CN103290131B - 一种区分乌鳢和斑鳢的引物对、试剂盒以及pcr-rflp检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种区分乌鳢和斑鳢的引物对、试剂盒以及PCR-RFLP检测方法，包括：引物对，上游引物，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；下游引物，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列。含有所述引物对的试剂盒还包括，PCR常规试剂，TaqDNA聚合酶，10×PCR缓冲液，dNTPs；酶切试剂，10×buffer，酶切缓冲液，EcoRI限制性内切酶以及使用所述引物对、所述试剂盒用于区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法。本发明方法操作简单，在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的进行鱼种的鉴别，增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大提高了工作效率。

Description

一种区分乌鳢和斑鳢的引物对、试剂盒以及PCR-RFLP检测方法

技术领域

本发明涉及分子学和分类学领域，特别涉及一种区分乌鳢和斑鳢的引物对、试剂盒以及PCR-RFLP检测方法。

背景技术

乌鳢(Channa argus)，鲈形目(Perciformes)鳢科(Channidae)鳢属(Channa)鱼类，俗称黑鱼，又名北方蛇头鱼、黑鱼、乌鱼、乌棒、蛇头鱼、文鱼和才鱼，是我国特有的名特优淡水鱼类，除高原地区外，在我国广泛分布。乌鳢肉质细嫩，口味鲜美，且营养价值颇高，在国内市场广受欢迎，目前在我国被广泛养殖，具有较高的经济价值。

斑鳢(Channa maculata)与乌鳢同属于鳢科鳢属，从形态学方面与乌鳢类似，从形态学鉴定有时并不一定准确，存在很强的主观因素，尤其是在苗种期或者食品加工处理后的区分和鉴定比较困难。由于消费习惯、养殖环境、营养价值和养殖成本等原因，乌鳢和斑鳢的市场价值具有较大差异。近年，通过杂交育种技术，以斑鳢作为母本、乌鳢作为父本培育出了杂交鳢品种斑乌鳢，市场价格相对较低，每年大量涌入北方市场，极大冲击了乌鳢的传统市场。很多商贩将斑乌鳢冒充乌鳢进行销售，欺骗消费者，且给管理部门带来了监管困难。

鉴于此，亟须开发出能够快速鉴定出乌鳢和斑鳢的分子检测技术，用于市场监管、种质鉴定等用途。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种区分乌鳢和斑鳢的引物对。本发明的另一目的在于提供一种区分乌鳢和斑鳢的试剂盒。本发明的目的之三是提供采用所述试剂盒进行区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，所述PCR-RFLP检测方法根据乌鳢和斑鳢线粒体DNA的不同，通过PCR扩增技术和PCR-RFLP的检测方法对乌鳢和斑鳢进行鉴别。本发明运用了较少的试剂以及方便快捷容易操作的实验过程，可以在较短时问内，在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的鉴别乌鳢和斑鳢。

为实现上述目的，本发明公开了一种区分乌鳢和斑鳢的引物对，其特征在于，包括，引物对，

上游引物，其为SEQ ID No．1所示的多核苷酸序列；

下游引物，其为SEQ ID No．2所示的多核苷酸序列。

一种区分乌鳢和斑鳢的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对的试剂盒，所述试剂盒还包括，

PCR常规试剂，Taq DNA聚合酶，10xPCR缓冲液，dNTPs；

酶切试剂，lO×酶切缓冲液，EcoRI限制性内切酶。

一种区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述引物对、权利要求2所述试剂盒用于区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，所述PCR-RFLP检测方法包括以下步骤：

步骤一，提取检测样品的基因组DNA作为模板；

步骤二，将所述基因组DNA使用所述引物对和所述试剂盒包含的试剂配制成PCR体系，配制成的PCR体系放入PCR扩增仪中将进行PCR扩增，反应完成之后，将PCR产物放入4℃保存备用；

步骤三，将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采集电泳图；

步骤四，将所述PCR产物进行酶切反应，获得酶切产物；

步骤五，将所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，采集电泳图；

步骤六，将所述PCR产物电泳图和所述酶切产物电泳图进行比较，获得检测结果。

优选的是，所述PCR体系为20 μl：即为在200μl PCR反应管中加入0．5μl浓度为2,500 units／mL的Taq DNA聚合酶，2 μl 10xPCR缓冲液，3．2 μl浓度为10 pm／Ltl的dNTPs，1 μl所述基因组DNA，0．5μl浓度为10 pm／μl的所述上游引物，0．5μl浓度为10 pm／pi的所述下游引物，12．3 μl无菌水。

优选的是，所述PCR反应条件为

优选的是，所述酶切反应体系为20 μl：即为在200 μl PCR反应管中加入2 μ1所述PCR产物，2μl 10×酶切缓冲液，1 μl浓度为20,000 units／mL的EcoRI限制性内切酶，15μl无菌水，所述酶切反应体系在37℃反应1 h，获得酶切产物。

优选的是，扩增多核苷酸序列为乌鳢和斑鳢线粒体DNA上的一段多核苷酸序列，所述斑鳢扩增多核苷酸序列为SEQ ID No．3所示序列，所述乌鳢多核苷酸序列为SEQ ID No．4所示序列。

优选的是，所述步骤四所述酶切位点为距离所述斑鳢扩增多核苷酸序列5、的第3 19和第320个碱基之间的磷酸二酯键，所述乌鳢扩增多核苷酸序列5、的第3 19和第320个碱基之间的磷酸二酯键不会发生酶切。

优选的是，所述步骤六所述检测结果为，如果电泳条带数量没有发生改变，即说明没有发生酶切，则样本取自乌鳢，如果电泳条带数量由一条变为两条，则说明发生了酶切，样本取自斑鳢。

斑鳢发生所述酶切反应后进行琼脂糖凝胶电泳获得的两条电泳条带分别为含有871bp和3 19 bp的两种DNA分子，这两种DNA分子为所述PCR产物中含有1190 bp的DNA分子发生酶切反应后获得。

本发明的有益效果是本发明提供的一种区分乌鳢和斑鳢的引物对、试剂盒和PCR-RFLP检测方法，该方法根据乌鳢和斑鳢线粒体DNA的不同，通过PCR扩增技术和PCR-RFLP酶切的检测方法对乌鳢和斑鳢进行鉴别。由于动物体内线粒体DNA遵循严格的母系遗传，所以斑乌鳢和斑鳢具有相同的线粒体DNA，故本发明方法同样能用于鉴别乌鳢和斑乌鳢。本发明方法只需提取检测样本的基因组DNA，所述引物对即可特异性的结合线粒体DNA进行扩增反应。本发明运用了较少的试剂以及方便快捷容易操作的实验过程，可以在较短时间内，在不处死鱼种的基础上，只需剪取少量鳍条或肌肉，快速准确的鉴别出鱼种。本发明有利于实际生产部门，科研部门快速鉴定所取样本，增加了鉴定结果的准确性和可信度，极大提高了工作效率。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸(RNA)及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。

术语"PCR"意指聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR。聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA、RNA的地方．聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

术语“PCR-RFLP检测方法”意指聚合酶链式反应．限制性片段长度多态性检测方法，是一种采用聚合酶链式反应(PCR)扩增目的DNA片段，然后将待检测的DNA片段用限制性内切酶酶切，限制性内切酶识别并切割特异的序列，然后将酶切后的产物进行电泳，再由限制酶图谱(restriction map)分析此段序列的特异酶切位点，藉由片段的多样性来比对不同来源基因序列的差异性。

术语“引物”意指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，除非特定限制，否则所述术语涵盖自然中生物的DNA复制和聚合酶链式反应(PCR)中人工合成的引物(通常为DNA引物)。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。除非特定限制，否则上游引物为在DNA复制时，作为DNA模板3、端的复制起始点的引物，下游引物为在DNA复制时，作为DNA模板5、端的复制起始点的引物。

术语“琼脂糖凝胶电泳”意指一种用琼脂或琼脂糖作支持介质的电泳方法。借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，多核苷酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离，是基因操作中常用的重要方法。

术语“限制性内切酶”意指一类在生物体内存有的酶，它们能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。本发明中所述EcoRI限制性内切酶为大肠杆菌I型限制性内切酶，这类酶既能催化宿主DNA的甲基化，又能催化非甲基化的DNA的水解。

术语"DNA聚合酶”意指一类在细胞复制DNA的过程中起重要作用的酶，以DNA为复制模板，从将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成及其相辅的活性。本发明中所述TaqDNA聚合酶可用长链Taq DNA聚合酶，在长链DNA的合成中效果更好。

术语“缓冲液”意指一类当往某些溶液中加入一定量的酸和碱时，有阻碍溶液pH变化作用的溶液。本发明中所述10xPCR缓冲液的PH值为9，所述10×酶切缓冲液PH值为7．5。

附图说明

图1为本发明所述的区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法的示意图。

图2为本发明所述的区分乌鳢和斑鳢的所述PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明所述的区分乌鳢和斑鳢PCR-RFLP检测方法的所述酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1：

引物对合成，引物对多核苷酸序列为根据乌鳢和斑鳢线粒体DNA自行设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司利用合成仪的型号是MERMADE192E型DNA合成仪合成。

合成的引物为，上游引物为SEQ ID No．1所示的多核苷酸序列：5、CTAAGCCCTT TCCACAGAGG TTCA3、；下游引物为SEQ ID No．2所示的多核苷酸序列：5、GCCCAAAAG CTTGTGTTAG CTG3、。

实施例2：

如图l所示，使用本发明所述试剂盒进行区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，

步骤一，首先提取检测样品的基因组DNA作为模板，分别剪取已知乌鳢和斑鳢各10尾鱼的尾鳍一小部分，共20个样本分别放入1．5 mL离心管中并编号为1-20，1～lO号样本为乌鳢，11-20号样本为斑鳢，使用DNA提取试剂盒提取20个样本的基因组DNA，步骤如下：

a)剪取约0．5 g鳍条，放入1．5 mL离心管中，剪碎。

b)加入0．45 mL三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)混匀，再加入50 μl质量浓度为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)，5．Oμl浓度为20 mg／mL蛋白酶K，充分混匀后，于56。C保温4-6 h，每2 h摇1次。

c)保温4-6 h后，将步骤b)中含混合液的1．5 mL离心管放置到室温，加入等体积饱和酚(500μ1)，颠倒混匀，10000 r／min，离心10 min，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1．5 mL离心管中。

d)将步骤c)分离出的水相的1．5 mL离心管中加入等体积酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，10000 r／min，离心10 min，取上层清液转移到新的1．5 mL离心管中。

e)将步骤d)中最终得到的上清液的1．5 mL离心管中加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀，10000 r／min，离心10 min，取上层清液到一个新的1．5 mL离心管中。

f)将步骤e)中最终得到的上清液的1．5 mL离心管中加入2．5倍体积的．20。C预冷的无水乙醇沉淀基因组DNA，观察到1．5 mL离心管中上清液逐渐产生浑浊。

g)12000 r／min，离心10 min，基因组DNA析出，附着在离心管底部，去除乙醇。

h)．20。C保存的75％乙醇洗涤，10000 r／min，离心5 min，去除乙醇，55。C干燥基因组DNA。

i)加入20 μl无菌水溶解基因组DNA，．20。C保存备用。

步骤二，将提取的上述基因组DNA使用SEQ ID No．1和SEQ ID No．2所示引物对和所述试剂盒包含的试剂配制成PCR体系，即为在200μl PCR反应管中加入1μl浓度为2,500 units／mL的Taq DNA聚合酶，2μ110xPCR缓冲液，3．2μl浓度为10pm／gl的dNTPs，1μl所述基因组DNA，0．5μl浓度为10 pm／gl的所述上游引物，0．5μl浓度为10pm／gl的所述下游引物，11.8μl无菌水。其中，10xPCR缓冲液的PH值为9，成分为60pm／Ltl Tris-80₄，20pm／gl(NH₄)₂80₄，2pm／μl MgS0₄，3％Glycerol 0．06％CA-630，0．05％20，

将上述PCR体系装于200μl PCR管中，将装有PCR体系的PCR管放入PCR扩增仪中进行PCR扩增，反应条件为

反应完成之后，将PCR产物放入4℃保存备用；

步骤三，将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1．0％，电泳结束后，用凝胶成像仪摄像采集电泳图(如图2所示)，图中M为标识物，标识物中包含2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp大小的多核苷酸序列，在琼脂糖凝胶电泳图中2000bp、1000bp、750bp、500bp、200bp从上到下排列，从电泳图可得出l-20号样本都获得了扩增的目的DNA的片段，大小为1190 bp；

步骤四，取所述PCR产物2 μl放入200 μl PCR反应管中，再加入2μ110×酶切缓冲液，l μl浓度为20,000 units／mL的EcoRI限制性内切酶，15μl无菌水，配制成酶切反应体系，将所述酶切反应体系在37℃反应1 h，获得酶切产物。其中10×酶切缓冲液PH值为7．5，成分为100pm／μi Tris-HCl，50 pm／μlNaCl，10pm／μl MgCl₂，0．025％×-100。

步骤五，将所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1．0％，用凝胶成像仪摄像采集电泳图(如图3所示)，图中M为标识物，图中编号1’～10’各自获得一条电泳条带，大小仍为1190 bp，编号11'-20'获得两条条带，大小分另0为871 bp和319bp；

步骤六，将图2和图3进行比较，1～10号样本的条带位置没有发生变化，说明没有发生酶切，11-20号样本的条带位置和数量都发生了变化，说明发生了酶切反应。检测结果为1～10号样本对应的是乌鳢，11-20号样本对应的是斑鳢，通过酶切反应，将斑鳢所述PCR产物包含的DNA分子切成了两段DNA分子，大小分别为871bp和319bp。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一种区分乌鳢和斑鳢的引物对，其特征在于，

引物对的

上游引物序列，其为SEQ ID No.1所示的多核苷酸序列；

下游引物序列，其为SEQ ID No.2所示的多核苷酸序列。

2.一种区分乌鳢和斑鳢的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对的试剂盒，所述试剂盒还包括，

PCR常规试剂：Taq DNA聚合酶，10×PCR缓冲液，dNTPs；

酶切试剂：10×buffer酶切缓冲液，EcoRI限制性内切酶。

3.一种区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述引物对、权利要求2所述试剂盒用于区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，所述PCR-RFLP检测方法包括以下步骤：

步骤一，提取检测样品的基因组DNA作为模板；

步骤二，将所述基因组DNA使用所述引物对和所述试剂盒包含的试剂配制成PCR体系，配制成的PCR体系放入PCR扩增仪中将进行PCR扩增，反应完成之后，将PCR产物放入4℃保存备用；

步骤三，将所述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，采集电泳图；

步骤四，将所述PCR产物进行酶切反应，获得酶切产物；

步骤五，将所述酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，采集电泳图；

步骤六，将所述PCR产物电泳图和所述酶切产物电泳图进行比较，获得检测结果，所述步骤六所述检测结果为，如果电泳条带数量没有发生改变，即说明没有发生酶切，则样本取自乌鳢，如果电泳条带数量由一条变为两条，则说明发生了酶切，样本取自斑鳢。

4.如权利要求3所述的区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述PCR体系为20μl：即为在200μl PCR反应管中加入0.5μl浓度为2,500units/mL的Taq DNA聚合酶，2μl10×PCR缓冲液，3.2μl浓度为10pm/μl的dNTPs，1μl所述基因组DNA，0.5μl浓度为10pm/μl的所述上游引物，0.5μl浓度为10pm/μl的所述下游引物，12.3μl无菌水。

5.如权利要求3所述的区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为

6.如权利要求3所述的区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述酶切反应体系为20μl：即为在200μl PCR反应管中加入2μl所述PCR产物，2μl10×酶切缓冲液，1μl浓度为20,000units/mL的EcoRI限制性内切酶，无菌水15μl，所述酶切反应体系在37℃反应1h，获得酶切产物。

7.如权利要求3所述的区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，扩增多核苷酸序列为斑鳢和乌鳢线粒体DNA上的一段多核苷酸序列，所述斑鳢扩增多核苷酸序列为SEQ ID No.3所示序列，所述乌鳢多核苷酸序列为SEQ ID No.4所示序列。

8.如权利要求3所述的区分乌鳢和斑鳢的PCR-RFLP检测方法，其特征在于，所述步骤四所述酶切位点为距离所述斑鳢扩增多核苷酸序列5`的319和第320个碱基之间的磷酸二酯键，所述乌鳢扩增多核苷酸序列5`的第319和第320个碱基之间的磷酸二酯键不会发生酶切。