CN112574963B - 一种npm1结合区域突变的pcv2病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NPM1结合区域突变的PCV2病毒及其制备方法和应用。将野生型PCV2毒株衣壳蛋白的两个位点147R及148H突变，使得突变PCV2通过感染性克隆进行病毒拯救，获得复制能力低于野生型PCV2的突变毒株。本发明的突变的PCV2病毒可以用于研究PCV2复制机制和减毒活疫苗，从而为PCV2的防控提供新思路。

Description

一种NPM1结合区域突变的PCV2病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及NPM1参与的猪圆环病毒2型(PCV2)DNA复制，具体涉及构建衣壳蛋白(Cap)与宿主细胞NPM1蛋白作用相关的氨基酸位点发生突变的PCV2毒株。
背景技术
PCV2是猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)的主要病原体，PCVAD包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemic wasting syndrome,PMWS)、猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis andnephropathy syndrome,PDNS)及猪呼吸与繁殖综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRDC)等多种疾病，给养猪业带来巨大的经济损失。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但PCV2的复制机制尚未完全清楚。
对宿主细胞蛋白在PCV2复制中的作用的研究表明，NPM1蛋白(一级结构由294个氨基酸构成)作为一种宿主细胞中常见的核质穿梭蛋白，除在细胞的生理进程中发挥重要作用，其在病毒感染过程中也发挥重要作用。但对于PCV2而言，目前仅发现在PK-15细胞中PCV2衣壳蛋白(Cap)与porcine NPM1蛋白(pNPM1)存在相互作用。pNPM1与Cap结合后对于PCV2的复制带来怎样的影响并未得到研究。PCV2的衣壳是由60个Cap按照一定的空间结构组成的，Cap包含234位氨基酸。中国专利CN108148816A公开了不受泛素化蛋白酶体降解的突变PCV2病毒，其通过对病毒的Cap进行突变提高了相应毒株的复制能力。目前尚难以通过基因工程手段有效获得复制能力明显减弱的PCV2突变毒株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种NPM1结合区域突变的PCV2病毒及其制备方法和应用。该突变的PCV2病毒的复制能力低于野生型PCV2毒株。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种突变的PCV2病毒，该突变的PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒的衣壳蛋白(Cap)中用于结合宿主细胞NPM1蛋白的区域(相互作用区域)内的一个或多个氨基酸位点处。
优选的，所述突变位点包括所述区域内的一个或多个碱性氨基酸位点。
优选的，所述突变位点包括所述区域内的一个或多个保守氨基酸位点。
优选的，所述突变位点选自所述区域内的一个以上的精氨酸位点和/或一个以上的组氨酸位点。
优选的，所述突变位点选自野生型PCV2病毒2b亚型(例如，DNA序列为GenBankNo.MH492006.1的毒株)的衣壳蛋白中自氨基端起第147位的精氨酸以及第148位的组氨酸。
优选的，突变后的氨基酸位点选自中性氨基酸中的任意一种(例如，丙氨酸)。
优选的，所述突变的PCV2病毒的DNA(基因组DNA)序列如SED.ID.NO.2所示。
上述突变的PCV2病毒的制备方法，包括以下步骤：
所述突变的PCV2病毒是将野生型PCV2病毒的衣壳蛋白(Cap)中用于结合宿主细胞NPM1蛋白的区域(相互作用区域)内的一个或多个氨基酸残基突变后得到的。
优选的，所述突变的PCV2病毒的制备方法，具体包括以下步骤：以保存的野生型PCV2病毒的克隆载体为模板，通过PCR扩增得到含有上述突变的PCV2病毒的DNA的环状PCR产物，将环状PCR产物经限制性内切酶Dpn I处理后进行转染及扩增，得到突变型PCV2病毒的克隆载体，从突变型PCV2病毒的克隆载体中分离(例如，通过酶切)上述突变的PCV2病毒的DNA并连接成环状DNA，将环状DNA转染宿主细胞，然后进行培养和传代，得到突变的PCV2病毒。
优选的，所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型(例如，DNA序列为GenBankNo.MH492006.1的毒株)。
优选的，所述PCR扩增的引物为：
P-F1：5’-GTGGTAGGAGAAGGGCTGGGGTATGGTATCGTCGGAGG-3’
P-R1：5’-GACCCCTACGTAAACTACTCCTCCGACGATACCATA-3’
上述突变的PCV2病毒在制备PCV2病毒感染动物模型中的应用。
优选的，所述动物模型为感染突变的PCV2病毒的PK-15细胞。
优选的，通过突变所述的147位精氨酸及148位组氨酸为丙氨酸，使得突变的PCV2病毒的DNA复制水平显著低于野生型PCV2病毒。
本发明的有益效果体现在：
本发明基于实验发现的野生型猪圆环病毒2型(PCV2)毒株Cap与pNPM1(PorcineNPM1蛋白)的相互作用区域，通过制备Cap中相应区域(包含两个保守的碱性氨基酸位点，即147R及148H)内位点发生突变的PCV2病毒，从而获得具有感染性且复制能力降低的突变PCV2毒株。本发明通过感染性克隆获得的突变病毒可以更好的研究PCV2的复制机制，对后续PCV2防控药物的研发具有重要意义。
附图说明
图1为npm1基因克隆及真核表达载体的鉴定结果；其中：A为npm1基因的PCR产物鉴定，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道1为npm1基因的PCR产物；B为pCI-Flag-NPM1酶切鉴定，泳道M为DL2000 plus DNA Markerr，泳道2为Xho I及Not I双酶切鉴定。
图2为干扰npm1基因表达对PCV2复制的影响的结果；其中：A为siRNA干扰后NPM1蛋白及Cap表达结果，β-actin为内参蛋白；B为NPM1蛋白表达量化分析结果，相对于转染NC的PK-15中NPM1蛋白表达水平*p<0.05、**p<0.01；C为Cap表达量化分析结果，相对于转染NC的PK-15中Cap表达水平*p<0.05；D为干扰npm1基因表达对PCV2 DNA拷贝数影响，相对于转染NC的PK-15中PCV2 DNA拷贝数*p<0.05；Mock代表未转染siRNA及未感染PCV2的细胞；Ctrl代表未转染PCV2感染的细胞。
图3为NPM1蛋白截短体的原核表达载体构建结果；其中：A为NPM1蛋白及其截短体基因序列PCR产物鉴定，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道1为npm1 PCR产物，泳道2为npm1(1-117)PCR产物，泳道3为npm1(1-188)PCR产物，泳道4为npm1(1-258)PCR产物，泳道5为npm1(117-294)PCR产物，泳道6为npm1(231-294)PCR产物，泳道7为npm1(251-294)PCR产物；B为基于A中扩增片段构建的重组载体的酶切鉴定，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道1-7为EcoR I和Sal I双酶切鉴定。
图4为NPM1蛋白及其截短体蛋白表达结果；其中：A为原核表达结果，泳道M为蛋白Marker，泳道1为GST蛋白，泳道2为GST-NPM1(1-117)融合蛋白，泳道3为GST-NPM1(1-258)融合蛋白，泳道4为GST-NPM1融合蛋白，泳道5为GST-NPM1(231-294)融合蛋白，泳道6为GST-NPM1(117-294)融合蛋白；B为原核表达结果，泳道M为蛋白Marker，泳道1为GST蛋白，泳道2为GST-NPM1(1-188)融合蛋白，泳道3为GST-NPM1(251-294)融合蛋白。
图5为Cap截短体真核表达载体构建结果；其中：A为Cap截短体基因序列PCR产物，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道0为Cap全长PCR产物，泳道1为Cap(41-234)PCR产物，泳道2为Cap(136-234)PCR产物，泳道3为Cap(61-234)PCR产物，泳道4为Cap(1-153)PCR产物，泳道5为Cap(1-63)PCR产物，泳道6为Cap(1-51)PCR产物；B为重组载体的酶切鉴定，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道1为pEGFP-Cap(41-234)酶切鉴定，泳道2为pEGFP-Cap(136-234)酶切鉴定，泳道3为pEGFP-Cap(61-234)酶切鉴定，泳道4为pEGFP-Cap(1-153)酶切鉴定，泳道5为pEGFP-Cap(1-51)酶切鉴定，泳道6为pEGFP-Cap(1-63)酶切鉴定。
图6为GST-pull down确定NPM1蛋白与Cap互作区域结果；其中：A为GST-pull down鉴定Cap截短体与NPM1蛋白互作区域；B为GST-pull down鉴定NPM1蛋白截短体与Cap互作区域。
图7为PCV2 Cap突变示意图(第147位精氨酸、148位组氨酸均突变为丙氨酸)。
图8为突变PCV2的构建与酶切鉴定结果；其中：A为高保真酶PCR结果，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道1为PCR产物；B为菌落PCR鉴定结果，泳道M为DL2000 plusDNA Marker，泳道1为PCR产物；C为酶切鉴定结果，泳道M为2k PLUS IIDNA Marker，泳道1为Sac II酶切产物。
图9为突变毒株PCV2-NmA复制水平测定结果；其中：A为荧光原位杂交检测PCV2DNA的复制，bar＝100μm；B为CP探针检测阳性细胞数量统计，相对于相同时间PCV2-WT感染组中CP探针检测阳性细胞数量*p<0.05；C为RFP探针检测阳性细胞数量统计，相对于相同时间PCV2-WT感染组中RFP探针检测阳性细胞数量*p<0.05；D为荧光定量PCR检测病毒DNA拷贝数，相对于相同时间PCV2-WT感染组中PCV2 DNA拷贝数*p<0.05。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
本发明首先通过分子克隆获得porcine NPM1蛋白(pNPM1)，通过免疫共沉淀试验确定pNPM1与野生型PCV2病毒衣壳蛋白(Cap)存在相互作用，进一步通过GST-pull down鉴定发现pNPM1与Cap是直接互作。通过序列比对分析PCV2 Cap与pNPM1结合的关键区域，根据预测的Cap与pNPM1的结合位点设计定点突变引物，以野生型PCV2 DNA为模板，PCR扩增得到NPM1蛋白结合位点突变的PCV2病毒DNA，将该DNA序列环化后转染PK-15细胞，培养一定时间后收集病毒上清，即可得到复制能力减弱的突变PCV2毒株。
(一)猪npm1基因克隆载体的构建
根据NCBI上公布的人npm1基因(GenBank：KU178237.1)，设计扩增猪npm1基因编码区全长的引物：
上游引物F1：5’-CGGAATTCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGAGGCATGGAAGATTCGATGGACATGG-3’(斜体部分表示EcoR I酶切位点，下划线部分表示Flag标签编码序列)
下游引物R1：5’-GCGTCGACTTAAAGAGACTTCCTCCA-3’(下划线部分表示SalI酶切位点)
利用TRIZOL沉淀法提取PK-15细胞(ATCC)的总RNA，再将上述RNA反转录为cDNA：反转录体系(表1)置于PCR仪中65℃5min，再冰浴2min，并根据表2依次加入试剂后置于PCR仪中25℃10min，再37℃50min，再70℃15min，最终得到cDNA。以该cDNA为模板，并利用引物F1和R1 PCR扩增猪npm1基因序列，将PCR产物(图1A)以及pCI-neo(promega#E1841)分别用限制性内切酶EcoR I及Sal I进行双酶切，酶切产物电泳后胶回收目的基因和载体骨架并进行连接(16℃连接过夜)，连接产物转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态中，37℃培养2h后吸取少量液体涂于具有氨苄抗性的LB固体培养基表面，37℃培养16h，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，再将阳性菌在具有氨苄抗性的LB液体培养基中扩大培养后提质粒进行酶切鉴定，结果如图1B所示，阳性质粒送生物公司测序，将测序正确的质粒进行命名，得到npm1基因克隆载体pCI-Flag-NPM1。
表1.反转录反应体系I
Figure BDA0002875956950000051
表2.反转录反应体系II
Figure BDA0002875956950000052
Figure BDA0002875956950000061
(二)干扰npm1基因表达对Cap表达和PCV2 DNA复制影响
为检测npm1基因在PCV2复制过程中的作用，设计3组针对npm1基因的siRNA：
siRNA#1：5’-GGAUGAGUUGCACAUUGUUTT-3’
siRNA#2：5’-CCGACAAAGAUUAUCACUUTT-3’
siRNA#3：5’-GGAAGCCAAAUUCAUCAAUTT-3’
使用Lipo6000转染试剂将阴性对照siRNA(NC)、siRNA#1、siRNA#2及siRNA#3分别转染到PK-15细胞中。将上述细胞在37℃培养6h后用PCV2(毒株DNA参见GenBank:MH492006.1)感染。在感染后24h收集细胞，分别用western blotting及荧光定量PCR进行检测，其中定量引物为：
NPM1-F：5’-GAAAAAGCTCCAGTAAAG-3’
NPM1-R：5’-TTAAAGAGACTTCCTCCA-3’
结果显示，与阴性对照siRNA比，siRNA#1的干扰效率最高(p<0.01；图2A、图2B)，Cap蛋白水平最低(p<0.05；图2A、图2C)，PCV2 DNA拷贝数显著下降(p<0.05；图2D)。而siRNA#2、siRNA#3转染的细胞与阴性对照siRNA转染的细胞相比，siRNA#2发挥了干扰作用(p<0.05)，Cap蛋白水平和PCV2 DNA拷贝数均无显著变化；siRNA#3没有发挥干扰作用。结果提示，干扰npm1基因表达能够显著抑制PCV2的复制。
(三)NPM1蛋白及其截短体原核表达载体的构建
参照pGEX-4T-1质粒(优宝生物#VT1253)序列选取酶切位点，设计针对NPM1蛋白编码序列全长及NPM1蛋白截短体编码序列的上、下游引物(具体引物序列见表3)。以pCI-Flag-NPM1质粒为模板，并利用中表3中的引物PCR扩增相应的目的片段，PCR产物(图3A)用限制性内切酶EcoR I及Sal I进行双酶切，同时双酶切pGEX-4T-1质粒。将酶切产物电泳并胶回收目的片段和载体骨架后进行连接、转化、挑取单克隆、菌落PCR鉴定。再将阳性菌扩大培养后提质粒进行酶切鉴定，结果如图3B所示，酶切产物经PCR分别扩增出大小为882bp、351bp、564bp、774bp、534bp、192bp、129bp的目的条带，符合预期大小，阳性质粒送生物公司测序，将测序正确的质粒分别命名，得到pGEX-4T-NPM1(1-294)、pGEX-4T-NPM1(1-117)、pGEX-4T-NPM1(1-188)、pGEX-4T-NPM1(1-258)、pGEX-4T-NPM1(117-294)、pGEX-4T-NPM1(231-294)及pGEX-4T-NPM1(251-294)。
将上述pGEX-4T-1质粒、利用pGEX-4T-1质粒构建的NPM1蛋白及其截短体的原核表达载体分别转化入大肠杆菌原核表达感受态BL21中，涂氨苄抗性的LB固体培养基，挑取单克隆后在含有Amp的100mL LB液体培养基中扩大培养。再加入1mL 100mM IPTG诱导剂，16℃诱导表达4h，收集菌液，离心，弃上清，加入细菌破碎裂解液重悬后进行超声破碎。将超声破碎后得到的裂解液于4℃、12000rpm离心25min，取上清。将上述上清分别与已预清洗的GST琼脂糖珠于4℃摇床孵育3h。5000g离心弃上清，加入清洗液清洗珠子3次，然后加入洗脱液洗脱蛋白，再向所得蛋白中加入适量的蛋白上样缓冲液，沸水中煮样10min，SDS-PAGE电泳。考马斯亮蓝染色结果显示，分别获得大小约为27kDa(pGEX-4T-1质粒表达的GST蛋白)、39kDa、55kDa、65kDa、33kDa、46kDa的蛋白条带(图4A箭头所指)以及大小约为27kDa(pGEX-4T-1质粒表达的GST蛋白)、44kDa、31kDa(图4B箭头所指)。通过比对发现，所得蛋白大小符合预期。
表3.NPM1蛋白及其截短体编码序列扩增引物
Figure BDA0002875956950000071
Figure BDA0002875956950000081
注：下划线为限制性内切酶位点。
(四)Cap截短体真核表达载体的构建
设计Cap截短体编码序列的上、下游引物(表4)，并以实验室保存的Cap(含全部1-234位氨基酸，GenBank：AXF92415.1)真核表达载体(融合表达荧光蛋白EGFP)pEGFP-Cap(Wang T,Du Q,Wu X,Niu Y,Guan L,Wang Z,Zhao X,Liu SL,Tong D,HuangY.2018.Porcine MKRN1 modulates the replication and pathogenesis of PCV2 byinducing capsid protein ubiquitination and degradation.J Virol.92(11):100-118)为模板分别进行PCR，PCR产物(图5A)再用限制性内切酶Xho I和Hind III进行双酶切，同时双酶切pEGFP-N1质粒(clontech#6085-1)。将酶切产物电泳并胶回收目的片段和载体骨架后进行连接、转化、挑取单克隆(涂卡那霉素抗性LB固体培养基)、菌落PCR鉴定。再将阳性菌扩大培养后提质粒进行酶切鉴定，结果如图5B所示，酶切产物经PCR分别扩增出大小为582bp、297bp、522bp、459bp、189bp及153bp的目的条带，符合预期大小，阳性质粒送生物公司测序，将测序正确的质粒分别命名，得到pEGFP-Cap(41-234)、pEGFP-Cap(136-234)、pEGFP-Cap(61-234)、pEGFP-Cap(1-153)、pEGFP-Cap(1-63)及pEGFP-Cap(1-51)。
表4.Cap截短体编码序列扩增引物
Figure BDA0002875956950000082
Figure BDA0002875956950000091
注：下划线为限制性内切酶位点。
pEGFP-Cap(1-107)、pEGFP-Cap(1-83)载体为实验室保存(Wang T,Du Q,Wu X,NiuY,Guan L,Wang Z,Zhao X,Liu SL,Tong D,Huang Y.2018.Porcine MKRN1 modulates thereplication and pathogenesis of PCV2 by inducing capsid proteinubiquitination and degradation.J Virol.92(11):100-118)。
(六)GST pull-down检测Cap与NPM1蛋白的互作
用Lipo6000转染试剂(上海碧云天生物技术有限公司#C0526)将pEGFP-Cap及Cap截短体表达载体分别转染于HEK293T细胞，转染后于37℃恒温细胞培养箱进行培养，培养48h收集细胞。将收集的细胞用裂解缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl[pH 7.4]、1％Nonidet P-40、0.5％TritonX-100、1mM EDTA、0.1％脱氧胆酸钠、1mM二硫苏糖醇及0.2mM苯基甲基磺酰氟)、PMSF和蛋白酶抑制剂混合物在冰上放置40min进行裂解。随后4℃、12000g离心15min取上清，将上清与纯化的GST蛋白在4℃下孵育3h，然后添加已用1×PBS预洗涤的谷胱甘肽琼脂糖珠并于4℃孵育1h，然后1500g离心3min得到上清液，备用。
将NPM1蛋白及其截短体的原核表达融合蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠(1×PBS预清洗3次)4℃过夜孵育。再用缓冲液A(20mM Tris-HCl[pH 8.0]、150mM NaCl、1mM MgCl2、0.1％Nonidet P-40、10％甘油、0.1mM二硫苏糖醇及蛋白酶抑制剂)洗3次，再加入Cap及截短体蛋白裂解上清共同在4℃下孵育3h，然后用缓冲液A洗涤3次。
最后，加入适量的蛋白上样缓冲液，煮沸10min。通过western blotting检测目的蛋白。结果显示(图6A)，Cap(含完整234位氨基酸)以及由Cap的41-234、61-234、136-234和1-153位氨基酸构成的截短体能与NPM1蛋白结合，而由Cap的1-51、1-63、1-83和1-107位氨基酸构成的截短体无法与NPM1蛋白结合。结果表明，Cap与NPM1蛋白的互作需要Cap的136-153位氨基酸。同时结果显示(图6B)，NPM1蛋白(含完整294位氨基酸)以及由NPM1蛋白的1-258、117-294、231-294和251-294位氨基酸构成的截短体能与Cap结合，而NPM1蛋白的其他截短体不能与Cap发生互作，结果表明，NPM1蛋白的251-258位氨基酸对于Cap与NPM1蛋白的互作同样重要。
(七)PCV2突变设计
在通过GST-pull down确定了Cap与NPM1蛋白的互作区域后，进一步分析Cap的136-153位氨基酸发现，其147位是精氨酸(Arg)，148位是组氨酸(His)。通过比对分析目前发现的PCV2毒株2a亚型和2b亚型，发现PCV2 Cap 147位精氨酸和148位组氨酸高度保守；同时，这两种氨基酸均属于碱性氨基酸，而NPM1蛋白属于由酸性氨基酸构成的蛋白质。据此推测Cap的147位精氨酸和148位组氨酸为NPM1蛋白结合位点，因此将Cap的147及148位氨基酸均突变为中性氨基酸，例如丙氨酸(Ala)，如图7所示。
(八)PCV2突变毒株感染性克隆的构建与鉴定
根据野生型PCV2毒株(PCV2-WT)DNA(参考序列GenBank No.MH492006.1；SEQ.ID.NO.1)，将该PCV2毒株Cap的147位及148位氨基酸对应的PCV2 DNA的1292-1297nt序列(ATGGCG)突变为ATCGTC，依据突变后PCV2 DNA序列(SEQ.ID.NO.2)设计环P引物：
P-F1：5’-GTGGTAGGAGAAGGGCTGGGGTATGGTATCGTCGGAGG-3’
P-R1：5’-GACCCCTACGTAAACTACTCCTCCGACGATACCATA-3’
以实验室保存的pGEM-T-PCV2重组质粒(杜谦.2016.猪圆环病毒2型对猪肺泡巨噬细胞IL-10/IL-12p40表达的影响及调控机制：西北农林科技大学，含有的PCV2 DNA序列即为GenBank No.MH492006.1)为模板，利用高保真酶进行PCR(反应体系参见表5)，可以得到大小为4794bp的目的条带(图8A)，将上述目的条带胶回收后用限制性内切酶Dpn I于37℃处理1h(消除重组质粒的甲基化)，再将产物转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态中，再将少量菌液涂于含有氨苄抗性的LB固体培养基上，37℃培养14h。挑取单克隆进行菌落PCR(图8B)，鉴定引物为：
F：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTC-3’
R：5’-AAATTTCTGACAAACGTTACA-3’
再将阳性菌加入具有氨苄抗性的LB液体培养基中扩大培养，提取质粒，利用限制性内切酶Sac II酶切鉴定(图8C)。
结果显示，菌落PCR及酶切鉴定均能获得大小为1768bp的突变病毒DNA条带，符合预期大小。将阳性质粒送生物公司测序，将测序正确的质粒命名为pGEM-T-PCV2NmA。
将pGEM-T-PCV2NmA质粒用Sac II于37℃处理30min(反应体系参见表6)，将酶切产物中1768bp的条带进行胶回收，再用T4连接酶将胶回收产物37℃处理1h连接成环(反应体系参见表7)，再将该环状DNA进行胶回收，胶回收产物用Lipo6000转染至PK-15细胞，盲传5代后获得病毒上清，即得到PCV2突变毒株，并命名为PCV2-NmA。
表5.PCR反应体系
Figure BDA0002875956950000111
表6.酶切反应体系
Figure BDA0002875956950000112
表7.连接反应体系
Figure BDA0002875956950000113
(九)荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况
针对PCV2 DNA模板链和复制链设计两种探针。其中，CY3标记的探针靶向病毒基因组DNA复制链(负链)，命名为RFP探针，用于检测PCV2的复制，探针序列为：
5’-CY3-TTTGATTATTTTTGTGGCGAGGAGGTAGGTAGGAGGATAGAGGAGGAGGAG-3’
FAM标记的探针靶向病毒基因组模板链(正链)，命名为CP探针，序列为：
5’-FAM-CCTTCCTTCCTCTCCCTCGCCAATAAAATAATCAAA-3’
按照5×104细胞/孔的密度将PK-15细胞均匀铺于48孔板(孔内已预先放置细胞爬片)中，37℃恒温CO2培养箱中培养12h，再分别用5MOI的野生型PCV2毒株(PCV2-WT)及突变型PCV2毒株(PCV2-NmA)感染上述细胞12h及24h。吸弃孔中培养基，PBS洗3次，每次3min。弃尽孔中PBS后，每孔加入200μL无水乙醇，室温固定30min。吸弃无水乙醇，每孔加入200μL0.1％tritonX-100，室温放置20min，PBS洗3次，每次3min。吸弃PBS，每孔加入200μL 2×SSC，37℃培养箱放置30min。吸弃液体，每孔加入200μL 70％乙醇，室温放置3min。吸弃液体，每孔加入200μL 85％，室温放置3min。吸弃液体，每孔加入200μL 90％乙醇，室温放置3min。吸弃液体，每孔加入200μL无水乙醇，室温放置3min，吸弃无水乙醇，室温干燥。
用DEPC水分别稀释两种探针，使浓度为1μg/μL，于冰上避光备用。避光下配制杂交缓冲液(100μL)：缓冲液A(上海吉玛FISH试剂盒)70μL、1μg/μL RFP或CP探针2μL，及DEPC水28μL。
在上述已经完成干燥的孔中每孔加入100μL杂交缓冲液，78℃变性8min，37℃培养箱孵育18h。吸弃液体，每孔依次加入200μL 65℃预热的0.4×SSC(0.3％Tween20)，37℃2min。吸弃液体，每孔加入200μL 2×SSC(0.1％Tween20)，37℃作用2min，吸弃液体，室温干燥。每孔加入200μL DAPI，37℃10min，吸弃液体再加入200μL PBS清洗3次。挑出细胞爬片，用防荧光猝灭剂滴封片，再通过激光共聚焦进行检测并进行统计。荧光点的数量统计结果显示，在PCV2-WT及PCV2-NmA感染细胞中均能检测到红色荧光点(靶向PCV2模板链)及绿色荧光(靶向PCV2复制链)，然而与相同感染时间的PCV2-WT感染组相比，PCV2-NmA感染组中绿色及红色荧光数量减少(图9A)。在感染24h后，PCV2-NmA感染组中CP阳性细胞的数目显著低于PCV2-WT感染组(p<0.05)，RFP阳性细胞的数目也显著低于PCV2-WT感染组(p<0.05；图9B、图9C)。结果提示，PCV2的Cap中与NPM1作用的位点突变后，可以显著降低PCV2 DNA复制能力。
(十)荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数
首先测定实验室保存的pGEM-T-PCV2重组质粒浓度，取一定量的质粒进行10倍倍比稀释，取不同浓度梯度等量的质粒为模板并做3组重复，待荧光定量PCR后获得PCV2病毒拷贝数标准曲线。
提取野生型及突变型PCV2毒株DNA，以提取的DNA为模板做3组重复，荧光定量检测PCV2 DNA拷贝数，定量引物如下：
PCV2-F：5’-TTGAATGTGGAGCTCCTAGAT-3’
PCV2-R：5’-GCAAGGTACTCACAGCAGTAGACA-3’
于避光条件下，在超净工作台中向各管中加样，混匀后瞬时离心至管底，于荧光定量PCR仪中进行PCR。反应条件：95℃，10min预变性；95℃，15s，再65℃，20s，共80个循环。经过实时荧光定量PCR后得到其CT值，通过标准曲线计算得到病毒的拷贝数。结果显示，感染后12h及24h，PCV2-NmA感染组中病毒DNA的拷贝数显著低于PCV2-WT感染组(p<0.05；图9D)。结果表明，突变毒株PCV2-NmA的复制能力低于野生型PCV2。
本发明获得的PCV2突变毒株(例如，PCV2-NmA)，具有如下特点：
(a)PCV2 Cap的147位精氨酸及148位组氨酸突变。
(b)通过感染性克隆(病毒拯救)获得的突变毒株具有感染性，并能在PK-15细胞中复制。
(c)突变型PCV2毒株的DNA复制能力远低于野生型毒株(GenBank No.
MH492006.1)。
以上特点为进一步研究PCV2的复制和减毒活疫苗奠定基础，从而为PCV2的防控提供了新思路。
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种NPM1结合区域突变的PCV2病毒及其制备方法和应用
<160> 43
<210> 1
<211> 1768
<212> DNA
<213> PCV2-WT
<400> 1
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60
agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120
cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240
ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt tggtgcccgc tgccatatcg 300
agaaagcgaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360
ttatcgaatg tggagctcct agatgtcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420
gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480
tcagaaattt ccgcgggctg gctgaactct tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540
attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600
ctgctaattt tgcagatccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaat aagtggtggg 660
atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720
atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agaaactaaa ggtggaactg 780
tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840
cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900
ggaagaatgc tacagaacag tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960
catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020
ttttattatt catttagggt ttaagtgggg ggtctttcag attaaattct ctgaattgta 1080
catacatggt tacacggata ttgtagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140
cgaggcctac gtggtctaca tttttactgg tttgaattct catccacagc tgatttcttt 1200
tgttatttgg ttggaagtaa tcaatggtgg aatcaaggac aggtttgggg gtaaagtacc 1260
gggtgtggta ggagaagggc tggggtatgg tatggcggga ggagtagttt acgtaggggt 1320
cataggttag ggctgtggac ttagggaaaa agttatcatc tagaataaca gcactggatc 1380
caactcccct gtcaccctgg gtgattgggg agcagggcca gaattcaacc ttaacctttc 1440
ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaagaa 1500
agtcgtcaat attaaatctg agcacgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtag 1560
ccttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcggctgtt gaaaatgcca tttttccttc 1620
tccagcggta acggtggcgg gggtggatga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680
gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctcc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740
aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768
<210> 2
<211> 1768
<212> DNA
<213> PCV2-NmA
<400> 2
accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60
agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120
cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180
ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240
ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt tggtgcccgc tgccatatcg 300
agaaagcgaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360
ttatcgaatg tggagctcct agatgtcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420
gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480
tcagaaattt ccgcgggctg gctgaactct tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540
attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600
ctgctaattt tgcagatccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaat aagtggtggg 660
atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720
atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agaaactaaa ggtggaactg 780
tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840
cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900
ggaagaatgc tacagaacag tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960
catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020
ttttattatt catttagggt ttaagtgggg ggtctttcag attaaattct ctgaattgta 1080
catacatggt tacacggata ttgtagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140
cgaggcctac gtggtctaca tttttactgg tttgaattct catccacagc tgatttcttt 1200
tgttatttgg ttggaagtaa tcaatggtgg aatcaaggac aggtttgggg gtaaagtacc 1260
gggtgtggta ggagaagggc tggggtatgg tatcgtcgga ggagtagttt acgtaggggt 1320
cataggttag ggctgtggac ttagggaaaa agttatcatc tagaataaca gcactggatc 1380
caactcccct gtcaccctgg gtgattgggg agcagggcca gaattcaacc ttaacctttc 1440
ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaagaa 1500
agtcgtcaat attaaatctg agcacgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtag 1560
ccttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcggctgtt gaaaatgcca tttttccttc 1620
tccagcggta acggtggcgg gggtggatga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680
gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctcc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740
aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768
<210> 3
<211> 63
<212> DNA
<213> F1
<400> 3
cggaattcat ggattacaag gatgacgacg ataagggagg catggaagat tcgatggaca 60
tgg 63
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> R1
<400> 4
gcgtcgactt aaagagactt cctcca 26
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> siRNA#1
<220>
<221> misc_feature
<222> （20）…（21）
<400> 5
ggaugaguug cacauuguut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> siRNA#2
<220>
<221> misc_feature
<222> （20）…（21）
<400> 6
ccgacaaaga uuaucacuut t 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> siRNA#3
<220>
<221> misc_feature
<222> （20）…（21）
<400> 7
ggaagccaaa uucaucaaut t 21
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> NPM1-F
<400> 8
gaaaaagctc cagtaaag 18
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> NPM1-R
<400> 9
ttaaagagac ttcctcca 18
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> NPM11-294-F
<400> 10
cggaattcat ggtagattac tatgaag 27
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> NPM11-294-R
<400> 11
gcgtcgacct aggggcggcc cttggtcga 29
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> NPM11-117-F
<400> 12
cggaattcat ggtagattac tatgaag 27
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> NPM11-117-R
<400> 13
gcgtcgacct attccctgga gacgtcatc 29
<210> 14
<211> 36
<212> DNA
<213> NPM11-188-F
<400> 14
cggaattcgc caccatggga ttgaacggtg gcagtg 36
<210> 15
<211> 33
<212> DNA
<213> NPM11-188-R
<400> 15
gcgtcgacct aaccaaacgc cgtggaagag aag 33
<210> 16
<211> 35
<212> DNA
<213> NPM11-258-F
<400> 16
cggaattcgc caccatgagg gaattttttg gtgga 35
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> NPM11-258-R
<400> 17
gcgtcgacct aggggcggcc cttggtcga 29
<210> 18
<211> 60
<212> DNA
<213> NPM1117-294-F
<400> 18
cggaattcat ggattacaag gatgacgacg ataagggagg catggtagat tactatgaag 60
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> NPM1117-294-R
<400> 19
gcgtcgacct attccctgga gacgtcatc 29
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> NPM1231-294-F
<400> 20
cggaattcat ggattacaag gatgacgacg ataa 34
<210> 21
<211> 33
<212> DNA
<213> NPM1231-294-R
<400> 21
gctctagact aaccaaacgc cgtggaagag aag 33
<210> 22
<211> 61
<212> DNA
<213> NPM1251-294-F
<400> 22
cggaattcat ggattacaag gatgacgacg ataagggagg catgagggaa ttttttgatg 60
g 61
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> NPM1251-294-R
<400> 23
gcgtcgacct aggggcggcc cttggtcga 29
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> Cap136-234-F
<400> 24
cgctcgagat gctaacctat gacccctacg taaactactc c 41
<210> 25
<211> 41
<212> DNA
<213> Cap136-234-R
<400> 25
gcaagcttag ggttaagtgg ggggtctttc agattaaatt c 41
<210> 26
<211> 41
<212> DNA
<213> Cap41-234-F
<400> 26
cgctcgagat gaatggcatt ttcaacagcc gcctctcccg c 41
<210> 27
<211> 41
<212> DNA
<213> Cap41-234-R
<400> 27
gcaagcttag ggttaagtgg ggggtctttc agattaaatt c 41
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> Cap61-234-F
<400> 28
cgctcgagat ggtcacaacg ccctcctggg cggtggacgt gc 42
<210> 29
<211> 29
<212> DNA
<213> Cap61-234-R
<400> 29
gcaagcttct aggggcggcc cttggtcga 29
<210> 30
<211> 43
<212> DNA
<213> Cap1-51-F
<400> 30
cgctcgagat gacgtatcca aggaggcgtt accggagaag aag 43
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> Cap1-51-R
<400> 31
gcaagcttgc gggagaggcg gctgttgaaa atgccatttt t 41
<210> 32
<211> 43
<212> DNA
<213> Cap1-63-F
<400> 32
cgctcgagat gacgtatcca aggaggcgtt accggagaag aag 43
<210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> Cap1-63-R
<400> 33
gcaagctttg tgactgtggt agccttgaca gtatatccga agg 43
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> Cap1-153-F
<400> 34
cgctcgagat gacgtatcca aggaggcgtt accggagaag aag 43
<210> 35
<211> 45
<212> DNA
<213> Cap1-153-R
<400> 35
gcaagcttgg gctggggtat ggtatggcgg gaggagtagt ttacg 45
<210> 36
<211> 38
<212> DNA
<213> P-F1
<400> 36
gtggtaggag aagggctggg gtatggtatc gtcggagg 38
<210> 37
<211> 36
<212> DNA
<213> P-R1
<400> 37
gacccctacg taaactactc ctccgacgat accata 36
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> F
<400> 38
gaaccgcggg ctggctgaac tc 22
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> R
<400> 39
aaatttctga caaacgttac a 21
<210> 40
<211> 51
<212> DNA
<213> RFP探针
<400> 40
tttgattatt tttgtggcga ggaggtaggt aggaggatag aggaggagga g 51
<210> 41
<211> 36
<212> DNA
<213> CP探针
<400> 41
ccttccttcc tctccctcgc caataaaata atcaaa 36
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> PCV2-F
<400> 42
ttgaatgtgg agctcctaga t 21
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> PCV2-R
<400> 43
gcaaggtact cacagcagta gaca 24

Claims (5)

1.一种突变的PCV2病毒，其特征在于：该突变的PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒的衣壳蛋白中用于结合宿主细胞NPM1蛋白的区域内，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SED.ID.NO.2所示。
2.根据权利要求1所述一种突变的PCV2病毒，其特征在于：所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型。
3.一种突变的PCV2病毒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
所述突变的PCV2病毒是将野生型PCV2病毒的衣壳蛋白中用于结合宿主细胞NPM1蛋白的区域内的一个或多个氨基酸残基突变后得到的，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SED.ID.NO.2所示。
4. 根据权利要求3所述一种突变的PCV2病毒的制备方法，其特征在于：所述突变的PCV2病毒的制备方法，具体包括以下步骤：以野生型PCV2病毒的克隆载体为模板，通过PCR扩增得到含有突变的PCV2病毒的DNA的环状PCR产物，将环状PCR产物经限制性内切酶Dpn I处理后进行扩增，得到突变型PCV2病毒的克隆载体，从突变型PCV2病毒的克隆载体中分离突变的PCV2病毒的DNA并连接成环状DNA，将环状DNA转染宿主细胞，然后进行培养和传代，得到突变的PCV2病毒；
所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型；
所述PCR扩增的引物为：
P-F1：5’- GTGGTAGGAGAAGGGCTGGGGTATGGTATCGTCGGAGG -3’
P-R1：5’- GACCCCTACGTAAACTACTCCTCCGACGATACCATA -3’。
5.一种如权利要求1-2中任意一项所述的突变的PCV2病毒在制备PCV2病毒感染动物模型中的应用。
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