CN108728581B - 同时检测5种甘蔗病毒的多重rt-pcr方法及其引物和试剂盒 - Google Patents

同时检测5种甘蔗病毒的多重rt-pcr方法及其引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了同时检测5种甘蔗病毒的多重RT‑PCR检测引物组，包括六对PCR引物，分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。据此，还对影响多重RT‑PCR扩增的引物浓度和退火温度等方面进行多重RT‑PCR体系的优化，建立了相应多重RT‑PCR检测方法，该法能够快速、准确又简便和经济地从甘蔗组织中同时检测这五种侵染甘蔗的病毒，对健康种苗母株筛选、健康种苗繁育监测、抗病育种和田间病害流行预测均具有重要意义。为方便应用本发明，还设计组装了相应试剂盒，以便在基层普及推广。

Description

同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒
技术领域
本发明属于甘蔗病毒检测技术领域，涉及一种同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒。
背景技术
甘蔗(Saccharum officinarum L.)属禾本科甘蔗属植物，是最重要的糖科作物，同时也是乙醇、糖醛和葡聚糖的生产原料，甘蔗糖占我国食糖生产总量85％以上。甘蔗在生长过程中会受到多种病害尤其是病毒病的危害，经过长期无性繁殖留种，甘蔗品种和种质材料中会积累各种病毒，导致甘蔗品种退化、产量和糖分降低，给甘蔗产业造成重大的经济损失。世界范围内发现侵染甘蔗的病毒种类超过15种，包括DNA病毒类的甘蔗杆状病毒(Sugarcane bacilliform virus，SCBV)和甘蔗线条病毒(Sugarcane streak virus，SSV)及RNA病毒类的甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus，SCMV)、高粱花叶病毒(Sorghummosaic virus，SrMV)、甘蔗黄叶病毒(Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV)、甘蔗线条花叶病毒(Sugarcane streak mosaic virus，SCSMV)、玉米线条病毒(Maize streakvirus，MSV)、玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic mottle virus，MCMV)、拉姆矮化病毒(Ramu stunt virus，RmSV)、甘蔗白条纹病毒(Sugarcane white streak virus，SWSV)、甘蔗斐济病毒(Sugarcane Fiji disease virus，SFDV)、甘蔗矮缩病毒(Sugarcane dwarfvirus，SDV)、香蕉线条病毒(Banana streak virus，BSV)、甘蔗褪绿线条病毒(Sugarcanechlorotic streak virus，SCSV)、甘蔗条纹花叶病毒(Sugarcane straite mosaic virus，SSMV)等。其中，我国大陆地区报道的有SCMV、SrMV、ScYLV、SCSMV、SFDV、SCBV、SCSV、MCMV。近年，广西全区进行的病毒病害调查显示，广西甘蔗种植区目前主要受SrMV，SCMV，ScYLV、SCBV和SSV五种病毒侵染。不同甘蔗病毒引起的症状不同，引发的症状包括植株束顶矮化、叶片中脉变黄、叶部斑点和斑驳、叶片皱缩、茎秆节间出现裂缝等。
基因检测是从核酸水平检测病毒，其检测的灵敏度和特异性均高于血清学检测，特别适用于准确性要求高的样本检测。目前甘蔗病毒的基因检测方法主要有PCR、RT-PCR、双链RNA(dsRNA)电泳和环介导等温扩增技术等，其中单重RT-PCR是目前应用最广泛的RNA病毒检测方法。但是单重RT-PCR一个反应只能检测一种病毒，如果反应模板中含有两个以上的病毒，则需进行多次PCR，成本高且费时费力。目前甘蔗病毒基因检测方法中，尚无同时检测两种及两种以上病毒的方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速、简便、经济且准确的同时检测5种甘蔗病毒(含两种DNA病毒和三种RNA病毒)的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒，可同时检测DNA病毒和RNA病毒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV 5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH(其作用是对反应体系中的甘蔗总核酸的量进行评估)，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。
上述检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，还包括通用接头引物序列(Universal Tag Sequence，UTS)的Tag-F序列和Tag-R序列，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.13至SEQ.ID.NO.14的碱基序列。
含有上述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
上述检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，包括以下试剂：阳性对照、阴性对照和引物组，引物组包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。
阳性对照为含有SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV 5种甘蔗病毒的甘蔗总核酸标准品，阴性对照为无病毒的甘蔗总核酸，引物组为预混的包含针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH的反转录引物组(RT Primer Mix，RPM)，以及预混的针对上述病毒和内参基因的PCR引物组(Forward Primer Mix)。
上述检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，还包括以下试剂：10×MultiHot Start Buffer，Super Pure dNTPs，MgCl2，DNA polymerase，ddH20，dNTP Mix，5×SuperRT Buffer，Super RT，RNase-Free Water。
利用上述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法。
反转录产物按以下方法制备：采用cDNA第一条链合成试剂盒，以提取的待测甘蔗样品的病毒核酸为模板，在20μL反应体系中加入所有反向引物的混合液RPM，使每条反向引物的终浓度为500nM，反转录制备cDNA模板；反转录体系为20μL，包括病毒核酸2μL，dNTPMix 4μL，10×RPM 2μL，5×Super RT Buffer 4μL，Super RT 1μL，RNase-Free Water 7μL；反应程序为PCR仪上42℃50min，85℃5min；反应结束立即插在冰上，-20℃保存备用。
上述同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法，PCR的反应体系和反应程序为：
反应体系：共25μL，包括反转录产物8μL，Forward Primer Mix 2μL，10×MultiHot Start Buffer 2.5μL，Super Pure dNTPs 2μL，MgCl22μL，DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 6μL；其中Forward Primer Mix为所有正向引物和接头引物按1∶60比例组成的混合液，每条正向引物的终浓度为200nM；
反应程序：95℃预变性15min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
针对上述五种常见甘蔗病毒缺乏快速有效同时检测手段的问题，发明人根据其核苷酸保守区序列设计并合成了同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV 5种甘蔗病毒(引物所在病毒的保守区域见图1～图5)和一个甘蔗内参基因GAPDH，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列。据此，发明人还对影响多重RT-PCR扩增的引物浓度和退火温度等方面进行多重RT-PCR体系的优化，建立了相应多重RT-PCR检测方法，该法在一个单一反应体系中加入5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH的特异引物对，可实现一次PCR反应同时检测5种甘蔗病毒，同时可对反应体系中的甘蔗总核酸的量进行评估，减少操作次数，避免交叉污染，同时还减少试剂、引物、模板及耗材等的使用量，省时、省力、省成本。实验表明，该法能够快速、准确又简便和经济地从甘蔗组织中同时检测这五种甘蔗病毒，明确甘蔗带毒情况，对尽早采取有效防治措施，控制病害在田间的发生、减少经济损失、抗病筛选和病害流行预测具有十分重要的意义，同时为健康种苗的发展奠定重要的基础。为方便应用本发明，发明人还设计组装了相应试剂盒，以便在基层普及推广。
附图说明
图1是SCBV基因组序列比对图，图中示SCBV检测引物SCBV-F和SCBV-R所在区域(序列保守区)。
图2是SSV基因组序列比对图，图中示SSV检测引物SSV-F和SSV-R所在区域(序列保守区)。
图3是SCMV基因组序列比对图，图中示SCMV检测引物SCMV-F和SCMV-R所在区域(序列保守区)。
图4是ScYLV基因组序列比对图，图中示ScYLV检测引物ScYLV-F和ScYLV-R所在区域(序列保守区)。
图5是SrMV基因组序列比对图，图中示SrMV检测引物SrMV-F和SrMV-R所在区域(序列保守区)。
图6是甘蔗病毒多重PCR扩增电泳图，图中：泳道1为DNA分子量标准(GeneRulerlkb plus DNA Ladder，Marker)；泳道2为未加模板的空白对照(NTC)；泳道3为阴性对照(Negetive control，NC)；泳道4为含有5种病毒的甘蔗样品的多重PCR产物(positivecontrol，PC)；泳道5～9为分别含有SrMV、ScYLV、SCMV、SSV和SCBV五种病毒的甘蔗样品的多重PCR产物。
图7是田间甘蔗样品的病毒检测多重PCR扩增电泳图，图中：泳道1为DNA分子量标准(GeneRuler lkb plus DNA Ladder，Marker)；泳道2为未加模板的空白对照(NTC)；泳道3为含有5种病毒的甘蔗样品的多重PCR产物(positive control，PC)；泳道4为阴性对照(Negetive control，NC)；泳道5～25为田间样品(样品编号：1-21)；泳道26为Marker。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明如何实施。
一、试验材料
试验试剂和药品：cDNA第一链合成试剂盒(HiFiScript cDNA Synthesis Kit)购自北京康为世纪生物科技有限公司、多重PCR扩增试剂盒(Multi PCR Kit)购自天根生化科技(北京)有限公司，其它药品为国产分析纯。
仪器设备：小型常温离心机(Centrifuge5424，Eppendorf)、life ECO基因扩增仪(杭州博日科技有限公司)、君意电泳仪JY300C(北京君意东方电泳设备有限公司)、凝胶成像系统(Gel Doc 1000，BIO-RAD)、电子分析天平、微量分光光度计(ND-1000，Nanodrop)、恒温培养箱、制冰机、摇床、烘箱等。
试验甘蔗样品：采集于广西扶绥蔗区的疑似甘蔗病毒病的21份样品、1份阳性对照样品和1份阴性对照样品。
二、试验方法
1.引物的设计与合成
根据文献及GenBank网站上已报道的SCBV、SSV、SCMV、ScYLV和SrMV的基因组的保守区序列，应用Primer6.0引物设计软件分别设计这5种病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH的特异引物(Gene Specific Primer，GSP)(SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12)。为保证每种病毒检测过程中的扩增效率一致，本发明采用的引物均带有通用接头序列，即：在甘蔗病毒序列设计特异性引物正向引物的5’端加上通用接头引物序列(Universe Tag Sequence，UTS)的Tag-F序列(SEQ.ID.NO.11)，在反向引物的5’端加上UTS的Tag-R序列(SEQ.ID.NO.12)。所有引物由上海生工生物工程有限公司合成。
2.制备病毒阳性对照标准品
采集被SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV单独侵染的甘蔗叶片，分别提取总核酸，经荧光定量PCR检测病毒的含量后，调整样品中的病毒含量一致并进行等比例混合，制备病毒阳性对照标准品。
3.提取甘蔗病毒核酸
取0.1g甘蔗叶片于备有3颗直径为3mm的研磨珠的1.8mL研磨管中，加入500mL裂解液A(20％SDS，5M NaCl，0.5M EDTA，1M Tris-HCl，pH8.0)，置于研磨仪(MP
Figure BDA0001708629740000051
-24均质破碎仪)进行细胞破碎(6米/秒，40秒)，12000rpm离心2分钟。然后取200μL上清液于RNase-free的PCR管中，室温放置30分钟。最后，移除上清液，用0.2M PBS缓冲液洗涤PCR管1次，RNase-Free ddH20洗涤1次，立即进行下一步操作。
该提取过程简洁实用，可同时提取甘蔗DNA病毒和RNA病毒的基因组。
4.cDNA的合成
采用cDNA第一条链合成试剂盒，以提取的待测甘蔗样品的病毒核酸为模板，在20μL反应体系中加入所有反向引物的混合液(RT Primer Mix，RPM)，使每条反向引物的终浓度为500nM，反转录制备cDNA模板；反转录体系为20μL，包括病毒核酸2μL，dNTP Mix4μL，10×RPM 2μL，5×Super RT Buffer 4μL，Super RT 1μL，RNase-Free Water 7μL；反应程序为PCR仪上42℃50min，85℃5min；反应结束立即插在冰上，-20℃保存备用。5.多重PCR扩增
反转录结束后，取8μL反转录产物，加入Forward Primer Mix 3.5μL，10×MultiHot Start Buffer 2.5μL，Super Pure dNTPs 2μL，MgCl22μL，DNA polymerase 0.5μL，ddH206.5μL。正向引物和接头引物按1∶60比例的混合液(Forward Primer Mix，FPM)，每条正向引物的终浓度为200nM，轻微混匀后直接进行多重PCR反应。
多重PCR扩增反应体系为25μL，包括：反转录产物8μL，Forward Primer Mix 2μL，10×Multi Hot Start Buffer 2.5μL，Super Pure dNTPs 2μL，MgCl22μL，DNApolymerase0.5μL，ddH2O 6μL。
反应程序：95℃预变性15min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
6.扩增产物检测
采用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，以病毒标准品作为阳性对照，将待测样品的产物与其比较，根据条带有无及条带大小判断待测样品是否含有这五种甘蔗病毒。
如图6和图7所示，结果表明本发明的多重RT-PCR检测方法不仅能有效检测出单一病毒感染的样品，还能有效检测出多种病毒复合感染的样品。
多重PCR反应要求在一个反应体系中进行多个基因片段的特异性扩增，但在PCR反应过程中引物间的竞争、非特异性反应和错配的发生率会随着模板和引物种类的增多而增大。如果引物组合不合理，引起引物间的竞争，导致一些靶标条带无法扩增。引物浓度比例搭配不合理会使反应体系产生非特异性条带，也可导致一些靶标条带无法扩增。因此，引物对的筛选，引物浓度的合理配比是多重PCR反应的关键。使用本发明提供的多重PCR检测方法检测待测植株是否感染SrMV，SCMV，ScYLV、SCBV和SSV，优选正向引物与接头引物的摩尔比为1∶60。本发明提供的引物组合及其引物配比，能够保证五种病毒的靶标条带均得到有效扩增，并且特异性强，检测结果的准确性高。
其他PCR反应条件如循环退火温度，Mg2+浓度，dNTPs浓度，Taq DNA聚合酶浓度等也直接影响产物的扩增。本发明对影响多重PCR反应的主要影响因素进行了优化，建立了最佳反应体系和反应程序。该方法能够检测SrMV、ScYLV、SCMV、SSV和SCBV的灵敏度达到fg级，与单重PCR检测的灵敏度一致(见图6)。
序列表
<110> 广西大学
<120> 同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR方法及其引物和试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<222> (24)..(24)
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<223> n is a, c, g, t or u
<220>
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<223> n is a, c, g, t or u
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Claims (7)

1.同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于包括六对PCR引物，它们分别针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH，所述六对PCR引物分别具有序列表SEQ.ID.NO.1至SEQ.ID.NO.12的碱基序列，其中奇数序列为正向引物，偶数序列为反向引物；所述多重RT-PCR检测引物组还包括通用接头引物序列Tag-F序列和Tag-R序列，它们分别具有序列表SEQ.ID.NO.13至SEQ.ID.NO.14的碱基序列。
2.含有权利要求1所述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒。
3.根据权利要求2所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于包括以下试剂：阳性对照、阴性对照和权利要求1所述引物组。
4.根据权利要求3所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为含有SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV 5种甘蔗病毒的甘蔗总核酸标准品；阴性对照为无病毒甘蔗总核酸；所述引物组为：①预混的针对SCBV、SSV、SCMV、ScYLV、SrMV5种甘蔗病毒和一个甘蔗内参基因GAPDH的反转录引物组(RT Primer Mix，RPM)，其为针对上述病毒和内参基因GAPDH的权利要求1中所述反向引物的混合液，以及②预混的针对上述病毒和内参基因GAPDH的PCR引物组(Forward Primer Mix)，其为权利要求1所述所有正向引物和接头引物的混合液。
5.利用权利要求1所述引物组的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法。
6.根据权利要求5所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于所述反转录产物按以下方法制备：采用cDNA第一条链合成试剂盒，以提取的待测甘蔗样品的病毒核酸为模板，在20μL反应体系中加入所有反向引物的混合液RPM，使每条反向引物的终浓度为500nM，反转录制备cDNA模板；反转录体系为20μL，包括病毒核酸2μL，dNTP Mix 4μL，10×RPM 2μL，5×Super RT Buffer 4μL，Super RT 1μL，RNase-Free Water 7μL；反应程序为PCR仪上42℃50min，85℃5min。
7.根据权利要求6所述的同时检测5种甘蔗病毒的多重RT-PCR检测方法，其特征在于PCR的反应体系为：共25μL，包括反转录产物8μL，Forward Primer Mix 2μL，10×Multi HotStart Buffer 2.5μL，Super Pure dNTPs 2μL，MgCl2 2μL，DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 6μL；其中Forward Primer Mix中每条正向引物的终浓度为200nM；PCR反应程序为：95℃预变性15min，94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，35个循环；最后72℃延伸5min。
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