CN101824411B

CN101824411B - 转基因水稻科丰6号的旁侧序列及定性pcr检测方法

Info

Publication number: CN101824411B
Application number: CN2010101588582A
Authority: CN
Inventors: 王渭霞
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2010-04-29
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2030-04-29
Also published as: CN101824411A

Abstract

本发明提供了转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列包括载体RB侧旁侧序列和载体LB侧序列，所述RB侧旁侧序列为SEQID No.1所示的序列，所述LB侧旁侧序列为SEQ ID No.2所示的序列。本发明提供了科丰6号其他两个拷贝的旁侧序列以及建立在这两个拷贝旁侧序列基础上的转化事件特异性检测方法，为转基因那水稻科丰6号的分子特征提供了重要的资料。

Description

转基因水稻科丰6号的旁侧序列及定性PCR检测方法

(一)技术领域

本发明涉及转基因水稻科丰6号的旁侧序列，以及转基因水稻科丰6号的定性PCR检测方法。

(二)背景技术

水稻(Oryza sativa)是一种主要的粮食作物，也是较早成功应用转基因技术进行遗传改良的作物。目前已经培育出了包含不同性状的转基因水稻品种。我国目前尚未批准转基因水稻的商品化生产，但有一些品种(品系)已获准环境释放和生产性实验。对转基因作物的有效监管是安全利用转基因作物的前提和保障。而转基因植物外源插入片段的旁侧序列是转基因植物品系最重要的分子特征之一，因此，依据外源插入片段的旁侧序列是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。

自2000年Zimmermann等利用反向PCR技术破译了转基因玉米Bt11的侧翼序列、建立了Bt11的品系特异性检测技术体系以来，目前已有多个作物转基因转化体都建立了相应的检测方法。在对现有专利和文献的分析基础上，发现已有一个关于转基因水稻科丰6号的外源插入片段的旁侧序列的专利(专利号200710063780.4)，由于在科丰6号中外源基因是多拷贝插入，而该专利涉及的仅是其中1个拷贝的旁侧序列。

(三)发明内容

针对科丰6号为多拷贝插入，本发明提供了另外两个拷贝的外源插入序列的旁侧序列，并在此基础上提供该品系外源两个拷贝的转化事件特异性检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列为载体RB侧序列，所述旁侧序列为SEQ ID No.1所示的序列。

一种转基因水稻科丰6号的旁侧序列，所述旁侧序列为载体LB侧序列，所述旁侧序列为SEQ ID No.2所示的序列。

所述RB侧旁侧序列可通过HiTail-PCR扩增得到。HiTail-PCR所用特异性嵌套引物依据nos终止子(NCBI数据库中登录号DQ005463)的序列设计。其中N1-1位于NOS序列的11-36，序列为TCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTT；N_1-2位于29-54，序列为AGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGC；N_1-3位于204-223，序列为AGCGCGCAAACTAGGATAAA

所述LB侧旁侧序列可通过HiTail-PCR扩增得到。HiTail-PCR所用特异性嵌套引物依据hyg抗性基因(NCBI数据库中登录号AB303069.1)的序列设计。其中Hpt_1-1位于427-404，序列为CGTACACAAATCGCCCGCAGAAGC；Hpt_1-2位于398-375，序列为CCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAG；Hpt_1-3位于358-338，序列为GGAAACCGACGCCCCAGCACT。

本发明还涉及转基因水稻科丰6号转化事件特异性定性PCR检测方法，所述方法是根据SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的序列设计特异性引物，对待测样品DNA进行扩增，若扩增获得目的片段(目的片段大小由引物决定)，则待测样品为转基因水稻科丰6号；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是转基因水稻科丰6号。通常待测样品为单一水稻品种，按照上述方法可直接得出结论；若待测样品为混合物，则可按照上述方法判断混合物中是否含有转基因水稻科丰6号。

具体的，所述特异性引物如下：

KF6-1-F：5’-CGACAAAAGATCAGGATTTGGG-3’

KF6-1-R：5’-GTTTGGAGTTTAAGAGCGA-3’

上述引物对中一条引物为依据SEQ ID NO.1中169～189位设计为正向引物，另一条引物依据450～468位设计为反向引物。利用该引物进行扩增，其目的片段为303bp。

或者，所述特异性引物如下：

KF6-2-F：5’-GATCCCGAAGGCCAACACAATAGG-3’，

KF6-2-R：5’-TCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAG-3’

上述引物对中一条引物为依据SEQ ID NO.2中134～157位设计为正向引物，另一条引物依据684～707位设计为反向引物。利用该引物进行扩增，其目的片段为450bp。

依赖于外源插入片段的旁侧序列的转基因水稻科丰6号的事件特异性定性PCR检测方法，可依据RB侧旁侧序列检测其中1个插入在6号水稻染色体位置，也可依据LB侧旁侧序列检测另外一个插入拷贝。上述两对引物可单独用于转基因水稻科丰6号的定性PCR检测，也可组合同时用于转基因水稻科丰6号的定性PCR检测使结果更加准确。进一步，所述方法同时以特异性引物KF6-1-F和KF6-1-R或KF6-2-F和KF6-2-R分别对待测样品DNA进行PCR扩增，如果扩增获得303bp和450bp的目的片段，则待测样品为转基因水稻科丰6号；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是转基因水稻科丰6号。

转基因水稻科丰6号所用载体的T-DNA区域结构见图1，由hpt抗性基因表达盒、CrylAc基因表达盒和CpTI基因表达盒组成。本发明采用常规方法提取植物基因组DNA，利用HiTAIL-PCR方法，分离得到RB侧旁侧序列507bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示通过分析发现SEQID NO.1中1-167与双元载体pUB-Hyg DNANCBI登录号AB303069.1的3926-4092完全相同。Filler DNA为转基因过程中修复序列与SEQ IDNO.1中168～189完全相同。水稻基因组DNA，位于水稻6号染色体NCBI(登录号AP004749.1)的95684～95962，与SEQ ID NO.1的190～507完全匹配。分离得到的LB侧旁侧序列607bp，其核苷酸序列如SEQNO.2所示。通过分析发现其1～283与水稻第9染色体(登录号AP009051.1)的8984～8701匹配。284～288为Filler DNA。289-607与双元载体pUB-HygDNANCBI登录号AB303069.1的41～358完全相同。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了科丰6号其他两个拷贝的旁侧序列以及建立在这两个拷贝旁侧序列基础上的转化事件特异性检测方法，为转基因那水稻科丰6号的分子特征提供了重要的资料。

(四)附图说明

图1为转基因水稻科丰6号所用载体的T-DNA区域结构图；

图2为引物KF6-1-F和KF6-1-R扩增电泳图；其中，Y6，Y7，Y8，Y9，Y10依次表示转基因水稻品系科丰6号、II优科丰6号、华恢1号、Bt63、克螟稻；YS6、YS7、YS8、YS9、YS10分别表示非转基因对照品种明恢86、II优明86、籼优63、明恢63、籼优10号；BLK：提取物空白对照；water：PCR扩增试剂对照；M：100bp DNAladder；

图3为引物KF6-2-F和KF6-2-R扩增电泳图；其中，1～10分别表示转基因大豆GTS40-3-2、转基因玉米MON863、BT11、BT176、MON810、转基因油菜GT73、转基因棉花MON531、转基因水稻华恢1号、Bt63、克螟稻；11～20分别为非转基因水稻对照品种明恢86(11、12)、II优明86(13、14)、籼优63(15、16)、明恢63(17、18)、籼优10号(19、20)各自重复2次；21：提取物空白对照；22：PCR扩增试剂对照；23：转基因水稻科丰6号；M：100bp DNAladder。

图4引物KF6-1-F和KF6-1-R对科丰6号不同含量的混合样品的扩增电泳图；其中，Y6：科丰6号；YS6：明恢86；BLK：提取物空白对照；water：PCR空白水对照；10％～0.05％示含不同含量的科丰6号混合样品；M：100bp DNA ladder。

图5引物KF6-2-F和KF6-2-R对科丰6号不同含量的混合样品的扩增电泳图；其中，100％～0.01％示含不同含量的科丰6号混合样品；ck-为非转基因对照明恢86；BLK：提取物空白对照；Y7为科丰6号衍生品种II优科丰6号，YS7为II优明86。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：转基因水稻品系科丰6号外源插入载体的旁侧序列克隆

一.实验材料

1、植物材料：转基因水稻科丰6号及其受体对照品种明恢86，由福建农科院提供；

2、试剂：Taq DNA聚合酶、10×PCR Buffer(100mM Tris-HCl pH8.3，500mMKCl，15mM MgCl₂)、dNTP购自宝生物工程大连有限公司；100bp ladder DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司。PCR产物纯化试剂盒(Cat.NO.SK1141)和PCR产物克隆试剂盒(Cat.NO.SK2213)购自上海生工生物工程有限公司。引物合成和克隆测序由Invitrogen公司完成。其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3、实验仪器：PCR扩增仪：PTC-200(Bio-Rad生产)

生物型分光光度计6131(Eppendorf生产)

核酸电泳仪：DYY-III型核酸电泳仪(北京六一仪器厂)

凝胶成像仪：Gel Doc XR(Bio-Rad生产)

其他仪器包括：离心机、电子天平、培养箱、超净工作台、金属恒温浴等。

二.实验方法和过程

1、水稻基因组DNA的提取与检测

1.1.1、抽提液配制(100mL)：在60mL水中加入6.93g葡萄糖，2g聚乙烯吡咯烷酮，100mg DIECA，充分溶解，然后加入1mol/LTris-HCl(pH7.5)10mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)1mL，加水定容至100mL，高压灭菌。使用前加入0.2％(V/V)(200μL)的β-巯基乙醇。

1.1.2、裂解液配制(100ml)：在60mL水中加入8.17g氯化钠，2g十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2g聚乙烯吡咯烷酮(K30)(PVP)，100mg DIECA，充分溶解，然后加入1mol/L Tris-HCl(pH7.5)10mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)0.4mL，加水定容至100mL，高压灭菌后4℃。使用时加入0.2％(V/V)的β-巯基乙醇。

1.1.3、提取方法：取水稻叶片或稻粉约200mg在液氮中磨成粉末。加入1mL预冷至4℃的水稻DNA抽提液，颠倒混匀后，在冰上静置5min，4℃条件下10000g离心15min，弃上清液。加入600μL预热到65℃的裂解液，充分重悬沉淀。在65℃恒温保持60min。加入2μLRNase A37℃保温30min后，用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇混合溶液(25∶24∶1)和氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液分别抽提两次。室温条件下，10000g离心10min。上清加入2/3体积异丙醇，1/10体积3mol/L乙酸钠溶液(pH 5.6)。在4℃条件下，10000g离心15min，用70％乙醇洗涤沉淀一次，倒出乙醇，晾干沉淀。加入50μL TE(pH8.0)溶解沉淀。

1.1.4、DNA的检测：取2.0μL DNA用0.8％的琼脂糖胶电泳检测其完整性，并用生物型分光光度计测定DNA浓度，并将其用TE稀释到浓度为100ng/μL。

2、旁侧序列的获得

2.1旁侧序列的扩增：利用HiTail-PCR参照Liu等方法进行，第一、二轮反应体积25uL，第三轮反应体积50uL。反应体系为1×PCR buffer，2.0mmol/L MgCl₂，200umol/L dNTP，第一轮扩增：25μL反应体系中简并引物用LAD1-1、LAD1-2、LAD1-3、LAD1-4或LAD1-5等1.0μmol/L，嵌套特异引物N_1-1或Hpt_1-1 0.3μmol/L，0.5U Taq酶，模板DNA1.0μL；第2轮扩增：25μL反应体系中引物AC₁ 0.3μmol/L，N_1-2或Hpt_1-2 0.3μmol/L，0.625U Taq酶，第一轮扩增产物稀释50倍后取1.0μL作为模板；第3轮扩增：50μL反应体系中引物AC₁0.3μmol/L，N_1-3或Hpt_1-3 0.3μmol/L，1.0U Taq酶，第2轮扩增产物稀释10倍后取1.0μL作为模板。扩增产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳并观察成像。所用引物序列见表1，扩增程序见表2。

表1：HiTAIL-PCR所用引物

表2：HiTAIL-PCR扩增程序

2.2旁侧序列的克隆和测序：利用上海生工生物工程有限公司的PCR产物纯化试剂盒(Cat.NO.SK1141)和PCR产物克隆试剂盒(Cat.NO.SK2213)进行PCR产物纯化和克隆。至pUCm-T载体后由上海生工生物工程有限测序。序列比较分析运用NCBI网站的blast软件进行。

3、结果

3.1依据nos终止子序列设计3个嵌套的特异引物，只有用简并引物LAD1-4时在第2和3轮中均仅在转基因水稻科丰6号中扩增出一条带，对其第3轮扩增产物进行回收、克隆和测序。测序结果见SEQ IDNO.1。序列分析发现T-DNA插入位置为水稻基因组中第6号染色体，T-DNA断裂位置在RB序列(tgacaggatatattggcgggtaaa)内侧第4个碱基处，在T-DNA序列与水稻基因组序列之间多出22bp的序列。

3.2依据hpt基因设计3个嵌套特异引物，只有用简并引物LAD1-4时在第2和3轮中均扩增出一条带，对其第3轮扩增产物进行回收、克隆和测序。测序结果SEQ ID NO.2。序列分析发现T-DNA插入位置为水稻基因组中第9号染色体，T-DNA断裂位置在LB序列(tggcaggatatattgtggtg taaaca)内侧第14个碱基处，在T-DNA序列与水稻基因组序列之间多出5bp的序列。

实施例2：基于转基因水稻品系科丰6号两个外源插入旁侧序列的品系特异性定性PCR检测

一、实验材料：转基因水稻品系科丰6号，及其衍生品种II优科丰6号，由福建农科院提供；其他转基因水稻华恢1号和Bt63由华中农业大学提供、克螟稻由浙江大学提供；非转基因水稻对照明恢86和II优明86由福建农科院提供，籼优63由华中农业大学提供，籼优10号由浙江大学提供。实验所用酶和试剂等同实施例1。

二、实验过程和方法：

1、DNA的提取和检测：同实施例1。

2、基于两个不同插入位点的特异性检测：根据实施例1中测定的两个序列，分别在水稻基因组部分和载体部分设计两对PCR引物，引物序列见表4。

表4：科丰6号两个不同插入位点的特异性检测用引物

PCR反应体系为：1×PCR buffer、200umol/L dNTP、0.2umol/L特异引物、0.025U/uLTaq酶。反应程序为95℃，5min；94℃30s、59℃45s、72℃45s 35个循环；72℃延伸3min。利用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。

3、结果

引物KF6-1-F和KF6-1-R仅在科丰6号及其衍生品种II优科丰6号中得到303bp扩增产物，而在其他转基因水稻品系和对照品种中均未得到扩增，见图2。引物KF6-2-F和KF6-2-R在转基因水稻科丰6号中得到450bp的扩增带，而在其对照非转基因水稻品种和其他转基因植物(包括大豆、玉米)中均未得到扩增(图3)。

实施例3：品系特异性检测的灵敏性检测

一、实验材料：转基因水稻品系科丰6号和对照受体品种明恢86。实验所用酶和试剂等同实施例1。

二、实验过程和方法：

1、DNA的提取和检测，将科丰6号及其非转基因对照受体明恢86的种子磨成粉后，制备系列混合样品，各样品所含科丰6号依次为10％、5.0％、2.5％、1.25％、0.5％、0.1％、0.05％和0.01％(W/W)，混匀后提取DNA方法同实施例1。

2、基于两个不同插入位点的灵敏性检测：所用引物见表4，PCR反应体系为1×PCR buffer、200umol/L dNTP、0.2umol/L特异引物、0.025U/uLTaq酶。反应程序为95℃，5min；94℃30s、59℃45s、72℃45s 35个循环；72℃延伸3min。利用2.0％的琼脂糖凝胶电泳进行产物分析。

3、结果

引物KF6-1-F、KF6-1-R和KF6-2-F、KF6-2-R能够在转基因水稻科丰6号含量为0.1～0.05％的混合样品中扩增到预期大小的目标产物(见图4、5)。

Claims

1.转基因水稻科丰6号的旁侧序列的定性PCR检测方法，所述方法是以特异性引物KF6-1-F和KF6-1-R对待测样品DNA进行扩增，若扩增获得目的片段，则待测样品为转基因水稻科丰6号；若扩增未获得目的片段，则待测样品不是转基因水稻科丰6号；

所述特异性引物为：

KF6-1-F：5’-CGACAAAAGATCAGGATTTGGG-3’

KF6-1-R：5’-GTTTGGAGTTTAAGAGCGA-3’

目的片段为303bp。