CN112725291B

CN112725291B - 一种gas样基序突变的pcv2毒株及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112725291B
Application number: CN202011626875.4A
Authority: CN
Inventors: 黄勇; 童德文; 韩聪; 杜谦; 朱磊
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2023-07-04
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112725291A

Abstract

本发明公开了一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用。对PCV2DNA中的GAS样基序进行突变，使得突变的PCV2DNA在病毒复制中不能与STAT5蛋白结合，并通过病毒拯救获得复制能力远低于野生型PCV2毒株的突变毒株。该突变毒株可以用于研究PCV2复制机制和减毒活疫苗，从而为PCV2的防控提供新思路。

Description

一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒2型(PCV2)突变毒株的构建，具体涉及GAS样基序突变的PCV2病毒。

背景技术

PCV2感染造成机体产生免疫抑制，导致PCV2与其他病原体，例如，猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪细小病毒(PPV)等混合感染，还使感染猪对疫苗保护性降低，严重威胁着养猪业的发展。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但是PCV2的复制机制并不明确。研究PCV2 DNA复制机制成为目前研究PCV2复制机制关键环节之一。

信号传导与转录激活因子5(STAT5)属于信号传导及转录激活蛋白家族，是一种能与DNA结合的蛋白质。研究表明，人的STAT5蛋白通过与人细小病毒B19 DNA GAS样基序结合促进病毒DNA复制。

但对于PCV2而言，宿主细胞蛋白STAT5是否与病毒的蛋白或DNA结合，并且其结合后对病毒复制带来怎样的影响并未得到研究。同时，目前尚难以通过基因工程手段有效获得复制能力明显减弱的PCV2突变毒株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用，该突变毒株的复制能力远低于野生型PCV2毒株。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种突变的PCV2病毒，该突变的PCV2病毒(DNA)在复制中不能与宿主细胞内的STAT5蛋白结合，即所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内。

优选的，所述野生型PCV2病毒DNA上存在用于与STAT5蛋白结合的GAS样基序。

优选的，所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的PCV2 2b亚型毒株)DNA自复制起始点起的第1066nt～1074nt存在的GAS样基序(TTCTCTGAA)。

优选的，通过将上述GAS样基序突变为非GAS样基序(例如，ACGAAAGCC)，使得PCV2DNA(基因组DNA)在病毒复制中不能与宿主细胞蛋白STAT5结合，并导致PCV2病毒的复制能力明显减弱。

优选的，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

上述突变的PCV2病毒的制备方法，包括以下步骤：

1)通过序列比对分析PCV2病毒DNA包含的与STAT5蛋白保守的结合位点，然后扩增或人工合成突变的PCV2病毒的DNA序列，所述PCV2病毒的突变位点位于野生型PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内；

2)将上述突变的PCV2病毒的DNA序列环化后转染宿主细胞(例如，PK-15细胞)，然后进行培养和传代，得到突变的PCV2病毒。

优选的，所述步骤1)具体包括以下步骤：根据GAS样基序是STAT5蛋白保守的结合位点，以野生型PCV2病毒DNA为模板，通过重叠PCR扩增得到GAS样基序突变的PCV2病毒DNA。

优选的，所述野生型PCV2病毒选自PCV2病毒2b亚型(例如，DNA序列如GenBankNo.MH492006.1所示的毒株)。

优选的，所述重叠PCR采用的扩增引物为：

病毒DNA片段I引物：

Overlap-F1：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTC-3’

Overlap-R1：5’-ATGTATGTACAATGGCTTTCGTTAATCTGAAAGACCCC-3’

病毒DNA片段II引物：

Overlap-F2：5’-AGATTAACGAAAGCCTTGTACATACATGGTTACACGGATAT-3’

Overlap-R2：5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’

病毒DNA全长引物：

Overlap-F1：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTC-3’

Overlap-R2：5’-GCACCGCGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’。

上述突变的PCV2病毒在制备PCV2病毒感染动物模型中的应用。例如，所述动物模型为感染突变的PCV2病毒的PK-15细胞。

本发明的有益效果体现在：

本发明基于猪STAT5(Porcine STAT5)蛋白与位于猪圆环病毒2型(PCV2)2b亚型毒株DNA 1066nt～1074nt的GAS样基序(TTCTCTGAA)之间的互作，通过将PCV2 DNA中的GAS样基序突变，并通过感染性克隆获得在复制中不能与STAT5蛋白结合的突变的PCV2毒株，该突变毒株复制更为缓慢，并且毒价低于野生型PCV2毒株。本发明获得的突变毒株可以用于更好的研究PCV2的复制机制，同时，由于本发明的突变毒株是从弱化病毒DNA复制的层面构建形成的弱毒PCV2毒株，从而为PCV2的防控提供了新思路，对疫苗研发具有重要意义。

进一步的，本发明通过实验(序列比对、DNA pull down)确定了PCV2病毒DNA中存在的与STAT5蛋白结合的GAS样区域(GAS样基序)是STAT5蛋白保守的结合位点，从而为构建不同复制能力的低毒价突变毒株提供了有效的候选靶点。

进一步的，本发明根据野生型PCV2序列(例如，GenBank No.MH492006.1)，将PCV2病毒DNA第1066nt～1074nt的TTCTCTGAA突变为ACGAAAGCC，构建得到GAS样区域突变的PCV2感染性克隆，通过原位杂交实验发现PCV2突变毒株的DNA复制能力显著低于野生型PCV2毒株，该突变毒株可以作为研究PCV2 DNA复制的一个重要模型。

本发明首次证实PCV2病毒DNA存在与STAT5蛋白结合的互作区域(例如，GAS样区域)，可以根据结合位点设计定点突变引物(使得突变的PCV2 DNA在病毒复制中不能与STAT5蛋白结合)，并通过重叠PCR获得突变的PCV2病毒DNA，从而通过感染性克隆快速构建获得复制能力远低于野生型PCV2毒株的突变毒株。

附图说明

图1为猪stat5基因克隆及真核表达载体的鉴定结果；其中：A为猪stat5基因的PCR产物鉴定，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道1为猪stat5基因的PCR产物；B为pCI-His-STAT5酶切鉴定，泳道M为DL2000 plus DNA Marker，泳道1为Xho I及Not I双酶切鉴定。

图2为免疫共沉淀鉴定Cap和猪STAT5蛋白互作的结果；其中：A为利用His抗体进行免疫沉淀的结果；B为利用GFP抗体进行免疫沉淀的结果；Input表示裂解产物对照(未加入用于免疫沉淀的抗体)，IP表示免疫沉淀；β-actin为内参。

图3为猪stat5原核表达载体的鉴定结果；其中：A为stat5基因的PCR产物鉴定，泳道M1为DL2000 plus DNA Marker，泳道1、2为stat5基因的PCR产物；B为pGEX-4T-STAT5酶切鉴定，泳道M2为1Kb DNA Marker，泳道1为原核重组质粒pGEX-4T-STAT5，泳道2为EcoR I及Not I双酶切鉴定。

图4为GST-pull down鉴定Cap与STAT5互作的结果；其中：Input表示裂解产物对照(未加入用于免疫沉淀的抗体)，Output表示GST-pull down。

图5为干扰stat5基因表达对PCV2复制影响的结果；A和B为STAT5蛋白表达量，＊＊表示相对于转染NC的PK-15中STAT5蛋白表达水平p<0.01；C为stat5 mRNA水平，＊＊表示相对于转染NC的PK-15中stat5 mRNA表达水平p<0.01；D为PCV2病毒DNA拷贝数，＊表示相对于转染NC的PK-15中PCV2 DNA拷贝数p<0.05；Ctrl为空白对照。

图6为PCV2突变示意图。

图7为PCV2突变毒株鉴定结果；其中：A为突变病毒的第一步PCR扩增，泳道M为DL2000 plus DNAmarker，泳道1为PCR产物(病毒DNA片段I)，泳道2为PCR产物(病毒DNA片段II)；B为突变病毒的第二步PCR扩增，泳道M为DL2000 plus DNA marker，泳道1为overlapPCR产物(病毒DNA全长片段)；C为pMD-PCV2-MDS酶切鉴定，泳道M为DL2000 plus DNAmarker，泳道1为质粒酶切产物。

图8为DNA pull down检测STAT5蛋白与PCV2 DNA互作区域的结果；其中：Input表示裂解产物对照(未加入检测抗体)，IP表示免疫沉淀；β-actin为内参。

图9为PCV2突变毒株在细胞内的复制情况结果；其中：A为荧光原位杂交检测PCV2DNA的复制，bar＝100μm；B为CP探针检测阳性细胞数量统计，＊表示相对于相同时间PCV2-WT感染组中CP探针(与病毒基因组DNA模板链特异性结合的探针)检测阳性细胞的数量具有显著差异(p<0.05)；C为RFP探针检测阳性细胞数量统计，＊表示相对于相同时间PCV2-WT感染组中RFP探针(与病毒基因组DNA复制链特异性结合的探针)检测阳性细胞的数量具有显著差异(p<0.05)；D为荧光定量PCR检测病毒DNA拷贝数，＊表示相对于相同时间PCV2-WT感染组中PCV2病毒DNA拷贝数具有显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而不是对发明保护范围的限制。

本发明首先通过分子克隆获得porcine STAT5蛋白(pSTAT5)，通过免疫共沉淀试验确定pSTAT5与野生型PCV2病毒衣壳蛋白Cap存在相互作用，进一步通过GST-pull down鉴定发现pSTAT5与Cap的互作是间接的。通过序列比对分析PCV2病毒DNA与pSTAT5结合的关键区域，根据结合位点设计定点突变引物，通过重叠PCR，以野生型PCV2 DNA为模板，扩增得到结合位点突变的PCV2病毒DNA，将该突变的PCV2病毒DNA环化后转染PK-15细胞，培养一定时间后收集病毒上清，即可得到复制能力明显减弱的PCV2突变毒株，并通过DNA pull down验证PCV2 DNA与pSTAT5互作区域。

(一)猪stat5基因克隆及真核表达载体的构建

根据NCBI上公布的猪stat5基因(HM462245.1)，设计扩增该基因编码区全长的引物：

上游引物F1-stat5：5’-CCCTCGAGATGCATCATCACCATCACCATGCCACCATGGCTGTGTGGATACAAGCC-3’(斜体部分表示Xho I酶切位点，下划线部分表示His标签)；

下游引物R1-stat5：5’-TTGCGGCCCGCTCATGAGGGATCCACTGACTGTCCATAG-3’(斜体部分表示Not I酶切位点)；

利用TRIZOL沉淀法提取PK-15细胞(ATCC)的总RNA，再将上述RNA反转录为cDNA：具体是将反转录反应体系(表1)置于PCR仪中65℃5min，再冰浴2min，然后于冰上依次加入试剂(表2)后置于PCR仪中25℃10min，再37℃50min，再70℃15min，最终得到cDNA。以该cDNA为模板，并利用引物F1-stat5和R1-stat5 PCR扩增猪stat5基因序列，将PCR产物及以pCI-neo(promega#E1841)分别用限制性内切酶Xho I和Not I进行双酶切，电泳后胶回收目的基因和载体骨架并进行连接，连接产物转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态中，37℃培养2h后吸取少量液体涂于具有氨苄抗性的固体培养基表面，37℃培养16h，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，再将阳性菌扩大培养后提质粒进行酶切鉴定，结果如图1所示，鉴定正确后再送至生物公司测序，将测序正确的质粒进行命名，得到His-STAT5蛋白表达载体pCI-His-STAT5。

表1.反转录反应体系I

表2.反转录反应体系II

(二)免疫共沉淀检测Cap与STAT5蛋白互作

用Lipo8000转染试剂将pEGFP-Cap(Wang T,Du Q,Wu X,Niu Y,Guan L,Wang Z,Zhao X,Liu SL,Tong D,Huang Y.2018.Porcine MKRN1 modulates the replication andpathogenesis of PCV2 by inducing capsid protein ubiquitination anddegradation.J Virol.92(11):100-118)与pCI-His-STAT5两种质粒共转染至HEK-293T细胞中，转染36h后，用含有蛋白酶抑制剂的IP裂解液裂解转染后的细胞，冰上裂解40min。然后4℃12000rpm离心15min获取裂解蛋白上清液。对裂解蛋白上清液进行预清除，具体操作步骤如下：取40μL protein G/protein A琼脂糖珠，加入500μL PBS混匀颠倒5次，5000g离心1min弃上清，再加入PBS洗如此重复3次；根据试验需要在不同的琼脂糖珠里加入对应的上清，4℃摇床孵育1.5h，然后4℃13000g离心10min获得预清除的蛋白上清。然后取500μL蛋白上清加入相应的1μL的抗体(兔源His单克隆抗体(Cell Signaling Technology#D3I10)/鼠源GFP单克隆抗体(Thermo Fisher#G10362))4℃孵育过夜。与此同时取100μL proteinG/protein A琼脂糖珠用PBS洗3次后加入100μL的PBS获得50％protein G/protein A琼脂糖珠。抗体孵育结束后加入50％protein G/protein A琼脂糖珠，4℃孵育6h，然后1500g离心1min获得沉淀，再用PBS洗3次。最后，再用100μL的PBS重悬沉淀物再加入20μL 5×蛋白上样缓冲液，煮沸5min，并通过western blotting进行检测。结果显示，用His抗体进行免疫沉淀，在沉淀物中检测到与GFP蛋白融合表达的GFP-Cap蛋白(图2A)；用GFP抗体进行免疫沉淀，在沉淀物中检测到与His蛋白融合表达的His-STAT5蛋白(图2B)，提示Cap与STAT5蛋白存在互作。

(三)猪stat5原核表达载体的构建

以pCI-His-STAT5质粒为模板，设计扩增猪stat5基因编码区全长的引物：

上游引物F2-stat5：5’-CGGAATTCATGCCACCATGGCTGTGTGGATACAAGCC-3’(斜体部分表示EcoR I酶切位点)

下游引物R2-stat5：5’-TTGCGGCCCGCTGAGGGATCCACTGACTGTCCATAG-3’(斜体下划线部分表示Not I酶切位点)

扩增出大小为2383bp的目的基因(图3A)，EcoR I及Not I双酶切，将目的基因克隆入pGEX-4T-1质粒(优宝生物#VT1253)中。进一步提取重组质粒进行酶切鉴定(图3B)，获得大小约5000bp和2383bp的目的条带，与预期大小一致。再送至生物公司测序，将测序正确的质粒进行命名，得到原核表达载体pGEX-4T-STAT5。

(四)GST-pull down鉴定Cap与STAT5蛋白互作

将pGEX-4T-1质粒及pGEX-4T-STAT5质粒转染于将大肠杆菌DH5ɑ感受态中，然后进行原核表达，将表达所得蛋白GST或GST-STAT5的上清与谷胱甘肽琼脂糖珠(1×PBS预先清洗3次)4℃过夜孵育。再用缓冲液A(20mM、pH 8.0Tris-HCl、150mM NaCl、1mM MgCl₂、0.1％Nonidet P-40、10％甘油，0.1mM二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂)洗3次，再将对应的琼脂糖珠与实验室保存的经纯化的His-Cap蛋白一起在4℃下孵育3h，然后用缓冲液A洗涤3次，离心弃上清再用200μL PBS重悬琼脂糖珠，再加入适量的蛋白上样缓冲液，煮沸10min。最后通过western blotting检测目的蛋白。结果显示，GST以及GST-STAT5蛋白均不能与His-Cap蛋白结合(图4)，结果提示PCV2 Cap与STAT5蛋白之间的互作是间接的，必须通过某种分子才能使两者结合。

(五)干扰stat5基因表达对PCV2复制影响

首先，设计针对STAT5蛋白表达的三组干扰RNA：

stat5 siRNA#1：5’-CCAGUGGAUUGAAAGCCAATT-3’

stat5 siRNA#2：5’-CCGGAACAUGUCGCUGAAATT-3’

stat5 siRNA#3：5’-GGUGGCAUCACCAUUGCUUTT-3’

接着，使用Lipo8000转染试剂将阴性对照siRNA(NC)、stat5 siRNA#1、stat5 siRNA#2及stat5 siRNA#3分别转染到PK-15细胞(ATCC)中。将转染后的PK-15细胞在37℃培养6h后用等量的PCV2感染。在感染后24h收集细胞用于后续实验：West ern blotting检测STAT5蛋白表达量的变化；相对荧光定量PCR检测对STAT5 mRNA水平的影响，检测的引物为STAT5-F(5’-TGTGAGAAGTTGGCGGAGAT-3’)和STAT5-R(5’-GCGAACTTGGTCTGCGTCT-3’)；提取病毒基因组DNA后利用绝对荧光定量PCR检测PCV2病毒DNA拷贝数。荧光定量PCR和westernblotting结果显示，siRNA#1组的干扰效率最高(图5A、图5B及图5C)。通过检测干扰stat5基因表达对PCV2复制的影响，结果显示，PCV2感染后siRNA#1组的DNA拷贝数显著低于NC转染组(p<0.05；图5D)，结果提示下调stat5基因表达能够显著抑制PCV2复制。

(六)PCV2突变位点序列设计

目前发现的PCV2毒株主要包括2a亚型和2b亚型，序列比对分析发现其自复制起点开始的1066nt～1074nt存在GAS样基序(TTCTCTGAA)，且该GAS样基序在不同毒株之间高度保守。故将PCV2 DNA自复制起点开始的第1066nt～1074nt的GAS样基序进行突变，使突变后的片段不符合目前已知的GAS样基序形式(TTCNNNGAA、TTCNNNTAA及TTANNNGAA)，即突变为非GAS样基序。

尽管突变形成的片段种类很多，但由于PCV2病毒的DNA中ORF存在多个病毒蛋白交叉共用的情况，突变后的序列容易导致病毒蛋白的表达提前终止，同时，排除掉突变导致基序对应氨基酸酸碱性质发生变化，从而同样可能影响病毒复制的情况。对最终筛选得到的GAS样基序突变方式，通过实验进行了验证。

(七)PCV2突变序列overlap扩增及感染性克隆载体的构建实例

突变方式一：根据野生型PCV2序列，将PCV2病毒2b亚型毒株(PCV2-WT)DNA(GenBank：MH492006.1)第1066nt～1074nt的TTCTCTGAA突变为ACGAAAGCC(图6)。

突变方式二：根据野生型PCV2序列，将PCV2病毒2b亚型毒株(PCV2-WT)DNA(GenBank：MH492006.1)第1066nt～1074nt的TTCTCTGAA突变为TTGAAAGAA。

对于突变方式二，经实验发现其对PCV2病毒复制中DNA与STAT5蛋白的结合无影响。

依据突变后PCV2的DNA序列(参见SEQ.ID.NO.1；突变方式一)设计overlap引物：

Overlap-F1：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTC-3’(下划线位置表示Sac II限制性酶切位点)

Overlap-R1：5’-ATGTATGTACAATGGCTTTCGTTAATCTGAAAGACCCC-3’(斜体位置为突变碱基)

Overlap-F2：5’-AGATTAACGAAAGCCTTGTACATACATGGTTACACGGATAT-3’(斜体位置为突变碱基)

Overlap-R2：5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’(下划线位置表示Sac II限制性酶切位点)

以PCV2 DNA(GenBank：MH492006.1)为模板，以Overlap-F1和Overlap-R1为一组上、下游引物，以Overlap-F2和Overlap-R2为为另一组上、下游引物，分别进行第一步PCR，将PCR产物分别电泳后胶回收两条目的片段的条带(即图7A所示的病毒DNA片段I和病毒DNA片段II)，再以这两条目的片段为模板，以Overlap-F1和Overlap-R2为上、下游引物进行第二步PCR(PCR反应体系见表3)，将第二步PCR产物胶收后得到的病毒DNA全长片段(如图7B所示)与pMD-18T(Takara)分别经限制性内切酶Sac II酶切，电泳后胶回收目的基因和载体骨架，于16℃过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5ɑ感受态中，再将其涂于固体LB培养基(氨苄抗性)，37℃培养14h，挑取单克隆进行菌落PCR，将阳性菌加入具有氨苄抗性的液体培养基中扩大培养，再提取质粒进行酶切鉴定(如图7C所示)，鉴定正确后再送至生物公司测序，将测序正确的质粒进行命名，得到突变病毒感染性克隆载体pMD-PCV2-MDS。

将pMD-PCV2-MDS质粒用Sac II 37℃反应30min(酶切反应体系见表4)将酶切产物中1768bp的条带进行胶回收，得到线性化的突变病毒DNA，再用T4连接酶将线性化的突变病毒DNA连接成环(37℃1h；连接反应体系见表5)，再将环状DNA进行胶回收，胶回收产物用Lipo6000(上海碧云天生物技术有限公司#C0526)转染至PK-15细胞，盲传5代后提取病毒DNA，用PCR检测病毒基因组，将获得的突变毒株命名为PCV2-MDS(如图6所示)。

表3.PCR反应体系

表4.酶切反应体系

表5.连接反应体系

(八)DNApull down检测STAT5蛋白与PCV2 DNA互作区域

设计针对PCV2基因组全长的特异性引物并在相应的上、下游引物中加入生物素标签：

上游引物F-BIO：5’-GAACCGCGGGCT(biodT)GGCT(biodT)GAACTTT(biodT)TGAAAGT-3’

下游引物R-BIO：5’-GCACCGCGGAAAT(biodT)TTCT(biodT)GACAAACGT(biodT)TACA-3’

PCR扩增生物素标记的目的DNA(以PCV2-WT DNA为模板扩增得到Bio-PCV-WT，以PCV2-MDS DNA为模板扩增得到Bio-PCV2-MDS)，其中，PCR反应程序为：95℃5min；然后94℃1min，48℃1min，72℃3min，共进行35个循环，最后72℃10min。用Sac II限制酶酶切PCR产物20min，然后65℃15min使内切酶失活，再加入T4连接酶及缓冲液并于37℃进行环化40min，电泳后将目的条带进行胶回收。将一定量生物素标记的PCV2环状DNA(Bio-PCV2-WT或Bio-PCV2-MDS)转染至PK-15细胞，转染6h后收集细胞，先用PBS冲洗，后用TEMT缓冲液(10mM、pH8.1Tris-base、0.1mM EDTA、2mM MgCl₂，及0.2％TritonX-100)冰上裂解30min。4℃13000g离心10min后收集上清，在上清中加入Cap抗体，4℃进行免疫沉淀6h，再加入经过预清洗的亲和链霉素磁珠(预先用1×binding&washing Buffer清洗珠子)。将亲和链霉素磁珠和裂解液的复合物放置在磁性支架上，弃上清。然后用1×binding&washing Buffer清洗试管底部珠子，弃上清，加入DNA酶混合物，37℃孵育15min，最后加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min，将试管放在磁性支架上收集蛋白样品，western blotting进行检测。结果如图8所示，野生型PCV2(PCV2-WT)DNA能够与STAT5蛋白结合，而PCV2-MDS DNA不能与STAT5蛋白结合，结果提示PCV2 DNA的1066nt～1074nt片段是PCV2 DNA与STAT5蛋白发生互作的关键区域。

(九)荧光原位杂交(FISH)检测突变毒株的复制情况

针对PCV2 DNA模板链和复制链分别设计两种探针：

CY3标记的探针序列：

5’-CY3-TTTGATTATTTTTGTGGCGAGGAGGTAGGTAGGAGGATAGAGGAGGAGGAG-3’

CY3标记的探针靶向病毒基因组DNA复制链(负链)，命名为RFP探针，用于检测PCV2的复制。

FAM标记的探针序列：

5’-FAM-CCTTCCTTCCTCTCCCTCGCCAATAAAATAATCAAA-3’

FAM标记的探针靶向病毒基因组DNA模板链(正链)，能与病毒DNA链特异性结合，命名为CP探针。

按照5×10⁴细胞/孔的密度将PK-15细胞均匀铺于48孔板(孔内提前已放入细胞爬片)中，细胞培养箱中培养过夜，待细胞长满整个爬片的70％时分别用5MOI野生型PCV2(PCV2-WT)及PCV2突变毒株PCV2-MDS感染细胞，培养12h及24h吸弃孔板中的培养基，1×PBS洗两次，每次5min吸弃PBS，每孔加入200μL无水乙醇，室温固定15min吸弃无水乙醇，每孔加入200μL 0.1％tritonX-100，室温浸泡15～20min，1×PBS洗三次，每次2min。吸弃PBS，每孔加入200μL 2×SSC，37℃培养箱放置30min。吸弃液体，每孔加入200μL 70％乙醇，室温放置3min吸弃液体，每孔加入200μL 85％或90％乙醇，室温放置3min。吸弃液体，每孔加入200μL无水乙醇，室温放置3min，吸弃无水乙醇，室温干燥。

用DEPC水稀释两种探针，使浓度为1μg/μL，于冰上避光备用。避光下配制杂交缓冲液(100μL)：缓冲液A(上海吉玛FISH试剂盒)70μL、1μg/μL RFP或CP探针2μL，及DEPC水28μL。

在上述已经完成干燥的孔中每孔加入100μL杂交缓冲液，78℃变性8min，37℃培养箱孵育18h。吸弃液体，每孔依次加入200μL 65℃预热的0.4×SSC(0.3％Tween20)，37℃2min。吸弃液体，每孔加入200μL 2×SSC(0.1％Tween20)，37℃2min，吸弃液体，室温干燥。每孔加入200μL DAPI，37℃10min，吸弃液体，再加入200μL PBS清洗3次。挑出细胞爬片，用防荧光猝灭剂滴封片，再通过激光共聚焦进行检测并进行统计。

结果如图9所示，在PCV2-WT及PCV2-MDS感染组均能检测到红色荧光点(靶向PCV2模板链)及绿色荧光(靶向PCV2复制链)，然而与相同感染时间的PCV2-WT感染组相比，PCV2-MDS感染组中绿色及红色荧光数量减少(图9A)。荧光点的数量统计结果显示，在感染24h后，PCV2-NmA感染组中CP阳性细胞的数目显著低于PCV2-WT感染组(p<0.05)，RFP阳性细胞的数目也显著低于PCV2-WT感染组(p<0.05)(图9B、图9C)。结果提示突变PCV2 DNA的STAT5结合位点后能降低PCV2 DNA的复制能力。(十)荧光定量PCR检测突变毒株的DNA拷贝数

首先测定实验室保存的pGEM-T-PCV2载体(杜谦.2016.猪圆环病毒2型对猪肺泡巨噬细胞IL-10/IL-12p40表达的影响及调控机制：西北农林科技大学)浓度，取一定量的质粒进行10倍倍比稀释，取不同浓度梯度等量的质粒为模板并做3组重复，待荧光定量PCR后获得PCV2病毒拷贝数标准曲线。

提取病毒DNA，以提取的DNA为模板做3组重复，荧光定量检测PCV2 DNA拷贝数(检测引物为PCV2-F：5’-TTGAATGTGGAGCTCCTAGAT-3’，PCV2-R：5’-GCAAGGTACTCACAGCAGTAGACA-3’)。于避光条件下，在超净工作台中向各管中加样，混匀后瞬离至管底，于荧光定量PCR仪中进行PCR。PCR反应条件：95℃，10min预变性；95℃15s，65℃20s，80个循环。经过实时荧光定量PCR后得到其CT值，通过标准曲线计算得到病毒的拷贝数。

结果如图9D所示，感染后12h及24h，PCV2-MDS感染组中病毒DNA的拷贝数显著低于野生型PCV2感染组(p<0.05；图9D)。结果表明突变毒株PCV2-MDS的复制能力低于野生型PCV2。

总之，本发明获得的PCV2突变毒株(例如，PCV2-MDS)，具有如下特点：

1)PCV2 DNA的GAS样区域突变。

2)突变毒株复制中病毒DNA不能与STAT5蛋白结合。

3)通过感染性克隆获得(病毒拯救)的突变毒株具有感染性，并能在PK-15中复制。

4)突变的PCV2毒株复制能力远低于野生型毒株。

以上特点为进一步研究PCV2 DNA复制和减毒活疫苗奠定基础，从而为PCV2的防控提供了新思路。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种GAS样基序突变的PCV2毒株及其制备方法和应用

<160> 20

<210> 1

<211> 1768

<212> DNA

<213> GAS样基序突变的PCV2 2b亚型

<400> 1

accagcgcac ttcggcagcg gcagcacctc ggcagcacct cagcagcaac atgcccagca 60

agaagaatgg aagaagcgga ccccaaccac ataaaaggtg ggtgttcacg ctgaataatc 120

cttccgaaga cgagcgcaag aaaatacggg agctcccaat ctccctattt gattatttta 180

ttgttggcga ggagggtaat gaggaaggac gaacacctca cctccagggg ttcgctaatt 240

ttgtgaagaa gcaaactttt aataaagtga agtggtattt tggtgcccgc tgccatatcg 300

agaaagcgaa aggaactgat cagcagaata aagaatattg cagtaaagaa ggcaacttac 360

ttatcgaatg tggagctcct agatgtcaag gacaacggag tgacctgtct actgctgtga 420

gtaccttgtt ggagagcggg agtctggtga ccgttgcaga gcagcaccct gtaacgtttg 480

tcagaaattt ccgcgggctg gctgaactct tgaaagtgag cgggaaaatg cagaagcgtg 540

attggaagac caatgtacac gtcattgtgg ggccacctgg gtgtggtaaa agcaaatggg 600

ctgctaattt tgcagatccg gaaaccacat actggaaacc acctagaaat aagtggtggg 660

atggttacca tggtgaagaa gtggttgtta ttgatgactt ttatggctgg ctgccgtggg 720

atgatctact gagactgtgt gatcgatatc cattgactgt agaaactaaa ggtggaactg 780

tacctttttt ggcccgcagt attctgatta ccagcaatca gaccccgttg gaatggtact 840

cctcaactgc tgtcccagct gtagaagctc tctatcggag gattacttcc ttggtatttt 900

ggaagaatgc tacagaacag tccacggagg aagggggcca gttcgtcacc ctttcccccc 960

catgccctga atttccatat gaaataaatt actgagtctt ttttatcact tcgtaatggt 1020

ttttattatt catttagggt ttaagtgggg ggtctttcag attaaaacga aagccttgta 1080

catacatggt tacacggata ttgtagtcct ggtcgtattt actgttttcg aacgcagtgc 1140

cgaggcctac gtggtctaca tttttactgg tttgaattct catccacagc tgatttcttt 1200

tgttatttgg ttggaagtaa tcaatggtgg aatcaaggac aggtttgggg gtaaagtacc 1260

gggtgtggta ggagaagggc tggggtatgg tatggcggga ggagtagttt acgtaggggt 1320

cataggttag ggctgtggac ttagggaaaa agttatcatc tagaataaca gcactggatc 1380

caactcccct gtcaccctgg gtgattgggg agcagggcca gaattcaacc ttaacctttc 1440

ttattctgta gtattcaaag ggtatagaga ttttgttggt cccccctccc gggggaagaa 1500

agtcgtcaat attaaatctg agcacgtcca ccgcccagga gggcgttgtg actgtggtag 1560

ccttgacagt atatccgaag gtgcgggaga ggcggctgtt gaaaatgcca tttttccttc 1620

tccagcggta acggtggcgg gggtggatga gccaggggcg gcggcggagg atctggccaa 1680

gatggctgcg ggggcggtgt cttcttctcc ggtaacgcct ccttggatac gtcatagctg 1740

aaaacgaaag aagtgcgctg taagtatt 1768

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Overlap-F1

<400> 2

gaaccgcggg ctggctgaac tc 22

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> Overlap-R1

<400> 3

atgtatgtac aatggctttc gttaatctga aagacccc 38

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> Overlap-F2

<400> 4

agattaacga aagccttgta catacatggt tacacggata t 41

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> Overlap-R2

<400> 5

gcaccgcgga aatttctgac aaacgttaca 30

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> F1-stat5

<400> 6

ccctcgagat gcatcatcac catcaccatg ccaccatggc tgtgtggata caagcc 56

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> R1-stat5

<400> 7

ttgcggcccg ctcatgaggg atccactgac tgtccatag 39

<210> 8

<211> 21

<212> RNA

<213> stat5 siRNA #1

<220>

<221> misc_feature

<222> （20）…（21）

<400> 8

ccaguggauu gaaagccaat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> stat5 siRNA #2

<220>

<221> misc_feature

<222> （20）…（21）

<400> 9

ccggaacaug ucgcugaaat t 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> stat5 siRNA #3

<220>

<221> misc_feature

<222> （20）…（21）

<400> 10

gguggcauca ccauugcuut t 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> STAT5-F

<400> 11

tgtgagaagt tggcggagat 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> STAT5-R

<400> 12

gcgaacttgg tctgcgtct 19

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> F-BIO

<400> 13

gaaccgcggg cttggcttga actttttgaa agt 33

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> R-BIO

<400> 14

gcaccgcgga aattttcttg acaaacgttt aca 33

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> PCV2-F

<400> 15

ttgaatgtgg agctcctaga t 21

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> PCV2-R

<400> 16

gcaaggtact cacagcagta gaca 24

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> F2-stat5

<400> 17

cggaattcat gccaccatgg ctgtgtggat acaagcc 37

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> R2-stat5

<400> 18

ttgcggcccg ctgagggatc cactgactgt ccatag 36

<210> 19

<211> 36

<212> DNA

<213> RFP探针

<400> 19

ccttccttcc tctccctcgc caataaaata atcaaa 36

<210> 20

<211> 36

<212> DNA

<213> CP探针

<400> 20

ccttccttcc tctccctcgc caataaaata atcaaa 36

Claims

1.一种突变的PCV2病毒，其特征在于：该突变的PCV2病毒的突变位点位于PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内；

所述与STAT5蛋白结合的序列区域为GAS样基序；

所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述一种突变的PCV2病毒，其特征在于：所述突变的PCV2病毒不能与宿主细胞内的STAT5蛋白结合，并导致PCV2病毒的复制能力减弱。

3.一种突变的PCV2病毒的感染性克隆载体，其特征在于：该载体包括与克隆载体骨架连接的突变的PCV2病毒的DNA序列，所述突变的PCV2病毒的突变位点位于PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内，所述与STAT5蛋白结合的序列区域为GAS样基序，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

4.一种突变的PCV2病毒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）扩增或人工合成突变的PCV2病毒的DNA序列，所述突变的PCV2病毒的突变位点位于PCV2病毒DNA与STAT5蛋白结合的序列区域内；

2）将步骤1）得到的DNA序列环化后转染宿主细胞，然后进行培养和传代，得到突变的PCV2病毒，所述与STAT5蛋白结合的序列区域为GAS样基序，所述突变的PCV2病毒的DNA序列如SEQ.ID.NO.1所示。

5.根据权利要求4所述一种突变的PCV2病毒的制备方法，其特征在于：所述步骤1）具体包括以下步骤：以野生型PCV2病毒DNA为模板，通过重叠PCR扩增得到GAS样基序突变的PCV2病毒DNA。

6.一种如权利要求1-2中任意一项所述的突变的PCV2病毒在制备PCV2病毒感染动物模型中的应用。