовании, очевидно, что обработка PCV2b дивергентной вакциной обеспечивала защиту против PCV2a, PCV2b и PCV2b-Дивергентных штаммов контрольного заражения.
При оценке эффективности PCV2 вакцины, многими рассматривается, что виремия и лимфоидное истощение являются ключевыми параметрами для измерения. В данном исследовании важно отметить, что PCV2b дивергентная вакцина исполняла роль защиты численно лучше против PCV2b дивергентного контрольного заражения, чем это делали PCV2a или PCV2b вакцины.
Пример 5: Модель оптимизации исследования PCV2b контрольного заражения
Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить титрования материала PCV2b контрольного заражения и пути введения. Кроме того, предварительная оценка нового препарата PCV2b дивергентного контрольного заражения была проведена вместе с текущими валидированными моделями PCV2a и PCV2b контрольного заражения. Схема дизайна исследования показана в таблице 9.
Кроссбред свиньи возрастом приблизительно 6 недель в день 0 с низким антителом отрицательной сыворотки к PCV2 и не содержащий PCV2 виремии были помещены в назначенные загоны/комнаты в BSL-2 приспособлении с отдельными воздушными промежутками. Было 4 загона в каждой из трех комнат с 12 свиньями на загон. Свиньи оставались в присвоенных загонах на протяжении всего исследования. Свиньи имели неограниченный доступ к воде и немедикаментозный соответствующий возрасту полный рацион на протяжении всего исследования. Всем свиньям давалась возможность акклиматизироваться в течение как минимум трех дней.
Контрольное заражение проводили в день 0, когда возраст свиней составляет приблизительно 6 недель. Каждую свинью инокулировали общим количеством 3 мл соответствующего вируса контрольного заражения, предварительно разбавляли до 4,0-6,0±0,5 log10 TCID50 /мл, 2 мл вводили интраназально (и.н.) в каждую ноздрю и 1 мл внутримышечно (в.м.) или 3 мл в.м. в зависимости от группы обработки. Резервированную аликвоту вирусов контрольного заражения титровали после контрольного заражения, чтобы подтвердить фактическую дозу контрольного заражения.
Индивидуальные образцы крови (5-10 мл) собирали в пробирки для отделения сыворотки (SST) в день -21, день -1 (перед вакцинацией) и 7, 14 и 21 день. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤ -65°С. Сыворотку с дней -21, -1, 7, 14 и 21 исследовали касательно титров на PCV2 антитела с использованием ИФА и PCV2 виремии с использованием кПЦР.
Индивидуальные фекальные мазки также были взяты от каждой свиньи перед контрольным заражением (день-1) и еженедельного после контрольного заражения. Индивидуальные стерильные полиэфирные тампоны были использованы для сбора фекальных мазков и помещены в пробирку, содержащую 3 мл стерильной PBS среды. Мазки взбалтывали в течение 5 секунд в среде перед тем, как отбросить. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤ -65°С. Образцы фекальных мазков исследовали на выделение вируса, используя стандартные методики количественной ПЦР.
Во время некропсии трахеобронхиальная секция, брыжейка и поверхностные паховые лимфатические узлы и ткани миндалин также были собраны в двух экземплярах для каждой свиньи, индивидуально идентифицированы и фиксированы в 10% буферном формалине. Один набор был представлен для стандартного гистопатологического исследования на лимфоидное истощение (PCVAD) и гистиоцитарную замену. Вывод был записан как Да (+) или Нет (-). Считалось, что свинья имеет лимфоидное истощение или гистиоцитарную замену, если одна или несколько тканей были оценены "+". Кроме того, ткани также исследовали на PCV2 антиген с помощью IHC. Результаты регистрировали как О (отсутствие окрашивания) и 1-3 (разные уровни окрашивания). Балл 0 рассматривался как PCV2 IHC (-), и балл от 1 или выше рассматривался как PCV2 IHC (+). Свинья считалась IHC (+), если одна или больше тканей были IHC (+).
Из-за фактической сложности PCV эпидемиологии и чувствительности PCV2 кПЦР, вполне возможно, что некоторые свиньи могут стать виремичными перед контрольным заражением. Свиньи, которых исследовали перед контрольным заражением, могут быть удалены из исследования и могут быть исключены при анализе данных на основе выбора клинического спонсора.
Первичные результаты представляли собой PCV2b дивергентный изолят контрольного заражения, которое исследовали по сравнению с валидированными моделями для PCV2a и PCV2b.
Результаты
Животные, которым вводили PCV2b дивергентный изолят контрольного заражения, имели увеличение в титрах антител перед контрольным заражением до конца исследования по всем группам обработки. Группы неразбавленного контрольного заражения с последующей группой Т12 (разбавление 1:5, вводили и.н.) имели пик виремии через 14 дней после контрольного заражения с более чем 4 миллионами и 1 миллионом ДНК копии/мл соответственно. Пик PCV2 выделений в неразбавленном материале контрольного заражения составлял 754,114 ДНК копии/мл. Неразбавленная в.м./и.н. и только 1:5 и.н. в результате приводила к наибольшему количеству животных положительных касательно гистологических отклонений от нормы и PCV2 колонизации.
На основе данных, собранных из данного исследования оптимизации PCV2b контрольного заражения (данные не показаны), путь контрольного заражения и дозу изменялась на 3 мл интраназально. Изменение пути контрольного заражения и дозы, как полагают, уменьшает вероятность побочных эффектов, которые, как считается, являются вызванными внутримышечным введением и повышают общее принятие контрольного заражения.
Пример 6: Оценка двух кандидатов в вакцины против PCV2b контрольного заражения
Цель исследования состояла в том, чтобы оценить химерную PCV2b вакцину и PCV2b дивергентную вакцину, каждая представлена с низкой и высокой антигенной дозой, против PCV2b контрольное заражение. Дизайн исследования приведен в таблице 10. Плацебо (T01) представляло собой 10% SP-масло. IVP были следующими: Т02, убитая PCV1:PCV2b капсидная химера с низкой дозой (низкий cPCV2b), адъювантная 10% SP-масло; Т03, убитая PCV1:PCV2b капсидная химера с высокой дозой (высокий cPCV2b), адъювантная 10% SP-масло; Т04, убитая PCV2b-дивергентная вакцина с низкой дозой (низкий PCV2b DIV), адъювантная 10% SP-масло; Т05, убитая PCV2b-дивергентная вакцина с высокой дозой (высокий PCV2b DIV), адъювантная 10% SP-масло. Вакцины были получены с использованием 20× концентрированного антигена и затем сформулированы в вакцину с: 0,69% введенного антигена = низкая доза или 3,00% введенного антигена = высокая доза.
Свиньи в возрасте ~3 недель были вакцинированы в день 0. Администратор лечения вводил единичную дозу 2 мл предназначенной вакцины внутримышечно (в.м.) в правую сторону шеи. Единичный 3 мл стерильный шприц с 1'' или ¾'' иглой использовали для каждой свиньи. Детальные сведения о вакцинации были записаны. Свиней наблюдали в течение 1 часа (±30 минут) после каждой вакцинации касательно ненормальных клинических признаков, включая, но не ограничиваются этим: вялость, затрудненное дыхание, рвота и нарушение координации. Какие-либо наблюдаемые клинические признаки были зафиксированы в общей медицинской форме о состоянии здоровья. Ветеринар был уведомлен следить за свиньей(ями) с каким-либо из признаков, описанных выше.
Контрольное заражение проводили на 21 день, когда свиньи достигли возраста приблизительно 6 недель. Каждую свинью инокулировали общим объемом 3 мл интраназально (и.н.) культуры вирулентного PCV2b штамма, предварительно разбавленного до 4,8-5,8 log10 TCID50 /мл. Резервированную аликвоту вирусов контрольного заражения титровали после контрольного заражения, чтобы подтвердить фактическую дозу контрольного заражения.
Индивидуальные образцы крови (5-10 мл) собирали в пробирки для отделения сыворотки (SST) в 1 день - (перед вакцинацией) и 7, 14, 20/21, 28, 35 и 42 день. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤ -65°С. Позже их исследовали касательно титров на PCV2 антитела с использованием ИФА и PCV2 виремии с использованием кПЦР.
Индивидуальные фекальные мазки также были взяты от каждой свиньи перед контрольным заражением (день 20/21) и еженедельно после контрольного заражения. Индивидуальные стерильные полиэфирные тампоны были использованы для сбора фекальных мазков и помещены в пробирку, содержащую 3 мл стерильной PBS среды. Мазки взбалтывали в течение 5 секунд в среде перед тем, как отбросить. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤ -65°С. Образцы фекальных мазков исследовали на выделение вируса, используя стандартные методики количественной ПЦР.
Во время некропсии трахеобронхиальная секция, брыжейка и поверхностные паховые лимфатические узлы и ткани миндалин также были собраны в двух экземплярах для каждой свиньи, индивидуально идентифицированы и фиксированы в 10% буферном формалине. Один набор был архивирован, тогда как другой был представлен для стандартного гистопатологического исследования на лимфоидное истощение (PCVAD) и гистиоцитарную замену. Вывод был записан как Да (+) или Нет (-). Считалось, что свинья имеет лимфоидное истощение или гистиоцитарную замену, если одна или несколько тканей были оценены "+". Кроме того, ткани также исследовали на PCV2 антиген с помощью IHC. Результаты регистрировали как 0 (отсутствие окрашивания) и 1-3 (разные уровни окрашивания). Балл 0 рассматривался как PCV2 IHC (-), и балл от 1 или выше рассматривался как PCV2 IHC (+). Свинья считалась IHC (+), если одна или больше тканей были IHC (+).
Первичные результаты представляли собой защиту одной из четырех кандидатных вакцин против PCV2b контрольного заражения, по сравнению с плацебо. Первичная переменная представляла собой виремию, и вторичные переменные представляли собой фекальные выделения и гистологические поражения.
Результаты
PCV2 Виремии
Сыворотку собирали еженедельно и анализировали касательно PCV2 виремии с использованием количественной ПЦР. Геометрическое среднее, рассчитанное методом наименьших квадратов, для каждого дня исследования проиллюстрированы на фигуре 2. Все свиньи оставались отрицательными касательно PCV2 виремии перед контрольным заражением, как продемонстрировано в таблице 11 ниже.
PCV2 Виремии (ДНК копии) путем обработки и контрольного заражения описаны ниже в таблице 12. Все группы обработки значительно отличались от Т01 группы после контрольного заражения на 35-й и 44-й день (Р<0,0001).
Процент животных, которые были еще положительными на протяжении всего хода исследования, перечислен ниже (таблица 12). Группа плацебо имела значительно более высокое число животных, которые были еще положительными по сравнению с вакцинированными группами (Р<0,0124).
Фекальные выделения PCV2
Геометрическое среднее, рассчитанное методом наименьших квадратов, фекальных выделений на день исследования проиллюстрировано на фигуре 3. PCV2 фекальные выделения (ДНК копии) путем обработки и контрольного заражения описаны ниже в таблице 13. Все группы обработки значительно отличались от Т01 группы после контрольного заражения на 35-й и 44-й день (Р<0,0001).
Процент животных, которые были еще положительными по выделениям на протяжении всего хода исследования, перечислен ниже (таблица 14). Группа плацебо имела значительно более высокое число животных, которые были еще положительными по сравнению с вакцинированными группами (Р<0,0124).
Ответ сывороточных антител
Средние титры PCV2 антител каждого лечения на день исследования проиллюстрированы на фигуре 4. Все свиньи были PCV2 серонегативными перед вакцинацией. Свиньи в группе плацебо оставались серонегативными перед контрольным заражением.
Титры PCV2 ИФА антител приведены в таблице 15 ниже. Все титры>0,5, как считается, являются положительными на PCV2 антитело. Свиньи во всех вакцинных группах показали значительное увеличение (Р≤0,0895) титра PCV2 антител на 28-44-й день после вакцинации по сравнению с плацебо, что указывает на активный иммунный ответ на PCV2 после вакцинации. Кроме того, Т03 и Т05 также имели значительно более высокие титры на 20-й день после вакцинации (Р≤0,0684 и Р≤0,0738 соответственно).
Гистопатология: Лимфоидное истощение (LD) и инфицирование вирусом в лимфоидных тканях (IНС)
Процентные оценки PCV2 не соответствующей норме гистопатологии (данные не показаны) не продемонстрировали существенную разницу между плацебо и вакцинированными группами при рассмотрении на лимфоидные поражения и на присутствие PCV2 антигенов.
Данные этого исследования показали, что все свиньи в исследовании вплоть до контрольного заражения на 21-й день оставались свободными от PCV2 инфекции о чем свидетельствует 1) отсутствие детектируемой PCV2 ДНК в сыворотке, собранной с недельными интервалами с момента вакцинации до времени контрольного заражения и 2) отсутствие серологических доказательств среди T01 группы о том, что было какое-либо непреднамеренное воздействие PCV2 перед контрольным заражением. Все вакцины значительно защищали вакцинированных животных от виремии после контрольного заражения. Кроме того, все вакцины значительно уменьшали фекальные выделения с PCV2 после контрольного заражения у вакцинированных животных. Свиньи во всех вакцинных группах показали значительное увеличение (Р≤0,0895) титра PCV2 антител на 28-44-й день после вакцинирования по сравнению с плацебо, что указывает на активный иммунный ответ к PCV2 после вакцинирования. Наблюдалось численное уменьшение колонизации (IHC) во всех вакцинированных группах по сравнению с контрольной, но это не было статистически значимым. Отсутствие существенных различий между группами может быть из-за слабого контрольного заражения, проводимого в контрольной группе.
Пример 7: Оценка двух кандидатов в вакцины против PCV2b-дивергентного контрольного заражения
Цель исследования состояла в том, чтобы оценить защиту химерной PCV2b вакцины и PCV2b дивергентной вакцины, каждая из которых представлена в низкой и высокой антигенной дозе, а также PCV2a капсид экспрессированный в бакуловирусе, против PCV2b дивергентного контрольного заражения. Дизайн исследования приведен в таблице 16. Плацебо (Т01) представляло собой 10% SP-масло. IVP были следующими: Т02, убитая PCV1:PCV2b капсидная химера с низкой дозой (низкий cPCV2b), адъювантная 10% SP-масло; Т03, убитая PCV1:PCV2b капсидная химера с высокой дозой (высокий cPCV2b), адъювантная 10% SP-масло; Т04, убитая PCV2b-дивергентная вакцина с низкой дозой (низкий PCV2b DIV), адъювантная 10% SP-масло; Т05, убитая PCV2b-дивергентная вакцина с высокой дозой (высокий PCV2b DIV), адъювантная 10% SP-масло; Т06, убитый бакуловирус, экспрессирующий PCV2a капсид, в адъюванте на основе воды (продукт сравнения). Т02-Т05 вакцины были получены с использованием 20-кратного концентрированного антигена и затем сформулированы в вакцину с: 0,69% введенного антигена = низкая доза или 3,00% введенного антигена = высокая доза.
Свиньи в возрасте ~3 недель (в возрасте 21±8 дней) были вакцинированы в день 0. Администратор лечения вводил единичную дозу 2 мл (Т01-Т05) или 1 мл (Т06) предназначенной вакцины внутримышечно (IM) в правую сторону шеи. Единичный 3 мл стерильный шприц с 1'' или ¾'' иглой использовали для каждой свиньи. Детальные сведения о вакцинации были записаны. Свиней наблюдали в течение 1 часа (±30 минут) после каждой вакцинации касательно ненормальных клинических признаков, включая, но не ограничиваются этим: вялость, затрудненное дыхание, рвота и нарушение координации. Какие-либо наблюдаемые клинические признаки были зафиксированы в общей медицинской форме о состоянии здоровья. Ветеринар был уведомлен следить за свиньей(ями) с каким-либо из признаков, описанных выше.
Контрольное заражение проводили на 21 день, когда свиньи достигли возраста приблизительно 6 недель. Каждую свинью инокулировали общим объемом 3 мл интраназально (и.н.) культуры вирулентного PCV2b-дивергентного штамма, предварительно разбавленного до 4,8-5,8 log10 TCID50 /мл. Резервированную аликвоту вирусов контрольного заражения титровали после контрольного заражения, чтобы подтвердить фактическую дозу контрольного заражения.
Индивидуальные образцы крови (5-10 мл) собирали в пробирки для отделения сыворотки (SST) в 1 день - (перед вакцинацией) и 7, 14, 20/21, 28, 35 и 42 день. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤-65°С. Позже их исследовали касательно титров на PCV2 антитела с использованием ИФА и PCV2 виремии с использованием кПЦР.
Индивидуальные фекальные мазки также были взяты от каждой свиньи перед контрольным заражением (день 20/21) и еженедельно после контрольного заражения. Индивидуальные стерильные полиэфирные тампоны были использованы для сбора фекальных мазков и помещены в пробирку, содержащую 3 мл стерильной PBS среды. Мазки взбалтывали в течение 5 секунд в среде перед тем, как отбросить. Образцы делили на аликвоты и хранили при ≤-65°С. Образцы фекальных мазков исследовали на выделение вируса, используя стандартные методики количественной ПЦР.
Во время некропсии трахеобронхиальная секция, брыжейка и поверхностные паховые лимфатические узлы и ткани миндалин также были собраны в двух экземплярах для каждой свиньи, индивидуально идентифицированы и фиксированы в 10% буферном формалине. Один набор был архивирован, тогда как другой был представлен для стандартного гистопатологического исследования на лимфоидное истощение (PCVAD) и гистиоцитарную замену. Вывод был записан как Да (+) или Нет (-). Считалось, что свинья имеет лимфоидное истощение или гистиоцитарную замену, если одна или несколько тканей были оценены "+". Кроме того, ткани также исследовали на PCV2 антиген с помощью IHC. Результаты регистрировали как 0 (отсутствие окрашивания) и 1-3 (разные уровни окрашивания). Балл 0 рассматривался как PCV2 IHC (-), и балл от 1 или выше рассматривался как PCV2 IHC (+). Свинья считалась IHC (+), если одна или больше тканей были IHC (+).
Первичные результаты представляли собой защиту одной из четырех кандидатных вакцин и бакуловирусной вакцины против PCV2b-дивергентного контрольного заражения, по сравнению с плацебо. Первичная переменная представляла собой виремию, и вторичные переменные представляли собой фекальные выделения и гистологические поражения.
PCV2 Виремии
Сыворотку собирали еженедельно и анализировали касательно PCV2 виремии с использованием количественной ПЦР. Геометрическое среднее, рассчитанное методом наименьших квадратов, для каждого дня исследования проиллюстрированы на фигуре 5. Все свиньи, за исключением одного животного как в Т04, так и Т05 группах оставались отрицательными для PCV2 виремии перед контрольным заражением, как продемонстрировано в таблице 17 ниже.
Процент животных, которые были еще положительными на протяжении всего хода исследования, перечислен ниже (таблица 18). Группа плацебо имела значительно более высокое число животных, которые были еще положительными по сравнению с вакцинированными группами (Р<0,0046).
Фекальные выделения PCV2
Геометрическое среднее, рассчитанное методом наименьших квадратов, фекальных выделений на день исследования проиллюстрированы на фигуре 6. PCV2 фекальные выделения (ДНК копии) путем обработки и контрольного заражения описаны ниже в таблице 19. Одно животное в Т04 группе было с выделением за день перед контрольным заражением. Все вакцинные группы были с выделением значительно более низкого (Р≤0,0001) числа PCV2 ДНК копий, как рассчитано по методу наименьших квадратов, чем в группе плацебо на 35-й и 43-й день после контрольного заражения. Кроме того, в Т03, Т05 и Т06 группах также было отмечено выделения значительно более низкого числа ДНК копий, как рассчитано по методу наименьших квадратов, (Р≤0,0830) на 28-й день исследования.
Процент животных, которые были еще положительными по выделениям на протяжении всего хода исследования, перечислен ниже (таблица 20). После контрольного заражения по сравнению с группой плацебо группы Т03-Т06 имели значительное снижение (Р≤0,0028) процента свиней, выделяющих PCV2 ДНК, детектируемую в ПЦР.
Ответ сывороточных антител
По отношению к титрам антител PCV2, результаты показали, что обработки PCV2b дивергентной вакциной (Т04; Т05) имели более сильный серологический ответ по сравнению с другими обработками перед контрольным заражением на 21-й день исследования, как оценено по ИФА (таблица 21; фигура 7). После контрольного заражения, однако, PCV2b дивергентные обработки не давали такого сильного ответа как другие обработки (фигура 7). Один из возможных выводов заключается в том, что животное уже имело конкретный сильный ответ анти-PCV2b дивергентного антитела и было в состоянии очень быстро нейтрализовать и устранить вирус контрольного заражения. Это переводится на сниженный антительный ответ после контрольного заражения, по сравнению с гетерологичной вакциной. Тогда как серология не является тем же самым, что и эффективность, было продемонстрировано, что снижение титра антител у свиней, получающих эффективную вакцину, показывает защиту (Thacker et al., 2013, Proc AASV, 217).
Гистопатология: Лимфоидное истощение (LD) и инфицирование вирусом в лимфоидных тканях (IHC)
Во время некропсии, по сравнению с группою плацебо, все вакцинные группы имели значительно меньший процесс животных с микроскопическими лимфоидными поражениями (LD) и колонизацией PCV2 антигена (IHC), Р≤0,0995.
Данные PCV2 IHC приведены в таблице 22 ниже.
Данные касательно PCV2 лимфоидного истощения (LD) приведены в таблице 23 ниже.
Данные этого исследования показали, что все группы обработки по титрам PCV2 согласно методу наименьших квадратов были серонегативными перед вакцинированием. Свиньи в группе плацебо оставались серонегативными до контрольного заражения. Одно животное в обеих Т04 и Т05 группами были виремичными за день до контрольного заражения. Животное в группе Т04 также было с выделением, однако меньше чем 10% животных стали виремичными перед контрольным заражением, и исследование считалось действительным. После контрольного заражения по сравнению с группой плацебо все вакцинированные группы имели значительное снижение процента свиней с виремией. После контрольного заражения по сравнению с группой плацебо группы Т03-Т06 имели значительное снижение процента свиней с детектируемой по ПЦР PCV2 ДНК в выделениях. При некропсии по сравнению с группой плацебо все вакцинированные группы имели значительно меньший процент животных с микроскопическими лимфоидными поражениями (LD) и колонизацией PCV2 антигена. Исследование продемонстрировало, что cPCV1-2b, PCV2b дивергентные и бакуловирус, экспрессирующая PCV2a, капсидные вакцины перекрестно защищают против PCV2b дивергентного штамма контрольного заражения.
Следует понимать, что приведенные выше примеры представлены только в качестве иллюстрации и ничто в них не должно рассматриваться как ограничение касательно общего объема настоящего изобретения.
Claims (17)
1. Вакцинная композиция для защиты свиней от цирковируса свиней типа 2 (PCV2), включая защиту от высоковирулентного дивергентного штамма цирковируса свиней типа 2b (PCV2b), где композиция содержит эффективное количество ORF2 полипептида PCV2b, кодированного геномной последовательностью, которая имеет, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66, где кодированный ORF2 полипептид содержит лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1; и эмульсионный адъювант масло-в-воде.
2. Композиция по п. 1, где композиция находится в форме инактивированного PCV2b дивергентного целого вируса, который содержит и/или экспрессирует ORF2 полипептид PCV2b в качестве его вирусного капсида.
3. Композиция по п. 1, где композиция находится в форме инактивированного химерного цирковируса свиней типа 1 - типа 2 целого вируса, где указанный химерный цирковирус свиней содержит инактивированный рекомбинантный цирковирус свиней типа 1, который содержит и/или экспрессирует ORF2 полипептид PCV2b вместо ORF2 капсида PCV1.
4. Композиция по п. 1, где композиция находится в форме выделенного рекомбинантного ORF2 полипептида PCV2b.
5. Композиция по п. 4, где выделенный рекомбинантный ORF2 полипептид PCV2b экспрессируется из вектора.
6. Композиция по какому-либо одному из пп. 1-5, где ORF2 полипептид PCV2b дополнительно содержит, по меньшей мере, один остаток, выбранный из группы, состоящей из: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцина (I) в остатке 215 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
7. Композиция по какому-либо одному из пп. 1-5, где ORF2 полипептид PCV2b дополнительно содержит лизин (K) в остатке 59 и лизин (K) в остатке 234 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
8. Композиция по п. 7, где ORF2 полипептид PCV2b дополнительно содержит треонин (Т) в остатке 190, изолейцин (I) в остатке 53, аспарагин (N) в остатке 68, аргинин (R) или глицин (G) в остатке 169 и изолейцин (I) в остатке 215 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1.
9. Композиция по какому-либо одному из пп. 1-8, где ORF2 полипептид PCV2 представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.
10. Композиция по какому-либо одному из пп. 1-9, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
11. Композиция по п. 10, где композиция дополнительно содержит дополнительный адъювант, который выбирают из группы, состоящей из полимерного и водного адъюванта, адъюванта вода-в-масле, адъюванта гидроксида алюминия и адъюванта витамина Е.
12. Способ иммунизации свиньи против цирковируса свиней типа 2 (PCV2), включая иммунизацию против высоковирулентного дивергентного штамма PCV2b, где способ включает введение свинье композиции по какому-либо одному из пп. 1-11.
13. Способ по п. 12, где композицию вводят внутримышечно.
14. Способ по п. 12 или 13, в котором композицию вводят одной дозой.
15. Набор для осуществления способа по п. 12, который включает: бутылочку, содержащую вакцинную композицию для защиты свиней от цирковируса свиней типа 2 (PCV2), включая защиту от высоковирулентного дивергентного штамма цирковируса свиней типа 2b (PCV2b), где композиция содержит эффективное количество ORF2 полипептида PCV2b, который кодируется геномной последовательностью, имеющий, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 66, где кодированный ORF2 полипептид содержит лейцин (L) в положении 89, треонин (Т) в положении 90 и аспарагин (N) в положении 134 в соответствии с нумерацией SEQ ID NO: 1; и эмульсионный адъювант масло-в-воде; и руководство по применению, которое содержит информацию касательно введения вакцинной композиции.
16. Набор по п. 15, в котором ORF2 полипептид PCV2b дополнительно содержит, по меньшей мере, один остаток, выбранный из группы, состоящей из: лизина (K) в остатке 59, лизина (K) в остатке 234, треонина (Т) в остатке 190, изолейцина (I) в остатке 53, аспарагина (N) в остатке 68, аргинина (R) или глицина (G) в остатке 169 и изолейцина (I) в остатке 215 в соответствии с нумерацией SEQ IDNO: 1.
17. Набор по п. 15 или 16, в котором композиция в бутылочке обеспечивается как готовая к применению жидкая композиция.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361882289P | 2013-09-25 | 2013-09-25 | |
US61/882,289 | 2013-09-25 | ||
PCT/US2014/057190 WO2015048115A1 (en) | 2013-09-25 | 2014-09-24 | Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016110430A RU2016110430A (ru) | 2017-10-30 |
RU2662685C2 true RU2662685C2 (ru) | 2018-07-26 |
Family
ID=51688446
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016110430A RU2662685C2 (ru) | 2013-09-25 | 2014-09-24 | Pcv2b дивергентная вакцинная композиция и способы её применения |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9987348B2 (ru) |
EP (2) | EP3049106A1 (ru) |
JP (2) | JP6821429B2 (ru) |
KR (2) | KR20160046879A (ru) |
CN (1) | CN105579060B (ru) |
BR (1) | BR112016006192A2 (ru) |
CA (1) | CA2925281C (ru) |
HK (1) | HK1225645A1 (ru) |
MX (1) | MX2016003855A (ru) |
PH (1) | PH12016500473A1 (ru) |
RU (1) | RU2662685C2 (ru) |
WO (1) | WO2015048115A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2774926C2 (ru) * | 2017-08-03 | 2022-06-24 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Вакцина, включающая белок orf2 pcv2 генотипа 2b |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9649370B2 (en) | 2013-05-08 | 2017-05-16 | Protatek International, Inc. | Vaccine for PCV2 and mycoplasma |
CA2925281C (en) * | 2013-09-25 | 2022-05-03 | Zoetis Services Llc | Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use |
AU2017257302A1 (en) * | 2016-03-07 | 2018-09-27 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccines |
GB201614799D0 (en) * | 2016-09-01 | 2016-10-19 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Compositions |
CN106754980A (zh) * | 2016-12-29 | 2017-05-31 | 福州大学 | Pcv2型衣壳蛋白基因、表达菌株及可溶性表达方法 |
CN111212847B (zh) | 2017-10-17 | 2024-01-30 | 英特维特国际股份有限公司 | PCV2b ORF2蛋白在昆虫细胞中的重组表达 |
EP3801609A1 (en) | 2018-06-11 | 2021-04-14 | Ceva Santé Animale | Vaccination against porcine circoviruses |
CN110606873B (zh) * | 2019-09-09 | 2021-05-04 | 武汉科前生物股份有限公司 | 猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用 |
KR20230073462A (ko) * | 2021-11-19 | 2023-05-26 | 주식회사 이노백 | 신규한 재조합 돼지 써코바이러스 2형 단백질 및 이의 용도 |
CN115960259B (zh) * | 2022-10-07 | 2023-11-24 | 浙江大学 | 一种模块化组装双组分纳米颗粒制备方法及其应用 |
WO2024096648A1 (ko) * | 2022-11-03 | 2024-05-10 | 주식회사 옵티팜 | 신규한 재조합 pcv2d 항원 및 이의 용도 |
CN117100851A (zh) * | 2023-10-23 | 2023-11-24 | 成都依思康生物科技有限公司 | 一种佐剂、疫苗组合物及其制备方法和应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2389506C2 (ru) * | 2005-09-09 | 2010-05-20 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Вакцина против рсv-2 |
WO2011116094A2 (en) * | 2010-03-16 | 2011-09-22 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Live attenuated chimeric porcine circovirus vaccine |
CN102296089A (zh) * | 2011-04-20 | 2011-12-28 | 中国兽医药品监察所 | 高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法 |
RU2493254C2 (ru) * | 2007-12-21 | 2013-09-20 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | Способы и композиции для иммунизации свиней против свиного цирковируса |
Family Cites Families (107)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US2262533A (en) | 1939-12-09 | 1941-11-11 | William D Hedge | Water-cooled grate |
FR964808A (ru) | 1941-03-20 | 1950-08-25 | ||
FR2422956A1 (fr) | 1978-04-13 | 1979-11-09 | Pasteur Institut | Procede de detection et de caracterisation d'un acide nucleique ou d'une sequence de celui-ci, et reactif enzymatique pour la mise en oeuvre de ce procede |
FR2518755B1 (fr) | 1981-12-23 | 1986-04-11 | Pasteur Institut | Sonde contenant un acide nucleique modifie et reconnaissable par des anticorps specifiques et utilisation de cette sonde pour detecter et caracteriser une sequence d'adn homologue |
US5833975A (en) | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
US4708871A (en) | 1983-03-08 | 1987-11-24 | Commonwealth Serum Laboratories Commission | Antigenically active amino acid sequences |
US4745051A (en) | 1983-05-27 | 1988-05-17 | The Texas A&M University System | Method for producing a recombinant baculovirus expression vector |
US4567043A (en) | 1983-06-15 | 1986-01-28 | American Home Products Corporation (Del.) | Canine corona virus vaccine |
US5545412A (en) | 1985-01-07 | 1996-08-13 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-[1, (1-1)-dialkyloxy]-and N-[1, (1-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-n,n,n-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US4946787A (en) | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
US5106733A (en) | 1987-06-25 | 1992-04-21 | Immunex Corporation | Bovine granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
SU1538305A1 (ru) | 1987-07-21 | 1994-12-15 | Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Госагропрома СССР | Ассоциированная вакцина против лептоспироза и парвовирусной инфекции свиней |
US5238662A (en) | 1987-07-31 | 1993-08-24 | Chevron Research Company | Processes for recovering precious metals |
US5069901A (en) | 1988-02-03 | 1991-12-03 | Jones Elaine V | Preparation of a recombinant subunit vaccine against pseudorabies infection |
AU638970B2 (en) | 1989-01-23 | 1993-07-15 | Auspharm International Limited | Vaccine composition |
US5811103A (en) | 1989-03-19 | 1998-09-22 | Akzo Nobel N.V. | Hog cholera virus vaccine and diagnostic |
JP3250802B2 (ja) | 1989-03-21 | 2002-01-28 | バイカル・インコーポレイテッド | 脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現 |
US5703055A (en) | 1989-03-21 | 1997-12-30 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery |
US5800992A (en) | 1989-06-07 | 1998-09-01 | Fodor; Stephen P.A. | Method of detecting nucleic acids |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
ATE160699T1 (de) | 1990-05-29 | 1997-12-15 | American Cyanamid Co | Impfstoff gegen die pneumonie bei schweinen und verfahren zu seiner herstellung |
US5147966A (en) | 1990-07-31 | 1992-09-15 | The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration | Polyimide molding powder, coating, adhesive and matrix resin |
US5565205A (en) | 1990-08-16 | 1996-10-15 | Solvay Animal Health, Inc. | Inactivated Mycoplasma hypopneumoniae bacterin and method of use thereof |
WO1992005255A1 (en) | 1990-09-13 | 1992-04-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Ovine cytokine genes |
GB9023111D0 (en) | 1990-10-24 | 1990-12-05 | Wellcome Found | Expression system |
WO1992007934A1 (en) | 1990-11-01 | 1992-05-14 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Bacterial attenuation method and vaccine |
JP3602530B2 (ja) | 1991-03-07 | 2004-12-15 | ヴァイロジェネティクス コーポレイション | 遺伝子操作したワクチン菌株 |
ES2026827A6 (es) | 1991-03-26 | 1992-05-01 | Ercros Sa | Procedimiento para la produccion de una vacuna subunidad contra el parvovirus porcino. |
US5580557A (en) | 1991-10-09 | 1996-12-03 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Live, avirulent salmonella choleraesuis vaccine used for inducing an immune response in animals |
US5382425A (en) | 1992-01-13 | 1995-01-17 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
US6033904A (en) | 1992-01-13 | 2000-03-07 | Syntro Corporation | Recombinant swinepox virus |
US5338543A (en) | 1992-02-27 | 1994-08-16 | Ambico, Inc. | Thimerosal inactivated mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
CA2139756A1 (en) | 1992-07-08 | 1994-01-20 | Eric M. Bonnem | Use of gm-csf as a vaccine adjuvant |
SK98695A3 (en) | 1993-02-08 | 1996-11-06 | Bayer Ag | Process for growing porcine reproductive and respiratory syndrome virus and its use in vaccines |
IL108915A0 (en) | 1993-03-18 | 1994-06-24 | Merck & Co Inc | Polynucleotide vaccine against influenza virus |
AU6672994A (en) | 1993-05-14 | 1994-12-12 | Mds Health Group Ltd. | Electronic worksheet system for microbiology testing and reporting |
EP0702516A4 (en) | 1993-06-01 | 1998-04-22 | Life Technologies Inc | GENETIC IMMUNIZATION WITH CATIONIC LIPIDS |
US5910488A (en) | 1993-06-07 | 1999-06-08 | Vical Incorporated | Plasmids suitable for gene therapy |
US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
FR2711670B1 (fr) | 1993-10-22 | 1996-01-12 | Pasteur Institut | Vecteur nucléotidique, composition le contenant et vaccin pour l'immunisation à l'encontre d'une hépatite. |
AU710504B2 (en) | 1994-03-15 | 1999-09-23 | Brown University Research Foundation | Polymeric gene delivery system |
ES2243937T3 (es) | 1994-04-29 | 2005-12-01 | Baxter Healthcare S.A. | Poxvirus recombinados en regiones esenciales con la ayuda de polinucleotidos extraños. |
CA2189979C (en) | 1994-05-10 | 2011-04-19 | Hsien-Jue Chu | Improved modified live brsv vaccine |
DK53595A (da) | 1994-05-13 | 1995-11-14 | Iberica Cyanamid | Rekombinante PRRSV-proteiner, diagnostiske kits og vaccine indeholdende sådanne rekombinante PRRSV-proteiner |
US5719131A (en) | 1994-12-09 | 1998-02-17 | Genzyme Corporation | Cationic amphiphiles containing dialkylamine lipophilic groups for intracellular delivery of therapeutic molecules |
BE1008978A5 (fr) | 1994-12-27 | 1996-10-01 | Solvay | Adjuvants pour vaccins. |
US5788962A (en) | 1995-01-17 | 1998-08-04 | The Curators Of The University Of Missouri | DNA sequences coding for mycoplasma hyopneumoniae surface antigens, corresponding proteins and use in vaccines and diagnostic procedures |
US6043232A (en) | 1997-07-23 | 2000-03-28 | Nitromed, Inc. | Nitroso esters of beta-oxo-amides and aryl propionic acid derivatives of non-steroidal antiinflammatory drugs |
JPH11504631A (ja) | 1995-04-25 | 1999-04-27 | バイカル インコーポレイテッド | Dna/脂質複合体の単一バイアル製剤 |
US5885823A (en) | 1995-06-05 | 1999-03-23 | Nobl Laboratories, Inc. | Lawsonia intracellularis cultivation, anti-Lawsonia intracellularis vaccines and diagnostic agents |
US5705385A (en) | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
CA2221570A1 (en) | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Aesculaap B.V. | Neutralizing conformation epitopes of chicken anemia virus |
US6019980A (en) | 1995-06-07 | 2000-02-01 | Connaught Laboratories Limited | Nucleic acid respiratory syncytial virus vaccines |
US5820869A (en) | 1995-06-07 | 1998-10-13 | American Home Products Corporation | Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline immunodeficiency virus infection |
US5795872A (en) | 1995-09-19 | 1998-08-18 | Pharmadigm, Inc. | DNA construct for immunization |
FR2751224B1 (fr) | 1996-07-19 | 1998-11-20 | Rhone Merieux | Formule de vaccin polynucleotidique contre les pathologies respiratoires et de reproduction des porcs |
EP0835930B1 (en) | 1996-10-09 | 2001-01-31 | Akzo Nobel N.V. | European vaccine strains of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) |
GB9622159D0 (en) | 1996-10-24 | 1996-12-18 | Solvay Sociutu Anonyme | Polyanionic polymers as adjuvants for mucosal immunization |
AU1987197A (en) | 1997-03-10 | 1998-09-29 | Heather Lynn Davis | Gene delivery to mucosal epithelium for immunization or therapeutic purpose |
US6004777A (en) | 1997-03-12 | 1999-12-21 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
US5990091A (en) | 1997-03-12 | 1999-11-23 | Virogenetics Corporation | Vectors having enhanced expression, and methods of making and uses thereof |
FR2769321B1 (fr) | 1997-10-03 | 2001-10-26 | Merial Sas | Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostics |
UA78180C2 (ru) | 1997-10-03 | 2007-03-15 | Меріаль | Кольцевой вирус свиньи, вакцины и диагностические реагенты |
US7211379B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-05-01 | Merial Sas | Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2 |
FR2769322B1 (fr) | 1997-10-03 | 2002-03-08 | Merial Sas | Nouveaux circovirus porcins, vaccins et reactifs de diagnostic |
US7192594B2 (en) | 1997-10-03 | 2007-03-20 | Merial Limited | Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs |
FR2781159B1 (fr) | 1998-07-06 | 2000-10-06 | Merial Sas | Vaccin circovirus et parvovirus porcin |
US6517843B1 (en) | 1999-08-31 | 2003-02-11 | Merial | Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2 |
US6391314B1 (en) | 1997-10-03 | 2002-05-21 | Merial | Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents |
US6165493A (en) | 1997-10-22 | 2000-12-26 | New York Blood Center, Inc. | "Methods and compositions for decreasing the frequency of HIV, herpesvirus and sexually transmitted bacterial infections" |
WO1999026664A1 (en) | 1997-11-26 | 1999-06-03 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Recombinant mycoplasma hyopneumoniae vaccine |
US20040062775A1 (en) | 1997-12-05 | 2004-04-01 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments | Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD) |
FR2772047B1 (fr) | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
KR100879650B1 (ko) | 1997-12-11 | 2009-01-20 | 유니버시티 오브 사스카췌완 | 돼지로부터의 이유후 다기관계작용성 소모 증후군 바이러스 |
EP1064024A4 (en) | 1998-03-13 | 2005-04-06 | Univ Georgia Res Found | VACCINES AGAINST CIRCOVIRUS INFECTIONS |
US6294176B1 (en) | 1998-07-10 | 2001-09-25 | Schering-Plough Veterinary Corp. | Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species |
WO2000024428A2 (en) | 1998-10-23 | 2000-05-04 | Heska Corporation | Cationic lipid-mediated enhancement of nucleic acid immunization of cats |
CA2440933A1 (en) | 1998-12-22 | 2000-06-22 | Pfizer Products Inc. | An infectious cdna clone of north american porcine reproductive and respiratory syndrome (prrs) virus and uses thereof |
FR2789695B1 (fr) | 1999-02-11 | 2003-03-07 | Merial Sas | Vecteurs et vaccins viraux a base d'adenovirus porcins recombines et replicatifs |
US6943152B1 (en) | 1999-06-10 | 2005-09-13 | Merial | DNA vaccine-PCV |
US6497883B1 (en) | 1999-06-10 | 2002-12-24 | Merial | Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine |
US6139179A (en) | 1999-09-03 | 2000-10-31 | Davis-Standard Corporation | Extruder screw having multi-channeled barrier section |
US6179461B1 (en) | 1999-09-03 | 2001-01-30 | Davis-Standard Corporation | Extruder screw |
WO2001017556A1 (fr) | 1999-09-07 | 2001-03-15 | Shionogi & Co., Ltd. | Préparations vaccinales administrables par les muqueuses |
CA2410229A1 (en) | 2000-06-15 | 2001-12-20 | Purdue Research Foundation | Vaccine for congenital tremors in pigs |
DE10044648A1 (de) | 2000-09-08 | 2002-03-21 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Vermehrung oder zur Entfernung von Cirocoviren aus biologischem Material |
US7018638B2 (en) | 2000-12-19 | 2006-03-28 | Wyeth | Mycoplasma hyopneumoniae bacterin vaccine |
MY146518A (en) | 2001-03-27 | 2012-08-15 | Univ Saskatchewan | Methods to culture circovirus. |
AUPR567401A0 (en) | 2001-06-14 | 2001-07-12 | University Of Melbourne, The | Circovirus vaccines |
US7279166B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-09 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
US7276353B2 (en) | 2001-12-12 | 2007-10-02 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof |
US20030215455A1 (en) | 2002-05-14 | 2003-11-20 | Bailey Reynolds | Vaccine stabilizer and method of use |
BR0312274A (pt) | 2002-06-28 | 2007-06-19 | Univ Iowa State Res Found Inc | polipeptìdeos imunogênicos de mycoplasma hyopneumoniae |
JP2006528882A (ja) | 2003-07-25 | 2006-12-28 | ベーリンガー インゲルハイム フェトメディカ インコーポレイテッド | 欧州起源のローソニア・イントラセルラリス並びにそのワクチン、診断薬及び使用方法 |
US7700285B1 (en) | 2005-12-29 | 2010-04-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | PCV2 immunogenic compositions and methods of producing such compositions |
US7833707B2 (en) | 2004-12-30 | 2010-11-16 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Methods of overexpression and recovery of porcine circovirus type 2 ORF2 |
WO2006074986A2 (en) | 2005-01-13 | 2006-07-20 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Prrs vaccines |
MX2007012786A (es) | 2005-04-13 | 2008-01-11 | Merial Ltd | Ensayo para produccion de circovirus porcino. |
EP1968630B1 (en) * | 2005-12-29 | 2018-01-24 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Multivalent pcv2 immunogenic compositions |
MX2008008311A (es) | 2005-12-29 | 2009-03-04 | Boehringer Ingelheim Vetmed | Uso de una composicion inmunogenica de pcv2 para reducir los sintomas clinicos en cerdos. |
CN107412761A (zh) * | 2006-12-15 | 2017-12-01 | 贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司 | 以pcv2抗原治疗猪 |
US20090017064A1 (en) | 2007-07-10 | 2009-01-15 | Wyeth | Methods and Compositions for Immunizing Pigs Against Porcine Circovirus |
US8703468B2 (en) | 2008-11-28 | 2014-04-22 | Ceva Sante Animale | Porcine circovirus type 2B isolate and uses thereof |
JP6096176B2 (ja) * | 2011-05-27 | 2017-03-15 | シノヴェット (ベイジン) バイオテクノロジー カンパニー,リミテッド | ブタウイルス感染の予防のための混合ワクチン |
CN103122352B (zh) | 2012-09-27 | 2015-02-11 | 华中农业大学 | 一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用 |
WO2015026912A1 (en) * | 2013-08-23 | 2015-02-26 | Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. | Porcine circovirus type 2 (pcv2) subunit vaccine |
CA2925281C (en) * | 2013-09-25 | 2022-05-03 | Zoetis Services Llc | Pcv2b divergent vaccine composition and methods of use |
-
2014
- 2014-09-24 CA CA2925281A patent/CA2925281C/en active Active
- 2014-09-24 WO PCT/US2014/057190 patent/WO2015048115A1/en active Application Filing
- 2014-09-24 JP JP2016516851A patent/JP6821429B2/ja active Active
- 2014-09-24 CN CN201480052946.0A patent/CN105579060B/zh active Active
- 2014-09-24 EP EP14782029.4A patent/EP3049106A1/en not_active Ceased
- 2014-09-24 MX MX2016003855A patent/MX2016003855A/es active IP Right Grant
- 2014-09-24 RU RU2016110430A patent/RU2662685C2/ru active
- 2014-09-24 BR BR112016006192A patent/BR112016006192A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-09-24 US US14/917,620 patent/US9987348B2/en active Active
- 2014-09-24 EP EP22171259.9A patent/EP4091629A1/en active Pending
- 2014-09-24 KR KR1020167007769A patent/KR20160046879A/ko active Search and Examination
- 2014-09-24 KR KR1020187009981A patent/KR102319843B1/ko active IP Right Grant
-
2016
- 2016-03-10 PH PH12016500473A patent/PH12016500473A1/en unknown
- 2016-12-12 HK HK16114102A patent/HK1225645A1/zh unknown
-
2019
- 2019-07-08 JP JP2019126715A patent/JP2019206541A/ja active Pending
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2389506C2 (ru) * | 2005-09-09 | 2010-05-20 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Вакцина против рсv-2 |
RU2493254C2 (ru) * | 2007-12-21 | 2013-09-20 | ВАЙЕТ ЭлЭлСи | Способы и композиции для иммунизации свиней против свиного цирковируса |
WO2011116094A2 (en) * | 2010-03-16 | 2011-09-22 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Live attenuated chimeric porcine circovirus vaccine |
CN102296089A (zh) * | 2011-04-20 | 2011-12-28 | 中国兽医药品监察所 | 高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LONG J GUO et al. PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2): GENETIC VARIATION AND NEWLY EMERGING GENOTYPES IN CHINA, VIROLOGY JOURNAL, 2010, 7:273. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2774926C2 (ru) * | 2017-08-03 | 2022-06-24 | Интервет Интернэшнл Б.В. | Вакцина, включающая белок orf2 pcv2 генотипа 2b |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2016531854A (ja) | 2016-10-13 |
KR20180041245A (ko) | 2018-04-23 |
HK1225645A1 (zh) | 2017-09-15 |
PH12016500473B1 (en) | 2016-05-16 |
MX2016003855A (es) | 2016-08-04 |
CN105579060B (zh) | 2021-03-16 |
BR112016006192A2 (pt) | 2017-09-26 |
CA2925281A1 (en) | 2015-04-02 |
US9987348B2 (en) | 2018-06-05 |
KR102319843B1 (ko) | 2021-10-29 |
CN105579060A (zh) | 2016-05-11 |
CA2925281C (en) | 2022-05-03 |
RU2016110430A (ru) | 2017-10-30 |
JP2019206541A (ja) | 2019-12-05 |
KR20160046879A (ko) | 2016-04-29 |
US20160220658A1 (en) | 2016-08-04 |
JP6821429B2 (ja) | 2021-01-27 |
PH12016500473A1 (en) | 2016-05-16 |
WO2015048115A1 (en) | 2015-04-02 |
EP4091629A1 (en) | 2022-11-23 |
EP3049106A1 (en) | 2016-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2662685C2 (ru) | Pcv2b дивергентная вакцинная композиция и способы её применения | |
US11154609B2 (en) | PCV/mycoplasma hyopneumoniae vaccine | |
US9650601B2 (en) | PCV/mycoplasma hyopneumoniae/PRRS combination vaccine | |
RU2644254C2 (ru) | Вакцина mycoplasma hyopneumoniae |