CN102296089A

CN102296089A - 高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法

Info

Publication number: CN102296089A
Application number: CN2011101003319A
Authority: CN
Inventors: 郎洪武; 张志芳; 李轶女; 陈晓春; 易咏竹; 高金源; 丁农; 吴华伟; 邓永; 韦永龙; 边大勇; 杨标
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS; China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS; China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2011-04-20
Filing date: 2011-04-20
Publication date: 2011-12-28
Anticipated expiration: 2031-04-20
Also published as: CN102296089B

Abstract

本发明提供了一种高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，包括将形成圆环病毒空衣壳所需的不同病毒株系的抗原基因cap、人工改造的cap的突变体克隆到家蚕杆状病毒运载载体中获得同源重组载体，将同源重组载体与亲本病毒DNA在昆虫细胞或菌中进行重组或转座获得重组杆状病毒，用含抗原基因的重组杆状病毒感染昆虫；培养被感染的昆虫宿主表达相应的圆环病毒2型空衣壳粒子，经过比较和实验确定病毒空衣壳颗粒高效组装所需的信息，获得可高效表达和组装病毒空衣壳颗粒的重组病毒株系，以大量生产圆环病毒2型空衣壳颗粒，将上述方法生产的猪圆环病毒2型空衣壳颗粒进行初步纯化就可用于制备防治猪圆环病毒病的疫苗。

Description

高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法

技术领域

本发明涉及一种用真核生物表达体系制备圆环病毒空衣壳粒子的方法，尤其涉及到利用重组杆状病毒在昆虫体内高效表达抗原基因或人工改造的抗原基因以及组装病毒空衣壳粒子的方法，用于制备预防猪圆环病毒病基因工程疫苗，属于基因工程和兽用生物制品领域。

背景技术

1.猪圆环病毒病概述

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是断乳仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wastingsyndrome，PMWS)等相关疾病的主要病原。是一种无包膜的二十四面体，单链环状DNA病毒，基因组全长为1 767bp或1 768bp，包含11个阅读框架，但是，有明确的编码产物的只有其中的两个，rep和cap。猪圆环病毒分为两个血清型，PCV1和PCV2。最早的PCV在猪肾传代细胞PK15中作为一个小核糖核酸病毒污染物被发现。当时未引起重视，后来发现一种新的PCV能够在全球范围内引起猪一系列临床病症，PCV才被重视起来。新的PCV被命名为PCV2，而原来发现的称为PCV1。目前，尚未发现PCV1有病原性。PCV1和PCV2的基因组分别为1759bp、1768bp，两者都编码两个主要蛋白：rep(复制相关蛋白)和cap(核衣壳蛋白)。由于PCV1尚无明确的致病证据，现在研究的主要对象还是PCV2。目前为止，在NCBI上注册，有完整基因组的PCV2的病毒株，包括重组的病毒已经达到了553株。

PCV2流行广泛，德国某些猪群中血清阳性率高达77％～95％，加拿大猪血清中的阳性率在26％～55％，英国为86％，爱尔兰达92％(刘丽霞，猪圆环病毒研究进展.畜牧兽医杂志，2007(02).)。在我国，郎洪武等从7个省(市)22个猪群采集各类猪血清样品559份，通过ELISA检测发现：后备母猪阳性率为43.3％(61/141)，经产母猪阳性率为85.6％(107/125)，肥猪阳性率为5 1.0％(49/96)，559头猪总阳性率为42.9％(240/559)(郎洪武等，断奶猪多系统衰弱综合征血清抗体检测.中国兽医科技，2000(03).)。PCV2的死亡率10％～30％(杨顺利等，猪圆环病毒2型致病机制研究进展.畜牧与兽医，2009(11).)。因此，PCV2能够给养猪业带来巨大损失。

2.猪圆环病毒病疫苗研制

目前，在商业上得到应用并且在一些欧美国家获得应用许可的疫苗均为含有佐剂的灭活PCV2疫苗，主要有以下几种：(1)以PCV1为骨架，用PCV2的ORF2置换PCV1的ORF2部分，构建嵌合病毒制备活疫苗。(2)PCV2全病毒灭活疫苗。(3)表达PCV2的ORF2的亚单位疫苗。

这类疫苗存在缺陷，主要表现在：1、灭活不彻底，造成受免动物感染和散毒；2、用细胞培养的方法获得的病毒抗原含量低，增加了生产成本，达不到良好的免疫效果。为此，在猪圆环病毒基因工程疫苗研究中，大肠埃希菌、减毒的伪狂犬病病毒活病毒载体、重组腺病毒等均被用来安全生产猪圆环病毒2抗原(隋慧等，猪圆环病毒2型疫苗研究进展动物医学进展，2007年12期)。但均无法达到大幅度提高猪圆环病毒抗原产量的目的。

3.猪圆环病毒分子生物学特征

血清学实验显示，ORF1在PCV1和PCV2之间具有交叉反应性，而ORF2却是特异的(Mahe et al.，Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcinecircoviruses and identification of immunorelevant epitopes.J Gen Virol，2000.81(Pt 7)：p.1815-24)，两种血清型的ORF2编码的蛋白没有抗原交叉反应，所以亚单位疫苗一般都选择ORF2。

ORF2的N端含有一个由41个氨基酸残基组成的的核定位信号(Nuclear locationsignal，NLS)。这个信号肽由于密码子偏爱性的原因，致使在细菌中表达量很低(Nawagitgulet al.，Modified indirect porcine circovirus(PCV)type 2-based and recombinant capsid protein(ORF2)-based enzyme-linked immunosorbent assays for detection of antibodies to PCV.ClinDiagn Lab Immunol，2002.9(1)：p.33-40)。去除NSL是否影响ORF2的免疫原性，这对做疫苗的表达研究是很重要的问题。Porntippa Lekcharoensuk等连续删除PCV2的ORF2的序列，并在删除的区段用PCV1的相应的区段来填补，构建DNA的嵌合体，表达这个嵌合体，最后用筛选的PCV2特异的7个单克隆抗体来对表达产物进行检测。结果发现：在ORF2的47～63残基，165～200残基，及C端的四个残基中，存在至少5个不同但是部分重叠的肽段，被7个单克隆抗体识别(Lekcharoensuk et al.Epitope mapping of the major capsid proteinof type 2 porcine circovirus(PCV2)by using chimeric PCV1 and PCV2.J Virol，2004.78(15)：p.8135-45)。而C.Truong等用SPF仔猪(specific pathogen-free piglets)及普通农场的猪为材料，利用酶联免疫(ELISA)的方法，找到在PCV2中的ORF2中，69～83残基及117～131残基是PCV2的特异免疫位点(Truong et al.，Identification of an immunorelevant ORF2 epitopefrom porcine circovirus type 2 as a serological marker for experimental and natural infection.Arch Virol，2001.146(6)：p.1197-211.)。Mahe等通过多肽扫描(PEPSCAN)预测并经过免疫实验验证发现67～87残基，113～139残基，193～207残基为PCV2的3个型特异性的抗原位点，25～43的残基仅和来自SPF仔猪的血清发生反应(Mahe et al.2000)。综上所述，认为去除NSL不会明显减低PCV2的免疫原性，作为疫苗对普通饲养的猪没有任何影响。而在细菌中表达去除NSL后的ORF2，蛋白的表达含量明显增高，且具有免疫原性(Wang et al.，The activation of lytic replication of Epstein-Barr virus by baculovirus-mediated genetransduction.Arch Virol，2006.151(10)：p.2047-53.；苗丽娟等，猪圆环病毒2型去核定位信号orf2基因的原核表达与初步应用.中国预防兽医学报，2008(05).)。

4.家蚕生物反应器的优点和实例

(1)家蚕生物反应器与大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达系统相比具有以下优点：

1)家蚕杆状病毒载体表达系统表达效率高是区别于其它真核表达系统的明显特征，据报道，在感染细胞中重组蛋白的表达水平最高可达到细胞总蛋白的50％。而且它表达产物具有很高的生物活性和可溶性，其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。

2)家蚕杆状病毒能容纳较大的外源基因而不影响其本身的增殖。杆状的衣壳与较大的基因组(约130kb)可容纳较大片段的DNA插入(约10kb)，因此可同时插入多个外源基因，可形成病毒样粒子(virus-like particle；VLP)，提高疫苗的免疫活性。

3)应用晚期多角体蛋白基因启动子表达外源基因，即使重组基因产物对细胞有毒性，也不影响表达水平。

4)借多元表达载体或借几个不同重组病毒共感染，可以同时表达2个或更多个外源蛋白，研究肽链超分子装配以及蛋白寡聚体的结构与功能。

5)杆状病毒对脊椎动物无病原性，家蚕没有与人畜共患的疾病，在遗传学上被认为安全的表达载体。

动物疾病的疫苗和治疗药物的研究和开发随着家蚕生物反应器的成熟也越来越受到重视。如口蹄疫病毒的空衣壳表达、狂犬病的N、P、N-P的联合表达均已获得了我国农业部遗传工程安全生产委员会颁发的商品化生产许可证。

1997年，田鄂等在家蚕细胞和幼虫中成功表达了日本血吸虫中国大陆株28KD谷胱甘肽S-转移酶基因，在家蚕培养细胞(10⁶个/mL)中的表达产量为0.77mg，在家蚕幼虫中则超过5mg/条蚕(田鄂等，日本血吸虫28kD GST基因在家蚕细胞和幼虫中的表达生物化学与生物物理学报(英文版)，1997年01期)。

日本国家动物卫生研究所的研究人员利用家蚕表达体系对猪的细胞因子，包括IL系列、GM-CSF、TNF及其受体、Caspase等进行了系统深入的基础和开发研究，用BmNPV体系生产的宠物(猫和狗)的预防性重组IL制剂最近已由日本“TORAY”株式会社生产并投入市场(木村滋，昆虫生物工厂[M]，日本：工业调查会，2000，124-127)。

(2)利用此系统来生产猪圆环病毒2型空衣壳粒子抗原的优点在于：

1)这一表达系统的表达效率极高，产量可达毫克级/虫的水平。因而可大大降低猪圆环病毒2型空衣壳粒子抗原的生产成本，并使通过基因工程方法大规模生产猪圆环病毒2型空衣壳粒子抗原成为可能；

2)这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等方面与天然产品相似，这为所表达的猪圆环病毒2型空衣壳粒子抗原具有正常的蛋白结构和生物学免疫活性提供了保证；

3)猪圆环病毒空衣壳抗原粒子在昆虫细胞核中的组装效率高、便于纯化和疫苗的制备。

目前，杆状病毒表达系统，尤其是家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。

发明内容

本发明的目的是要克服现有技术的不足，提供一种真核生物表达系统，利用杆状病毒表达系统在昆虫体内组装猪圆环病毒2型空衣壳粒子。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法，其特征在于该方法主要包括：将形成圆环病毒2型空衣壳所需的不同病毒株的抗原基因cap、人工改造的cap的突变体克隆到家蚕杆状病毒运载载体得同源重组载体，将同源重组载体与亲本病毒DNA在昆虫细胞或大肠杆菌中进行重组或转座得重组杆状病毒，用含抗原基因的重组杆状病毒感染昆虫；培养被感染的昆虫宿主表达相应的圆环病毒2型空衣壳粒子；收集并纯化表达产物可得上述猪圆环病毒2型空衣壳粒子。

具体描述如下：

一种用昆虫生物反应器高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法，包括：将形成猪圆环病毒2型空衣壳所需的不同病毒株的抗原基因cap和人工改造的cap的突变体基因：cap1、cap2、cap3、cap4、cap5、cap6等先克隆到家蚕杆状病毒运载载体上，获得同源重组载体：pVL-cap1pVL-cap1、pVL-cap2、pVL-cap3、pVL-cap4、pVL-cap5、pVL-cap6，将这些同源重组载体与亲本病毒DNA在昆虫细胞或菌中进行重组或转座获得重组杆状病毒，用含猪圆环病毒2型抗原基因的重组杆状病毒感染昆虫或细胞；培养被感染的昆虫宿主，表达相应的猪圆环病毒2型空衣壳粒子，并比较不同猪圆环病毒2型毒株基因的空衣壳粒子组装效率；获得设计高表达和高效组装猪圆环病毒2型空衣壳粒子所需的基因结构信息，构建含有上述相关信息的cap7基因，克隆于家蚕杆状病毒运载载体，得同源重组载体：pVL-cap7，将此同源重组载体与亲本病毒DNA在昆虫细胞或菌中进行重组或转座得重组杆状病毒，并用此重组杆状病毒感染昆虫或细胞；培养被感染的昆虫宿主高效表达相应的猪圆环病毒2型空衣壳粒子；收集并纯化上述重组杆状病毒所表达的产物可得猪圆环病毒2型空衣壳粒子。

其中，所述的猪圆环病毒2型不同毒株的cap基因优选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12所示的DNA和氨基酸序列及经人工改造后所获得cap基因的DNA或氨基酸序列为：SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，其中SEQ ID No.13和SEQ ID No.14的序列特征是在下述位置的氨基酸为8Y、12K、17I、30D、47A、59A。

所述的杆状病毒运载载体所用表达盒的启动子为多角体蛋白p10，ie-1等与增强子组合，优选自pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，pVL1391，pVL1392，pVL1393，pVL941，pVL945，pVL985，pVTBac，pBm030，pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组运载载体或转座载体；所述的杆状病毒同源运载转移载体最优选的是为pVL1393。

本发明中所构建的转运载体优选为pVL-cap1、pVL-cap2、pVL-cap3、pVL-cap4、pVL-cap5、pVL-cap6和pVL-cap7，用于猪圆环病毒2型抗原基因形成病毒空衣壳粒子形式的表达，在家蚕中进行形成病毒空衣壳粒子形式抗原的高效表达和组装。

所述的杆状病毒选自BmNPV，AcMNPV，ApNPV，HaNPV，HzNPV，LdMNPV，MbMNPV，OpMNPV，SlMNPV，SeMNPV或SpltNPV。

优选为家蚕杆状病毒Bm-NPV；

所述的重组杆状病毒优选为以下任意一种：(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap1；(2)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap2；(3)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap3；(4)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap4；(5)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap5；(6)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap6；分别在家蚕中进行表达并测定病毒空衣壳粒子的表达量，筛选得不同重组病毒中猪圆环病毒2型空衣壳病毒粒子的表达效率；与此表达效率结合，分析猪圆环病毒2型不同毒株的cap基因，即SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12所示的DNA或氨基酸序列特征，发现在SEQ ID No.9下述氨基酸序列1-MTYPRRRYRRRKHRPRIHLGQILRRRPWLDHPRHRYRWRRK-41是CAP蛋白高效定位于昆虫细胞核内所必需的，下列位置的氨基酸发生了改变：F8Y、R12K、S17I、V30D，其中8Y、12K、17I、30D是猪圆环病毒2型空衣壳抗原在昆虫细胞核中高效定位所必需的；而SEQ ID No.3中的下述位置的氨基酸发生了改变：T47A、R59A，其第47位和第59位氨基酸A是猪圆环病毒2型空衣壳粒子高效组装所必需的。(7)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap7：按照上述分析我们获得了经过人工改造的cap基因的DNA和氨基酸序列为SEQ ID No.13和SEQ IDNo.14，其特征是在下述位置的氨基酸为8Y、12K、17I、30D、T47A、R59A。按照上述所述的方法将SEQ ID No.13克隆到表达载体经重组得rBmNPV-cap7，rBmNPV-cap7是最高效表达圆环病毒空衣壳粒子的。

所述的昆虫宿主选自家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamiacynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraeapernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等及相应的昆虫细胞；最优选的为家蚕(Bombyx mori)及相应的昆虫细胞。

所述的感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1～5天龄的昆虫幼虫或蛹体。更优选为：将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种5天龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3～6天后收集家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹体为1～2天的早期嫩蛹。

本发明采用基因重组技术，将来源于猪圆环病毒2型不同毒株的抗原基因和人工改造的抗原基因包括cap1、cap2、cap3、cap4、cap5、cap6和cap7构建到各种由启动子为多角体蛋白，p10，ie-1等及与增强子组合所驱动的杆状病毒表达所用表达盒的杆状病毒表达转移运载载体(如选自pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac to Pac，Bacmid，pVL1391，pVL1392，pVL1393，pVL941，pVL945，pVL985，pVTBac，pBm030，pUAC-5)上，使抗原基因，包括cap1、cap2、cap3、cap4、cap5、cap6和cap7，在多角体启动子、p10启动子或其他病毒和真核生物的强启动子控制之下，通过体内或体外重组，将上述抗原基因通过同源重组或转座子介导整合到杆状病毒的基因组上，敲除掉基因组上的Polyhedrin基因，通过反复多轮的空斑筛选技术和PCR检测技术确证重组病毒的正确性，得到重组病毒。重组病毒可经口食下或采用各种手段透过表皮感染1～5天龄(最优时间为4或5天龄起蚕)的昆虫幼虫或蛹体(最优时间为1～2天的早期嫩蛹)，感染的重组病毒在蚕体内开始复制后，在多角体蛋白基因(polh)启动子控制下cap基因开始大量表达，在高效核定位信号的引导下，定位到昆虫细胞核内，继之在cap抗原的高效组装位点信息的诱导下，产生大量的猪圆环病毒2型空衣壳病毒粒子，由于发现上述重组病毒在昆虫体内的脂肪体内优先表达，当大量杆状病毒复制和猪圆环病毒2型空衣壳病毒粒子表达和组装后，脂肪体组织和细胞破裂，大部分抗原蛋白随之释放到昆虫的体液中。

基因工程疫苗的制备及免疫：将本按发明高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法所获得的空衣壳粒子作为抗原按现有技术用佐剂经乳化后制成基因工程疫苗；用此疫苗免疫动物、可经受猪圆环病毒2型病毒的攻击；或用脂肪酸和蜂胶乳化后，经口添饲动物，动物也能产生相应的保护抗体，并能经受住猪圆环病毒2型的攻击。

附图说明

图1PCV2基因组及ORF2的比对结果

图26个不同毒株的cap基因的比较

图36个cap基因及3个去核定位信号的cap基因的克隆示意图(NLS为核定位信号)

图4原核表达载体pET28a-cap5DN示意图

图5加IPTG(终浓度为0.5mM)诱导之后的样品，1，2，3，4，5，6为不同的表达时间。未诱导为对照。

图6cap5DNF融合蛋白纯化结果

图7cap5DNF原核表达蛋白的质谱结果

图8自制抗体效价检测，X轴表示抗体稀释倍数，Y轴表示在波长492nm处的吸光值

图9不同cap基因在家蚕中的相对表达量其中：1：rBmNPV(cap1)；2：rBmNPV(cap2)；3：rBmNPV(cap3)；4：rBmNPV(cap4)；5：rBmNPV(cap5)；6：rBmNPV(cap6)；7：rBmNPV(cap2DN)；8：rBmNPV(cap4DN)；9：rBmNPV(cap5DN)。

图10家蚕生物反应器中高表达的病毒空衣壳粒子

图11不同剂量免疫猪后所产生的PCV特异性抗体滴度。图中：1：Wt；2：PCV15μg/剂量；3：30μg/剂量；4：60μg/剂量；5：90μg/剂量；6：120μg/剂量；7：商品化的PCV2疫苗。

本发明的积极意义

本发明方法由于采用杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中高效表达和组装生产猪圆环病毒2型空衣壳病毒粒子，表达量是同体积的昆虫细胞生产量的10～100倍，每克蚕体或蛹体可生产毫克级猪圆环病毒2型空衣壳病毒粒子，这样大大减少了抗原生产和疫苗制备的成本。由于家蚕已经被我国卫生部批准为食药兼用昆虫，所以将本发明方法所制备的抗原纯化后，安全性极高，可直接制备疫苗免疫动物。

总体而言，本发明方法可以大幅度降低猪圆环病毒2型疫苗生产成本，简化了以前用昆虫细胞生产抗原的纯化过程，避免了使用传统全病毒灭活疫苗因灭活不全而造成的散毒的危险，具有安全、高效、成本低等诸多优点，前景广阔。

实施例一

不同毒株PCV2抗原基因在家蚕生物反应器中的表达及空衣壳粒子的组装

1.材料：

1.1猪圆环病毒毒株、细菌菌株，载体等

猪圆环病毒组织毒株PCV2-1，细胞毒株PCV2-2、PCV2-3、PCV2-4、PCV2-5和PCV2-6均来自中国兽医药品监察所。pMD18-T载体购自大连宝生物(Takara)公司；pET28a载体购自(Novagen)公司，菌株TOP10，BL21，DH1OB甘油菌由实验室保存，镍亲和层析柱购自Amersham公司；新西兰大白兔(约2.5kg)由中国科学院遗传与发育研究所动物中心饲养。

1.2工具酶及其它试剂盒

LATaq酶、T4 DNA连接酶，EcoRI，BamH I、Pst I，Xho I、Bsu36 I等限制性内切酶购自Promega公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；生化试剂Tris、SDS及dNTPs购自Sigma公司；DL2000 Plus DNA Marker购自全式金生物公司；各种寡核苷酸引物均由北京三博合成。19-1044kD蛋白预染Marker均购自BIO-RAD公司；IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)购自Promega公司；考马斯亮R-250，N，N′-甲叉双丙烯酰胺，TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)，丙烯酰胺购自Aldrich化学有限公司；咪唑购自Sigma公司；Whatman 1号滤纸购自Minipore公司；其它均为国产或进口分析纯试剂。

1.3试剂配制

常用试剂的配制一般都遵照《分子克隆实验指南(上下册)》第三版(Joseph et al.科学出版社2002)和《精编分子生物学指南》(奥斯伯等.科学出版社1998)配制。

病毒DNA抽提buffer

镍柱亲和层析纯化所需试剂按下述配方配制：

NTA-0 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol

NTA-20 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，20mM Imidazole(咪唑)

NTA-40 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，40mM Imidazole(咪唑)

NTA-60 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，60mM Imidazole(咪唑)

NTA-80 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，80mM Imidazole(咪唑)

NTA-100 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，100mM Imidazole(咪唑)

NTA-150 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，150mM Imidazole(咪唑)

NTA-200 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，200mM Imidazole(咪唑)

NTA-300 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，300mM Imidazole(咪唑)

NTA-400 Buffer：20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％Glycerol，400mM Imidazole(咪唑)

1.4 Bradford法测定蛋白含量所需试剂

储存液，工作液均按照《精编分子生物学指南》(奥斯伯et al.科学出版社1998)配制。

Western blotting试剂：

转膜Buffer：Glycine，28.82g，Tris 24.22g，甲醇100ml，加ddH₂O至500ml，保存于4℃中。

洗涤液：Tween-20溶于PBS溶液中至终浓度为0.2％(v/v)。

封闭液：BSA溶于PBS中至终浓度为3％(m/v)。

一抗溶液：按1∶1500将自行制备的多克隆抗体(见3.5.3.4项内)稀释于PBS溶液中；

二抗溶液：按1∶1000将购自Sigma公司的HRP标记的羊抗兔抗体稀释PBS溶液中；

DAB显色液：12mg DAB溶于30ml 100mM的Tris-Cl缓冲液(pH 7.5)中，再加入45μl30％H₂O₂，现用现配。

1.5 Bradford检测用试剂

见《精编分子生物学实验指南》(奥斯伯et al.科学出版社1998)

SDS-PAGE用溶液

配制方法参见分子克隆实验指南(第三版)(Joseph et al.科学出版社2002)

2.基本方法

2.1 PCR反应

PCR扩增结束后，取5.0μL反应产物用1.0％的TAE琼脂糖凝胶中电泳，凝胶中含有0.5μg/mL的溴化乙锭，电泳缓冲液为1×TAE，80～100V，大约10～20min于紫外凝胶成像系统观察片段大小，与标准的DNA Marker比较，进行分析。

2.2纯化回收DNA片段

(1)PCR产物用普通凝胶进行电泳后，切下所需大小的DNA目的条带，放入Eppendorf管中后称重；

(2)加入3倍体积(v/w)的6mol/LNaI溶液，65℃下充分溶解；

(3)再加入10μL玻璃奶吸附DNA，混匀后室温下放置5min；10000r/min稍离心，去上清；

(4)沉淀用New Wash洗液洗涤三次，10000r/min重复离心，前两次达到转速即可，最后一次离心2min，37℃晾干；

(5)用10μL0.1×TE Buffer溶解DNA，凝胶电泳检测回收效果，其余置-20℃保存备用。

2.3 PCR产物与克隆载体pMD18-T的连接

连接体系如下：

混匀后，16℃连接过夜，连接产物用于转化DH10B。

2.4连接产物的转化

2.4.1感受态细胞的制备

(1)将DH10B甘油菌在LB平板上复苏；

(2)用灭菌牙签挑取单菌落，放入4mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取100μL过夜培养物接种到另一4mL LB培养基中，37℃振荡培养2～2.5h，使OD_600？值在0.6左右；

(3)5,000g离心4min收集菌体，将菌体重悬于800μL75mmol/L冷CaCl₂中，冰浴30min；

(4)5,000g离心4min，弃上清，加入200μL75mmol/L冷CaCl₂，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放2h后用于转化。

2.4.2连接产物的转化

(1)质粒DNA20～100ng或连接混合物5μL加到100μL上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

(2)进行热休克(42℃保温2min)，迅速置冰上1～2min，加入1mL已温育至37℃的LB培养基，37℃振荡培养1h，

(3)稍离心，去部分上清后重悬沉淀，涂布于数个含相应抗生素的LB平板上。37℃倒置培养过夜。

2.5重组质粒的鉴定

2.5.1细胞破碎法快速鉴定

重组后的质粒与原来的质粒分子量有一定差别时可用此法检出重组子(Beuken，et al.，One-step procedure for screening recombinant plasmids by size.Biotechniques，1998.24(5)：p.748-50.)。

(1)分别挑取多个单菌落转化子接种于4mL含80μg/mLAmp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

(2)取300～500μL菌液于Eppendorf管中，12,000g离心10sec，弃上清，加入30μL缓冲液(6％蔗糖，0.1％溴酚蓝)，再加入20μL酚/氯仿(1∶1)，充分振荡将菌体弹起；

(3)12,000g离心5min，取上清上样电泳，观察结果。

2.5.2重组质粒的酶切鉴定

(1)取上面快速鉴定后，显示一定差别的质粒对应的菌液1.5mL于Eppendorf管内，5,000g离心5min收集菌体，弃上清；

(2)用150μLSol I悬浮沉淀，冰上放置5min；

(3)加300μLSol II和50μL氯仿，轻轻倒转混匀后冰浴5min；

(4)加450μLSol III，剧烈混匀后冰浴5～10min；

(5)4℃12,000g离心10min，取上清，加450μL异丙醇，混匀后于-20℃放置20min；

(6)12,000g离心10min，弃上清，沉淀溶于250μLTER(含20μg/mLRNaseA的TE)中，37℃消化20min；加入350μL PPt沉淀Buffer，混匀后置4℃ 20min；

(7)12,000g离心10min，弃上清，70％乙醇洗一次，真空干燥沉淀，用40μL0.1×TE(pH8.0)溶解，进行酶切鉴定或-20℃保存备用。

3.具体实施步骤

3.1合成引物

已有序列分析：为了克隆PCV2的cap基因，在NCBI上搜索并下载了目前公布的所有PCV2全基因组序列及一部分cap基因，选取其中的100条序列用cluxtal w进行序列比对，部分结果如图1，从绿色，棕色到红色匹配率递增，红色为100％匹配的位点，总体来看，不同地区分离到的PCV2毒株的基因组的相似性很高。

引物设计：首先从NCBI数据库中抽取100个已公开的PCV2基因组或ORF2序列，使用Lasergene软件的megAlign进行比对，在cap基因的两侧选择保守的区域设计引物，引物的最后一位均位于红色的完全匹配位点。用于扩增6个PCV2毒株的cap基因序列，引物序列见表1。

表1实施例一中所用的扩增引物

3.2基因克隆

3.2.1病毒DNA的提取：6个毒株均按照用PCV2检测试剂盒(世纪元亨)说明书，处理样品，抽提出DNA，做为模版。

3.2.2 6个cap基因的克隆：用上述表1的第一对引物(PCVF-1F和PCVF-1R)或用第二对引物(PCVF-2F和PCVF-2R)扩增6个猪圆环病毒2型毒株的cap基因。反应体系及反应程序见上“2、基本方法”项内容。将6个cap基因及其含ORF外保守序列的扩增片段克隆于T载体，鉴定准确后(方法见2、基本方法)，进行测序，得序列SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQID No.8，SEQ ID No.9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12。6个cap基因的序列及其同源性比较列于图2。

在上述实验基础上，设计引物(见表1)，即引物PCV2-cap1F/PCV2-cap1R、PCV2-cap2F/PCV2-cap2R、PCV2-cap3F/PCV2-cap3R、PCV2-cap4F/PCV2-cap4R、PCV2-cap5F/PCV2-cap5R、PCV2-cap6F/PCV2-cap6R，PCR扩增完整cap基因ORF的序列。与pMD18-T载体连接，通过一步法电泳检测之后测序，通过Blast将获得的序列和已知的cap基因进行比对，验证其正确性，确认其起始密码和终止密码，并引入相应的酶切位点，并分别命名为pMD18-Tcap1、pMD18-Tcap2、pMD18-Tcap3、pMD18-Tcap4、pMD18-Tcap5、pMD18-Tcap6。

3.3人工改造cap基因的过程

3.3.1设计引物(见表1)，分别用引物PCV2-cap2 DNF和PCV2-cap2R，DNF PCV 2-cap4DNF和PCV2-cap4R，PCV 2-cap5 DNF和PCV2-cap5R扩增去核定位信号的cap2DN、cap4DN、cap5DN基因。

3.3.2将cap2DN、cap4DN、cap5DN基因与pMD18-T载体连接，测序证明其准确性。并命名为pMD18-Tcap2DN、pMD18-T cap4DN、pMD18-Tcap5DN。

整个过程如图3所示：

3.4重组杆状病毒转移载体pVL-cap1～6和pVL-cap2DN、pVL-cap4DN、pVL-cap5DN的构建

3.4.1 pMD 18-T cap1-6和杆状病毒转移载体pVL1393质粒的双酶切

pVL1393载体酶切体系：

按上述体系加好混匀后，在37℃消化2～3h。目的片段电泳后glassmilk法回收；pVL1393质粒在70℃在灭活15min，涂Amp⁺LB平板检测酶切是否完全。

3.4.2目的基因片段与pVL1393质粒的连接

在T4DNA连接酶的作用下连接将胶回收的cap1-6的片段和pVL1393质粒。连接体系如下：

混匀后离心，16℃连接过夜。

3.4.2重组质粒的转化与鉴定

将上述连接产物转化大肠埃希氏菌DH10B感受态细胞，在含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上筛选，挑选克隆后，提取质粒。重组质粒经过双酶切和菌液PCR鉴定，并将鉴定正确的重组质粒命名为pVL-cap1、pVL-cap2、pVL-cap3、pVL-cap4、pVL-cap5、pVL-cap6和pVL-cap2DN、pVL-cap4DN、pVL-cap5DN，具体方法同3.2。

3.4.3Bm-N细胞的复苏、传代及病毒繁殖

迅速取出液氮中冻存的细胞，置于37℃水浴中，轻轻摇动，待冻存液完全融化后，将之转移入25cm²培养瓶中，并逐滴加入至少5倍体积的新鲜的冷(4℃)的TC-100培养基(含10％FBS，100μg/mL链霉素，50μg/mL青霉素)，让细胞在室温下贴壁1h，再将之置于27℃培养箱中培养2～3h。细胞贴壁后，更换培养基。根据细胞生长状况，进行换液或传代。

待细胞铺满细胞瓶后，倒掉旧培养液，向细胞瓶中加入新鲜培养基，用弯头吸管吹打贴壁细胞，使其脱落，按照1∶2～3的比例(根据细胞密度)将细胞悬浮液转移至新培养瓶中。

家蚕杆状病毒(BmNPV)感染Bm细胞进行传代繁殖。

相关溶液配方如下：

(1)1X TC-100细胞培养液：按Gibco BRL公司产品说明书进行。将1个包装(1X1L)TC-100粉边搅拌边加到双蒸水中，加0.35g NaHCO₃，用5mol/L NaOH缓慢调pH至6.22，调节渗透压，定容至1L，在消毒滤器中，将培养基通过0.22μm消毒滤膜加压过滤除菌。

(2)1X TC-100完全培养基：1X TC-100细胞培养液补加FBS和抗生素。FBS保存于-20℃，使用前融化，并经56℃水浴保温30min使补体灭活，然后按10％加入上述配制的1XTC-100培养基中。链霉素终浓度为100μg/mL，氨苄青霉素为50μg/mL。

3.4.5超速离心法制备病毒BmNPV-ZJ8基因组DNA

收集BmNPV-ZJ8病毒感染的细胞培养液或感染的家蚕血淋巴，5000r/min离心10min，除去细胞沉淀，上清25,000r/mim超速离心1h，用1mL游离病毒抽提液悬浮病毒粒子，加蛋白酶K至终浓度50ug/mL，50℃保温2h。再加入35％的Sarkorsel至终浓度1％，继续于50℃保温2h。分别用等体积的饱和酚、苯酚∶氯仿(1∶1)、氯仿各抽提一次，5000r/mim离心5min，将上层水相转入新管中，添加1/10体积的3mol/LNaCl(pH 6.5)，2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2h以上，DNA呈絮状沉淀。5000r/mim离心10min，用70％乙醇洗沉淀一次，干燥后，用适量TE溶解DNA，4℃保存备用。

3.4.6共转染

接种约0.5～1×10⁶Bm-N细胞于15cm²培养瓶中，贴壁培养过夜(即细胞密度约为80％)。除去含FBS的培养基，用无血清培养基洗细胞二次，再加1mL无血清培养基。在50μL反应体系中加入线性化的Bm NPV-ZJ8病毒DNA1μg，pVL-cap1、pVL-cap1、pVL-cap1、pVL-cap1、pVL-cap1、pVL-cap1和pVL-cap2DN、pVL-cap4DN、pVL-cap5DN质粒DNA各2ug，脂质体5uL混合，加水补足体积，轻轻混匀，27℃温育15min，逐滴加入培养瓶中，边加边摇匀。27℃培养4～6h后倾去含转染液的无血清培养基，补加4.5mL无血清培养基并加入500μL的FBS，使其终浓度为10％，封口，27℃培养4～5d，至细胞浮起后收集上清液用于重组病毒的筛选。

3.4.7重组病毒的筛选、纯化和扩增

接种适量细胞(平皿底部面积的80％)于35mm小dish中，27℃培养16h至细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清液按10^-3～10^-5作适当稀释后，取1mL稀释液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与等体积经40℃预热的2X TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，添加X-gal使其终浓度达150μg/mL，沿小dish边缘将胶慢慢倒入，凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养4～7d。显微镜下选取无色重组病毒空斑，超净台内用Tip头挑取重组病毒斑，溶于400μL TC-100培养基中，4℃放置4h使病毒粒子释放出来，取100μL病毒液感染24孔板中的细胞，27℃培养3d后，取150μL感染细胞上清按碱变性法快速制备病毒基因组DNA，进行PC R扩增鉴定。方法如下：

参照多角体基因启动子序列在ATG上游40bp处设计一条引物polh-F：5′-ACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAA-3′(SEQID No.15)，和各自的扩增引物cap1R～cap6R一起，以提取的病毒基因组DNA为模板，进行PCR扩增。反应条件为：94℃变性5min、94℃1min、59℃1min、72℃1min，30个循环，最后72℃延伸10min。电泳鉴定扩增产物。鉴定为阳性的重组病毒分别命名为rBmNPV-cap1、rBmNPV-(cap2、rBmNPV-cap3、rBmNPV-cap4、rBmNPV-cap5、rBmNPV-cap6、rBmNPV-cap2DN、rBmNPV-cap4DN和rBmNPV-cap5DN。分别取100μL重组病毒感染正常生长的Bm-5贴壁细胞，在感染后约5d待细胞浮起后，4℃保存，用以注射。

3.5检测用特异性抗体的制备

为了下一步免疫学方法检测蚕血中表达的蛋白，需要制备Cap的特异抗体，由于原核表达(大肠杆菌)系统的表达量高，而且表达载体有现成标签可以利用，容易纯化，我们选用大肠杆菌来表达去核定位信号的Cap蛋白(如参考文献Nawagitgul)，去核定位信号的cap在大场杆菌表达量高)，然后纯化表达蛋白，注射新西兰大白兔来制备Cap蛋白的多克隆抗体。为此，我们将PCV2-5去核定位信号的cap基因与原核表达载体pET-28a连接，得到pET28a-cap5DNF。克隆过程见图4。

3.5.1 PCV核衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化基本步骤

(1)将测序正确的重组质粒pET28a-cap5DNF转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落，过夜培养。

(2)将上一步的菌液1％接入含Kan终浓度50μg/ml的LB培养液中，37℃振荡培养至OD600＝0.5。

(3)加入IPTG至终浓度0.1mM，37℃诱导表达。

(4)5h后收集菌液1ml，12000r/min离心30s，弃上清，加200μl NTA-0重悬。

(5)向样品中加入样品缓冲液，100℃煮10min，电泳检测表达产物的存在形式。

(6)参考《分子克隆》制备分离胶和积层胶。

(7)煮沸的菌液样品，13000r/min，5min离心，取15μL上样。

(8)先90V电压走浓缩胶，再110V走分离胶，待溴酚蓝条带到达凝胶底端，结束电泳。

(9)将凝胶从制胶板上剥离，轻轻转移至染色液中，在摇床上摇动染色2-3h。

(10)倒出染色液，加入脱色液，摇床上摇动脱色，直到完全脱去背景蓝色。

(11)培养100mL重组菌，加IPTG至终浓度0.5mM后继续摇5h，诱导目的蛋白表达。

(12)收集菌，用NTA-0重悬，超声波破碎至澄清，离心收集上清。

(13)将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白质的结合情况。

(14)层析用5倍NTA体积的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30ml/小时左右。

(15)分别用5倍NTA体积的NTA-20，NTA-40，NTA-60，NTA-80，NTA-100，NTA-200，NTA-1000 Buffer洗脱，流速控制在15ml/小时左右，收集洗脱液，每管收集一个NTA体积。

(16)SDS/PAGE检测目标蛋白质在洗脱液中的分布情况。

(17)融合蛋白的质谱鉴定：切下SDS-PAGE电泳图谱中的目的蛋白条带，再分别切成很小的胶块，用于质谱鉴定。质谱分析在中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室完成，方法为二级质谱的数据库搜索鉴定法(MS/MS Database Searching)，标准为：Score Delta Cn超过30，每一段氨基酸片断至少有连续6个氨基酸能够完全匹配，每个蛋白至少有3个氨基酸片断能够匹配。

3.5.2多克隆抗体的制备

将纯化好的融合目的蛋白溶液转移到超滤管中，5000rpm离心2-4h，浓缩到大约0.5ml。把浓缩的融合目的蛋白经Bradford法进行定量，收集3mg目的蛋白，经SDS-PAGE电泳，切割下电泳图谱中的目的蛋白条带，放在研钵中加入液氮磨碎，送至中科院遗产与发育研究所制备多克隆抗体。三次免疫后得到的兔血清保存于-70℃。

用间接ELISA法测抗体效价，具体方法见《精编分子生物学实验指南》(奥斯伯等.1998)

3.5.3PCV核衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化结果

3.5.3.1重组蛋白的诱导表达用浓度为0.5mM的IPTG诱导重组菌后，收集菌体，经12％SDS-PAGE电泳检测，结果与阴性对照相比具有浓集的融合蛋白表达条带(如图5)。

3.5.3.2重组蛋白的纯化

经过超声破碎后，表达的融合蛋白既存在于上清中，也存在于沉淀中，而上清中的含量较高。将该重组菌的诱导表达产物的上清用于亲和纯化。取蛋白上清液过1ml镍亲合柱纯化之后，经12％SDS-PAGE电泳，显示纯化之后的蛋白纯度较高，其中图6为cap5DNF的纯化结果。

3.5.3.3二级质谱鉴定结果

纯化cap5DNF的蛋白，送到中科院动物研究所质谱中心，经过二级质谱的数据库搜索鉴定法(MS/MS Database Searching)得到如图7结果，分析显示，纯化的蛋白的氨基酸序列与理论序列相一致，cap5DN的覆盖率达63.60％。说明纯化得到的蛋白为融合的目的蛋白，序列与预测结果相符。

3.5.3.4多克隆抗体的效价测定

纯化的PCV2 cap5DNF的蛋白在中科院遗传所免疫兔子得到多抗之后，用纯化的融合蛋白作包被抗原，用PBS稀释不同倍数100、200、400、800、1600、3200、6400、12800、25600、51200的多克隆抗血清作一抗，ELISA测抗体效价，免疫前血清作阴性对照(图8)。从图中我们可以看出，自制的抗体在蛋白浓度为10μg/ml时抗体的效价可达1∶3200以上。

3.6 cap1-6基因和cap2DN、cap4DN、cap5DN基因在家蚕中的表达及检测

将重组病毒培养液按10⁵pfu/头注射五天龄幼蚕，待家蚕发病后，剪掉足，收集蚕血，-20℃冻存，用ELISA法检测cap抗原基因在蚕体中的表达情况。

包被液作为空白对照，以正常蚕血作为阴性对照，原核表达的cap5DN蛋白免疫家兔之后的兔血清为第一抗体，HRP标记的羊抗兔抗体为第二抗体。

将rBmNPV(cap1-6)和rBmNPV(cap2DN、cap4DN、cap5DN)感染的蚕血，用包被液做梯度稀释，从100×(3μL蚕血加到270μL包被液)两倍倍比稀释到2048倍。每个梯度处做双孔检测，各取100μL包被到酶标板上。结果如表4-1，结果表明1024倍为一个较为合适的稀释度，可用于下一步比较不同的cap基因在蚕血中cap的表达量。

表达产物经超声破碎和超速离心初步纯化后，产物经20万倍电子显微镜观察均有病毒粒子存在，其中cap5和cap2的空衣壳病毒粒子相对较多。

ELISA结果表明cap基因在家蚕中得到了高量的表达，在1024倍稀释甚至更高稀释度下仍能检测到抗原与抗体的特异性反应。表明cap在家蚕血淋巴中为可溶性表达，如果以表达量最高的rBmNPV(cap5)为100，则rBmNPV(cap1)为29，rBmNPV(cap2)为72，rBmNPV(cap3)为43，rBmNPV(cap4)为36，rBmNPV(cap6)为27，rBmNPV(cap2DN)为20，rBmNPV(cap4DN)为18，rBmNPV(cap5DN)为15。具体结果见图9

4.实施例一分析

综合分析图2和图9的结果，cap基因中N端前41位氨基酸为核定位信号，是把表达产物定位在真核细胞中所必需的。所有3个删除核定位信号的基因cap2DN、cap4DN和cap5DN表达量要远远低于未删除核定位信号的相应的cap2、cap4和cap5的表达量，证明核定位信号是在真核生物中高表达所必须的。

进一步分析rBmNPV-cap5的表达量最高原因，从图2的6个cap基因的氨基酸序列比较来看：cap1、cap2、cap3、cap4和cap6的核定位信号序列是基本一致的，而只有cap5的核定位信号序列发生了很大的改变，相应发生的突变位点分别为F8Y、R12K、S17I、V30D，因此我们认为8Y、12K、17I、30D这几位核定位信号中的氨基酸是将表达产物cap高效定位至昆虫细胞核中，并引起高表达所必须的特征性氨基酸。

而分析rBmNPV-cap2的较高表达量原因，可惊奇地发现在N端前41位的核定位信号序列外，其它的氨基酸序列与cap5基因相比只有第47位和第59位不同，分别为T47A、R59A，而cap2的核定位信号与cap1、cap3、cap4、cap6则完全一致，因此，提示我们cap基因中的第47位氨基酸A和第59位氨基酸A是cap2基因高效表达的特征序列，这也暗示着如果将cap2和cap5基因进行改造，将核定位信号中的高效表达氨基酸如8Y、12K、17I和30D与编码序列中47A、59A通过人工的方法集中在一个cap基因中，则有可能获得表达效率有更大改善的cap基因。

实施例二

改良的猪圆环病毒抗原基因cap7在家蚕生物反应器中的表达及空衣壳粒子的组装

通过实施例1的实验结果分析发现，如果将cap5的高表达的核定位信号与cap2中的47A、59A高表达的特征氨基酸序列结合在一起，则有可能进一步改良cap基因在家蚕生物反应器中的表达效率。

我们分别设计下述引物：cap2-5F：5’-GAAAAATGGCATCTTCAACGCCCG CCTCTC-3(SEQID No.35)和cap2-5R：5’-GAGAGGCGGGCGTTGAAGATGCCAT TTTTC-3’(SEQIDNo.36)，分别用cap5F与cap2-5R作为引物，以cap5基因的DNA为模板进行PCR扩增；而用cap2-5F与cap2R以cap2基因DNA为模板进行PCR扩增。最后，用cap5F和cap2R作为引物，将相应的PCR扩增产物纯化后共同作为模板进行融合PCR扩增，扩增产物克隆到T-载体，经测序发现与预先设计的序列完全一致，命名为cap7，得核苷酸序列SEQ ID.No.13和SEQ ID No.14。在cap7中包含了高表达的8Y、12K、17I、30D、47A、59A等特征氨基酸序列。

进一步将cap7基因按实施例1中同样的方法，克隆到转移载体pVL1393中。得pVL-cap7。pVL-cap7DNA与亲本病毒DNA在昆虫细胞中进行共转染，经筛查、纯化得重组病毒rBmNPV-cap7，将rBmNPV-cap7按同样方法感染家蚕，取血淋巴，经ELISA检测后，发现表达量是最高的rBmNPV-cap5的5.3倍，这充分说明8Y、12K、17I、30D、47A、59A等特征氨基酸序列是高效表达和组装圆环病毒空衣壳粒子所必须的。其中8Y、12K、17I、30D是将表达产物cap高效定位至昆虫细胞核中所必需的，而47A、59A是cap高效表达和组装圆环病毒空衣壳粒子所需的。

将cap7在家蚕中含表达产物的一粒蚕蛹的匀浆液，经超声波破碎，15,000g，10min离心去细胞碎片，上清用270,000g在40％蔗糖密度中离心6h，所得的沉淀溶于1毫升无菌水中，经电镜观察，病毒粒子已经完全纯化(见图10)，用每毫升含20微克的商品化空衣壳PCV2疫苗经处理后作为阳性对照，发现每粒蚕蛹的空衣壳表达量达1.2～1.6毫克。是目前报道最高的PCV2空衣壳表达水平，具有非常巨大的经济效益。

实施例三、家蚕表达的猪圆环病毒2型空衣壳粒子的动物实验

1.疫苗的制备

用实施例2中纯化的PCV2病毒空衣壳粒子，经电镜检查纯一的空衣壳病毒粒子，进行蛋白质定量后，按每剂15μg、30μg、60μg、90μg、120μg的量，用油剂或水剂佐剂，以抗原与佐剂1∶1混合制备疫苗，用于肌肉注射免疫PCV2抗原抗体阴性的一至二周龄仔猪。

2.免疫动物

筛选70头PCV2抗原抗体阴性1-2周龄健康仔猪，随机分成7组，每组10头，第1～6组分别按抗原蛋白含量0μg、15μg、30μg、60μg、90μg、120μg/头份的剂量，肌肉注射仔猪，其中第7组以商品化的PCV2疫苗作为阳性对照。

3.抗体检测

免疫3周和6周后分别取猪血，常规方法分离血清，测定血样中的PCV2ELISA抗体滴度，以细胞繁殖的灭活PCV2纯病毒粒子为抗原，以羊抗猪HRP标记的IgG为二抗，进行实验，PCV特异性抗体的滴度见图11。

4.攻毒

当第六周血样取完后，用2ml PCV2病毒液(病毒含量为10⁵TCID₅₀/ml)进行攻毒，其中0μg组全部发病，15μg组有4头发病，30μg组只有一头发病，60μg组及以上的全部保护。商品化疫苗组有2头发病，因此说明，家蚕制备的PCV2空衣壳病毒粒子保护效果良好。

5.口服疫苗效果研究

为了证明家蚕生产的PCV2病毒空衣壳粒子的经口免疫效果，我们设计了以下实验：将实施例2中初步纯化的PCV2空衣壳病毒粒子，按每头猪200μg的量与同样体积的含25％-35％脂肪酸和8％-12％的蜂胶混合(最佳浓度为脂肪酸30％+蜂胶10％(脂肪酸组成为棕榈酸8％、油酸19％、其它成分为3％)，经超声波乳化后灌注PCV2抗原抗体阴性的仔猪(同上)，6周后取血样，没有检测到PCV2特异的IgG抗体，未能测定口服免疫猪的PCV2特异的IgA抗体(因为未购到猪的IgA有标记的二抗)。用2mlPCV2病毒液(病毒含量为10⁵TCID₅₀/ml)进行攻毒，含量为200μg的免疫组10头猪全部保护，而脂肪酸和蜂胶组对照组10头猪全部发病。

为了进一步证明口服PCV2空衣壳病毒粒子的免疫效果，用每只小鼠按上述配方，口服免疫20μg的PCV2空衣壳病毒粒子，6周后取血样，经测定10只小鼠全部产生了PCV特异的IgA抗体，平均滴度为35左右，而空白对照PCV2特异性IgA抗体滴度只有3左右，与免疫前的滴度相同，证明口服PCV2病毒空衣壳粒子能够产生抗体，并有相当的保护效果。

序列表

<110>中国兽医药品监察所，中国农业科学院生物技术研究所

<120>高效制备猪圆环病毒2型空衣壳粒子的方法

<130>

<160>33

<170>Patentin version 3.5

<210>1

<211>705

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型cap1序列

<400>1

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCCGCAGA CGAAGACACC GCCCCCGCAG CCATCTTGGC 60

CAGATCCTCC GCCGCCGCCC CTGGCTAGCC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCATCG GTTATACTGT CAAGAAAACC 180

ACAGTCAGAA CGCCCTCCTG GAATGTGGAC ATGATGAGAT TTAATATTAA TGATTTTCTT 240

CCCCCAGGAG GGGGCTCAAA CCCCCTCACT GTGCCCTTTG AATACTACAG AATAAGGAAG 300

GTTAAGGTTG AATTCTGGCC CTGCTCCCCA ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTGGGCTCC 360

ACTGCTGTTA TTCTAGATGA TAACTTTGTA ACAAAGGCCA ATGCCCTAAC CTATGACCCC 420

TATGTAAACT ACTCCTCCCG CCATACCATA ACCCAGCCCT TCTCCTACCA CTCCCGGTAC 480

TTTACCCCGA AACCTGTCCT TGATAGGACA ATCGATTACT TCCAACCCAA TAACAAAAGA 540

AATCAACTCT GGCTGAGACT ACAAACTACT GGAAATGTAG ACCATGTAGG CCTCGGCACT 600

GCGTTCGAAA ACAGTATATA CGACCAGGAC TACAATATCC GTATAACCAT GTATGTACAA 660

TTCAGAGAAT TTAATCTTAA AGACCCCCCA CTTAACCCTA AGTGA 705

SEQIDNo.2：cap1氨基酸序列

<210>2

<211>234

<212>PRT

<213>猪圆环病毒2型cap1氨基酸序列

<400>2

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Ala His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

<210>3

<211>705

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型cap2序列

<400>3

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCCGCAGA CGAAGACACC GCCCCCGCAG CCATCTTGGC 60

CAGATCCTCC GCCGCCGCCC CTGGCTCGTC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACGC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG GATATACTGT CAAGGCTACC 180

ACAGTCAGCA CGCCCTCCTG GGCGGTGGAC ATGCTGAGAT TTAATCTTGA CGACTTTGTT 240

CCCCCGGGAG GGGGGACCAA CAAAATCTCT ATACCCTTTG AATACTACAG AATAAGAAAG 300

GTTAAGGTTG AATTCTGGCC CTGCTCCCCG ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTTGGATCC 360

AGTGCTATTA TTCTAGATGA CAACTTTGTA ATAAAGGCCA CAGCCCAAAC CTACGACCCC 420

TATGTAAACT ACTCCTCCCG CCATACAATC CCCCAACCCT TCTCCTACCA CTCCCGTTAC 480

TTCACACCCA AACCTGTTCT TGATTCCACT ATTGATTACT TCCAACCAAA TAACAAAAGG 540

AATCAGCTGT GGATGAGACT CCAAACCAGT AGAAATGTGG ACCACGTAGG CCTCGGCACT 600

GCCTTCGAAA ACAGTAAATA CGACCAGGAC TACAATATCC GTGTAACCAT GTATGTACAA 660

TTCAGAGAAT TTAATCTTAA AGACCCCCCA CTTAAACCCT AA 702

<210>4

<211>233

<212>PRT

<213>猪圆环病毒2型cap2氨基酸序列

<400>4

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Ala Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Ser Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Leu Arg Phe Asn Leu Asp Asp Phe Val

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Ile Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro

225 230

<210>5

<211>705

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型cap3序列

<400>5

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCCGCAGA CGAAGACACC GCCCCCGCAG CCATCTTGGC 60

CAGATCCTCC GCCGCCGCCC CTGGCTAGTC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG GTTATACTGT CAAGAAAACC 180

ACAGTCAGAA CGCCCTCCTG GAATGTGGAC ATGATGAGAT TTAATATTAA TGATTTTCTT 240

CCCCCAGGAG GGGGCTCAAA CCCCCTCACT GTGCCCTTTG AATACTACAG AATAAGGAAG 300

GTTAAGGTTG AATTCTGGCC CTGCTCCCCA ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTGGGCTCC 360

ACTGCTGTTA TTCTAGATGA TAACTTTGTA ACAAAGGCCA ATGCCCTAAC CTATGACCCC 420

TATGTAAACT ACTCCTCCCG CCATACCATA ACCCAGCCCT TCTCCTACCA CTCCCGGTAC 480

TTTACCCCGA AACCTGTCCT TGATAGGACA ATCGATTACT TCCAACCCAA TAACAAAAGA 540

AATCAACTCT GGCTGAGACT ACAAACTACT GGAAATGTAG ACCATGTAGG CCTCGGCACT 600

GCGTTCGAAA ACAGTATATA CGACCAGGAC TACAATATCC GTATAACCAT GTATGTACAA 660

TTCAGAGAAT TTAATCTTAA AGACCCCCCA CTTAACCCTA AGTGA 705

<210>6

<211>234

<212>PRT

<213>猪圆环病毒2型cap3氨基酸序列

<400>6

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

<210>7

<211>705

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型cap4序列

<400>7

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCCGCAGA CGAAGACACC GCCCCCGCAG CCATCTTGGC 60

CAGATCCTCC GCCGCCGCCC CTGGCTCGTC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCATCG GTTATACTGT CAAGAAAACC 180

ACAGTCAGAA CGCCCTCCTG GAATGTGGAC ATGATGAGAT TTAATATTAA TGATTTTCTT 240

CCCCCAGGAG GGGGCTCAAA CCCCCTCACT GTGCCCTTTG AATACTACAG AATAAGGAAG 300

GTTAAGGTTG AATTCTGGCC CTGCTCCCCA ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTGGGCTCC 360

ACTGCTGTTA TTCTAGATGA TAACTTTGTA ACAAAGGCCA ATGCCCTAAC CTATGACCCC 420

TATGTAAACT ACTCCTCCCG CCATACCATA ACCCAGCCCT TCTCCTACCA CTCCCGATAC 480

TTTACCCCGA AACCTGTCCT TGATAGGACA ATCGATTACT TCCAACCCAA TAACAAAAGA 540

AATCAACTCT GGCTAAGACT ACAAACTACT GGAAATGTAG ACCATGTAGG CCTCGGCACT 600

GCGTTCGAAA ACAGTATATA CGACCAGGAC TACAATATCC GTATAACCAT GTATGTACAA 660

TTTAGAGAAT TTAATCTTAA AGACCCCCCA CTTAACCCTA AGTGA 705

<210>8

<211>234

<212>PRT

<213>猪圆环病毒2型cap4氨基酸序列

<400>8

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

<210>9

<211>702

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型cap5序列

<400>9

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTACCGCAGA AGAAAACACC GCCCCCGCAT CCATCTTGGC 60

CAGATCCTCC GCCGCCGCCC CTGGCTCGAC CACCCCCGCC ACCGCTACCG TTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG GATATACTGT CAAGCGTACC 180

ACAGTCAGCA CGCCCTCCTG GGCGGTGGAC ATGCTGAGAT TTAATCTTGA CGACTTTGTT 240

CCCCCGGGAG GGGGGACCAA CAAAATCTCT ATACCCTTTG AATACTACAG AATAAGAAAG 300

GTTAAGGTTG AATTCTGGCC CTGCTCCCCG ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTTGGATCC 360

AGTGCTATTA TTCTAGATGA CAACTTTGTA ATAAAGGCCA CAGCCCAAAC CTACGACCCC 420

TATGTAAACT ACTCCTCCCG CCATACAATC CCCCAACCCT TCTCCTACCA CTcCCGTTAC 480

TTCACACCCA AACCTGTTCT TGATTCCACT ATTGATTACT TCCAACCAAA TAACAAAAGG 540

AATCAGCTGT GGATGAGACT CCAAACCAGT AGAAATGTGG ACCACGTAGG CCTCGGCACT 600

GCCTTCGAAA ACAGTAAATA CGACCAGGAC TACAATATCC GTGTAACCAT GTATGTACAA 660

TTCAGAGAAT TTAATCTTAA AGACCCCCCA CTTAAACCCT AA 702

<210>10

<211>233

<212>PRT

<213>猪圆环病毒2型cap5氨基酸序列

<400>10

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Lys His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ile His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Asp His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Arg Thr Thr Val Ser Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Leu Arg Phe Asn Leu Asp Asp Phe Val

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Ile Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro

225 230

<210>11

<211>705

<212>DNA

<213>猪圆环病毒2型cap6序列

<400>11

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCCGCAGA CGAAGACACC GCCCCCGCAG CCATCTTGGC 60

CAGATCCTCC GCCGCCGCCC CTGGCTAGTC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG GTTATACTGT CAAGAAAACC 180

ACAGTCAGAA CGCCCTCCTG GAATGTGGAC ATGATGAGAT TTAATATTAA TGATTTTCTT 240

CCCCCAGGAG GGGGCTCAAA CCCCCTCACT GTGCCCTTTG AATACTACAG AATAAGGAAG 300

GTTAAGGTTG AATTCTGGCC CTGCTCCCCA ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTGGGCTCC 360

ACTGCTGTTA TTCTAGATGA TAACTTTGTA ACAAAGGCCA ATGCCCTAAC CTATGACCCC 420

TATGTAAACT ACTCCTCCCG CCATACCATA ACCCAGCCCT TCTCCTACCA CTCCCGGTAC 480

TTTACCCCGA AACCTGTCCT TGATAGGACA ATCGATTACT TCCAACCCAA TAACAAAAGA 540

AATCAACTCT GGCTGAGACT ACAAACTACT GGAAATGTAG ACCATGTAGG CCTCGGCACT 600

GCGTTCGAAA ACAGTATATA CGACCAGGAC TACAATATCC GTATAACCAT GTATGTACAA 660

TTCAGAGAAT TTAATCTTAA AGACCCCCCA CTTAACCCTA AGTGA

705

<210>12

<211>234

<212>PRT

<213>猪圆环病毒2型cap6氨基酸序列

<400>12

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Phe Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

<210>13

<211>702

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：重组的cap7序列

<400>13

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTACCGCAGA AGAAAACACC GCCCCCGCAT CCATCTTGGC 60

CAGATCCTCC GCCGCCGCCC CTGGCTCGAC CACCCCCGCC ACCGCTACCG TTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACGC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG GATATACTGT CAAGGCTACC 180

ACAGTCAGCA CGCCCTCCTG GGCGGTGGAC ATGCTGAGAT TTAATCTTGA CGACTTTGTT 240

CCCCCGGGAG GGGGGACCAA CAAAATCTCT ATACCCTTTG AATACTACAG AATAAGAAAG 300

GTTAAGGTTG AATTCTGGCC CTGCTCCCCG ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTTGGATCC 360

AGTGCTATTA TTCTAGATGA CAACTTTGTA ATAAAGGCCA CAGCCCAAAC CTACGACCCC 420

TATGTAAACT ACTCCTCCCG CCATACAATC CCCCAACCCT TCTCCTACCA CTCCCGTTAC 480

TTCACACCCA AACCTGTTCT TGATTCCACT ATTGATTACT TCCAACCAAA TAACAAAAGG 540

AATCAGCTGT GGATGAGACT CCAAACCAGT AGAAATGTGG ACCACGTAGG CCTCGGCACT 600

GCCTTCGAAA ACAGTAAATA CGACCAGGAC TACAATATCC GTGTAACCAT GTATGTACAA 660

TTCAGAGAAT TTAATCTTAA AGACCCCCCA CTTAAACCCT AA 702

<210>14

<211>233

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>对人工序列的描述：重组的cap7氨基酸序列

<400>14

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Lys His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ile His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Asp His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Ala Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Ser Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Ala Val Asp Met Leu Arg Phe Asn Leu Asp Asp Phe Val

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Ser Ala Ile Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Ile Lys Ala Thr Ala Gln Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Met Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro

225 230

<210>15

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于扩增重组病毒的引物polh-F

<400>15

ACTGTTTTCG TAACAGTTTT GTAA 24

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中预期扩增结果：1465bp所用的第一对引物PCVF-1F

<400>16

GCTCCCGTAT TTTCTTGCGC TCGTC 25

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中预期扩增结果：1465bp所用的第一对引物PCVF-1R

<400>17

CAAACGTTAC AGGGTGCTGC TCTGC 25

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中预期扩增结果：1400bp所用的第一对引物PCVF-2F

<400>18

CGTTACAGGG TGCTGCTCTG CAACG 25

<210>19

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中预期扩增结果：1400bp所用的第一对引物PCVF-2R

<400>19

GAGCTTCTAC AGCTGGGACA GCAGTTG

<210>20

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap1F

<400>20

CGGATCCAAC ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCC 35

<210>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap1R

<400>21

GCTGCAGTCA CTTAGGGTTA AGTGGGGGGT C 31

<210>22

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap2F

<400>22

GAGATCTAAC ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCC 35

<210>23

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap2DNF

<400>23

GAGATCTAAC ATGAATGGCA TCTTCAACGC CCGCCTC 37

<210>24

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap2R

<400>24

GCTGCAGCTT TTAGGGTTTA AGTGGGGGGT C 31

<210>25

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap3F

<400>25

CGGATCCAAC ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTACC 35

<210>26

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap3R

<400>26

GCTGCAGCAT TAAGGGTTAA GTGGGGGGTC 30

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap4F

<400>27

CGGATCCAAC ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCC 35

<210>28

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap4DNF

<400>28

CGGATCCAAC ATGAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTC 37

<210>29

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap4R

<400>29

GCTGCAGTCA CTTAGGGTTA AGTGGGGGGT C 31

<210>30

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap5F

<400>30

cGGATCCAAC ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTACC 35

<210>31

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap5DNF

<400>31

cAGATCTAAC ATGGCATCTT CAACACCCGC CTC 33

<210>32

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap5R

<400>32

GCTGCAGTCA TTTAGGGTTT AAGTGGGGGG TC 32

<210>33

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap6F

<400>33

cGGATCCAAC ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTTCC 35

<210>34

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例1中所用的引物PCV2-cap6R

<400>34

GCTGCAGTCA CTTAGGGTTA AGTGGGGGGT C 31

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例2中所用的引物cap2-5F

<400>35

GAAAAATGGC ATCTTCAACG CCCGCCTCTC 30

<210>36

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实施例2中所用的引物cap2-5R

<400>36

GAGAGGCGGG CGTTGAAGAT GCCATTTTTC 30

Claims

1.高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于该方法主要包括：将形成圆环病毒2型空衣壳所需的不同病毒株的抗原基因cap、人工改造的cap的突变体克隆到家蚕杆状病毒运载载体得同源重组载体，将同源重组载体与亲本病毒DNA在昆虫细胞或大肠杆菌中进行重组或转座得重组杆状病毒，用含抗原基因的重组杆状病毒感染昆虫；培养被感染的昆虫宿主表达相应的圆环病毒2型空衣壳粒子；收集并纯化表达产物可得上述猪圆环病毒2型空衣壳颗粒。

2.如权利要求1高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，，其特征在于：所述猪圆环病毒2型空衣壳不同毒株的cap基因选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQID No.4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9，SEQ IDNo.10，SEQ ID No.11和SEQ ID No.12所示的DNA和氨基酸序列。

3.如权利要求1-2高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于：所述的杆状病毒运载载体其所用表达盒的启动子为多角体蛋白，p10，ie-1等及与增强子组合，选自pBm034，pBm93，BacPAK6，Bac to Bac，Bacmid，pVL1391，pVL 1392，pVL 1393，pVL941，pVL945，pVL 985，pVTBac，pBm030，pUAC-5或其它类似的杆状病毒同源重组或转座载体；所述的杆状病毒同源运载转移载体最优是pVL 1393。

4.如权利要求1-3所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于所构建的同源运载表达载体是pVL-cap 1、pVL-cap2、pVL-cap3、pVL-cap4、pVL-cap5、pVL-cap6，用于空衣壳颗粒形成所需抗原基因表达并组装为病毒粒子。

5.如权利要求1-4所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于所述的重组杆状病毒选自以下任意一种重组病毒：(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap1；(2)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap2；(3)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap3；(4)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap4；(5)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap5；(6)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap6。

6.如权利要求1-4所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于所述的杆状病毒选自以下任意一种：BmNPV，AcMNPV，ApNPV，HaNPV，HzNPV，LdMNPV，MbMNPV，OpMNPV，SlMNPV，SeMNPV和SpltNPV；优选为家蚕杆状病毒Bm-NPV。

7.如权利要求1-5所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于所述的昆虫宿主包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoploca japanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestra brassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)及相应的昆虫细胞；本发明所述的最优昆虫宿主是家蚕(Bombyx mori)或相应的细胞。

8.如权利要求1-6所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于将所述的重组病毒(1)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap1；(2)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap2；(3)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap3；(4)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap4；(5)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap5；(6)重组家蚕核型多角体病毒rBmNPV-cap6分别在家蚕中进行表达测定病毒空衣壳粒子的表达量，筛选得不同重组病毒的猪圆环病毒2型空衣壳病毒粒子的表达效率。

9.如权利要求1，2所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于分析猪圆环病毒2型空衣壳不同毒株的cap基因：SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ IDNo.：4，SEQ ID No.5，SEQ ID No.：6，SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.：9，SEQ ID No.10，SEQ ID No.11，SEQ ID No.12所示的DNA或氨基酸序列特征，在于SEQ ID No.9中下述氨基酸序列1-MTYPRRRYRRRKHRPRIHLGQILRRRPWLDHP RHRYRWRRK-41是CAP蛋白高效定位于昆虫细胞核内所必需的，下列位置的氨基酸发生了改变：F8Y、R12K、S17I、V30D，其中8Y、12K、17I、30D是空衣壳抗原在昆虫细胞核中高效定位所必需的；而SEQ ID NO：3中的下述位置的氨基酸发生了改变：T47A、R59A，其第47位和第59位氨基酸A是猪圆环病毒2型空衣壳粒子高效组装所必需的。

10.如权利要求1-5和8所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于按照权利要求8所述获得的特征序列，经过人工改造获得SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，其中下述位置的氨基酸为8Y、12K、17I、30D、47A、59A；将SEQ ID No.13的片段克隆到表达载体经重组得rBmNPV-cap7，rBmNPV-cap7能最高表达猪圆环病毒2型空衣壳粒子。

11.如权利要求1-9所述高效制备猪圆环病毒2型空衣壳颗粒的方法，其特征在于将所获得的空衣壳颗粒作为抗原按现有技术用佐剂经乳化后制成基因工程疫苗；用此疫苗免疫动物、可经受猪圆环病毒2型病毒的攻击；或用脂肪酸和蜂胶乳化后，经口添饲动物，动物也能产生相应的保护抗体，并能经受住猪圆环病毒2型的攻击。