CN105579060A - Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法 - Google Patents

Pcv2b趋异株疫苗组合物以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于保护猪对抗PCV2的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株，所述组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据本文的SEQ？ID？NO:1的编号，所述ORF2多肽包含位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。

Description

PCV2B趋异株疫苗组合物以及使用方法
技术领域
本发明涉及猪圆环病毒。更具体地说，本发明涉及一种包括PCV2b趋异株(divergent)ORF2抗原的疫苗组合物以及它在用于保护猪对抗包括高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株在内的PCV2以及断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的疫苗中的用途。
背景技术
猪2型圆环病毒(PCV2)是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)的成员，是一种最初在1998年被发现的小型无包膜圆环状病毒。PCV2是在养猪业所遭遇的两种最普遍的病原体之一，另一种是猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，M.hyo)。感染PCV2的猪表现出通常被称为断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的综合征。PMWS在临床上的特征在于衰弱、皮肤苍白、瘦弱、呼吸窘迫、腹泻、黄染、以及黄疸。除了PMWS之外，PCV2还与多种其它疾病有关，包括伪狂犬病、猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)、地方性肺炎、格雷舍氏病(Glasser'sdisease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病(salmonellosis)、断奶后大肠杆菌病、饮食性肝病、以及化脓性支气管肺炎。跨越年龄组的猪的PCV2感染的各种临床表现已经被称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)，并且特征在于衰弱和生长迟缓。PRRS病毒、猪流感病毒(SIV)、猪肺炎支原体以及其它细菌已经作为主要的辅助因子牵涉到PCVAD的产生中。PCVAD已经持续地对全球养猪业构成威胁，从而造成高的经济损失。
PCV2分离株当前被进一步细分成三种基因型：PCV2a、PCV2b、以及PCV2c。PCV2含有两个主要的开放阅读框(ORF)，它们编码与复制(ORF1，945nt)和病毒衣壳(ORF2，702nt)相关的蛋白质。近年来，PCV2已经经历了显著的遗传变异。与典型的PCV2a和PCV2b基因型相比在ORF2编码的衣壳蛋白的C末端处具有另外的赖氨酸(K)的新出现的PCV2突变株在2008年从来自流产的猪的血清样品中被分离出(Guo等,2010,VirologyJournal7:273)。在这种新出现的PCV2突变株中，在基因组序列中的位置1039处的单碱基缺失使得ORF2中的终止密码子发生突变(从UAA突变成AAG)，从而得到705nt的ORF2基因和新的终止密码子(Guo等,2011,VirologyJournal8:291)。此外，Knell等先前已经报道在ORF2基因中可能发生突变，这是因为在一株(基因库号：AY713470)的1767nt基因组中在位置1042处发现缺失(T)，这使得ORF2编码的衣壳蛋白的C末端延长了一个氨基酸(赖氨酸)(Knell等,2005,VeterinaryMicrobiology109:169-177)。Olvera等也已经报道了由于ORF2的终止密码子的突变而使得衣壳蛋白的C末端延长了一个赖氨酸残基(Olvera等,2007,Virology357:175-185)。此外，被称作“JSTZ”的具有基因库登录号JQ413808的PCV2株在中国在患有严重腹泻的仔猪的粪便样品中被检测到和鉴定出，并且对它的完整1767nt基因组进行了测序(Li等,2012,JournalofVirology(jvi.asm.org),第4716页)。基于PCV2株JSTZ的基因组和其它中国PCV2株的ORF的系统发育分析表明PCV2株JSTZ在中国属于一种新型基因型(Li等,2012,同上)。
Guo等评估了被称作PCV2b/rBDHorBDH的PCV2突变株(基因库登录号HM038017)的相对毒力，所述突变株已经在2008年从来自患有PMWS的流产的猪的样品中被回收，并且确认与和典型的PCV2a和PCV2b基因型相关的毒力相比，PCV2突变株在仔猪中具有更大的毒力(Guo等,2012,PLoSONE(plosone.org),第7卷,第7期,e41463,1-10)。这种PCV2突变株表现出与PMWS一致的更严重的体征，特征在于衰弱、咳嗽、呼吸困难、腹泻、被毛粗乱以及抑郁症。此外，对于由所述PCV2突变株攻击的仔猪来说，与由典型的PCV2a和PCV2b攻击的组中的那些相比，病理损伤和病毒血症以及淋巴结、扁桃体、和脾脏中的病毒载量显著更严重。此外，与在由普遍的PCV2a和PCV2b基因型攻击的组中相比，在由所述PCV2突变株攻击的组中，记录到显著更低的平均日增重(Guo等,2012,同上)。
两种PCV2株，即US22625-33和US22664-35最近在位于美国的生产系统中的患有PMWS的猪中的疑似疫苗无效的病例中被鉴定出(Xiao等,2012,JournalofVirology(jvi.asm.org),第86卷,第22期,第12469页)。这两种美国株的全基因组被发现包含1767nt，并且它的ORF2基因的尺寸是705nt，编码234aa的ORF2蛋白质，所述ORF2蛋白质比常见PCV2的ORF2蛋白质长了一个氨基酸。使用典型PCV2a株和PCV2b株的ORF2的核苷酸序列进行的系统发育分析表明这两种美国PCV2株US22625-33和US22664-35与PCV2b密切相关。与典型PCV2b相比，ORF2基因内的单碱基缺失会使得ORF2蛋白质的C末端增添单个氨基酸(赖氨酸)。进一步的序列BLAST和比较证实这两种美国PCV2株与在中国所发现的并且被报道具有增加的毒力的PCV2株BDH具有高水平的同一性(99.9％)。在BDH与这两种美国突变型PCV2之间发现ORF1中的一处沉默突变(1677A→1677T)。根据新的PCV2基因型定义和命名标准(Cortey等,2011,Vet.Microbiol.149:522-523；Segales等,2008,Vet.Rec.162:867-868)，基于对ORF2基因的核苷酸序列的系统发育分析，所有这些新型突变型PCV2株均可以被分类为基因型PCV2b(Xiao等,2012,同上)。
鉴于所述新的PCV2b趋异株的所报道的增加的毒力以及它在美国在疑似疫苗无效病例中的存在，需要的是一种对抗这种新的PCV2b趋异株的有效疫苗。优选地，这种疫苗将与其它猪抗原，如猪肺炎支原体和PRRS病毒相容。
发明内容
本发明提供了一种用于保护猪对抗PCV2的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株，所述组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包含位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。在一个实施方案中，所述组合物还提供了对抗典型PCV2a株和PCV2b株的异源性保护。
在一个实施方案中，所述组合物呈灭活的PCV2b趋异株全病毒的形式，所述全病毒包含和/或表达PCV2b趋异株ORF2多肽。
在另一个实施方案中，所述组合物呈灭活的嵌合病毒的形式，其中所述嵌合病毒包含灭活的重组猪1型圆环病毒，所述灭活的重组猪1型圆环病毒包含和/或表达PCV2b趋异株ORF2多肽。
在又另一个实施方案中，所述组合物呈分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽的形式。在一个实施方案中，所述分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽是由载体表达的。在另一个实施方案中，所述载体是杆状病毒或副痘病毒。在另一个实施方案中，所述载体是活的或灭活的载体。
在一个实施方案中，所述根据SEQIDNO:1的编号包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)的PCV2b趋异株ORF2多肽根据SEQIDNO:1的编号还包括选自由以下各项组成的组的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在另一个实施方案中，所述根据SEQIDNO:1的编号包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)的PCV2b趋异株ORF2多肽根据SEQIDNO:1的编号还包括残基59处的赖氨酸(K)和残基234处的赖氨酸(K)。
在另一个实施方案中，所述根据SEQIDNO:1的编号包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、位置134处的天冬酰胺(N)、残基59处的赖氨酸(K)以及残基234处的赖氨酸(K)的PCV2b趋异株ORF2多肽根据SEQIDNO:1的编号还包括残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在一个实施方案中，所述PCV2趋异株ORF2多肽由氨基酸序列SEQIDNO:1或其片段表示。
在另一个实施方案中，所述包括所述PCV2趋异株ORF2多肽的组合物还包括至少一种另外的猪抗原。在一个实施方案中，所述至少一种另外的抗原具有对抗猪的由微生物所引起的疾病的保护性。
在一个实施方案中，所述微生物包括细菌、病毒、或原生动物。在另一个实施方案中，所述微生物选自但不限于以下各项：猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、猪链球菌(Streptococcumsuis)、猪葡萄球菌(Staphylococcushyicus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillluspleuropneumoniae)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、猪鼻支原体(Mycoplamahyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasmahyosynoviae)、钩端螺旋菌(leptospirabacteria)、细胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)、猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻(PED)病毒、轮状病毒(rotavirus)、细环病毒(Torquetenovirus，TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠道病毒、脑心肌炎病毒、导致奥耶斯基氏病(Aujesky'sDisease)、典型猪瘟(CSF)的病原体以及导致猪传染性胃肠炎的病原体、或其组合。
在一些实施方案中，本发明的组合物还包括佐剂。在一个实施方案中，所述佐剂选自但不限于水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂以及其组合。在另一个实施方案中，本发明的组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种对猪进行免疫接种以对抗包括PCV2b趋异株在内的PCV2的方法，所述方法包括向所述猪施用如上文所述的本发明的组合物。这种用于施用的组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。如上文所述，根据SEQIDNO:1的编号，这种PCV2b趋异株ORF2多肽还可以包括选自以下各项的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在一个实施方案中，所述用于施用的组合物包括包含和/或表达所述PCV2b趋异株ORF2多肽的病毒。在另一个实施方案中，所述用于施用的组合物包括分离的重组PCV2bORF2多肽。
在本发明的方法的一个实施方案中，可以肌内、真皮内、透皮、皮下、鼻内、或口服、或通过本领域技术人员已知的其它途径施用所述组合物。在另一个实施方案中，以单次剂量施用所述组合物。在又另一个实施方案中，将所述组合物作为两次剂量施用。
在另一个实施方案中，向带有对抗PCV2的母源性抗体的猪施用所述组合物。
在一个实施方案中，向3周大或年龄更大的猪施用所述组合物。
本发明还提供了一种试剂盒。这种试剂盒包括包含根据本发明的用于保护猪对抗高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株的疫苗组合物的瓶子。这种疫苗组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。如上文所述，根据SEQIDNO:1的编号，这种PCV2b趋异株ORF2多肽还可以包括选自以下各项的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在所述试剂盒的一个实施方案中，所述疫苗组合物呈包含和/或表达所述PCV2b趋异株ORF2多肽的病毒形式。在所述试剂盒的另一个实施方案中，所述疫苗组合物呈分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽的形式。
在所述试剂盒的一个实施方案中，所述瓶子中的所述疫苗组合物是以即用型液体组合物的形式提供的。在所述试剂盒的另一个实施方案中，所述瓶子中的所述疫苗组合物是以冻干形式提供的。在另一个实施方案中，所述试剂盒可以包括稀释剂。在又另一个实施方案中，所述试剂盒还可以包括说明手册，所述说明手册含有关于所述疫苗组合物的施用的信息。
附图说明
图1示出了被称作“PCV2B-DIV-MUT”的PCV2b趋异株的衣壳序列与典型的PCV2A株(被称作ISU-40895)和典型的PCV2b株(被称作NMB)的衣壳序列之间的氨基酸序列比对。
图2是示出了到处理日时DNA拷贝数的几何最小二乘平均值的图表。*所有的“0”出于绘图的目的被转换成1。
图3是示出了到攻击后的处理日时粪便脱落量(DNA拷贝数)的几何最小二乘平均值的图表。*所有的“0”出于绘图的目的被转换成1。
图4是示出了到处理日时并且通过处理所产生的PCV2ELISAS/PLS平均滴度的图表。
图5是到处理日时DNA拷贝数的经过逆向转换的几何最小二乘平均值的图表。
图6是到攻击后的处理日时粪便脱落量(DNA拷贝数)的经过逆向转换的几何最小二乘平均值的图表。
图7是示出了到研究日时的PCV2ELISAS/PLS平均滴度的图表。
序列简要说明
如本文所用，由SEQIDNO:1至57以及66表示的PCV2分离株是PCV2b趋异株的代表性实例。
SEQIDNO:1是对应于本文被称作PCV2B-DIV-MUT的PCV2b趋异株的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:2是编码本文被称作PCV2B-DIV-MUT的PCV2b趋异株的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:3是对应于具有基因库登录号AB462384的PCV2株798-1的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:4是编码具有基因库登录号AB462384的PCV2株798-1的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:5是对应于具有基因库登录号DQ231516的PCV2株FF的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:6是编码具有基因库登录号DQ231516的PCV2株FF的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:7是对应于具有基因库登录号EF990645的PCV2株VC2002-k2的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:8是编码具有基因库登录号EF990645的PCV2株VC2002-k2的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:9是对应于具有基因库登录号GQ845025的PCV2分离株GY09的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:10是编码具有基因库登录号GQ845025的PCV2株GY09的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:11是对应于具有基因库登录号GQ845028的PCV2分离株XS09的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:12是编码具有基因库登录号GQ845028的PCV2株XS09的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:13是对应于具有基因库登录号HM535640的PCV2分离株SDld01的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:14是编码具有基因库登录号HM535640的PCV2分离株SDld01的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:15是对应于具有基因库登录号HM755880的PCV2分离株SDld02的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:16是编码具有基因库登录号HM755880的PCV2分离株SDld02的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:17是对应于具有基因库登录号HM755881的PCV2分离株HM01的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:18是编码具有基因库登录号HM755881的PCV2分离株HM01的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:19是对应于具有基因库登录号HQ378157的PCV2株NIVS-1的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:20是编码具有基因库登录号HQ378157的PCV2株NIVS-1的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:21是对应于具有基因库登录号JF683394的PCV2分离株C/2010-2*的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:22是编码具有基因库登录号JF683394的PCV2分离株C/2010-2*的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:23是对应于具有基因库登录号JF683408的PCV2分离株G/2009-2的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:24是编码具有基因库登录号JF683408的PCV2分离株G/2009-2的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:25是对应于具有基因库登录号JF927984的PCV2分离株I/2010的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:26是编码具有基因库登录号JF927984的PCV2分离株I/2010的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:27是对应于具有基因库登录号JF927985的PCV2分离株J/2010的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:28是编码具有基因库登录号JF927985的PCV2分离株J/2010的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:29是对应于具有基因库登录号JF927986的PCV2分离株K/2010的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:30是编码具有基因库登录号JF927986的PCV2分离株K/2010的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:31是对应于具有基因库登录号JF927988的PCV2分离株M/2010的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:32是编码具有基因库登录号JF927988的PCV2分离株M/2010的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:33是对应于具有基因库登录号JN006445的PCV2分离株WB/ROM89的衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:34是编码具有基因库登录号JN006445的PCV2分离株WB/ROM89的衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:35是对应于具有基因库登录号JN382188的PCV2分离株EU-RO-F4-3的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:36是编码具有基因库登录号JN382188的PCV2分离株EU-RO-F4-3的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:37是对应于具有基因库登录号JN411096的PCV2分离株HNing09的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:38是编码具有基因库登录号JN411096的PCV2分离株HNing09的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:39是对应于具有基因库登录号JN411099的PCV2分离株YWu09的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:40是编码具有基因库登录号JN411099的PCV2分离株YWu09的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:41是对应于具有基因库登录号JX984586的PCV2分离株CH-IVT4的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:42是具有基因库登录号JX984586的PCV2分离株CH-IVT4的全长衣壳基因的核苷酸序列。
SEQIDNO:43是对应于具有基因库登录号JX984588的PCV2分离株CH-IVT6的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:44是具有基因库登录号JX984588的PCV2分离株CH-IVT6的全长衣壳基因的核苷酸序列。
SEQIDNO:45是对应于具有基因库登录号JX984589的PCV2分离株CH-IVT7的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:46是具有基因库登录号JX984589的PCV2分离株CH-IVT7的全长衣壳基因的核苷酸序列。
SEQIDNO:47是对应于具有基因库登录号JX984590的PCV2分离株的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:48是具有基因库登录号JX984590的PCV2分离株的全长衣壳基因的核苷酸序列。
SEQIDNO:49是对应于具有基因库登录号JX984591的PCV2分离株CH-IVT9的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:50是具有基因库登录号JX984591的PCV2分离株CH-IVT9的全长衣壳基因的核苷酸序列。
SEQIDNO:51是对应于具有基因库登录号JX984592的PCV2分离株CH-IVT10的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:52是具有基因库登录号JX984592的PCV2分离株CH-IVT10的全长衣壳基因的核苷酸序列。
SEQIDNO:53是对应于具有基因库登录号JX984593的PCV2分离株CH-IVT11的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:54是具有基因库登录号JX984593的PCV2分离株CH-IVT11的全长衣壳基因的核苷酸序列。
SEQIDNO:55是对应于具有基因库登录号JX519293的PCV2分离株GDYX的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:56是编码具有基因库登录号JX519293的PCV2分离株GDYX的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:57是具有基因库登录号JX519293的PCV2分离株GDYX的全基因组序列。
SEQIDNO:58是对应于具有基因库登录号AF264042的典型PCV2a分离株ISU-40895的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:59是编码具有基因库登录号AF264042的PCV2a分离株ISU-40895的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:60是对应于具有基因库登录号AF055392的典型PCV2a分离株Imp.1010-Stoon的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:61是编码具有基因库登录号AF055392的典型PCV2a分离株Imp.1010-Stoon的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:62是对应于具有基因库登录号GU799576的典型PCV2b株NMB的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:63是编码具有基因库登录号GU799576的典型PCV2b分离株NMB的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:64是对应于具有基因库登录号EU148503的典型PCV2c株DK1980PMWSfree的全长衣壳的氨基酸序列。
SEQIDNO:65是编码具有基因库登录号EU148503的典型PCV2c株DK1980PMWSfree的全长衣壳的核苷酸序列。
SEQIDNO:66是被称作“PCV2b-DIV-MUT”的PCV2趋异株的全基因组序列。
具体实施方式
除非上下文另外明确规定，否则如本说明书和权利要求书中所用的单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数指代对象。举例来说，术语“一种/个蛋白质抗原”包括多种/个蛋白质抗原，包括其混合物在内。
如本文所用的术语“包含”意图意指所述组合物和方法包括所叙述的要素，但是并不排除其它要素。
如本文所用的术语“PCV2b趋异株(PCV2bdivergentstrain)”、“PCV2b趋异株(PCV2bdivergent)”、“PCV2突变株”、“新型突变型PCV2”、“突变型PCV2”等指的是编码ORF2衣壳多肽的高毒力PCV2b株，根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2衣壳多肽包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。根据SEQIDNO:1的编号，所编码的PCV2b趋异株ORF2多肽还可以包括选自以下各项的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
如本文所用的术语“PCV2b趋异株ORF2多肽”意图包括包含和/或表达PCV2b趋异株ORF2多肽的病毒，因此所述ORF2多肽是所述病毒本身的组分(例如所述病毒的蛋白质外壳)。所述病毒可以是PCV，但是不应当被解释成限于此，并且可以包括其它病毒。这个术语还意图包括分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽。
术语“抗原”指的是可以在动物体内刺激抗体产生或T细胞反应或这两者的化合物、组合物、或免疫原性物质，包括注射或吸收到动物体内的组合物。可以对整个分子、或所述分子的一部分(例如表位或半抗原)产生免疫反应。术语“抗原”可以包括全病毒、多肽、或其片段。
如本文所用的术语“疫苗组合物”包括处于药学上可接受的媒介物中可用于诱导宿主的免疫反应的至少一种抗原或免疫原。在考虑到诸如接受动物的年龄、性别、体重、物种和病况以及施用途径的因素的情况下，可以医学或兽医学领域的技术人员熟知的剂量和技术施用疫苗组合物。所述施用途径可以是经皮、经由粘膜施用(例如口服、经鼻、经肛门、经阴道)或经由肠胃外途径(真皮内、透皮、肌内、皮下、静脉内、或腹膜内)。疫苗组合物可以被单独施用，或可以与其它治疗或疗法共同施用或相继施用。施用形式可以包括悬浮液、糖浆或酏剂、以及用于肠胃外、皮下、真皮内、肌内或静脉内施用(例如注射施用)的制剂，如无菌悬浮液或乳液。疫苗组合物可以作为喷雾剂被施用，或混合在食物和/或水中，或在与合适的载体、稀释剂、或赋形剂，如无菌水、生理盐水、葡萄糖等的混合物中被递送。所述组合物可以含有辅剂物质，如湿润剂或乳化剂、pH值缓冲剂、佐剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于施用途径和所期望的制剂。可以查阅标准药学教科书，如“《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceuticalSciences)”(1990年)以制备合适的制剂而无需过度实验。
如本文所定义的“免疫原性或免疫组合物”指的是包含至少一种抗原的物质组合物，所述抗原在对所关注的组合物或疫苗产生细胞免疫反应和/或抗体介导的免疫反应的宿主中引出免疫反应。
如本文所用的术语“免疫反应”指的是在动物中所引出的反应。免疫反应可以指的是细胞免疫(CMI)、体液免疫、或可以涉及这两者。本发明还涵盖了限于免疫系统的一部分的反应。通常，“免疫反应”包括但不限于以下效应中的一种或多种：特异性针对所关注的组合物或疫苗中所包括的一种或多种抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞、和/或细胞毒性T细胞和/或ydT细胞的产生或激活。优选地，所述宿主将表现出治疗性或保护性免疫反应，以使得对新感染的抗性将得以增强，和/或疾病的临床严重程度减轻。这样的保护将表现为通常由受感染宿主所表现的症状的减少或缺乏、恢复时间更快、和/或受感染宿主的病毒滴度降低。
如本文所用的术语“免疫原性”意指能够在宿主动物中针对一种或多种抗原产生免疫反应。这种免疫反应形成了由疫苗所引出的对抗特定的感染性生物体的保护性免疫的基础。
如本文所用的“佐剂”意指包含增强对一种或多种抗原的免疫反应的一种或多种物质的组合物。佐剂如何起作用的机制并不是完全已知的。一些佐剂被认为通过缓慢释放抗原来增强免疫反应，而其它佐剂本身就具有强免疫原性，并且被认为起协同作用。
如本文所用的术语“多价”意指含有多于一种抗原的疫苗，无论所述抗原是来自相同的微生物物种(例如猪肺炎支原体或PCV的不同分离株)，还是来自不同的物种(例如来自溶血巴氏杆菌(Pasteurellahemolytica)和多杀性巴氏杆菌这两者的分离株)；或含有来自不同属的抗原的组合的疫苗(例如包含来自多杀性巴氏杆菌、沙门氏菌属(Salmonella)、大肠杆菌、睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus)以及梭菌属(Clostridium)的抗原的疫苗)。
如本文所用的术语“猪”或“仔猪”意指猪来源的动物，而“大母猪”指的是具有繁殖年龄和繁殖能力的雌性猪。“小母猪”是从未妊娠的雌性猪。
如本文所用的术语“有毒力”意指分离株保持它在动物宿主中具有感染性的能力并且能够在宿主动物中引起疾病。
“灭活疫苗”意指含有不再能够复制或生长的感染性生物体或病原体的疫苗组合物。所述病原体在来源上可以是细菌的、病毒的、原生动物的或真菌的。灭活可以通过多种方法来实现，所述方法包括冷冻-解冻、化学处理(例如用β-丙内酯(BPL)或福尔马林处理)、超声处理、放射、热、或足以阻止所述生物体复制或生长，同时维持它的免疫原性的任何其它常规手段。
如本文所用的术语“变体”指的是多肽或编码多肽的核酸序列，它具有一处或多处保守氨基酸变异或其它微小修饰，以使得相应的多肽在与野生型多肽相比时具有基本上等同的功能。术语“变体”同样还可以指的是包含具有所述变异或修饰的多肽或核酸序列的微生物。
“保守变异”表示氨基酸残基被另一个在生物学上相似的残基置换、或核酸序列中的核苷酸被置换以使得所编码的氨基酸残基没有发生变化或是另一个在生物学上相似的残基。保守变异的实例包括一个疏水性残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水性残基、或一个极性残基被另一个极性残基取代，如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。术语“保守变异”还包括取代的氨基酸置换亲本氨基酸，前提条件是针对取代的多肽所产生的抗体也与亲本(未取代)多肽发生免疫反应。
如本文所用的术语“药学上可接受的载体”和“药学上可接受的媒介物”是可互换的，并且指的是可以被注射到宿主体内而没有不良作用的用于含有疫苗抗原的流体媒介物。本领域已知的合适的药学上可接受的载体包括但不限于无菌水、盐水、葡萄糖、右旋糖、或缓冲溶液。载体可以包括辅剂，包括但不限于稀释剂、稳定剂(即糖和氨基酸)、防腐剂、湿润剂、乳化剂、pH值缓冲剂、粘度增强添加剂、着色添加剂等。
“北美PRRS病毒”意指具有与北美PRRS病毒分离株相关的遗传特征的任何PRRS病毒，所述北美PRRS病毒分离株诸如但不限于最初在约20世纪90年代早期在美国分离的PRRS病毒(参见例如Collins,J.E.等,1992,J.Vet.Diagn.Invest.4:117-126)；北美PRRS病毒分离株MN-1b(Kwang,J.等,1994,J.Vet.Diagn.Invest.6:293-296)；PRRS病毒的QuebecLAF-exp91株(Mardassi,H.等,1995,Arch.Virol.140:1405-1418)；以及北美PRRS病毒分离株VR2385(Meng,X.-J等,1994,J.Gen.Virol.75:1795-1801)。北美PRRS病毒株的另外的实例是本领域已知的。遗传特征指的是北美PRRS病毒株所共有的基因组核苷酸序列相似性和氨基酸序列相似性。中国PRRS病毒株一般与北美病毒株显示出约80％-93％的核苷酸序列相似性。
“欧洲PRRS病毒”指的是具有与最初在约1991年在欧洲分离的PRRS病毒相关的遗传特征的任何PRRS病毒株(参见例如Wensvoort,G.等,1991,Vet.Q.13:121-130)。“欧洲PRRS病毒”在本领域中有时也被称作“莱利斯塔德病毒(Lelystadvirus)”。欧洲PRRS病毒株的另外的实例是本领域已知的。
如本文所用，如果遗传修饰的病毒具有比它的未修饰的亲本株小的毒力，那么它是“减毒的”。如果病毒株显示出确定疾病严重程度的一个或多个参数的统计显著性减小，那么它“有更小的毒力”。这些参数可以包括病毒血症、发热的水平、呼吸窘迫的严重程度、繁殖症状的严重程度、或病理损伤的数目或严重程度等。
“感染性克隆”是疾病病原体(例如病毒)的分离或克隆的基因组，所述基因组可以在实验室中被特异性和有意地修饰，然后用于重新形成活的遗传修饰的生物体。由感染性克隆产生的活的遗传修饰的病毒可以用于活病毒疫苗中。或者，可以通过将源自于感染性克隆的活病毒用灭活剂，如福尔马林、β-丙内酯、二乙撑亚胺或疏水性溶剂、酸等、通过用紫外光或X射线辐照、通过加热等处理来制备灭活病毒疫苗。
本发明提供了一种用于保护猪对抗PCV2的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株，所述组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包含位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。如上文所述，根据SEQIDNO:1的编号，这种PCV2b趋异株ORF2多肽还可以包括选自以下各项的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在一个实施方案中，根据SEQIDNO:1的编号包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)的PCV2b趋异株ORF2多肽根据SEQIDNO:1的编号还包括残基59处的赖氨酸(K)和残基234处的赖氨酸(K)。
在另一个实施方案中，根据SEQIDNO:1的编号包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、位置134处的天冬酰胺(N)、残基59处的赖氨酸(K)以及残基234处的赖氨酸(K)的PCV2b趋异株ORF2多肽根据SEQIDNO:1的编号还包括残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在一个实施方案中，所述PCV2趋异株ORF2多肽由氨基酸序列SEQIDNO:1或其片段表示。然而，本发明不限于这个实施方案。举例来说，在其它实施方案中，所述PCV2趋异株ORF2多肽可以选自但不限于氨基酸序列SEQIDNO:3或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:5或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:7或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:9或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:11或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:13或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:13或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:15或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:17或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:19或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:21或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:23或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:25或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:27或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:29或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:31或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:33或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:35或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:37或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:39或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:41或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:43或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:45或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:47或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:49或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:51或其片段；氨基酸序列SEQIDNO:53或其片段；或氨基酸序列SEQIDNO:55或其片段。
在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包括至少一种另外的抗原。在一个实施方案中，所述至少一种另外的抗原具有对抗猪的由微生物所引起的疾病的保护性。
在一些实施方案中，所述至少一种另外的抗原组分具有对抗猪的由已知会感染猪的细菌、病毒、或原生动物所引起的疾病的保护性。这些微生物的实例包括但不限于以下各项：猪肺炎支原体、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、支气管炎博德特氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、红斑丹毒丝菌、猪鼻支原体、猪滑液支原体、钩端螺旋菌、细胞内劳森菌、猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻(PED)病毒、猪轮状病毒(例如A群、B群以及C群)、细环病毒(TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠道病毒、脑心肌炎病毒、导致奥耶斯基氏病、典型猪瘟(CSF)的病原体以及导致猪传染性胃肠炎的病原体、或其组合。
在一个实施方案中，所述至少一种另外的抗原是猪肺炎支原体(M.hyo)。在另一个实施方案中，所述至少一种另外的抗原是PRRS病毒，如北美PRRS病毒株、中国PRRS病毒株、或欧洲PRRS病毒株。还预期的是，至少一种另外的抗原可以是PCV2的不同分离株，如典型的PCV2a株、典型的PCV2b株、或其它PCV2基因型。
在一个实施方案中，所述组合物呈包含和/或表达PCV2b趋异株ORF2多肽的灭活的PCV2b趋异株全病毒的形式。
在一个实施方案中，所述PCV2b趋异株全病毒的ORF2衣壳基因对应于SEQIDNO:2。在另一个实施方案中，由PCV2b趋异株全病毒表达的PCV2b趋异株ORF2多肽的氨基酸序列对应于SEQIDNO:1或其片段。然而，本发明不限于这些实施方案。举例来说，在一些实施方案中，由PCV2b趋异株全病毒表达的PCV2b趋异株ORF2多肽可以选自以下序列或其片段中的任一个：SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、或SEQIDNO:55。相应的ORF2基因序列描述于本文中。
在另一个实施方案中，所述组合物呈灭活的嵌合病毒的形式，其中所述嵌合病毒包含灭活的重组猪1型圆环病毒，所述灭活的重组猪1型圆环病毒包含和/或表达PCV2b趋异株ORF2多肽(嵌合PCV1-2b病毒)。嵌合的猪圆环病毒以及它们的制备方法描述于WO03/049703A2中，并且还描述于美国专利号7,279,166和7,575,752中，这些文献以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，嵌合PCV1-2病毒的ORF2衣壳基因对应于SEQIDNO:2。在另一个实施方案中，由嵌合PCV1-2b病毒表达的PCV2b趋异株ORF2多肽的氨基酸序列对应于SEQIDNO:1或其片段。然而，本发明不限于这些实施方案。举例来说，在一些实施方案中，由嵌合PCV1-2b病毒表达的PCV2b趋异株ORF2多肽可以选自以下序列或其片段中的任一个：SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、或SEQIDNO:55。
在又另一个实施方案中，所述组合物呈分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽的形式。在一个实施方案中，所述分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽是由载体，如杆状病毒表达的。或者，可以使用其它已知的表达载体，诸如包括但不限于副痘病毒载体。在一个实施方案中，所述载体可以是活的或灭活的载体。
在另一个实施方案中，所述重组表达的PCV2b趋异株ORF2多肽对应于SEQIDNO:1或其片段。或者，在一些实施方案中，所述重组表达的PCV2b趋异株ORF2多肽可以选自以下序列或其片段中的任一个：SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:11、SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:21、SEQIDNO:23、SEQIDNO:25、SEQIDNO:27、SEQIDNO:29、SEQIDNO:31、SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、SEQIDNO:41、SEQIDNO:43、SEQIDNO:45、SEQIDNO:47、SEQIDNO:49、SEQIDNO:51、SEQIDNO:53、或SEQIDNO:55。
在一些形式中，在所述组合物中使用PCV2趋异株ORF2蛋白质的免疫原性部分作为抗原组分。举例来说，可以在本发明的组合物中使用PCV2趋异株ORF2蛋白质的截短和/或取代形式或片段。
本领域技术人员应当了解的是，可以在本发明的组合物中使用PCV2b趋异株ORF2多肽的变体，前提条件是它们仍保留使得它可用于本发明的疫苗组合物中的抗原特征。优选地，PCV2b趋异株变体与被称作PCV2B-DIV-MUT的PCV2分离株的全长基因组序列具有至少80％，优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％序列同一性。可以例如通过如实施例中所提供的攻击实验来估计免疫组合物的抗原特征。此外，当修饰的PCV2b趋异株ORF2抗原与具有SEQIDNO:1的野生型PCV2b趋异株ORF2蛋白质相比赋予至少70％，优选地80％，更优选地90％的保护性免疫时，所述修饰的抗原的抗原特征仍被保留。
所述PCV2b趋异株ORF2抗原组分以有效诱导所期望的免疫反应的抗原纳入水平提供于免疫原性/疫苗组合物中，所述所期望的免疫反应即减少由感染高毒力PCV2b株所引起的临床体征的发病或减轻所述临床体征的严重程度，所述高毒力PCV2b株的实例是本文被称作PCV2B-DIV-MUT的病毒。在一些实施方案中，所述组合物还提供对抗典型PCV2a株和PCV2b株的异源性保护。
在一个实施方案中，根据本发明的疫苗组合物呈包含和/或表达PCV2b趋异株ORF2多肽的灭活的重组猪1型圆环病毒(嵌合PCV1-2bDIV病毒)的形式。这种嵌合病毒以至少1.0≤RP≤5.0的水平包括在本发明的组合物中，其中RP是通过ELISA抗原定量(体外效力测试)与参考疫苗相比所确定的相对效力单位。在另一个实施方案中，嵌合PCV1-2bDIV病毒以约0.5％至约5％的20倍(20×)浓缩的本体PCV1-2bDIV抗原的最终浓度包括在本发明的组合物中。
在另一个实施方案中，根据本发明的疫苗组合物呈包含和/或表达PCV2b趋异株ORF2多肽的灭活的PCV2b趋异株全病毒的形式。这种病毒以至少1.0≤RP≤5.0的水平包括在本发明的组合物中，其中RP是通过ELISA抗原定量(体外效力测试)与参考疫苗相比所确定的相对效力单位。在另一个实施方案中，灭活的PCV2b趋异株全病毒以约0.5％至约5％的20倍(20×)浓缩的本体PCV2b趋异株ORF2抗原的最终浓度包括在本发明的组合物中。
在又另一个实施方案中，根据本发明的疫苗组合物呈分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽的形式。所述PCV2b趋异株ORF2重组蛋白可以每毫升最终免疫原性/疫苗组合物至少0.2μg的抗原(μg/ml)的水平包括在本发明的组合物中。在另一个实施方案中，所述重组PCV2b趋异株ORF2多肽纳入水平是约0.2μg/ml至约400μg/ml。在又另一个实施方案中，所述重组PCV2b趋异株ORF2多肽纳入水平是约0.3μg/ml至约200μg/ml。在再另一个实施方案中，所述重组PCV2b趋异株ORF2多肽纳入水平是约0.35μg/ml至约100μg/ml。在再另一个实施方案中，所述重组PCV2b趋异株ORF2多肽纳入水平是约0.4μg/ml至约50μg/ml。
在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽和至少一种猪肺炎支原体可溶性抗原(例如两种或更多种)的组合。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽和以下猪肺炎支原体特异性蛋白质抗原中的一种或多种：具有约46kD(p46)、64kD(p64)以及97kD(p97)分子量的猪肺炎支原体蛋白质。具有约64kD的猪肺炎支原体蛋白质(p64)或者可以被称为由Kim等[Infect.Immun.58(8):2637-2643(1990)]以及美国专利号5,788,962所述的来自猪肺炎支原体的p65表面抗原。Futo等描述了可以用于本发明的组合物中的来自猪肺炎支原体的46kD表面蛋白的克隆和表征[J.Bact177:1915-1917(1995)]。Zhang等描述并且表征了猪肺炎支原体的p97粘附素蛋白[Infect.Immun.63:1013-1019,1995]。此外，King等描述了来自猪肺炎支原体的P-5722株的被称作Mhp1的124kD蛋白质并且呈现了表明Mhp1和p97是相同蛋白质的数据[Vaccine15:25-35(1997)]。这些p97蛋白质可以用于本发明的组合物中。本发明的疫苗组合物还可以包括猪肺炎支原体特异性蛋白质抗原，诸如但不限于约41kD(p41)、42kD(p42)、89kD(p89)、以及65kD(p65)的蛋白质。参见Okada等,2000,J.Vet.Med.B47:527-533以及Kim等,1990,Infect.Immun.58(8):2637-2643。此外，猪肺炎支原体组分可以包括约102kD(p102)和216kD(p216)的猪肺炎支原体特异性蛋白质抗原。参见Minion等的美国专利号6,162,435和7,419,806。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽、至少一种猪肺炎支原体可溶性抗原(例如两种或更多种)、以及PRRS病毒抗原的组合。用于本发明的PCV2b趋异株/猪肺炎支原体/PRRS组合物中的合适的PRRS病毒抗原包括北美PRRS病毒分离株、中国PRRS病毒株、和欧洲PRRS病毒株、以及这些分离株/株的遗传修饰型式。在一个实施方案中，用于根据本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是北美PRRS病毒。
在一些实施方案中，用于本发明的组合物中的PRRS病毒抗原组分是被命名为P129的北美PRRS病毒分离株或其活的遗传修饰型式。优选地，所述遗传修饰的PRRS病毒不能产生病原感染，而能够引出对抗野生型PRRS病毒感染的有效的免疫保护性反应。
用于本发明的组合物中的遗传修饰的PRRS病毒可以由感染性克隆产生。被命名为P129的北美PRRS病毒分离株的感染性cDNA克隆的制备描述于美国专利号6,500,662中，该美国专利在此以引用的方式完全并入本文。P129cDNA的序列公开在基因库登录号AF494042和美国专利号6,500,662中。
在一个实施方案中，PCV2b趋异株/猪肺炎支原体组合疫苗是作为单次剂量1瓶装疫苗提供的。在另一个实施方案中，PCV2b趋异株/猪肺炎支原体/PRRS病毒组合疫苗是作为单次剂量2瓶装疫苗提供的。举例来说，在一些实施方案中，PCV2b趋异株/猪肺炎支原体组合是作为稳定的液体组合物提供于第一个瓶子中，并且PRRS病毒是以冻干状态提供于第二个瓶子中。在一些实施方案中，可以将另外的猪抗原添加到第一个瓶子或第二个瓶子中。
在一个实施方案中，PRRS病毒组分是以冻干的遗传修饰的活病毒形式提供的。在施用之前，可以使用来自第一个瓶子的PCV2b趋异株/猪肺炎支原体液体将第二个瓶子中的PRRS病毒再水化以使可以单次剂量向动物施用所有三种抗原。
本发明的疫苗可以遵循公认的惯例来配制以包括用于包括人类(如果适用的话)在内的动物的药学上可接受的载体，如标准缓冲剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且还可以被配制以有助于持续释放。稀释剂包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等渗的添加剂包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨糖醇、以及乳糖等等。稳定剂包括白蛋白等等。其它合适的疫苗媒介物和添加剂，包括特别可用于配制修饰的活疫苗的那些是本领域技术人员已知的或对于本领域技术人员来说将是显而易见的。参见例如《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceuticalScience),第18版,1990,MackPublishing，该文献以引用的方式并入本文。
本发明的疫苗还可以包含一种或多种另外的免疫调节组分，例如像佐剂或细胞因子等等。用于本发明的组合物中的合适佐剂的类型包括以下各项：水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂以及其组合。佐剂的一些具体实例包括但不限于完全弗氏佐剂(completeFreund'sadjuvant)、不完全弗氏佐剂、小棒状杆菌(Corynebacteriumparvum)、卡介苗(BacillusCalmetteGuerin)、氢氧化铝凝胶、葡聚糖、硫酸右旋糖酐、氧化铁、藻酸钠、细菌佐剂(Bacto-Adjuvant)、某些合成聚合物，如聚氨基酸以及氨基酸的共聚物、嵌段共聚物(佐治亚州亚特兰大的CytRx公司(CytRx,Atlanta,Ga.))、QS-21(马萨诸塞州剑桥的剑桥生物科技公司(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMass.))、SAF-M(加利福尼亚州埃默里维尔的Chiron公司(Chiron,EmeryvilleCalif.))、佐剂、皂角苷、QuilA或其它皂角苷级分、单磷酰脂质A、以及Avridine脂质-胺佐剂(N,N-二-十八烷基-N',N'-双(2-羟乙基)-丙二胺)、“REGRESSIN”(佐治亚州雅典城的Vetrepharm公司(Vetrepharm,Athens,Ga.))、石蜡油、RIBI佐剂系统(蒙大拿州汉密尔顿的Ribi公司(RibiInc.,Hamilton,Mont.))、胞壁酰二肽等。
可用于本发明的疫苗中的水包油乳液的非限制性实例包括改性的SEAM62和SEAM1/2制剂。改性的SEAM62是含有以下各项的水包油乳液：5％(v/v)角鲨烯(西格玛公司(Sigma))、1％(v/v)85洗涤剂(ICI表面活性剂公司(ICISurfactants))、0.7％(v/v)80洗涤剂(ICI表面活性剂公司)、2.5％(v/v)乙醇、200μg/mlQuilA、100μg/ml胆固醇、以及0.5％(v/v)卵磷脂。改性的SEAM1/2是包含以下各项的水包油乳液：5％(v/v)角鲨烯、1％(v/v)85洗涤剂、0.7％(v/v)Tween80洗涤剂、2.5％(v/v)乙醇、100μg/mlQuilA、以及50μg/ml胆固醇。
可用于本发明的组合物中的佐剂的另一个实例是SP油。如本说明书和权利要求书中所用的术语“SP油”表示包含聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、角鲨烷、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯以及缓冲盐溶液的油乳液。聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物是有助于悬浮固体组分和液体组分的表面活性剂。这些表面活性剂是可以商品名的聚合物商购获得的。优选的表面活性剂是可以商品名L-121商购获得的泊洛沙姆401。一般来说，SP油乳液是免疫刺激性佐剂混合物，它将包含约1％至3％体积/体积的嵌段共聚物、约2％至6％体积/体积的角鲨烷，更特别是约3％至6％的角鲨烷、以及约0.1％至0.5％体积/体积的聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯，其余部分是缓冲盐溶液。在一个实施方案中，SP油乳液以约1％至25％，优选地约2％至15％，更优选地约5％至12％v/v的体积/体积量存在于最终的组合物中。
用于本发明的组合物中的合适的佐剂的又另一个实例是AMPHIGENTM佐剂，它由溶解在油，通常是轻液体石蜡中的脱油卵磷脂组成。
可用于本发明的组合物中的佐剂的其它实例是以下专有佐剂：MicrosolDiluvac双乳液佐剂系统、Emunade佐剂、以及Xsolve佐剂。Emunade佐剂和Xsolve佐剂这两者是轻质矿物油在水中的乳液，但是Emunade还含有铝胶，并且d,l-α-生育酚乙酸酯是XSolve佐剂的一部分。用于本发明的组合物中的合适的佐剂的再另一个实例是ImpranFLEXTM佐剂(油包水佐剂)。合适的佐剂的再另一个实例是基于卡波姆(Carbomer)的佐剂。优选的佐剂包括934聚合物和941聚合物。
在一个实施方案中，以每剂约100μg至约10mg的量添加佐剂或佐剂混合物。在另一个实施方案中，以每剂约200μg至约5mg的量添加佐剂/佐剂混合物。在又另一个实施方案中，以每剂约300μg至约1mg的量添加佐剂/佐剂混合物。
佐剂或佐剂混合物通常以约1％至25％，优选地约2％至15％，更优选地约5％至12％v/v的体积/体积量存在于本发明的疫苗组合物中。
可以被包括在所述疫苗中的其它“免疫调节剂”包括例如一种或多种白细胞介素、干扰素、或其它已知的细胞因子。在一个实施方案中，所述佐剂可以是环糊精衍生物或聚阴离子聚合物，如分别在美国专利号6,165,995和6,610,310中所述的那些。
本发明还提供了一种对猪进行免疫接种以对抗PCV2b趋异株的方法，所述方法包括向所述猪施用如上文所述的根据本发明的组合物。这种用于施用的组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。如上文所述，根据SEQIDNO:1的编号，这种PCV2b趋异株ORF2多肽还可以包括选自以下各项的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在一个实施方案中，所述用于施用的组合物包括包含和/或表达所述PCV2b趋异株ORF2多肽的病毒。在另一个实施方案中，所述用于施用的组合物包括分离的重组PCV2bORF2多肽。
在本发明的方法的一个实施方案中，肌内、真皮内、透皮、皮下、或口服施用所述组合物。在另一个实施方案中，以单次剂量施用所述组合物。在又另一个实施方案中，将所述组合物作为两次剂量施用。
在另一个实施方案中，向带有对抗PCV2的母源性抗体的猪施用所述组合物。
在一个实施方案中，向3周大或年龄更大的猪施用所述组合物。
在考虑到诸如接受动物的年龄、性别、体重、物种和病况以及施用途径的因素的情况下，可以医学或兽医学领域的技术人员熟知的剂量和技术施用根据本发明的疫苗组合物。所述施用途径可以是经皮、经由粘膜施用(例如口服、经鼻、经肛门、经阴道)或经由肠胃外途径(真皮内、透皮、肌内、皮下、静脉内、或腹膜内)。根据本发明的疫苗组合物可以被单独施用，或可以与其它治疗或疗法共同施用或相继施用。施用形式可以包括悬浮液、糖浆或酏剂、以及用于肠胃外、皮下、真皮内、肌内或静脉内施用(例如注射施用)的制剂，如无菌悬浮液或乳液。根据本发明的疫苗组合物可以作为喷雾剂被施用，或混合在食物和/或水中，或在与合适的载体、稀释剂、或赋形剂，如无菌水、生理盐水、葡萄糖等的混合物中被递送。所述组合物可以含有辅剂物质，如湿润剂或乳化剂、pH值缓冲剂、佐剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等，这取决于施用途径和所期望的制剂。
本发明还提供了一种试剂盒。这种试剂盒包括容纳根据本发明的用于保护猪对抗高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株的疫苗组合物的瓶子。这种疫苗组合物包括PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包括位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。如上文所述，根据SEQIDNO:1的编号，这种PCV2b趋异株ORF2多肽还可以包括选自以下各项的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
在所述试剂盒的一个实施方案中，所述疫苗组合物呈包含和/或表达所述PCV2b趋异株ORF2多肽的病毒形式。在所述试剂盒的另一个实施方案中，所述疫苗组合物呈分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽的形式。
在本发明的试剂盒的一个实施方案中，所述瓶子中的疫苗组合物是以即用型液体组合物的形式提供的。在所述试剂盒的另一个实施方案中，所述瓶子中的所述疫苗组合物是以冻干形式提供的。在另一个实施方案中，所述试剂盒可以包括稀释剂。在又另一个实施方案中，所述试剂盒还可以包括说明手册，所述说明手册含有关于所述疫苗组合物的施用的信息。
本发明的另一个方面提供了产生呈灭活的嵌合病毒形式的疫苗组合物的方法，其中所述嵌合病毒包括表达PCV2b趋异株ORF2多肽的灭活的重组猪1型圆环病毒。嵌合的猪圆环病毒和它们的制备方法描述于WO03/049703A2中，并且还描述于美国专利号7,279,166和7,575,752中。产生包括表达PCV2b趋异株ORF2多肽的灭活的PCV1的嵌合猪圆环病毒的方法描述于以下实施例1中。在一个实施方案中，通过将灭活的cPCV1-2b病毒与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的载体组合来制备最终的组合物。
本发明的另一个方面提供了产生呈灭活的PCV2b趋异株全病毒形式的疫苗组合物的方法，所述灭活的PCV2b趋异株全病毒表达PCV2b趋异株ORF2多肽。这样的方法描述于以下实施例3中。在一个实施方案中，通过将灭活的PCV2B-DIV-MUT病毒与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的载体组合来制备最终的组合物。
本发明的又另一个方面提供了产生重组PCV2趋异株ORF2蛋白质的方法，所述方法是通过以下步骤实现的：i)用含有PCV2趋异株ORF2DNA编码序列的重组病毒载体感染培养物中的易感细胞，其中由所述重组病毒载体表达ORF2蛋白质，以及ii)之后，回收上清液中的ORF2蛋白质。通常，可以在上清液中回收大量的PCV2趋异株ORF2蛋白质。大量的PCV2趋异株ORF2意指每毫升上清液多于约20μg，优选多于约25μg/mL，甚至更优选多于约30μg/mL，甚至更优选多于约40μg/mL，甚至更优选多于约50μg/mL，甚至更优选多于约60μg/mL，甚至更优选多于约80μg/mL，甚至更优选多于约100μg/mL，甚至更优选多于约150μg/mL，最优选多于约190μg/mL。
优选的细胞培养物具有以下细胞计数：约0.3×106-2.0×106个细胞/毫升，更优选地约0.35×106-1.9×106个细胞/毫升，还更优选地约0.4×106-1.8×106个细胞/毫升，甚至更优选地约0.45×106-1.7×106个细胞/毫升，并且最优选地约0.5×106-1.5×106个细胞/毫升。优选的细胞是可由本领域技术人员确定的。优选的细胞是容易感染适当的重组病毒载体的那些，所述载体含有PCV2趋异株ORF2DNA并且表达PCV2趋异株ORF2蛋白质。优选地，所述细胞是昆虫细胞，并且更优选地，它们包括以商标Sf+昆虫细胞(康涅狄格州梅里登的蛋白质科技公司(ProteinSciencesCorporation,Meriden,Conn.))出售的昆虫细胞。
适当的生长培养基也将可由本领域技术人员确定，优选的生长培养基是无血清昆虫细胞培养基，如Excell420(堪萨斯州列涅萨的JRH生物科技公司(JRHBiosciences,Inc.,Lenexa,Kans.))等。优选的病毒载体包括杆状病毒，如BaculoGold(加利福尼亚州圣地亚哥的BDBiosciencesPharmingen公司(BDBiosciencesPharmingen,SanDiego,Calif.))，特别是如果产生细胞是昆虫细胞的话。尽管杆状病毒表达系统是优选的，但是本领域技术人员应当了解的是，其它表达系统将起作用以实现本发明的目的，即将PCV2趋异株ORF2表达到细胞培养物的上清液中。这样的其它表达系统可能需要使用信号序列以使得ORF2表达到培养基中。然而，当由杆状病毒表达系统产生ORF2时，它则通常不需要任何信号序列或另外的修饰以使得ORF2表达到培养基中。认为这种蛋白质可以独立地形成病毒样颗粒(JournalofGeneralVirology2000,第81卷,第2281-2287页)，并且被分泌到培养上清液中。含有PCV2趋异株ORF2DNA序列的重组病毒载体在用于感染易感细胞时具有约0.03-1.5，更优选地约0.05-1.3，还更优选地约0.09-1.1，并且最优选地约0.1-1.0的优选的感染复数(MOI)。优选地，上述的MOI涉及一毫升的细胞培养流体。优选地，本文所述的方法包括用重组病毒载体感染0.35×106-1.9×106个细胞/毫升，还更优选地约0.4×106-1.8×106个细胞/毫升，甚至更优选地约0.45×106-1.7×106个细胞/毫升，并且最优选地约0.5×106-1.5×106个细胞/毫升，所述重组病毒载体含有PCV2趋异株ORF2DNA并且表达PCV2趋异株ORF蛋白质，具有约0.03-1.5，更优选地约0.05-1.3，还更优选地约0.09-1.1，并且最优选地约0.1-1.0的MOI(感染复数)。
然后经过最长十天，更优选地约两天至约十天，还更优选地约四天至约九天，并且最优选地约五天至约八天的时间孵育受感染的细胞。优选的孵育条件包括约22℃-32℃，更优选地约24℃-30℃，还更优选地约25℃-29℃，甚至更优选地约26℃-28℃，并且最优选地约27℃的温度。优选地，在接种后针对特征性杆状病毒诱导的变化对Sf+细胞进行观测。这样的观测可以包括在感染后时间段期间监测细胞密度趋势和活力的降低。通常在感染后的3天-5天时观测到峰值病毒滴度，并且通常在第5天与第8天之间和/或在细胞活力降低到低于10％时获得从细胞向上清液中的峰值ORF2释放。
回收过程优选地开始于经由分离步骤将细胞碎片与培养基中的所表达的PCV2趋异株ORF2多肽分离。优选的分离步骤包括过滤、以最多约20,000×g的速度离心、连续流动离心、使用离子交换或凝胶过滤进行色谱分离、以及常规的免疫亲和方法。那些方法是本领域技术人员已知的(例如Harris和Angel(编著),《蛋白质纯化方法——实用的方法》(Proteinpurificationmethods--apracticalapproach),IRLpressOxford1995)。优选的过滤法包括死端微滤和切向流(或错流)过滤，包括中空纤维过滤。这些当中，死端微滤是优选的。用于死端微滤的优选的孔径是约0.30-1.35μm，更优选地约0.35-1.25μm，还更优选地约0.40-1.10μm，并且最优选地约0.45-1.0μm。
对于回收将被用于诸如疫苗的免疫原性或免疫组合物中的重组PCV2趋异株ORF2多肽，包括灭活步骤是优选的以将病毒载体灭活。优选地，在即将进行过滤步骤之前或在过滤步骤后立即进行这一灭活，在过滤步骤后是灭活的优选时间。可以使用任何常规的灭活方法以实现本发明的目的。因此，可以通过化学处理和/或物理处理来进行灭活。在优选的形式中，确定收获流体的体积并且使温度达到约32℃-42℃，更优选地约34℃-40℃，并且最优选地约35℃-39℃。优选的灭活方法包括添加环化二乙撑亚胺(BEI)，优选地以约1mM至约20mM，优选地约2mM至约10mM，还更优选地约2mM至约8mM，还更优选地约3mM至约7mM，最优选地约5mM的浓度添加。举例来说，灭活包括将已经在0.3NNaOH中环化成0.2M的二乙撑亚胺(BEI)的优选地约0.4M的2-溴乙撑胺氢溴酸盐的溶液添加到流体中以得到约5mMBEI的最终浓度。优选地，然后将流体连续搅拌72小时-96小时，并且可以将灭活的收获流体冷冻储存在-40℃或更低或约1℃-7℃。在完成灭活之后，添加优选地1.0M的硫代硫酸钠溶液以中和任何残留的BEI。优选地，以与在灭活之前所添加的BEI相比等同的量添加硫代硫酸钠。举例来说，如果添加BEI达到5mM的最终浓度，那么添加1.0M的硫代硫酸钠溶液以得到5mM的最终最低浓度以中和任何残留的BEI。
本发明的另一个方面涉及一种用于制备包含PCV2趋异株ORF2蛋白质和灭活的病毒载体的组合物的方法。这种方法包括以下步骤：i)将扩增的PCV2趋异株ORF2基因克隆到转移载体中；ii)将含有重组PCV2趋异株ORF2基因的转移载体的部分转染到病毒中；iii)在培养基中用转染的病毒载体感染细胞；iv)使转染的病毒载体由PCV2趋异株ORF2基因表达PCV2趋异株ORF2重组蛋白；v)将细胞与上清液分离；vi)从所述上清液中回收所表达的PCV2趋异株ORF2蛋白质；以及vii)将重组病毒载体灭活。优选地，所述重组病毒载体是含有ORF2DNA编码序列的杆状病毒，并且所述细胞是Sf+细胞。优选的分离步骤是上文所述的那些，最优选的是过滤步骤。优选的灭活步骤是上文所述的那些。优选地，在约35℃-39℃并且在2mM至8mMBEI存在下，还更优选在约5mMBEI存在下进行灭活。优选地，将灭活进行至少24小时，甚至更优选进行24小时至72小时。
根据另一个方面，如上文所述的用于制备包含PCV2趋异株ORF2蛋白质和灭活的病毒载体的组合物的方法在步骤vii)之后还包括中和步骤。这个步骤viii)包括添加等同量的中和溶液内的灭活剂的试剂。优选地，如果灭活剂是BEI，那么添加硫代硫酸钠达到等同的量是优选的。因此，根据另一个方面，在灭活剂是BEI时，步骤viii)包括添加硫代硫酸钠溶液达到以下最终浓度：约1mM至约20mM，优选地约2mM至约10mM，还更优选地约2mM至约8mM，还更优选地约3mM至约7mM，最优选地约5mM。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于制备用于激发对抗PCV2趋异株的免疫反应的组合物，优选地抗原组合物，例如像疫苗的方法。一般来说，这种方法包括将构建体转染到病毒中的步骤，其中所述构建体包含i)来自PCV2趋异株的ORF2的重组DNA；ii)在生长培养基中用转染的病毒感染细胞；iii)使病毒由PCV2趋异株ORF2表达重组蛋白；iv)从上清液中回收所表达的ORF2蛋白质；v)以及通过将所回收的蛋白质与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的载体组合来制备所述组合物。
以下实施例阐述了根据本发明的优选的材料和程序。然而，应当了解的是，这些实施例仅是以说明的方式提供的，并且其中任何内容不应当被认为对本发明的总体范围构成限制。
实施例1：嵌合猪圆环病毒(cPCV)1-2产生方法
通过将病原性猪2b型圆环病毒趋异株(被称作“PCV2B-DIV-MUT”)的免疫原性衣壳基因克隆到非病原性猪1型圆环病毒(PCV1)的基因组骨架中来构建cPCV1-2。用于构建嵌合DNA克隆的程序描述于例如美国专利号7,279,166中，该美国专利以引用的方式整体并入本文。使用嵌合病毒的感染性原液感染在补充有0.05％乳白蛋白水解物(LAH)、30μg/mL的硫酸庆大霉素(gentamicinsulfate)以及5％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)中培养的猪肾(PK)-15细胞。通过使用除了含有2％至3％胎牛血清之外相同的生长培养基再连续传代四次来使所得的感染了cPCV1-2的PK-15细胞进一步扩增。将第五代冷冻，解冻并且过滤，并且使用所得的裂解物来制备前主种子(pre-masterseed)和后续的主种子。
用于产生病毒种子的培养基与用于产生病毒原液的培养基是相同的。对于生长培养基，MEM、OptiMEM、或等同物是可以用于接种PK-15细胞系以进行生长的基础培养基。生长培养基可以补充有最多10％的牛血清、最多0.5％的乳白蛋白水解物、最多0.5％的牛血清白蛋白、以及最多30μg/mL的庆大霉素。对于病毒繁殖培养基，使用MEM、OptiMEM或等同物。病毒繁殖培养基可以补充有最多0.5％的乳白蛋白水解物、最多2％的牛血清、最多0.5％的牛血清白蛋白、以及最多30μg/mL的庆大霉素。可以根据需要将最多5g/L的葡萄糖和最多5mmol/L的L-谷氨酰胺添加到生长培养基和/或病毒繁殖培养基中以维持细胞。
将cPCV1-2主种病毒添加到PK-15细胞的细胞悬浮液中并且吸附最多3小时。将种病毒在生长基础培养基中稀释以提供0.1至0.2的感染复数(MOI)。
最初在细胞接种时，或在细胞达到约20％至50％汇合时，用工作种病毒对PK-15细胞的培养物进行接种。这一最初的传代可以被称为用于产生抗原原液的“单步感染法”，或可以被进一步用于连续传代。对于连续传代，通过以1:5-20的比率连续分装来使感染了cPCV1-2的PK-15细胞进一步扩增到第7代以使病毒繁殖。含有来自前一次传代的受感染的细胞悬浮液的培养基可以用作用于下一次传代的种子材料。对于每一次传代，在细胞达到≥90％汇合时，将感染了cPCV1-2的细胞在36℃±2℃孵育三(3)天至14天。cPCV1-2病毒在病毒复制期间引起了可观测的细胞病变。在收获时，观测到细胞变圆以及相当多的漂浮碎片。还针对细菌或真菌污染的目视证据对培养物进行观测。cPCV抗原的收获之间的孵育时间提供于下表1中：
表1：收获cPCV抗原的最短时间和最长时间
方法 最短时间/最长时间 温度范围
单步感染 5天至16天 36℃±2℃
连续传代(MSV+1至MSV+4) 16天至36天 36℃±2℃
将cPCV1-2培养流体收获到无菌容器中并且使用已知的方法针对支原体污染进行取样。可以从滚瓶、生物反应器以及灌注容器进行多次收获。
在将所收获的cPCV1-2病毒灭活之前，可以通过超滤将一批或多批抗原浓缩(例如最多达60×)。可以将浓缩物用平衡盐溶液洗涤以减少血清蛋白。
现在将描述将cPCV1-2病毒灭活、减毒、或脱毒的方法。在cPCV抗原浓缩之后，将β-丙内酯(BPL)添加到所汇集的cPCV1-2病毒材料中以获得0.2％v/v的大致浓度。然后将所汇集的病毒流体搅拌最少15分钟，然后将灭活本体抗原流体转移到第二无菌容器中。在恒定搅拌下将所转移的抗原流体维持在2℃-7℃，持续最少24小时。在最少24小时之后，向汇集的悬浮液中添加0.2％v/vBPL的第二批添加物。随后将内容物搅拌，转移到第三容器中，并且在恒定搅拌下维持在2℃-7℃，再持续不少于84小时的时间。一般来说，总灭活时间不少于108小时并且不超过120小时。灭活方法汇总在下表2中。
表2：灭活方法
通过添加最终浓度不超过0.1M的硫代硫酸钠溶液来终止灭活。使用NaOH或HCl将灭活的抗原原液的pH值调节到约6.8。在灭活后，从汇集物中获取代表性样品并且针对灭活的完成进行测试。将灭活的cPCV1-2抗原产物标准化以达到大于1.0RP的目标，如经由效力ELISA所测量。在一个实施方案中，通过将灭活的cPCV1-2b病毒与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的载体组合来制备最终的组合物。
实施例2：产生重组PCV2b趋异株衣壳蛋白的方法
亚单位疫苗的产生是两阶段过程的结果：首先，在杆状病毒表达系统中产生ORF2亚单位抗原，以及其次，配制/制造最终产品。对于初始步骤(构建重组杆状病毒和产生ORF2抗原)，现在将描述所使用的基本技术工艺。使用杆状病毒表达系统来表达来自PCV2b趋异株的ORF2基因。如下产生含有PCV2ORF2基因的重组杆状病毒：将病毒DNA从感染了在本文被标示为“PCV2B-DIV-MUT”的PCV2b趋异株的PK-15细胞中分离。将来自这种PCV2b趋异株的ORF2基因进行PCR扩增以含有5'端Kozak序列(ccgccatg)和3'端EcoR1位点(gaattc)，并且克隆到pGEM-T-Easy载体(威斯康星州麦迪逊的普洛麦格公司(Promega,Madison,Wis.))中。然后，随后将它切除并且亚克隆到转移载体pVL1392(加利福尼亚州圣地亚哥的BDBiosciencesPharmingen公司)中。然后将含有PCV2b趋异株ORF2基因的pVL1392质粒与(BDBiosciencesPharmingen公司)杆状病毒DNA一起共转染到草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf+)昆虫细胞(康涅狄格州梅里登的蛋白质科技公司)中以产生含有PCV2b趋异株ORF2基因的重组杆状病毒。将含有这种PCV2b趋异株ORF2基因的重组杆状病毒进行噬斑纯化并且使主种病毒(MSV)在SF+细胞系上繁殖，等分，并且储存在-70℃。通过PCR-RFLP，使用杆状病毒特异性引物将MSV确定地鉴定为PCV2ORF2杆状病毒。感染了PCV2ORF2杆状病毒以产生MSV或工作种病毒的昆虫细胞表达PCV2ORF2抗原。通过使用在兔中针对PCV2B-DIV-MUT所产生的超免疫血清或单克隆抗体在间接荧光抗体测定中进行免疫测定来确认PCV2B-DIV-MUT的ORF2基因的表达。或者，通过使用针对典型的PCV2a或PCV2b所产生的与PCV2b趋异株交叉反应的抗体进行免疫测定来确认PCV2B-DIV-MUT的ORF2基因的表达。此外，通过N末端氨基酸测序来确认PCV2b趋异株ORF2杆状病毒的身份。还根据9C.F.R.113.27(c)、113.28以及113.55测试PCV2b趋异株ORF2杆状病毒MSV的纯度。
含有PCV2ORF2DNA序列的重组病毒载体在用于感染易感细胞时具有约0.03-1.5，更优选地约0.05-1.3，还更优选地约0.09-1.1，并且最优选地约0.1-1.0的优选的感染复数(MOI)。优选地，本文所述的方法包括用重组病毒载体感染0.35×106-1.9×106个细胞/毫升，还更优选地约0.4×106-1.8×106个细胞/毫升，甚至更优选地约0.45×106-1.7×106个细胞/毫升，并且最优选地约0.5×106-1.5×106个细胞/毫升，所述重组病毒载体含有PCV2ORF2DNA并且表达PCV2ORF蛋白质，具有约0.03-1.5，更优选地约0.05-1.3，还更优选地约0.09-1.1，并且最优选地约0.1-1.0的MOI(感染复数)。
然后经过最长十天，更优选地约两天至约十天，还更优选地约四天至约九天，并且最优选地约五天至约八天的时间孵育受感染的细胞。优选的孵育条件包括约22℃-32℃，更优选地约24℃-30℃，还更优选地约25℃-29℃，甚至更优选地约26℃-28℃，并且最优选地约27℃的温度。优选地，在接种后针对特征性杆状病毒诱导的变化对Sf+细胞进行观测。这样的观测可以包括在感染后时间段期间监测细胞密度趋势和活力的降低。通常在感染后的3天-5天时观测到峰值病毒滴度，并且通常在第5天与第8天之间和/或在细胞活力降低到低于10％时获得从细胞向上清液中的峰值ORF2释放。
在一个实施方案中，在300mL的Excell420培养基中以约1.0×106个Sf+细胞/毫升对1000mL的旋转烧瓶进行接种。然后将烧瓶在27℃孵育并且以100rpm搅拌。随后，在孵育24小时之后，将烧瓶用具有0.1MOI的PCV2b趋异株ORF2/Bac(含有PCV2b趋异株ORF2基因的重组杆状病毒)病毒种子接种。
然后将烧瓶在27℃孵育总共6天。在孵育之后，将烧瓶的内容物离心，并且收获所得的上清液，经由0.45μm-1.0μm孔径的膜微滤，然后灭活。将上清液通过使它的温度达到37℃+/-2℃，并且将10mM二乙撑亚胺(BEI)添加到上清液中来灭活。然后将上清液连续搅拌48小时。添加1.0M硫代硫酸钠溶液以得到5mM的最终最低浓度以中和任何残留的BEI。然后使用ELISA测定程序，如Eichmeyer等的美国专利号7,700,285的实施例1中所述的程序对中和了的上清液中ORF2的量进行定量。所使用的检测抗体是PCV2b趋异株ORF2衣壳蛋白的单克隆抗体。
本发明可从重组PCV2b趋异株ORF2的小规模生产按比例放大到重组PCV2b趋异株ORF2的大规模生产。
疫苗生产的第二个阶段是配制/制造最终产品。共混策略是基于：a)每剂固定的抗原含量；以及b)至少一种佐剂的固定量。在一个实施方案中，成品的药物形式等同于水包油乳液。为了制备最终的疫苗，将佐剂添加到抗原部分中并且搅拌直到获得均一的乳液为止。提供证据表明令人满意的均一性。为了确保一批疫苗将产生所声称的功效，通过已经被验证的体内测定来确定它的相对效力。基于所进行的分析，所述效力测试能够检测出效力减弱(sub-potent)的批次。
实施例3：产生灭活的PCV2b趋异株全病毒的方法
使用PCV2b趋异株病毒PCV2B-DIV-MUT的感染性原液感染在补充有0.05％乳白蛋白水解物(LAH)、30μg/mL的硫酸庆大霉素以及5％胎牛血清的最低必需培养基(MEM)中培养的猪肾(PK)-15细胞。通过使用除了含有0.5％至3％胎牛血清之外相同的生长培养基再连续传代四次来使所得的感染了PCV2B-DIV-MUT的PK-15细胞进一步扩增。将第五代冷冻，解冻并且过滤，并且使用所得的裂解物来制备前主种子和后续的主种子。
用于产生病毒种子的培养基与用于产生病毒原液的培养基是相同的。对于生长培养基，MEM、OptiMEM、或等同物是可以用于接种PK-15细胞系以进行生长的基础培养基。生长培养基可以补充有最多10％的牛血清、最多0.5％的乳白蛋白水解物、最多0.5％的牛血清白蛋白、以及最多30μg/mL的庆大霉素。对于病毒繁殖培养基，使用MEM、OptiMEM或等同物。病毒繁殖培养基可以补充有最多0.5％的乳白蛋白水解物、最多2％的牛血清、最多0.5％的牛血清白蛋白、以及最多30μg/mL的庆大霉素。可以根据需要将最多5g/L的葡萄糖和最多5mmol/L的L-谷氨酰胺添加到生长培养基和/或病毒繁殖培养基中以维持细胞。
将PCV2B-DIV-MUT主种病毒添加到PK-15细胞的细胞悬浮液中并且吸附最多3小时。将种病毒在生长基础培养基中稀释以提供0.1-0.2的感染复数(MOI)。
最初在细胞接种时，或在细胞达到约20％至50％汇合时，用工作种病毒对PK-15细胞的培养物进行接种。这一最初的传代可以被称为用于产生抗原原液的“单步感染法”，或可以被进一步用于连续传代。对于连续传代，通过以1:5-20的比率连续分装来使感染了PCV2B-DIV-MUT的PK-15细胞进一步扩增到第7代以使病毒繁殖。含有来自前一次传代的受感染的细胞悬浮液的培养基可以用作用于下一次传代的种子材料。对于每一次传代，在细胞达到≥90％汇合时，将感染了PCV2B-DIV-MUT的细胞在36℃±2℃孵育三(3)天至14天。PCV2B-DIV-MUT病毒在病毒复制期间可能引起可观测的细胞病变。在收获时，观测到细胞变圆以及相当多的漂浮碎片。还针对细菌或真菌污染的目视证据对培养物进行观测。PCV2B-DIV-MUT抗原的收获之间的孵育时间与上表1中提供的那些是相同的。
将PCV2B-DIV-MUT培养流体收获到无菌容器中并且使用已知的方法针对支原体污染进行取样。可以从滚瓶、生物反应器以及灌注容器进行多次收获。
在将所收获的PCV2B-DIV-MUT病毒灭活之前，可以通过超滤将一批或多批抗原浓缩(例如最多达60×)。可以将浓缩物用平衡盐溶液洗涤以减少血清蛋白。
PCV2B-DIV-MUT病毒的灭活、减毒、或脱毒的方法与实施例1和上表2中所述的方法相同。通过添加最终浓度不超过0.1M的硫代硫酸钠溶液来终止灭活。使用NaOH或HCl将灭活的抗原原液的pH值调节到约6.8。在灭活后，从汇集物中获取代表性样品并且针对灭活的完成进行测试。将灭活的PCV2B-DIV-MUT抗原产物标准化以达到大于1.0RP的目标，如经由效力ELISA所测量。在一个实施方案中，通过将灭活的PCV2B-DIV-MUT病毒与合适的佐剂和/或其它药学上可接受的载体组合来制备最终的组合物。
实施例4：PCV2b原理验证性研究
所述研究的目的在于评估PCV2b趋异株候选疫苗的同源性和异源性保护作用。研究设计概述于表3中。用于T04、T08以及T12的IVP由用10％SP油佐剂化的杀死的PCV2b趋异株病毒组成。用于T02、T06以及T10的IVP由用10％SP油佐剂化的杀死的嵌合PCV1:2a病毒组成。用于T03、T07以及T11的IVP由用10％SP油佐剂化的杀死的嵌合PCV1:2b病毒组成。
表3：原理验证性研究设计
猪在疫苗接种的第0天时是3周大至4周大。将单次剂量的2mL的所分配的疫苗肌内(IM)施用到颈部的右侧中。对于每一头猪使用具有1"或3/4"针头的单个3mL无菌注射器。记录疫苗接种细节。在每一次疫苗接种之后1小时(±30分钟)内针对异常的临床体征对猪进行观测，所述临床体征包括但不限于：嗜睡、呼吸困难、呕吐、以及共济失调。将任何所观测到的临床体征记录在一般健康表格上。通知兽医跟进表现出总体状况不佳和健康状况下降的体征的两头猪。将那些动物处以人道的安乐死。
在第21天，在猪约6周-7周大时进行攻击。用预先稀释到4.8-5.8log10TCID50/mL的总共3mL的对应的攻击病毒对每一头猪进行接种，其中在每一个鼻孔中鼻内(IN)施用1mL，并且肌内(IM)施用1mL。在攻击后对攻击病毒的保留的等分部分进行滴定以确认实际的攻击剂量。
在第-1天(在疫苗接种之前)、以及在第7天、第14天、第20/21天、第28天、第35天、以及第42天将单个血液样品(5mL-10mL)采集在血清分离管(SST)中。将样品等分并且储存在≤-65℃，并且随后通过ELISA测试PCV2抗体滴度，并且通过qPCR测试PCV2病毒血症。
还在攻击之前(第20/21天)以及在攻击后每周一次从每一头猪获取单个粪便拭子。使用单个无菌聚酯拭子来采集粪便拭子，并且放置在容纳3mL无菌PBS介质的管中。将拭子在介质中旋动5秒，之后丢弃。将样品等分并且储存在≤-65℃。通过标准定量PCR程序测试粪便拭子样品的病毒脱落量。
在验尸期间，还按一式两份采集每一头猪的气管支气管淋巴结、肠系膜淋巴结和腹股沟浅淋巴结以及扁桃体组织的切片，单独地鉴定，并且固定在10％缓冲福尔马林中。将一组存档，而将其它递交以对淋巴组织缺失(PCVAD)和组织细胞替代进行标准的组织病理学研究。结论被记录为是(+)或否(-)。如果一个或多个组织被评为“+”，那么猪被认为有淋巴组织缺失或组织细胞替代。此外，还通过IHC测试组织的PCV2抗原。结果被记录为0(无染色)和1-3(不同水平的染色)。评分0被认为是PCV2IHC(-)，并且1或更高的评分被认为是PCV2IHC(+)。如果一个或多个组织是IHC(+)，那么猪被认为呈IHC(+)。
主要结果是候选疫苗在与安慰剂相比时的同源性和异源性保护作用。主要变量是病毒血症，并且次要变量是粪便脱落量和组织病理损伤。
结果表明猪在攻击之前PCV2病毒血症和粪便脱落量保持呈阴性，如表4和表5中所示。然而，在整个研究期间，所有处理组中的所有猪均在某个点时变成PCV2阳性，如由定量PCR针对PCV2病毒血症(表4)和PCV2粪便脱落量(表5)所评估。
表4：PCV2病毒血症
表5：PCV2粪便脱落量
如通过PCV2ELISA所测量的攻击前滴度表明所有处理组的最小二乘(LS)平均滴度呈PCV2抗体阴性(表6)。PCV2ELISA抗体滴度>0.5被认为是呈PCV2抗体阳性。
表6：PCV2ELISA
处理 攻击 第-2天 第7天 第14天 第20天 第28天 第35天 第42天
T01 PCV2b 0.1673 0.2741 0.1245 0.0241 0.0223 0.0995 0.3663
T02 PCV2b 0.1828 0.2934 0.1640 0.0644 0.3926 0.6212 0.5712
T03 PCV2b 0.1628 0.2783 0.1700 0.0183 0.0434 0.1833 0.2481
T04 PCV2b 0.1673 0.2593 0.1088 0.0278 0.1635 0.3956 0.3491
T05 PCV2a 0.2316 0.4322 0.2580 0.0320 0.0256 0.2396 0.3511
T06 PCV2a 0.1970 0.3726 0.2357 0.0887 0.4316 0.5458 0.4569
T07 PCV2a 0.2582 0.3787 0.2079 0.0399 0.0914 0.3066 0.4831
T08 PCV2a 0.1940 0.3437 0.2012 0.0357 0.2637 0.4717 0.4526
T09 PCV2b趋异株 0.1334 0.2283 0.1603 0.0070 0.0102 0.0989 0.2374
T10 PCV2b趋异株 0.1593 0.2071 0.1400 0.0518 0.4015 0.6827 0.6433
T11 PCV2b趋异株 0.1752 0.2484 0.1340 0.0252 0.0807 0.2255 0.3105
T12 PCV2b趋异株 0.1652 0.3035 0.1669 0.0270 0.2632 0.4868 0.4604
实验性PCV2b趋异株疫苗处理(T04、T08、以及T12)在数量上减少了PCV2病毒血症(表4)和粪便脱落量(表5)。它在与安慰剂相比时还在大多数时间点使得组织病理损伤减少，如通过免疫组织化学(IHC)评分(表7)和淋巴组织缺失评分(表8)所证实。在攻击之后，在所有攻击组中观测到PCV2ELISA抗体滴度的适度的回忆反应(表6)，这可能表明疫苗抗原剂量需要进一步优化。尽管在这一研究中没有进行统计比较，但是显然，PCV2b趋异株疫苗处理提供了对抗PCV2a、PCV2b、以及PCV2b趋异株攻击病毒株的保护。
在评估PCV2疫苗功效时，病毒血症和淋巴组织缺失被许多人认为是所测量的关键参数。在这一研究中，重要的是，注意到PCV2b趋异株疫苗在对抗PCV2b趋异株攻击方面在数量上表现得好于PCV2a疫苗或PCV2b疫苗。
表7：免疫组织化学(IHC)评分
表8：淋巴组织缺失评分
实施例5：PCV2b攻击模型优化研究
这一研究的目的在于评估PCV2b攻击材料滴定和施用途径。此外，连同当前经过验证的PCV2a和PCV2b攻击模型一起对新的PCV2b趋异株攻击制剂进行初步评估。研究设计的概要示于表9中。
表9：PCV2b攻击模型优化研究设计
将在第0天时约6周大的带有低至阴性的PCV2血清抗体并且无PCV2病毒血症的杂交育种猪放在具有独立的空气空间的BSL-2设施中的所分配的圈/房间中。在3个房间中的每一个中存在4个圈，每圈12头猪。在整个研究期间猪保持在所分配的圈中。在整个研究期间，猪随意获得水和未加药的适合年龄的完全日粮。允许所有猪适应最少3天。
在第0天，在猪约6周大时进行攻击。用预先稀释到4.0-6.0+/-0.5log10TCID50/mL的总共3mL的对应的攻击病毒对每一头猪进行接种，其中在每一个鼻孔中鼻内(IN)施用2mL，并且肌内(IM)施用1mL，或IN施用3mL，这取决于处理组。在攻击后对攻击病毒的保留的等分部分进行滴定以确认实际的攻击剂量。
在第-21天、第-1天(疫苗接种之前)、以及第7天、第14天、和第21天将单个血液样品(5mL-10mL)采集在血清分离管(SST)中。将样品等分并且储存在≤-65℃。通过ELISA测试第-21天、第-1天、第7天、第14天以及第21天的血清的PCV2抗体滴度，并且通过qPCR测试PCV2病毒血症。
在攻击之前(第-1天)以及在攻击后每周一次从每一头猪获取单个粪便拭子。使用单个无菌聚酯拭子来采集粪便拭子，并且放置在容纳3mL无菌PBS介质的管中。将拭子在介质中旋动5秒，之后丢弃。将样品等分并且储存在≤-65℃。通过标准定量PCR程序测试粪便拭子样品的病毒脱落量。
在验尸期间，按一式两份采集每一头猪的气管支气管淋巴结、肠系膜淋巴结和腹股沟浅淋巴结以及扁桃体组织的切片，单独地鉴定，并且固定在10％缓冲福尔马林中。将一组递交以对淋巴组织缺失(PCVAD)和组织细胞替代进行标准的组织病理学研究。结论被记录为是(+)或否(-)。如果一个或多个组织被评为“+”，那么猪被认为有淋巴组织缺失或组织细胞替代。此外，还通过IHC测试组织的PCV2抗原。结果被记录为0(无染色)和1-3(不同水平的染色)。评分0被认为是PCV2IHC(-)，并且1或更高的评分被认为是PCV2IHC(+)。如果一个或多个组织是IHC(+)，那么猪被认为呈IHC(+)。
由于PCV流行病学和PCV2qPCR的灵敏度的实际复杂性，因此有可能一些猪在攻击之前可能变成有病毒血症。在攻击之前测试有病毒血症的猪可以从研究中被去除，并且可以被排除在基于临床申办者的判断的数据分析之外。
主要结果是与经过验证的PCV2a和PCV2b模型相比所测试的PCV2b趋异株攻击分离株。
结果
在各处理组中，接受PCV2b趋异株攻击分离株施用的动物从攻击之前到研究结束时抗体滴度增加。在攻击之后第14天时未稀释攻击组，其次是T12组(1:5稀释，IN施用)具有峰值病毒血症，分别具有超过4百万和1百万个DNA拷贝/毫升。未稀释的攻击材料的峰值PCV2脱落量是754,114个DNA拷贝/毫升。只有未稀释IM/IN和1:5IN产生最高的在组织病理学异常和PCV2定殖方面呈阳性的动物数目。
基于从这一PCV2b攻击优化研究采集的数据(数据未示)，攻击途径和剂量变成3mL鼻内。攻击途径和剂量的变化被认为减少了被认为由肌内施用引起的不良事件的可能性并且提高了总体攻击成效。
实施例6：对抗PCV2b攻击的两种疫苗候选者的评价
所述研究的目的在于评估嵌合PCV2b疫苗和PCV2b趋异株疫苗对抗PCV2b攻击的保护作用，每一种疫苗均以低抗原剂量和高抗原剂量提供。研究设计概述于表10中。安慰剂(T01)是10％SP油。IVP如下：T02：杀死的PCV1:PCV2b衣壳嵌合体低剂量(cPCV2b低)，用10％SP油佐剂化；T03：杀死的PCV1:PCV2b衣壳嵌合体高剂量(cPCV2b高)，用10％SP油佐剂化；T04：杀死的PCV2b趋异株疫苗低剂量(PCV2bDIV低)，用10％SP油佐剂化；T05：杀死的PCV2b趋异株疫苗高剂量(PCV2bDIV高)，用10％SP油佐剂化。使用20×浓缩的抗原，然后以0.69％抗原输入＝低剂量或3.00％抗原输入＝高剂量配制疫苗来产生疫苗。
表10：研究设计
猪在疫苗接种的第0天时是约3周大(21天±7天大)。处理施用人员将单次剂量的2mL的所分配的疫苗肌内(IM)施用到颈部的右侧中。对于每一头猪使用具有1"或3/4"针头的单个3mL无菌注射器。记录疫苗接种细节。在每一次疫苗接种之后1小时(±30分钟)内针对异常的临床体征对猪进行观测，所述临床体征包括但不限于：嗜睡、呼吸困难、呕吐、以及共济失调。将任何所观测到的临床体征记录在一般健康表格上。通知兽医跟进有上文所述的体征中的任一种的一头或多头猪。
在第21天，在猪约6周大时进行攻击。用总共3mL的预先稀释到4.8-5.8log10TCID50/mL的有毒力的PCV2b株的培养物对每一头猪进行鼻内(IN)接种。在攻击后对攻击病毒的保留的等分部分进行滴定以确认实际的攻击剂量。
在第-1天(在疫苗接种之前)、以及在第7天、第14天、第20/21天、第28天、第35天、以及第42天将单个血液样品(5mL-10mL)采集在血清分离管(SST)中。将样品等分并且储存在≤-65℃。随后通过ELISA针对PCV2抗体滴度并且通过qPCR针对PCV2病毒血症对它们进行测试。
在攻击之前(第20/21天)以及在攻击后每周一次从每一头猪获取单个粪便拭子。使用单个无菌聚酯拭子来采集粪便拭子，并且放置在容纳3mL无菌PBS介质的管中。将拭子在介质中旋动5秒，之后丢弃。将样品等分并且储存在≤-65℃。通过标准定量PCR程序测试粪便拭子样品的病毒脱落量。
在验尸期间，按一式两份采集每一头猪的气管支气管淋巴结、肠系膜淋巴结和腹股沟浅淋巴结以及扁桃体组织的切片，单独地鉴定，并且固定在10％缓冲福尔马林中。将一组存档，而将其它递交以对淋巴组织缺失(PCVAD)和组织细胞替代进行标准的组织病理学研究。结论被记录为是(+)或否(-)。如果一个或多个组织被评为“+”，那么猪被认为有淋巴组织缺失或组织细胞替代。此外，还通过IHC测试组织的PCV2抗原。结果被记录为0(无染色)和1-3(不同水平的染色)。评分0被认为是PCV2IHC(-)，并且1或更高的评分被认为是PCV2IHC(+)。如果一个或多个组织是IHC(+)，那么猪被认为呈IHC(+)。
主要结果是在与安慰剂相比时四种候选疫苗之一对抗PCV2b攻击的保护作用。主要变量是病毒血症，并且次要变量是粪便脱落量和组织病理损伤。
结果
PCV2病毒血症
每周一次采集血清并且通过定量PCR针对PCV2病毒血症进行分析。每一个研究日的几何最小二乘平均值示于图2中。所有猪在攻击之前保持PCV2病毒血症呈阴性，如下表11中所示。
表11：到研究日时如通过qPCR所测试的PCV2病毒血症(DNA拷贝数)
通过处理和攻击的PCV2病毒血症(DNA拷贝数)描述于下表12中。所有处理组在攻击后在第35天和第44天与T01组显著不同(P<0.0001)。
在整个研究过程中曾经呈阳性的动物的百分比列于下文(表12)中。安慰剂组具有比疫苗接种组显著更高的曾经呈阳性的动物数目(P<0.0124)。
表12：qPCR定性血清病毒血症-曾经呈阳性百分比
PCV2粪便脱落量
到研究日时粪便脱落量几何最小二乘平均值示于图3中。通过处理和攻击的PCV2粪便脱落量(DNA拷贝数)描述于下表13中。所有处理组在攻击后在第35天和第44天与T01组显著不同(P<0.0001)。
表13：如通过qPCR所测试的PCV2粪便脱落量(DNA拷贝数)
在整个研究过程中脱落量曾经呈阳性的动物的百分比列于下文(表14)中。安慰剂组具有比疫苗接种组显著更高的曾经有脱落的动物数目(P<0.0124)。
表14：qPCR定性粪便脱落量-曾经呈阳性的百分比
血清抗体反应
到研究日时每一种处理的PCV2抗体滴度平均值示于图4中。所有猪在疫苗接种之前呈PCV2血清阴性。安慰剂组中的猪在攻击之前保持呈血清阴性。
PCV2ELISA抗体滴度汇总在下表15中。>0.5的所有滴度被认为呈PCV2抗体阳性。在与安慰剂相比时，所有疫苗组中的猪在疫苗接种后第28天-第44天时显示出PCV2抗体滴度的显著增加(P≤0.0895)，这表明在疫苗接种后对PCV2的主动免疫反应。此外，T03和T05在疫苗接种后第20天时也具有显著更高的滴度(分别是P≤0.0684和P≤0.0738)。
表15：到研究日时PCV2ELISAS/PLS平均滴度
处理 第-1天 第7天 第14天 第20天 第28天
安慰剂 0.215 0.172 0.092 0.066 0.046
cPCV2b低 0.203 0.168 0.119 0.113 0.266*
cPCV2b高 0.195 0.156 0.118 0.138* 0.214*
PCV2b DIV低 0.193 0.176 0.090 0.086 0.172*
PCV2b DIV高 0.233 0.191 0.125 0.137* 0.157*
处理 第35天 第44天
安慰剂 0.225 0.526
cPCV2b低 0.715* 0.807*
cPCV2b高 0.667* 0.706*
PCV2b DIV低 0.563* 0.685*
PCV2b DIV高 0.702* 0.783*
组织病理学：淋巴组织中的淋巴组织缺失(LD)和病毒感染(IHC)
PCV2异常组织病理学评分百分比(数据未示)没有显示在考虑淋巴损伤和PCV2抗原的存在时，安慰剂组与疫苗接种组之间有显著性差异。
来自这一研究的数据表明直到第21天攻击时所研究的所有猪保持无PCV2感染，如由以下各项所证实：1)从疫苗接种时开始到攻击时每周一次采集的血清中缺乏可检测的PCV2DNA；以及2)在T01组当中缺少表明在攻击之前存在任何无意的对PCV2的暴露的血清学证据。所有的疫苗显著地保护接受疫苗接种的动物在攻击后变成有病毒血症。此外，所有的疫苗显著地减少接受疫苗接种的动物在攻击后的PCV2粪便脱落量。在与安慰剂相比时，所有疫苗组中的猪在疫苗接种后第28天-第44天时显示出PCV2抗体滴度的显著增加(P≤0.0895)，这表明在疫苗接种后对PCV2的主动免疫反应。与对照相比，在所有疫苗接种组中定殖有数量上的减少(IHC)，但是它没有统计显著性。组之间缺乏显著性差异可能是因为在对照组中所看到的弱的攻击成效。
实施例7：对抗PCV2b趋异株攻击的两种疫苗候选者的评价
所述研究的目的在于评估嵌合PCV2b疫苗和PCV2b趋异株疫苗以及表达于杆状病毒中的PCV2a衣壳对抗PCV2b趋异株攻击的保护作用，每一种疫苗均以低抗原剂量和高抗原剂量提供。研究设计概述于表16中。安慰剂(T01)是10％SP油。IVP如下：T02：杀死的PCV1:PCV2b衣壳嵌合体低剂量(cPCV2b低)，用10％SP油佐剂化；T03：杀死的PCV1:PCV2b衣壳嵌合体高剂量(cPCV2b高)，用10％SP油佐剂化；T04：杀死的PCV2b趋异株疫苗低剂量(PCV2bDIV低)，用10％SP油佐剂化；T05：杀死的PCV2b趋异株疫苗高剂量(PCV2bDIV高)，用10％SP油佐剂化；T06：杀死的表达PCV2a衣壳的杆状病毒，于水基佐剂中(比较产品)。使用20×浓缩的抗原，然后以0.69％抗原输入＝低剂量或3.00％抗原输入＝高剂量配制疫苗来产生T02-T05疫苗。
表16：研究设计
猪在疫苗接种的第0天时是约3周大(21天±8天大)。处理施用人员将单次剂量的2mL(T01-T05)或1ml(T06)的所分配的疫苗肌内(IM)施用到颈部的右侧中。对于每一头猪使用具有1"或3/4"针头的单个3mL无菌注射器。记录疫苗接种细节。在每一次疫苗接种之后1小时(±30分钟)内针对异常的临床体征对猪进行观测，所述临床体征包括但不限于：嗜睡、呼吸困难、呕吐、以及共济失调。将任何所观测到的临床体征记录在一般健康表格上。通知兽医跟进有上文所述的体征中的任一种的一头或多头猪。
在第21天，在猪约6周大时进行攻击。用总共3mL的预先稀释到4.8-5.8log10TCID50/mL的有毒力的PCV2b趋异株的培养物对每一头猪进行鼻内
(IN)接种。在攻击后对攻击病毒的保留的等分部分进行滴定以确认实际的攻击剂量。
在第-1天(在疫苗接种之前)、以及在第7天、第14天、第20/21天、第28天、第35天、以及第42天将单个血液样品(5mL-10mL)采集在血清分离管(SST)中。将样品等分并且储存在≤-65℃。随后通过ELISA针对PCV2抗体滴度并且通过qPCR针对PCV2病毒血症对它们进行测试。
在攻击之前(第20/21天)以及在攻击后每周一次从每一头猪获取单个粪便拭子。使用单个无菌聚酯拭子来采集粪便拭子，并且放置在容纳3mL无菌PBS介质的管中。将拭子在介质中旋动5秒，之后丢弃。将样品等分并且储存在≤-65℃。通过标准定量PCR程序测试粪便拭子样品的病毒脱落量。
在验尸期间，按一式两份采集每一头猪的气管支气管淋巴结、肠系膜淋巴结和腹股沟浅淋巴结以及扁桃体组织的切片，单独地鉴定，并且固定在10％缓冲福尔马林中。将一组存档，而将其它递交以对淋巴组织缺失(PCVAD)和组织细胞替代进行标准的组织病理学研究。结论被记录为是(+)或否(-)。如果一个或多个组织被评为“+”，那么猪被认为有淋巴组织缺失或组织细胞替代。此外，还通过IHC测试组织的PCV2抗原。结果被记录为0(无染色)和1-3(不同水平的染色)。评分0被认为是PCV2IHC(-)，并且1或更高的评分被认为是PCV2IHC(+)。如果一个或多个组织是IHC(+)，那么猪被认为呈IHC(+)。
主要结果是在与安慰剂相比时四种候选疫苗以及杆状病毒疫苗之一对抗PCV2b趋异株攻击的保护作用。主要变量是病毒血症，并且次要变量是粪便脱落量和组织病理损伤。
PCV2病毒血症
每周一次采集血清并且通过定量PCR针对PCV2病毒血症进行分析。每一个研究日的几何最小二乘平均值示于图5中。T04组和T05组这两者中除了一只动物之外所有的猪在攻击之前均保持呈PCV2病毒血症阴性，如下表17中所示。
表17：到研究日时如通过qPCR所测试的PCV2病毒血症(DNA拷贝数)
在整个研究过程中曾经呈阳性的动物的百分比列于下文(表18)中。安慰剂组具有比疫苗接种组显著更高的曾经呈阳性的动物百分比(P≤0.0046)。
表18：qPCR定性血清病毒血症-曾经呈阳性百分比
PCV2粪便脱落量
到研究日时粪便脱落量几何最小二乘平均值示于图6中。通过处理和攻击的PCV2粪便脱落量(DNA拷贝数)描述于下表19中。T04组中有一只动物在攻击前一天有脱落。在攻击后第35天和第43天，所有疫苗组比安慰剂组脱落显著更低(P≤0.0001)的最小二乘平均PCV2DNA拷贝数。此外，还注意到T03组、T05组以及T06组在研究第28天脱落显著更低的最小二乘平均DNA拷贝数(P≤0.0830)。
表19：如通过qPCR所测试的PCV2粪便脱落量(DNA拷贝数)
在整个研究过程中脱落量曾经呈阳性的动物的百分比列于下文(表20)中。在攻击后，在与安慰剂组相比时，组T03-T06的脱落PCR可检测的PCV2DNA的猪的百分比有显著减少(P≤0.0028)。
表20：qPCR定性粪便脱落量-曾经呈阳性的百分比
血清抗体反应
对于PCV2抗体滴度，结果表明与其它处理相比，PCV2b趋异株疫苗处理(T04；T05)在研究第21天在攻击之前具有更强的血清学反应，如通过ELISA所评估(表21；图7)。然而，在攻击后，PCV2b趋异株处理没有像其它处理那样强烈地反应(图7)。一个可能的结论是动物已经具有特异性强抗PCV2b趋异株抗体反应，并且能够非常快速地中和并且消除攻击病毒。这体现为在与异源性疫苗的抗体反应相比时，攻击后的抗体反应减小。虽然血清学与功效并不相同，但是已经证实接受有效疫苗的猪的抗体滴度不断下降表明了保护作用(Thacker等,2013,ProcAASV,217)。
表21：PCV2ELISA
*与T01相比，P值<0.10
组织病理学：淋巴组织中的淋巴组织缺失(LD)和病毒感染(IHC)
在验尸时，在与安慰剂组相比时，所有疫苗组具有显著更少的有显微镜下淋巴损伤(LD)和PCV2抗原定殖(IHC)的动物百分比，P≤0.0995。
PCV2IHC数据汇总在下表22中。
表22：PCV2IHC评分：是否淋巴组织或扁桃体组织曾经异常
PCV2淋巴组织缺失(LD)数据汇总在下表23中。
表23：PCV2淋巴组织缺失评分：是否淋巴组织或扁桃体组织曾经异常
来自这一研究的数据表明在疫苗接种之前，所有处理组的最小二乘平均PCV2滴度呈血清阴性。安慰剂组中的猪在攻击之前保持呈血清阴性。T04组和T05组这两者中有一只动物在攻击前一天有病毒血症。T04组中的所述动物还有脱落，然而在攻击之前少于10％的动物变成有病毒血症并且所述研究被认为是有效的。在攻击后，在与安慰剂组相比时，所有疫苗接种组的有病毒血症的猪的百分比有显著减少。在攻击后，在与安慰剂组相比时，组T03-T06的脱落PCR可检测的PCV2DNA的猪的百分比有显著减少。在验尸时，在与安慰剂组相比时，所有疫苗组具有显著更少的有显微镜下淋巴损伤(LD)和PCV2抗原定殖的动物百分比。所述研究证实cPCV1-2b疫苗、PCV2b趋异株疫苗以及表达PCV2a衣壳的杆状病毒疫苗有对抗PCV2b趋异株攻击的交叉保护作用。
应当了解的是，上述实施例仅是以说明的方式提供的，并且其中任何内容不应当被认为对本发明的总体范围构成限制。

Claims (30)

1.一种用于保护猪对抗PCV2的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株，所述组合物包含PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包含位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈包含和/或表达所述PCV2b趋异株ORF2多肽的灭活的PCV2b趋异株全病毒的形式。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈灭活的嵌合病毒的形式，其中所述嵌合病毒包含灭活的重组猪1型圆环病毒，所述灭活的重组猪1型圆环病毒包含和/或表达所述PCV2b趋异株ORF2多肽。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物呈分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽的形式。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述分离的重组PCV2b趋异株ORF2多肽是由载体表达的。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述载体是杆状病毒或副痘病毒。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述载体是活的或灭活的载体。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中根据所述SEQIDNO:1的编号，所述PCV2b趋异株ORF2多肽还包含选自由以下各项组成的组的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
9.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中根据所述SEQIDNO:1的编号，所述PCV2b趋异株ORF2多肽还包含残基59处的赖氨酸(K)和残基234处的赖氨酸(K)。
10.如权利要求9所述的组合物，其中根据所述SEQIDNO:1的编号，所述PCV2b趋异株ORF2多肽还包含残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述PCV2趋异株ORF2多肽由所述氨基酸序列SEQIDNO:1或其片段表示。
12.如权利要求1至11中任一项所述的组合物，所述组合物还包含至少一种另外的猪抗原。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述至少一种另外的抗原具有对抗猪的由微生物所引起的疾病的保护性。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述微生物包括细菌、病毒、或原生动物。
15.如权利要求14所述的组合物，其中所述微生物选自由以下各项组成的组：猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae，M.hyo)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、猪链球菌(Streptococcumsuis)、猪葡萄球菌(Staphylococcushyicus)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillluspleuropneumoniae)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)、猪鼻支原体(Mycoplamahyorhinis)、猪滑液支原体(Mycoplasmahyosynoviae)、钩端螺旋菌(leptospirabacteria)、细胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)、猪流感病毒(SIV)、大肠杆菌抗原、猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysenteriae)、猪呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻(PED)病毒、轮状病毒(rotavirus)、细环病毒(Torquetenovirus，TTV)、猪巨细胞病毒、猪肠道病毒、脑心肌炎病毒、导致奥耶斯基氏病(Aujesky'sDisease)、典型猪瘟(CSF)的病原体以及导致猪传染性胃肠炎的病原体、或其组合。
16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述佐剂选自由以下各项组成的组：水包油佐剂、聚合物和水佐剂、油包水佐剂、氢氧化铝佐剂、维生素E佐剂以及其组合。
18.如权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的载体。
19.一种对猪进行免疫接种以对抗PCV2b趋异株的方法，所述方法包括向所述猪施用如权利要求1至18中任一项所述的组合物。
20.如权利要求19所述的方法，其中鼻内、肌内、真皮内、透皮、皮下或口服施用所述组合物。
21.如权利要求19或20所述的方法，其中以单次剂量施用所述组合物。
22.如权利要求19或20所述的方法，其中将所述组合物作为两次剂量施用。
23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中向带有对抗PCV2的母源性抗体的猪施用所述组合物。
24.如权利要求19至23中任一项所述的方法，其中向3周大或更大年龄的猪施用所述组合物。
25.一种试剂盒，所述试剂盒包括：包括用于保护猪对抗高毒力猪2b型圆环病毒(PCV2b)趋异株的疫苗组合物的瓶子，所述组合物包含PCV2b趋异株ORF2多肽，其中根据SEQIDNO:1的编号，所述ORF2多肽包含位置89处的亮氨酸(L)、位置90处的苏氨酸(T)、以及位置134处的天冬酰胺(N)。
26.如权利要求25所述的试剂盒，其中根据所述SEQIDNO:1的编号，所述PCV2b趋异株ORF2多肽还包含选自由以下各项组成的组的至少一个残基：残基59处的赖氨酸(K)、残基234处的赖氨酸(K)、残基190处的苏氨酸(T)、残基53处的异亮氨酸(I)、残基68处的天冬酰胺(N)、残基169处的精氨酸(R)或甘氨酸(G)、以及残基215处的异亮氨酸(I)。
27.如权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述瓶子中的所述组合物是以即用型液体组合物的形式提供的。
28.如权利要求25或26所述的试剂盒，其中所述组合物是以冻干形式提供的。
29.如权利要求28所述的试剂盒，所述试剂盒还包括稀释剂。
30.如权利要求25至29中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包括说明手册，所述说明手册含有关于所述疫苗组合物的施用的信息。
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