CN108148816B

CN108148816B - 一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变pcv2病毒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108148816B
Application number: CN201810049195.7A
Authority: CN
Inventors: 黄勇; 童德文; 王彤彤
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2020-06-05
Anticipated expiration: 2038-01-18
Also published as: CN108148816A

Abstract

本发明提供一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒及其制备方法和应用，对猪圆环病毒2型(PCV2，GenBank No.EU366323)毒株Cap的三个位点(164K、179K、191K)突变，使得突变的PCV2不能被MKRN1介导的泛素化降解，并且可通过感染性克隆进行高速复制，毒价高于野生型的PCV2毒价。通过感染性克隆获得的突变病毒可以更好的研究PCV2的致病机制，并为PCV2暴发提供潜在的控制措施。

Description

一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及pMKRN1介导的猪圆环病毒2型(PCV2)毒株Cap泛素化，具体涉及与pMKRN1泛素连接酶作用相关的氨基酸位点突变的PCV2的构建。

背景技术

猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)引起的，主要包括猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔猪传染性先天性震颤(congenital tremors,CT)和断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)等多种疾病。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但是一直不能高速繁殖，这对PCV2致病机制的研究造成障碍。如何提高PCV2复制能力是目前研究其致病机制亟待解决的问题之一。

研究表明，人的MKRN1对包括病毒蛋白在内的多种底物蛋白具有E3泛素连接酶的作用。但对于PCV2而言，目前仅报道了PCV2在PK-15细胞中与porcine MKRN1(pMKRN1)结合。pMKRN1结合后对于PCV2包括的主要结构蛋白成分，即其衣壳蛋白(Cap)有怎样的作用，带来怎样的影响，并未得到研究。PCV2的Cap是由234个氨基酸(aa)组成的单肽链蛋白，其具体氨基酸序列可以参考“Ultrasensitive Detection of RNA and DNA VirusesSimultaneously Using Duplex UNDP-PCR Assay”，其包含11个赖氨酸。目前发现的PCV2毒株主要包括2a亚型、2b亚型，比对分析2a亚型与2b亚型发现164位和179位的赖氨酸高度保守，191位氨基酸不同。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒及其制备方法和应用。该病毒毒株具有感染活性，可在PK-15细胞中高速复制，从而可以替代野生型PCV2来研究PCV2致病机制和疾病药物的开发。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种突变的PCV2病毒，该PCV2病毒的衣壳蛋白(Cap)在宿主体内的泛素化蛋白酶体途径的降解中保持完整性。

所述泛素化蛋白酶体途径的降解或泛素化由猪MKRN1蛋白(pMKRN1)介导。

所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒的衣壳蛋白(Cap)上与泛素(Ub)分子结合的氨基酸位点的编码序列处。

所述氨基酸位点选自野生型PCV2病毒(2b亚型)的衣壳蛋白(Cap)自氨基端起第164、179及191位赖氨酸中的一个、两个或三个；通过突变，所述第164、179及191位赖氨酸中的一个、两个或三个变为丙氨酸，使得Cap不能被pMKRN1介导的泛素化蛋白酶体途径降解。

所述突变的PCV2病毒的序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述突变的PCV2病毒的制备方法，包括以下步骤：

通过免疫共沉淀(Co-IP)试验确定猪MKRN1蛋白(pMKRN1)与野生型PCV2病毒衣壳蛋白(Cap)的相互作用区域，在该区域内确定与泛素(Ub)分子结合的降解位点，然后根据降解位点，通过重叠PCR，以野生型PCV2病毒的DNA为模板，扩增得到降解位点突变的PCV2病毒序列，将该序列环化后转染PK-15细胞，培养一定时间后收集病毒上清。

所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型，其DNA序列，例如如GenBankNo.EU366323所示。

所述重叠PCR采用的扩增引物为：

病毒DNA片段1引物：

Overlap-F1：5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT-3'；

Overlap-R1：5'-CTTCCAACCAAATAACGCCAGAAATCAGCTGTGGATGAGAATTCAAACCAGTGCCAA-3'；

病毒DNA片段2引物：

Overlap-F2：5'-ATTTCTGGCGTTATTTGGTTGGAAGTAATCAATGGTGGAATCAAGGACAGGGGCGGG-3'；

Overlap-R2：5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3'；

病毒DNA全长引物：

Overlap-F1：5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT-3'；

Overlap-R2：5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3'。

上述突变的PCV2病毒在制备PCV2病毒感染动物细胞模型中的应用。

所述动物细胞模型为感染突变的PCV2病毒的PK-15细胞。

本发明的有益效果体现在：

本发明基于对pMKRN1(Porcine MKRN1)蛋白能够对野生型猪圆环病毒2型(PCV2)毒株Cap的三个氨基酸位点(即164K,179K,191K)发挥其泛素连接酶作用的发现。通过制备不能被MKRN1蛋白介导的泛素化降解的PCV2，从而获得具有感染性、复制速度快的突变的PCV2毒株，其毒价高于野生型的PCV2。本发明通过感染性克隆获得的突变病毒可以更好的研究PCV2的致病机制，并为PCV2暴发提供潜在的控制措施。

进一步的，本发明构建的三个氨基酸位点同时突变的PCV2感染性克隆，通过泛素化试验证实pMKRN1不能介导突变病毒的泛素化作用，通过感染实验发现PCV2突变病毒毒株的毒价可以达到10^7.3copies/mL，比野生型PCV2明显增高，完全可以替代野生型PCV2来研究PCV2致病机制，并对控制药物的研发有着重要的意义。

附图说明

图1为pMKRN1和PCV2Cap的PCR和双酶切鉴定结果；其中：A为pMKRN1的PCR产物鉴定；B为Cap的PCR产物鉴定；C为不带Flag标签的pMKRN1的真核表达载体的双酶切鉴定；D为不带Flag标签的Cap的真核表达载体的双酶切鉴定；数字1～4为泳道编号，M为DNA MarkerDL5000/2000。

图2为pMKRN1稳定表达细胞系的鉴定结果；其中：泳道1为PK-15细胞，泳道2为转染pCI-neo的细胞，泳道3为转染Flag-pMKRN1-pCI的细胞；β-actin为内参，Flag-pMKRN1为带Flag标签的pMKRN1。

图3为pMKRN1稳定表达细胞系中Cap蛋白表达的检测结果；其中：泳道1为PK-15细胞，泳道2为转染pCI-neo的阳性细胞，泳道3为转染Flag-pMKRN1-pCI的阳性细胞。

图4为瞬时表达pMKRN1的293T细胞中Cap蛋白表达的检测结果。

图5为pMKRN1与PCV2Cap相互作用区域的免疫共沉淀实验设计与结果；其中：Cap(*-*)表示不同截短长度Cap的表达载体；Input表示裂解产物对照，IP表示免疫沉淀；β-actin为内参。

图6为pMKRN1与PCV2Cap结合位点的实验设计与结果；其中：A为pMKRN1对Cap不同截短体的降解作用鉴定；B为pMKRN1对Cap不同突变体的降解作用鉴定；C为pMKRN1对Cap不同突变体的泛素化作用鉴定；β-actin为内参；3M指3个位点同时突变；Flag-K164A\Flag-K179A\Flag-K191A\Flag-Cap-3M参照Flag-Cap构建；HA(Ub)n表示Cap蛋白结合n个带HA标签的ub分子；β-actin为内参。

图7为PCV2突变体的PCR(A)和双酶切鉴定(B)结果；其中：M为DNA marker DL5000/2000，泳道1为野生型PCV2全长，泳道2为PCV2突变体全长，泳道3为PCV2突变体克隆载体的酶切鉴定。

图8为PCV2突变病毒(PCV2KmA)的DNA扩增结果；其中：M为DNA marker DL5000，泳道1为PCV2突变病毒(PCV2KmA)的DNA全长。

图9为感染PCV2KmA的PK-15细胞中Cap蛋白的表达(A)和病毒复制(B)检测结果；其中：PCV2表示野生型PCV2；β-actin为内参。

图10为PK-15细胞感染PCV2KmA后的泛素化Cap蛋白检测结果；其中：Cap-(Ub)n表示Cap连接n个ub分子；Lysate表示细胞裂解物；β-actin为内参。

图11为PCV2KmA在动物体内外周血、器官组织中复制(A、B)及28d致病(C)结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。所述是对本发明的解释，而不是限定。

本发明通过将porcine MKRN1(pMKRN1)与PCV2Cap共表达检测pMKRN1对Cap降解的作用确定pMKRN1对PCV2Cap降解的作用后构建PCV2Cap蛋白的截短突变体，用免疫共沉淀试验证实pMKRN1与PCV2Cap的相互作用区域，并进一步通过泛素化及降解分析确定pMKRN1与PCV2Cap的作用位点。根据作用位点构建的PCV2突变体并不能被泛素化，从而使PCV2在细胞和体内的复制能力显著提高。这一发现为研究PCV2的致病机制提供方便，并为PCV2暴发提供潜在的控制措施。

(一)pMKRN1和PCV2Cap真核表达载体的构建

设计pMKRN1和PCV2Cap的扩增引物：

pMKRN1上游引物P1：5'-CCGCTCGAGATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGCATGGGGTTTGTAAGGAAG-3'(下划线位置表示Xhol限制性酶切位点，斜体位置表示Flag标签)；

pMKRN1下游引物P2：5'-GCTCTAGACTATAGATCCAAGTCATAAAAGTCT-3'(下划线位置表示Xbal限制性酶切位点)；

Cap上游引物P3：5'-CCGCTCGAGATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGACGTATCCAAGGAGGCGTTA-3'(下划线位置表示Xhol限制性酶切位点，斜体位置表示Flag标签)；

Cap下游引物P4：5'-CCCAAGCTTAGGGTTAAGTGGGGGGTC-3'(下划线位置表示HindIII限制性酶切位点)；

以PK-15细胞(ATCC)的cDNA(提取细胞总RNA反转录获得)和PCV2病毒DNA(2b亚型，GenBank No.EU366323)为模板，分别PCR扩增带有或不带Flag的pMKRN1读码框和带有或不带Flag的Cap读码框，PCR产物经电泳后分别用胶回收试剂盒回收，用限制性内切酶双酶切目的基因和对应真核表达载体，然后将目的基因pMKRN1(带Flag标签或者不带Flag标签)连接到pCI-neo载体(Promega)上，将Cap(带Flag标签或者不带Flag标签)连接到pcDNA3.1载体(Biovector)或者pEGFP-N1载体(Biovector)上，转化大肠杆菌感受态DH5a(TAKARA)，37℃过夜培养后，挑取单克隆，37℃摇床摇菌12h，质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用PCR鉴定和双酶切鉴定，鉴定正确后送上海生工生物科技有限公司进行测序，测序正确后命名为Flag-pMKRN1-pCI(由pCI-neo载体和带Flag标签的pMKRN1连接而成)、pMKRN1-pCI(由pCI-neo载体和不带Flag标签的pMKRN1连接而成)、GFP-Cap(由pEGFP-N1载体和不带Flag标签的Cap连接而成)、Flag-Cap(由pcDNA3.1载体和带Flag标签的Cap连接而成)、pcDNA-Cap(由pcDNA3.1载体和不带Flag标签的Cap连接而成)，结果如图1所示。

(二)pMKRN1稳定表达细胞系的构建

将PK-15细胞铺至6孔板，待细胞贴壁后分别转染Flag-pMKRN1-pCI和pCI-neo质粒，转染24h后用G418筛选阳性细胞，待阳性细胞长满后扩大培养，并冻存细胞备用，利用western blotting方法检测到pMKRN1过表达，结果如图2所示。

(三)pMKRN1介导Cap蛋白的降解及泛素化

1.稳定表达pMKRN1降低Cap蛋白的表达

在pMKRN1稳定表达细胞系中共转染pcDNA-Cap和pEGFP-N1表达载体，36h后收集细胞，用western blotting检测蛋白表达，结果显示Cap的表达量下降约70％，而绿色荧光蛋白(GFP)的表达量没有变化，结果如图3所示。

2.瞬时表达pMKRN1降低Cap蛋白的表达

在293T细胞中分别瞬时转染不同量的Flag-pMKRN1-pCI质粒(0、1、3、5μg/3×10⁵个细胞)，同时转染相同量的pcDNA-Cap和pEGFP-N1表达载体，36h后收集细胞，用westernblotting检测蛋白表达，结果显示Cap的表达量随pMKRN1表达量的上升而逐渐下降，而GFP的表达量没有变化，结果如图4所示。

(四)Co-IP确定pMKRN1与PCV2Cap相互作用区域

将PCV2Cap基因截短(参见图5)并构建至pEGFP-N1过表达载体上(具体构建参照第(一)部分)，通过荧光信号确定过表达成功后分别与Flag-pMKRN1-pCI共转染293T细胞，转染36h后收集细胞，用NP-40裂解液冰上裂解细胞30min，取上清与proteinG琼脂悬液共孵育进行杂蛋白的预清除，4℃、6000rpm离心15min，取上清移至新的离心管，加入GFP捕获抗体(Cell Signalling Technology)，置于4℃轻摇混匀过夜使之充分形成混合物，将此混合物加入100μL含50％proteinG琼脂悬液中室温孵育1h，用微量离心机瞬离弃上清，然后用预冷PBS洗3遍，加入2×SDS上样缓冲液煮10min，最后4℃、12000rpm离心10min，取上清进行SDS-PAGE。Western blotting用Flag单抗(Thermo Fisher)检测与其结合的Cap片段，结果分析得出108-161aa、162-198aa与pMKRN1结合。

(五)pMKRN1与PCV2Cap结合位点的确定

分别构建1-107aa，108-161aa，162-198aa及199-234aa片段的表达载体，分别与Flag-pMKRN1-pCI共转染293T细胞，用western blotting检测pMKRN1对其的降解作用，结果分析发现pMKRN1仅对162-198aa介导降解作用，如图6(A)所示，pMKRN1存在时162-198aa蛋白表达量比没有pMKRN1存在时表达量显著降低，而其他片段的表达没有显著变化。

对162-198aa序列分析得到此片段中存在3个赖氨酸，即164K，179K，191K。将其分别和同时突变成丙氨酸，将突变后的Cap分别与Flag-pMKRN1-pCI共转染293T细胞，用western blotting检测Cap的降解，结果发现3个赖氨酸对Cap的降解均起作用(表达量变少)，结果如图6(B)所示。进一步用泛素化试验验证这3个位点对Cap的泛素化作用，结果发现3个赖氨酸对Cap的泛素化均起作用(与多个ub分子结合)，结果如图6(C)所示。根据以上结果，得出：野生型PCV2病毒的Cap可以与pMKRN1介导的ub分子结合，发生泛素化蛋白酶体途径的降解。

(六)PCV2突变序列overlap扩增及感染性克隆载体的构建

根据野生型PCV2序列，将PCV2Cap 162-198aa中3位点赖氨酸(164K，179K，191K)同时突变成丙氨酸，依据突变后PCV2序列(SEQ.ID.NO.1)设计overlap引物

Overlap-F1：5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT-3'(下划线位置表示SacII限制性酶切位点)；

Overlap-R1：5'-CTTCCAACCAAATAACGCCAGAAATCAGCTGTGGATGAGAATTCAAACCAGTGCCAA-3'(斜体位置为突变碱基)；

Overlap-F2：5'-ATTTCTGGCGTTATTTGGTTGGAAGTAATCAATGGTGGAATCAAGGACAGGGGCGGG-3'(斜体位置为突变碱基)；

Overlap-R2：5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3'(下划线位置表示SacII限制性酶切位点)；

表1.PCR反应体系

表2.PCR反应条件

以野生型PCV2病毒DNA(2b亚型，GenBank No.EU366323)为模板(病毒是从采集的2010-2012年的组织样品中分离得到，采集地点：陕西省宝鸡，延安，咸阳)，利用引物对Overlap-F1/R1及Overlap-F2/R2分别扩增，分别扩增的两个片段回收后共同作为模板，用全长引物(Overlap-F1和Overlap-R2)扩增，反应体系和反应条件见表1和表2，得到完整突变PCV2序列，大小与野生型一致(1767bp)，经过测序鉴定序列正确(比对SEQ.ID.NO.1)，如图7(A)所示。将突变PCV2全长与T载体(pGEM-T-easy；Promega)连接(表3)。

表3.连接反应体系

连接后转化至大肠杆菌感受态DH5a，提质粒后选用SacII酶切，回收突变的PCV2全长(1767bp)，如图7(B)所示，连接酶环化，最后抽提(苯酚、氯仿、异戊醇的混合物(25:24:1))环状DNA(双链)。

(七)突变病毒的获得

将环状DNA用

2000转染PK-15细胞(每2μg DNA加1.5μL脂质体)，5-6h后换成完全培养基，在细胞中连续传代5次(37℃，5％CO₂培养箱，每代培养4天)，收集病毒(反复冻融3次，12000rpm离心5min收集上清)。提取病毒DNA(病毒DNA提取试剂盒，TAKARA)，以引物对V-F/R PCR扩增出突变PCV2DNA片段，与野生型大小一致(1767bp)，将突变病毒命名为PCV2KmA，结果如图8所示。

V-F:5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT-3'(下划线位置表示SacII限制性酶切位点)；

V-R:5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3'(下划线位置表示SacII限制性酶切位点)；

(八)PCV2KmA感染实验

将PK-15细胞铺到6孔板中，每孔5×10⁵个细胞，待细胞贴壁后分别接种1MOI PCV2和1MOI PCV2KmA，24、48、72hpi用western blotting检测病毒Cap蛋白的表达量的变化，同时用定量PCR检测病毒拷贝数的变化。PCV2KmA Cap蛋白的表达量高于野生型Cap蛋白的表达量，结果如图9(A)所示。PCV2KmA拷贝数明显高于野生型PCV2，攻毒后72h的拷贝数(viralgenomic number)达到10^7.3Copies/mL，结果如图9(B)所示。

(九)PCV2KmA的泛素化试验

将PK-15细胞铺于10cm平皿内，每个皿3×10⁶个细胞，待细胞贴壁后分别感染PCV2和PCV2KmA 24h，收集细胞并裂解，用PCV2Cap多克隆抗体作为捕获抗体，最后用泛素ub抗体(Cell Signalling Technology)做western blotting检测，结果显示PCV2KmA感染细胞中检测不到Cap蛋白的多泛素化，如图10所示。PCV2KmA的Cap不能被pMKRN1介导的泛素化蛋白酶体途径降解。

(十)PCV2KmA在动物体内的扩增及致病作用

购买18头5周龄仔猪，随机分成3组，每组6头。攻毒前用PCR和ELISA试剂盒检测血清中的PPV、PRRSV、PRV、PCV2的病原及抗体水平，结果均成阴性。同时扩增PCV2和PCV2KmA，分别检测两种病毒的TCID₅₀。用滴鼻和肌肉注射的方法分别感染5×10⁵TCID₅₀PCV2和5×10⁵TCID₅₀PCV2KmA，以给PBS做对照。攻毒后每天测体温、体重，攻毒后7、14、21、28d分别采集外周血。攻毒后14d、28d剖检分别采集心脏(Heart)、肝脏(Liver)、脾脏(Spleen)、肺脏(Lung)、肾脏(Kidney)、大脑(Brain)、胃(Stomach)、淋巴结(Lymph nodes)，一部分固定于10％福尔马林溶液里，一部分冻存于-80℃。利用定量PCR检测外周血和组织中PCV2和PCV2KmA的拷贝数，HE常规染色检测组织的病理变化。结果显示，外周血(serum)和组织中PCV2KmA的拷贝数明显高于野生型PCV2，如图11(A、B)。PCV2KmA感染的组织病理变化比野生型PCV2感染引起的病理变化明显严重。病理变化主要表现在：肺脏的间质性肺炎(II型肺泡上皮细胞增多，炎性细胞浸润，肺泡壁增厚)，淋巴细胞减少(皮质区和副皮质区淋巴细胞变性、坏死，生发中心减少或缺失)，如图11(C)。PCV2KmA能够通过感染性克隆获得高毒价的PCV2。

本发明获得的高毒价PCV2(PCV2KmA)，具有如下特征：

(a)三个位点164K,179K,191K同时突变。

(b)通过感染性克隆获得的病毒具有感染性，并能在PK-15细胞中扩增。

(c)突变的PCV2(PCV2KmA)毒价可以达到10^7.3copies/mL。

(d)不能被pMKRN1介导的泛素化蛋白酶体途径降解。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒及其制备方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1767

<212> DNA

<213> porcine circovirus type 2

<400> 1

accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60

agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120

cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180

ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240

ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt tggtgcccgc tgccatatcg 300

agaaagcgaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360

ttatcgaatg tggagctcct agatgtcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420

gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480

tcagaaattt ccgcgggctg gctgaactct tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540

attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600

ctgctaattt tgcagatccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaat aagtggtggg 660

atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720

atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agaaactaaa ggtggaactg 780

tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840

cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900

ggaagaatgc tacagaacag tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960

catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020

ttttattatt cattagggtt taagtggggg gtctttcaga ttaaattctc tgaattgtac 1080

atacatggtt acacggatat tgtagtcctg gtcgtattta ctgttttcga acgcagtgcc 1140

gaggcctacg tggtctacat tggcactggt ttgaattctc atccacagct gatttctggc 1200

gttatttggt tggaagtaat caatggtgga atcaaggaca ggggcggggg taaagtaccg 1260

ggtgtggtag gagaagggct ggggtatggt atggcgggag gagtagttta cgtaggggtc 1320

ataggttagg gctgtggact tagggaaaaa gttatcatct agaataacag cactggatcc 1380

aactcccctg tcaccctggg tgattgggga gcagggccag aattcaacct taacctttct 1440

tattctgtag tattcaaagg gtatagagat tttgttggtc ccccctcccg ggggaagaaa 1500

gtcgtcaata ttaaatctga gcacgtccac cgcccaggag ggcgttgtga ctgtggtagc 1560

cttgacagta tatccgaagg tgcgggagag gcggctgttg aaaatgccat ttttccttct 1620

ccagcggtaa cggtggcggg ggtggatgag ccagggggcg gcggcgagga tctggccaag 1680

atggctgcgg gggcggtgtc ttcttctccg gtaacgcctc cttggatacg tcatagctga 1740

aaacgaaaga agtgcgctgt aagtatt 1767

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> pMKRN1上游引物P1()

<400> 2

ccgctcgaga tggattacaa ggatgacgac gataagcatg gggtttgtaa ggaag 55

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> pMKRN1下游引物P2()

<400> 3

gctctagact atagatccaa gtcataaaag tct 33

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> Cap上游引物P3()

<400> 4

ccgctcgaga tggattacaa ggatgacgac gataagacgt atccaaggag gcgtta 56

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Cap下游引物P4()

<400> 5

cccaagctta gggttaagtg gggggtc 27

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Overlap-F1

<400> 6

gaaccgcggg ctggctgaac t 21

<210> 7

<211> 57

<212> DNA

<213> Overlap-R1

<400> 7

cttccaacca aataacgcca gaaatcagct gtggatgaga attcaaacca gtgccaa 57

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> Overlap-F2

<400> 8

atttctggcg ttatttggtt ggaagtaatc aatggtggaa tcaaggacag gggcggg 57

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Overlap-R2

<400> 9

gcaccgcgga aatttctgac aaacgttaca 30

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> V-F

<400> 10

gaaccgcggg ctggctgaac t 21

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> V-R

<400> 11

gcaccgcgga aatttctgac aaacgttaca 30

Claims

1.一种突变的PCV2病毒，其特征在于：该突变的PCV2病毒的衣壳蛋白在宿主体内的泛素化蛋白酶体途径的降解中保持完整性；

所述泛素化蛋白酶体途径的降解或泛素化由猪MKRN1蛋白介导；

所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒的衣壳蛋白上与泛素分子结合的氨基酸位点的编码序列处；

所述氨基酸位点选自野生型PCV2病毒的衣壳蛋白自氨基端起第164、179及191位赖氨酸中的三个；

所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.一种突变的PCV2病毒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

通过免疫共沉淀试验确定猪MKRN1蛋白与野生型PCV2病毒衣壳蛋白的相互作用区域，在该区域内确定与泛素分子结合的降解位点，然后根据降解位点，通过重叠PCR，以野生型PCV2病毒的DNA为模板，扩增得到降解位点突变的PCV2病毒序列，将该序列环化后转染细胞，培养一定时间后收集病毒，所述位点选自野生型PCV2病毒的衣壳蛋白自氨基端起第164、179及191位赖氨酸中的三个，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

3.根据权利要求2所述一种突变的PCV2病毒的制备方法，其特征在于：所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型。

4.根据权利要求2所述一种突变的PCV2病毒的制备方法，其特征在于：所述重叠PCR采用的扩增引物为：

病毒DNA片段1引物：

Overlap-F1：5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT -3'；

Overlap-R1：5'-CTTCCAACCAAATAACGCCAGAAATCAGCTGTGGATGAGAATTCAAACCAGTGCCAA -3'；

病毒DNA片段2引物：

Overlap-F2：5'-ATTTCTGGCGTTATTTGGTTGGAAGTAATCAATGGTGGAATCAAGGACAGGGGCGGG -3'；

Overlap-R2：5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA -3'；

病毒DNA全长引物：

Overlap-F1：5'-GAACCGCGGGCTGGCTGAACT -3'；

Overlap-R2：5'-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA -3'。

5.一种如权利要求1所述的突变的PCV2病毒在制备PCV2病毒感染动物细胞模型中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述动物细胞模型为感染突变的PCV2病毒的PK-15细胞。