CN106754980A - Pcv2型衣壳蛋白基因、表达菌株及可溶性表达方法 - Google Patents

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CN106754980A CN201611244031.7A CN201611244031A CN106754980A CN 106754980 A CN106754980 A CN 106754980A CN 201611244031 A CN201611244031 A CN 201611244031A CN 106754980 A CN106754980 A CN 106754980A
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Abstract

本发明公开了PCV2型衣壳蛋白基因、表达菌株及可溶性表达方法，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO．1。所述基因在大肠杆菌中表达，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL‑21。本发明利用生物信息学手段，通过自主设计，对猪圆环病毒2型的ORF2基因进行优化，并人工合成适合在大肠杆菌高效表达的PCV2衣壳蛋白基因。

Description

PCV2型衣壳蛋白基因、表达菌株及可溶性表达方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PCV2型衣壳蛋白基因、表达菌株及可溶性表达方法。
背景技术
断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是由PCV2为主要病原体而引起的一种严重的猪疾病，感染的主要对象是大约6-15周龄的仔猪，主要的临床症状是体弱、生长缓慢、呼吸困难、贫血、腹泻、淋巴肿大、黄疸等等，以及淋巴细胞缺失、炎症粒细胞浸润等病理变化，在临床上常与猪高致病性呼吸与繁殖综合征、猪细小病毒以及猪口蹄疫病毒等混合感染猪仔，以及由此引起的继发感染等。自从猪圆环病毒发病以来，猪圆环病毒疫苗的研制便已经开始提上日程。猪圆环病毒疫苗于2006年研制成功并率先在北美应用。2009年勃林格亚单位疫苗是在中国首次注册成功的猪圆环病毒亚单位疫苗。2010年下半年国产疫苗才陆续上市。目前的亚单位疫苗多数采用杆状病毒表达系统，表达出蛋白可以自发形成病毒样颗粒，且表现出较好的免疫学活性。目前，国内注册的圆环病毒疫苗大部分为全病毒灭活疫苗。例如，哈尔滨兽医研究所和南京农业大学研制的“圆克清”，上海海利公司生产的“圆毕净”，江苏南农高科技公司生产的SH株全病毒灭活疫苗以及2011年北京大北农集团研发的“诛欢泰”。尽管人们对PCV2疫苗做了很多研究，但是仍有很多问题亟待解决，杆状病毒表达系统的成本昂贵，设备要求苛刻。全病毒灭活疫苗的效价低，效果略差。随着基因工程技术的发展，DNA疫苗是疫苗研究的热点，DNA疫苗佐剂也已经发现，但是因为其免疫活性低等诸多因素制约其发展。
猪圆环病毒2型的ORF2是构成病毒衣壳的主要结构蛋白，含有233个氨基酸，分子量约为27.8KDa。在Cap蛋白的N端含有41个氨基酸的核定位序列(NLS)。N端1-16个氨基酸里面含有9个精氨酸残基，这对于大肠杆菌来说是稀有密码子，因此，在大肠杆菌里面很难实现对PCV2-Cap蛋白的可溶表达。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的为提供能够在大肠杆菌中成功得到表达的优化的猪圆环病毒ORF2截短基因。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
优化后的PCV2型衣壳蛋白基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
所述基因在大肠杆菌中表达。
所述大肠杆菌为大肠杆菌BL-21(DE3)。
一种可溶表达PCV2型衣壳蛋白基因的菌株，宿主菌为大肠杆菌BL-21(DE3)，表达载体为含有权利要求1所述PCV2型衣壳蛋白基因的pET32a质粒。
本发明还提供了所述PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，使用终浓度为0.01-0.2mM的IPTG在诱导温度16-37℃下诱导8-24h。
优选的，所述PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，使用终浓度为0.08mM的IPTG在诱导温度32.5℃下诱导16h。
所述可溶性表达过程使用的裂解液组成如下：终浓度10-100mMNa2HPO4，终浓度1-3mM KH2PO4，终浓度200-500mM NaCl，终浓度2-3mMKCl，终浓度25-100mM咪唑，终浓度1-15mMEDTA。
进一步，所述裂解液组成如下：终浓度10-100mM Na2HPO4，终浓度1.8mM KH2PO4，终浓度200-500mM NaCl，终浓度2-3mM KCl，终浓度50mM咪唑，终浓度10mM EDTA。
优选的，所述诱导过程使用的裂解液组成如下：终浓度10mM Na2HPO4，终浓度1.8mMKH2PO4，终浓度240mM NaCl，终浓度2.7mM KCl，终浓度50mM咪唑，终浓度10mM EDTA。
所述裂解液pH为8.0。
本发明采用以上技术方案，利用生物信息学手段，通过自主设计，对猪圆环病毒2型的ORF2基因进行优化，并人工合成适合在大肠杆菌高效表达的PCV2衣壳蛋白基因。
本发明采用的受体菌BL-21(DE3)系大肠杆菌，具有大肠杆菌的一般生物学特性；能在富营养培养成分的LB培养基，pH中性，温度37℃时迅速生长繁殖。该受体菌是经过改造的，缺乏降解蛋白的lon蛋白酶及ompT外膜蛋白酶。BL-21(DE3)是噬菌体的溶源菌，噬菌体DE3是一种衍生噬菌体，带有噬菌体21抗性区和lac I基因，lac UV5启动子，以及T7RNA聚合酶基因。这一区段被插入int基因，因此阻止了DE3在没有辅助噬菌体时整合到染色体上或从染色体切出。一旦形成DE3溶源状态，就只有IPTG诱导的lac UV5启动子指导的T7RNA聚合酶基因转录，在溶源体系里加入IPTG诱导T7RNA聚合酶产生，继而启动质粒上的目的基因开始转录。
本发明采用的表达载体pET载体最初由Studier及其同事构建，经过Navagen公司多年的开发，形成了一系列新的pET载体。目的基因被克隆到pET质粒上，受噬菌体T7强转录及(可选择)翻译信号控制；表达有宿主细胞(BL-21)提供的T7RNA聚合酶诱导；调控方式为化学诱导型，类似于Lac表达系统，可以通过在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。
附图说明
图1为重组的Pet32a-ORF2-Cap(702bp)表质粒图谱；
图2为pET32a-ORF2-Cap(702bp)的验证结果(1：诱导菌体；2：未诱导菌体；3：Western-blot结果)；
图3为pET32a-ORF2-Cap(702bp)的可溶表达结果(1：未诱导菌体；2：诱导菌体；3：超声波破碎后上清；4：超声波破碎后沉淀)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
实施例1 目的基因(PCV2型衣壳蛋白基因)的合成
将用分子生物学设计的ORF2序列，送于上海生工生物公司进行全序列合成，合成后基因测序正确，序列以质粒形式存在。
优化后的ORF2基因，即PCV2型衣壳蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2 目的基因与表达载体连接
1)将目的基因利用Nco1和Xho1双酶切，酶切条件：37℃，酶切2h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的基因。回收步骤按上海生工胶回收试剂盒进行，具体步骤参见产品说明书。
2)表达载体利用常见的pET32a质粒，在大肠杆菌中是氨苄抗性。先利用上海生工质粒提取试剂盒，提取质粒，具体步骤参见产品说明书。然后也利用Nco1和Xho1双酶切，酶切条件：37℃，酶切2.5h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的基因。具体方法同上。
3)目的基因与表达载体相连
表达载体与目的基因的比例在1:3-1:10之间。
2μL表达载体
6μL目的基因
1μL T4 DNA Ligase
1μL T4 DNA Ligase buffer
总体积10μL
16℃酶连过夜，得到带有目的基因片段的重组质粒。
4)大肠杆菌的Top10感受态细胞的制备与转化
1、挑取Top10单菌落于LB液体培养基中，37℃培养过夜；
2、第二天，按1:100的比例转接到新鲜的LB液体培养基中，培养至OD600＝0.5左右；
3、取1mL菌液，冰浴20min，8000rpm离心1min；
4、弃上清，加入1mL 0.1M的CaCl2，重悬并充分混匀，冰浴30min；
5、1000rpm离心1min，弃上清，加入100μL 0.1M的CaCl2，充分混匀，即为Top10感受态细胞；
6、将上述带有目的基因片段的重组质粒立即加入100μL制备好的Top10感受态细胞中，冰浴30min；
7、取出冰浴的Top10感受态细胞，立即42℃热激90S，冰浴2min，再加入500μL不含抗生素的新鲜LB培养基，整个过程需要轻拿轻放，37℃复苏1h；
8、将复苏后的菌液涂布在含相应氨苄抗性的平板上，37℃培养过夜。
5)阳性克隆的验证
1、挑取平板上过夜生长的具有本发明所述PCV2型衣壳蛋白基因的单菌落，过夜培养，温度37℃，转速200rpm；
2、取1μL过夜培养的菌液进行PCR验证；
3、PCR反应条件如下：
PCR程序设定如下：94℃预变性10min；94℃变性30s，60℃退火30s；72℃延伸60s；并设置30个循环；最后72℃延伸10min。不同基因的扩增差异主要在于退火温度和延伸时间，根据公司合成的引物合成单上面的建议温度进行适当调整，扩增的延伸时间根据扩增基因序列长度来确定，对于Taq酶来说，合成1000bp需要大约1min。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的条带的长度约702b。
将阳性克隆菌株进行过夜培养，并提取质粒。质粒提取方法按上海生工的质粒提取试剂盒进行，具体方法参见产品说明书。将提取的质粒进行双酶切验证。将双酶切正切的质粒，进行测序。测序结果如SEQ ID NO.1所示。
经过测序后证明序列正确。pET32a-PCV2质粒图谱如图1所示。
实施例3 表达菌株的构建
1、大肠杆菌感受态的制备与转化，其步骤参考分子克隆手册。挑取BL-21单菌落于LB培养基中，37℃培养过夜；
2、第二天，按1:100的比例转接到新鲜的LB培养基中，培养至OD600＝0.5左右，取1mL菌液，冰浴30min，8000rpm离心1min；
3、弃上清，加入1mL 0.1M的CaCl2，充分混匀，冰浴30min；
4、8000rpm离心1min，弃上清，加入100μL 0.1M的CaCl2，充分混匀，即为感受态细胞；
5、将测序正确的阳性质粒加入100μL制备好的BL-21感受态细胞中，冰浴30min；
6、42℃热激60s，冰浴2min，再加入500μL不含抗生素的新鲜LB培养基，整个过程要轻拿轻放，37℃复苏1h；
7、将复苏后的菌液涂布在含氨苄抗性的平板上，37℃培养过夜；
实施例4 SDS-PAGE以及Western-blot检测目的蛋白的表达
将阳性表达菌株按1:100的接种量接入加入氨苄抗生素的新鲜LB液体培养基，培养至OD600约为0.5时，加入IPTG(终浓度约为0.8mM)诱导8小时左右，收集菌体。利用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白是否表达。兔抗组氨酸标签为抗原，利用Western-blot检测目的蛋白是否有活性。检测结果如图2。通过简单诱导条件优化，实现目的蛋白的表达。
(1)SDS-PAGE检测目的蛋白的表达：
1、清洗蛋白电泳槽以及玻璃板，按照说明书安装蛋白电泳装置；
2、配制分离胶，迅速加入夹板间，保持上层液面和梳子下缘相距1cm左右，停止加入分离胶；
3、迅速加入无水乙醇封住液面，轻轻摇动，使得无水乙醇均匀分散在液面，并防止气泡产生，室温放置30-60min左右，分离胶即凝固；
4、倒掉无水乙醇，用去离子水洗涤分离胶顶部数次，以除去未聚合的丙烯酰胺以及无水乙醇，然后用滤纸吸干残余液体；
5、配制浓缩胶，迅速加入夹板间，垂直插入梳子，在室温下放置30-60min左右，浓缩胶即可完全凝固；
6、去掉玻璃夹板，将配制好的凝胶放入电泳槽，在电泳槽中加入电泳缓冲液，小心拔出梳子；
7、取100μL蛋白样品加入100μL的2×上样缓冲液，在沸水浴中加热变性5-10min后，冷却至室温，12000rpm离心2min，取50μL上清加入凝胶空中；
8、电泳条件设置为电压100V，时间2h；
9、当指示剂跑到凝胶底时停止电泳，拆下玻璃夹板，取出凝胶，加入适量考马斯亮蓝染液进行染色；
10、将染色后的胶块用去离子水清洗数次，加入脱色液脱色直到条带明显。
(2)Western-blot检测目的蛋白的表达：
1、将上述步骤得到的SDS-PAGE电泳凝胶与PVDF膜在甲醇中浸泡约1min，并按照凝胶大小裁剪的滤纸浸泡在转膜缓冲液中，并将凝胶与PVDF膜浸泡在转膜缓冲液中；
2、按从负极到正极的顺序放置滤纸、凝胶与膜，顺序为滤纸—凝胶—PVDF膜—滤纸，轻轻按压去除气泡；
3、转膜电流为100mA，时间为40min；
4、TBST缓冲液清洗膜三次，每次三分钟；
5、封闭液封闭1h，温度为37℃；
6、将膜放入一抗中，4℃孵育过夜，一抗的稀释比例参照说明书进行操作；一抗为兔抗PCV2抗体；
7、TBST洗膜三次，每次3min，继续孵育二抗，孵育温度为37℃，二抗稀释按照1:2000比例参照说明书进行，二抗为羊抗兔IgG抗体；
8、TBST洗膜三次，加入DAB显色液，避光显色10min，观察结果。
实验结果如图2所示，由图2可知，在SDS-PAGE凝胶上，诱导的菌体和未诱导的菌体相比明显多一条带，说明实现了目的基因在大肠杆菌里面表达，然后利用Western-blot方法，证明表达的PCV2衣壳蛋白是有活性的，能够识别PCV2特异性抗体。
实施例5 目的蛋白的可溶表达
利用单因素实验设计，分别对诱导时间(8-24h)、诱导剂IPTG浓度(0.01-0.2mM)、诱导温度(16-37℃)设置不同的水平，对培养条件实验优化，并且对裂解液以及裂解方法也进行一定条件的优化，从而实现PCV2-cap蛋白的可溶表达。
将阳性表达菌株按1:100的接种量接入加入氨苄抗生素的新鲜LB液体培养基，培养至OD600约为0.5时，用终浓度为0.08mM的IPTG在诱导温度32.5℃下诱导16h，收集菌体。
然后将诱导后的菌液在12000rpm，4℃下离心20min，收集菌体，菌体用PBS(pH＝7.2)洗涤两次，然后重悬于裂解液中，用超声波细胞破碎仪进行菌体破碎，破碎程序为：破碎总时间30min，超声3s，停4.3s，破碎温度16℃，破碎功率900×0.3＝270W。破碎后对破碎液进行离心，12000rpm，30min，然后将沉淀和上清进行SDS-PAGE电泳验证。
上述过程采用的裂解液组成如下；终浓度10-100mM Na2HPO4，终浓度1-3mMKH2PO4，终浓度200-500mM NaCl，终浓度2-3mM KCl，终浓度25-100mM咪唑，终浓度1-15mMEDTA，用高浓度NaOH调节pH值至8.0。
优选的，裂解液组成如下：终浓度10mM Na2HPO4，终浓度1.8mMKH2PO4，终浓度240mMNaCl，终浓度2.7mM KCl，终浓度50mM咪唑，终浓度10mM EDTA，用高浓度NaOH调节pH值至8.0
验证结果如图3所示，从图3可以看出，目的蛋白大部分在上清溶液中，而且表达量特别高，上清中的表达量占总目的蛋白表达量的80％以上。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> PCV2型衣壳蛋白基因、表达菌株及可溶性表达方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgacgtatc caaggaggcg ttaccggaga agaagacacc gcccccgcag ccatcttggc 60
cagatcctcc gcagaaggcc atggctggtt catccgcggc accgttaccg ctggagaagg 120
aaaaatggca tcttcaacac ccgcctctcc cgcaccttcg gatatactat caagcgaacg 180
acggttaaaa cgccaagctg ggccgtcgac atgatgagat tcaatattaa cgactttttg 240
ccgccaggag ggggctcaaa cccccgctct gtgccatttg agtactacag aataagaaag 300
gtgaaggtcg aattttggcc ctgttcgcct atcacccaag gcgacagagg ggtcggcagt 360
tcggcggtga ttttggacga caatttcgtg acaaaggcta cggctttaac ttacgaccca 420
tacgtcaact actcctcccg ccataccata acacagccat tcagctacca ctcccgctac 480
tttacgccta aacctgtctt ggattcaact atcgactact tccaaccaaa caacaaaaga 540
aatcagctgt ggctgagact acaaacggct ggaaacgttg accatgtcgg cctcggcacg 600
gctttcgaaa acagtattta cgaccaggag tataatatcc gggtgaccat gtatgtacaa 660
ttcagagaat ttaatcttaa agacccgcca ttgaaccctt aa 702

Claims (10)

1.PCV2型衣壳蛋白基因，其特征在于：所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的PCV2型衣壳蛋白基因，其特征在于：所述基因在大肠杆菌中表达。
3.根据权利要求2所述的PCV2型衣壳蛋白基因，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌BL-21。
4.可溶表达PCV2型衣壳蛋白基因的菌株，其特征在于：宿主菌为大肠杆菌BL-21，表达载体为含有权利要求1所述PCV2型衣壳蛋白基因的pET32a质粒。
5.如权利要求1所述的PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，其特征在于：用终浓度为0.01-0.2mM的IPTG在诱导温度16-37℃下诱导8-24h。
6.根据权利要求5所述的PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，其特征在于：用终浓度为0.08mM的IPTG在诱导温度32.5℃下诱导16h。
7.根据权利要求5所述的PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，其特征在于：所述可溶性表达过程使用的裂解液组成如下：终浓度10-100mM Na2HPO4，终浓度1-3mM KH2PO4，终浓度200-500mM NaCl，终浓度2-3mM KCl，终浓度25-100mM 咪唑，终浓度1-15mM EDTA。
8.根据权利要求7所述的PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，其特征在于：所述裂解液组成如下：终浓度10-100mM Na2HPO4，终浓度1.8mM KH2PO4，终浓度200-500mM NaCl，终浓度2-3mM KCl，终浓度50mM 咪唑，终浓度10mM EDTA。
9.根据权利要求7所述的PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，其特征在于：所述诱导过程使用的裂解液组成如下：终浓度10mM Na2HPO4，终浓度1.8mM KH2PO4，终浓度240mMNaCl，终浓度2.7mM KCl，终浓度50mM咪唑，终浓度10mM EDTA。
10.根据权利要求7所述的PCV2型衣壳蛋白基因的可溶性表达方法，其特征在于：所述裂解液pH为8.0。
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