CN103436612A

CN103436612A - 一种常见鲟鱼类的pcr-rflp快速检测方法

Info

Publication number: CN103436612A
Application number: CN2013103644839A
Authority: CN
Inventors: 徐鹏; 刘晓勇; 刘园园; 孙效文
Original assignee: 徐鹏
Priority date: 2013-08-20
Filing date: 2013-08-20
Publication date: 2013-12-11

Abstract

本发明涉及分子生物学和分类学领域，本发明公开了一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法以及用于所述快速检测方法的引物对和试剂盒，所述常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法包括以下步骤：步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；步骤二，以所述基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应获得PCR产物；步骤三，用限制性内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；步骤四，将所述PCR产物和所述酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳图进行物种鉴定。本发明方法操作简单，在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的进行常见鲟鱼类鱼种的鉴别，增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大提高了工作效率。

Description

一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学和分类学领域，特别涉及一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法。

背景技术

鲟鱼（sturgeon）隶属于硬骨鱼纲（Osteichthyes）、辐鳍亚纲（Actinopterygii）、硬鳞总目（Ganoidomorpha）、鲟形目（Acipenseriformes），现在全世界共有2科6属27种。我国境内有2科3属8种,分别为施氏鲟（Acipenser schrenckii）、达氏鳇（Huso dauricus）、中华鲟（Acipenser sinensis）、达氏鳇（Acipenserdabryanus）、白鲟（Psephurus gladius）、西伯利亚鲟（Acipenser baerii）、小体鲟（Acipenser ruthenus）、裸腹鲟（Acipenser nudiventris），鲟鱼是一类古老的软骨硬鳞鱼，有“活化石”之称。这些古老的鲟鱼类均处于不同程度的濒危状态，甚至有的有灭绝的危险。鲟鱼卵营养丰富，以其卵加工制成的鲟鱼籽酱，价格昂贵，是国际公认的奢侈食材，被比作“黑色黄金”。

目前国际上进行鲟鱼种类鉴定主要采用的方法包括形态学、生物化学和遗传学等方法。Congiu等使用AFLP分子标记方法进行了鲟鱼及鱼籽酱产品的鉴别应用，Chelomina等使用RAPD分子标记进行施氏鲟自然种群中杂交种鉴别分析。以线粒体为材料来研究鲟鱼类进化关系的研究报道相对也较多。主要集中在线粒体D-loop序列部分、细胞色素B、12s rRNA、16s rRNA等基因。对线粒体DNA控制区的研究发现，多个种的鲟鱼线粒体DNA均存在异质现象。近年来国内外常用线粒体DNA控制区序列以及微卫星DNA标记开展鲟鱼的分子鉴定。这些技术手段尽管能够不同程度的对鲟鱼和鲟鱼产品进行相对精确的鉴定，但是，也存在技术操作繁琐、鉴定时间长、设备昂贵等缺点，且对操作人员技术要求较高。

鉴于此，亟须开发出能够快速、准确检测出常见鲟鱼的分子检测技术，用于市场监管、种质鉴定等用途。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法。本发明运用了较少的试剂以及方便快捷容易操作的实验过程，可以在较短时间内，在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的将小体鲟和达氏鳇从所述常见鲟鱼类中区分出来。

一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，包括：

引物对；

PCR常规试剂：Taq DNA聚合酶、10×buffer PCR缓冲液、MgCl₂和dNTPs；

以及酶切试剂：10×buffer酶切缓冲液、100×BSA、限制性内切酶Avall和限制性内切酶Eag1-HF。

优选的是，所述引物对为：

上游引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

下游引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列。

一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，使用权利要求2所述试剂盒用于常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；

步骤二，将所述基因组DNA使用所述试剂盒包含的试剂和所述引物对配制成PCR体系，配制成的PCR体系放入PCR扩增仪中将进行PCR扩增，反应完成之后，将PCR产物放入4℃保存备用；

步骤三，用限制性内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；

步骤四，将所述PCR产物和所述酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳，根据电泳图进行物种鉴定。

优选的是，所述PCR扩增反应的反应体系为15μl：即为在200μl PCR反应管中加入0.1μl浓度为2,500units/mL的Taq DNA聚合酶，1.5μl10×bufferPCR缓冲液，1.5μl25mM MgCl₂，1.2μl浓度为10pm/μl的dNTPs，2μl所述基因组DNA，0.5μl浓度为10pm/μl的所述上游引物，0.5μl浓度为10pm/μl的所述下游引物和7.7μl无菌水。

优选的是，所述PCR扩增反应的反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，从预热、退火到延伸共反应35个循环，然后72℃延伸10min。

优选的是，反应体系一为在200μl PCR反应管中加入1μg所述PCR产物，2μl10×buffer酶切缓冲液，0.2μl100×BSA和0.5μl限制性内切酶Avall，加无菌水至20μl，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应1h，65℃热失活20min；

反应体系二为在200μl PCR反应管中加入1μg所述PCR产物，2μl10×buffer酶切缓冲液，0.2μl100×BSA和0.5μl限制性内切酶Eag1-HF，加无菌水至20μl，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应15min，65℃热失活20min。

优选的是，所述常见鲟鱼种类为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟。

优选的是，区分小体鲟或达氏鳇与中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟中任一种。

优选的是，采用所述Avall限制性内切酶进行所述酶切反应后可将小体鲟和达氏鳇从所述常见鲟鱼类中区分出来，再采用所述Eag1-HF限制性内切酶进行所述酶切反应可将小体鲟与达氏鳇区分开。

优选的是，所述限制性内切酶Avall的酶切位点为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟所述PCR产物中多核苷酸序列5`的第196和197个碱基之间的磷酸二酯键，小体鲟和达氏鳇没有所述酶切位点；在区分小体鲟和达氏鳇的基础上，所述的限制性内切酶Eag1-HF酶切位点为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟、俄罗斯鲟和达氏鳇所述PCR产物中多核苷酸序列5`的第522和523个碱基之间的磷酸二酯键，小体鲟没有所述酶切位点；中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟所述PCR产物中扩增多核苷酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQ ID No.10所示序列。

本发明的有益效果是本发明方法根据小体鲟或达氏鳇与中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟线粒体DNA之间存在的位点差异，通过PCR扩增技术和酶切的检测方法对小体鲟或达氏鳇与中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟进行鉴别。本发明方法只需提取待检测样本的基因组DNA，所述引物对即可特异性的结合线粒体DNA进行扩增反应。本发明运用了较少的试剂以及方便快捷容易操作的实验过程，可以在较短时间内，在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的鉴别出鱼种。本发明有利于实际生产部门，科研部门快速鉴定所取样本，增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大提高了工作效率。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。

术语“PCR”意指聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方．聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

术语“PCR-RFLP检测方法”意指聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性检测方法，是一种采用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱（restriction map）分析此段序列的特异酶切位点，藉由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。

术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物（通常为DNA引物）。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3`端的复制起始点的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA模板5`端的复制起始点的引物。

术语“琼脂糖凝胶电泳”意指一种用琼脂或琼脂糖作支持介质的电泳方法。借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，多核苷酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离，是基因操作中常用的重要方法。

术语“限制性内切酶”意指一类在生物体内存有的酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。本发明中所述限制性内切酶为Avall和限制性内切酶Eag1-HF。

术语“DNA聚合酶”意指一类在细胞复制DNA的过程中起重要作用的酶，以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相辅的活性。本发明中所述TaqDNA聚合酶可用长链Taq DNA聚合酶，在长链DNA的合成中效果更好。

术语“缓冲液”意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化作用的溶液。

附图说明

图1为本发明所述中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟的所述PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为本发明所述中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟的所述限制性内切酶Avall酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明所述中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟的所述限制性内切酶Eag1-HF酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：

提取待检测样品的基因组DNA，推荐采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA：

a)分别剪取已知中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟约0.5g鳍条，剪碎，分别放入1.5mL离心管中并编号为1～8；

b)加入0.45mL三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)混匀，再加入50μl质量浓度为10%的十二烷基磺酸钠(SDS)，5.0μl浓度为20mg/mL蛋白酶K，充分混匀后，于56℃保温4-6h，每2h摇1次。

c)保温4-6h后，将步骤b)中含混合液的1.5mL离心管放置到室温，加入等体积饱和酚(500μl)，颠倒混匀，12000rpm，离心10min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5mL离心管中。

d)将步骤c)分离出的水相的1.5mL离心管中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm，离心10min，取上层清液转移到新的1.5mL离心管中。

e)将步骤d)中最终得到的上清液的1.5mL离心管中加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀，12000rpm，离心10min，取上层清液到一个新的1.5mL离心管中。

f)将步骤e)中最终得到的上清液的1.5mL离心管中加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇沉淀基因组DNA，观察到1.5mL离心管中上清液逐渐产生浑浊。

g)12000rpm，离心10min，基因组DNA析出，附着在离心管底部，去除乙醇。

h)-20℃保存的75%乙醇洗涤，12000rpm，离心5min，去除乙醇，55℃干燥基因组DNA。

i)加入20μl无菌水溶解基因组DNA，-20℃保存备用。

实施例2：

常见鲟鱼种类的快速检测

使用本发明方法及所述试剂盒进行常见鲟鱼种类的快速检测，包括以下具体步骤：

步骤一，将实施例1中提取的上述基因组DNA使用SEQ ID No.1和SEQID No.2所示引物对和所述试剂盒包含的试剂配制成PCR体系，即为在200μlPCR反应管中加入所述PCR扩增反应反应体系为15μl：加入0.1μl浓度为2,500units/mL的Taq DNA聚合酶，1.5μl10×PCR缓冲液，1.5μl浓度为10pm/μl的dNTPs，1.2μl25mM MgCl₂，2μl所述基因组DNA，0.5μl浓度为10pm/μl的所述上游引物，0.5μl浓度为10pm/μl的所述下游引物和7.7μl无菌水。

将上述PCR体系装于200μl PCR管中，将装有PCR体系的PCR管放入PCR扩增仪中进行PCR扩增，所述PCR扩增反应反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，从变性、退火到延伸共35个循环，72℃延伸10min，反应完成之后，将PCR产物放入4℃保存备用；

步骤二，取200μl PCR反应管中加入1μg所述PCR产物，2μl10×buffer酶切缓冲液，0.2μl100×BSA和0.5μl限制性内切酶Avall，加无菌水至20μl，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应1h，65℃热失活20min；其中10×酶切缓冲液PH值为7.5，成分为100pm/μl Tris-HCl，50pm/μl NaCl，10pm/μlMgCl₂，0.025%

步骤三，将步骤一中所述PCR产物和步骤二中所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为3.0～3.5％，电泳结束后，用凝胶成像仪摄像采集电泳图(如图1和图2所示)，图中M为标识物，标识物中包含2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp大小的多核苷酸序列，在琼脂糖凝胶电泳图中2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp从上到下排列，从电泳图1可得出1～8号样本都获得了扩增的目的DNA的片段，大小为666bp；电泳图2中编号1′～3′和6′～8′号各自获得一条电泳条带，大小仍为666bp，编号4′和5′号获得两条条带，大小分别为196bp和470bp；

步骤四，分析检测结果，4′和5′号样本的条带位置没有发生变化，说明没有发生酶切，1′～3′和6′～8′号样本的条带位置和数量都发生了变化，说明发生了酶切反应。检测结果为1～3号和6～8号样本对应的是中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟，4和5号样本对应的是小体鲟和达氏鳇。

步骤五，重复步骤二和步骤三，其中所述酶切反应体系为在200μl PCR反应管中加入1μg所述PCR产物，2μl10×buffer酶切缓冲液，0.2μl100×BSA和0.5μl限制性内切酶Eag1-HF，加无菌水至20μl，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应15min，65℃热失活20min。

分析检测结果，如图3所示，4′′号样本的条带位置没有发生变化，说明没有发生酶切，1′′～3′′和5′′～8′′号样本的条带位置和数量都发生了变化，说明发生了酶切反应，酶切条带为522bp和144bp。检测结果为4号样本对应的是小体鲟，5号样本对应的是达氏鳇。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，包括：

引物对；

2.如权利要求1所述常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测用试剂盒，其特征在于，所述引物对为：

上游引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

下游引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列。

3.一种常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，使用权利要求2所述试剂盒用于常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，包括以下步骤：

步骤一，提取待检测样品的基因组DNA作为模板；

步骤三，用限制性内切酶酶切所述PCR产物，获得酶切产物；

4.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应体系为15μl：即为在200μlPCR反应管中加入0.1μl浓度为2,500units/mL的Taq DNA聚合酶，1.5μl10×buffer PCR缓冲液，1.5μl 25mMMgCl₂，1.2μl浓度为10pm/μl的dNTPs，2μl所述基因组DNA，0.5μl浓度为10pm/μl的所述上游引物，0.5μl浓度为10pm/μl的所述下游引物和7.7μl无菌水。

5.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述PCR扩增反应的反应条件为94℃预变性5min，然后94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸45s，从预热、退火到延伸共反应35个循环，然后72℃延伸10min。

6.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述酶切反应的反应体系为20μl：

反应体系一为在200μlPCR反应管中加入1μg所述PCR产物，2μl10×buffer酶切缓冲液，0.2μl100×BSA和0.5μl限制性内切酶Avall，加无菌水至20μl，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应1h，65℃热失活20min；

反应体系二为在200μlPCR反应管中加入1μg所述PCR产物，2μl10×buffer酶切缓冲液，0.2μl100×BSA和0.5μl限制性内切酶Eag1-HF，加无菌水至20μl，然后将所述酶切反应体系在37℃温育反应15min，65℃热失活20min。

7.如权利要求3所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述常见鲟鱼种类为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟。

8.如权利要求7所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法可用于区分小体鲟或达氏鳇与中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟中任一种。

9.如权利要求8所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，采用所述限制性内切酶Avall进行所述酶切反应后可将小体鲟和达氏鳇从所述常见鲟鱼类中区分出来，再采用所述限制性内切酶Eag1-HF进行所述酶切反应可将小体鲟与达氏鳇区分开。

10.如权利要求9所述的常见鲟鱼类的PCR-RFLP快速检测方法，其特征在于，所述限制性内切酶Avall的酶切位点为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟或俄罗斯鲟所述PCR产物中多核苷酸序列5`的第196和197个碱基之间的磷酸二酯键，小体鲟和达氏鳇没有所述酶切位点；在区分小体鲟和达氏鳇的基础上，所述的限制性内切酶Eag1-HF酶切位点为中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、欧煌、闪光鲟、俄罗斯鲟和达氏鳇所述PCR产物中多核苷酸序列5`的第522和523个碱基之间的磷酸二酯键，小体鲟没有所述酶切位点；中华鲟、施氏鲟、西伯利亚鲟、小体鲟、达氏鳇、欧煌、闪光鲟和俄罗斯鲟所述PCR产物中扩增多核苷酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9和SEQID No.10所示序列。