CN101429557B - 圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法 - Google Patents

Abstract

一种圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别检测方法，它的方法是鳍条DNA的提取、基因组DNA的AFLP分析、性别特异AFLP标记的筛选及其序列，以及遗传性别鉴定方法的建立。本发明建立了圆斑星鲽鳍条DNA提取方法和AFLP分析技术，筛选出分子量分别为533bp和218bp的2个雌性特异AFLP分子标记，获得了这2个AFLP标记的核苷酸序列，创建了圆斑星鲽遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明首次筛选到圆斑星鲽雌性特异AFLP分子标记，建立了圆斑星鲽遗传性别鉴定的分子标记技术。本发明方法具有先进、准确、可靠的特点，在圆斑星鲽性别控制和全雌苗种生产中具有重要应用价值，同时在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有广阔应用前景。

Description

圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法

技术领域：

本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定和性别控制技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。

背景技术：

我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，例如，罗非鱼雄性比雌性生长快约40％以上，而圆斑星鲽等海水鱼类，雌性个体比雄性个体生长快40％-100％，因此，开展这些鱼类遗传性别检测和性别控制的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。

圆斑星鲽(Verasper variegates)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海冷水性鱼类，我国北方沿海均有分布，以黄海、渤海为多。圆斑星鲽由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。尽管近2年来，圆斑星鲽人工育苗技术获得突破，年产圆斑星鲽苗种近百万尾，但是，研究表明圆斑星鲽雌性个体和雄性个体在生长速率上存在很大差别，其雌性个体比雄性个体大80-100％。由于雄性个体生长过慢，降低了圆斑星鲽的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了圆斑星鲽苗种的推广及养殖产业的形成，由于难以鉴定圆斑星鲽的遗传性别，严重影响了圆斑星鲽雌核发育和性别控制研究的进行。

有关鱼类性别相关分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；匈牙利农业生物技术中心的Kovacs等(2000)用RAPD扫描非洲鲶鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记，一个(CgaY1)大约2.6kb，另一个(CgaY2)458bp，这是首次从鲶鱼中找到性别特异的DNA标记。美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的DNA标记，找到10个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国Stirling大学的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(OniY425、OniY382、OniY227)和一个X染色体连锁(OniX420)的AFLP标记。而有关圆斑星鲽性别特异分子标记以及遗传性别鉴定的分子生物学技术，目前国内外均未见报道。

发明内容：

本发明的目的是为了筛选出圆斑星鲽性别特异分子标记，建立遗传性别鉴定的分子生物学方法，为圆斑星鲽性别控制和全雌育种研究提供分子标记和技术方法。

本发明其技术内容如下：一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列；二、圆斑星鲽遗传性别鉴定方法。

一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列，包括：1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法；2.圆斑星鲽性别特异分子标记的序列。

1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法；包括：1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取；2)、基因组DNA的AFLP分析；3)、性别特异分子标记的筛选：

1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取：

剪取重约10mg鳍条置于600μl裂解液中匀浆，加蛋白酶K和RNaseA，于55℃水浴消化至澄清。加入600μl的酚:氯仿:异戊醇混合物(25:24:1)抽提，充分混匀后离心(12000rpm，10min)；吸取上清液再次抽提、离心；最后，用1000μl的冰乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用。

所述的裂解液组成为10mM Tris-HCl，pH8.0；100mM EDTA，pH8.0；100mM NaCl；0.5％SDS；

所述的蛋白酶K终浓度为18-22mg/ml；

所述的RNaseA终浓度为95-105μg/ml；

所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.76-1.80。

2)、基因组DNA的AFLP分析：

基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤：第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。

所述的对DNA模板进行酶切，其方法是：先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶。

所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是：向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4 DNA连接酶，20℃孵育20小时。

所述的预扩增，其方法是：将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增。

所述的选择性扩增：其方法是：将预扩增产物稀释45倍，作为选择性扩增的模板。用荧光标记的EcoRI引物和MseI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基。向PCR扩增产物中加入适量的变性剂，于94℃变性5分钟后立即置于冰上待用。总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。

所述的电泳分析，其方法是：将变性好的扩增产物用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件：电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时。然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析。

3)、性别特异分子标记的筛选：

总共用64个引物组合(即8个M序列引物分别与8个E序列引物进行组合，这些引物购自美国Life Technologies公司)对20尾圆斑星鲽雌性个体和20尾圆斑星鲽雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出两个引物组合产生了两条雌性特异的DNA片段，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在：其中商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4扩增出一条533bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF533；商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8扩增出一条长度为218bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF218。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记。

2.圆斑星鲽性别特异分子标记的序列，包括：1)圆斑星鲽雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异AFLP标记的序列：

1)、雌性特异AFLP片段的回收：

选取能扩增出VevaF533bp、VevaF218bp雌性特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下分别含有以上三种长度的雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。

2)、AFLP片段的克隆：

将回收的雌性特异AFLP片段，克隆到pMD18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。

3)、性别特异分子标记的序列：

选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析。将来自5个阳性克隆的相同长度的雌性特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，其同源性分别为99.56％、99.78％，表明各个个体得到的条带是同一个序列。两条序列之间也没有同源性。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。

二、圆斑星鲽遗传性别鉴定方法

剪取待测圆斑星鲽的鳍条，应用上面建立的鳍条DNA提取方法提取DNA，再用上面筛选出来的能产生圆斑星鲽雌性特异DNA片段(VevaF533或VevaF218)的AFLP引物(商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4，或商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8)对基因组DNA进行AFLP分析，电泳证实DNA条带的有无，如果M-CAG和E-ACC的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出533bp的特异DNA片段，或者M-CAT和E-AGG的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出218bp的雌性特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有该片段的个体则可认为是遗传上的雄性个体。

本发明与已有技术对比其特点是：本发明采用分子标记技术，以圆斑星鲽为材料首次筛选到雌性特异DNA分子标记，建立了我国鲽类遗传性别鉴定的分子生物学技术。该技术具有准确、灵敏、可靠等优点，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，适宜在所有养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类单性育种具有重要意义和应用价值。

附图说明：

图1、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF533电泳图：表示引物组合M3E4的扩增产物；M表示分子量标准；

图2、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF218电泳图：表示引物组合M4E8的扩增产物；M表示分子量标准；

图3、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF533的核苷酸序列：“有下划线的字符”表示选择性引物序列；

图4、圆斑星鲽雌性特异AFLP片段VevaF218的核苷酸序列：“有下划线的字符”表示选择性引物序列；

图5、圆斑星鲽雌性个体和雄性个体遗传性别PCR鉴定结果：(M4E8引物组合)M表示分子量标准；“C”表示雌性对照；1-24表示检测了24尾个体，其中，6-10，15，16，18，19，24共10个个体为雌性，其余14个个体为雄性。

具体实施方式：

采用现代分子生物学技术，筛选出性别特异的分子标记，采用分子克隆技术，克隆出性别特异的AFLP片段，建立圆斑星鲽遗传性别鉴定的PCR分析技术，这对于培育圆斑星鲽全雌苗种，进行全雌苗种养殖，提高养殖产量，提高养殖的经济效益，真正将圆斑星鲽开发为一个被广大养殖户接受的优良养殖品种，推动圆斑星鲽养殖产业的发展及海水鱼类养殖品种的更新换代，具有重要的现实意义和巨大的经济效益。

下面通过圆斑星鲽雌性特异AFLP分子标记的筛选及遗传性别鉴定方法的建立，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明：

本发明其技术内容如下：一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列；二、圆斑星鲽遗传性别鉴定方法。

一、圆斑星鲽性别特异分子标记筛选及其序列，包括：1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选；2.圆斑星鲽性别特异分子标记的序列。

1.圆斑星鲽性别特异分子标记筛选；包括：1)、圆斑星鲽鳍条DNA提取，2)、基因组DNA的AFLP分析，3)、性别特异分子标记的筛选。

1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取：

剪取重约10mg鳍条置于600μl裂解液(10mM Tris-HCl，pH8.0；100mM EDTA，pH8.0；100mM NaCl；0.5％SDS)中匀浆，加蛋白酶K(终浓度为18-22mg/ml)和RNaseA(终浓度为95-105μg/ml)，于55℃水浴消化至澄清。加入600μl的酚：氯仿：异戊醇混合物(25：24：1)抽提，充分混匀后离心(12000rpm，10min)；吸取上清液再次抽提、离心；最后，用1000μl的冰乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用。基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.8左右。

2)、基因组DNA的AFLP分析：主要包括如下步骤：第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析。

(1)、对DNA模板进行酶切：

用1.0μl EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA6小时，再用1％的琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，然后将充分酶切的DNA溶液于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶。

(2)、将特异接头连接到酶切片段上：

向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4 DNA连接酶，20℃孵育20小时，保证接头充分连接。

(3)、预扩增：

将连接产物稀释10倍，作为预扩增的模板；预扩增引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物。PCR反应条件为：92-94℃，30秒；54-56℃，1分钟；70-72℃，1分钟。20个循环后，4℃待用。

(4)、选择性扩增：

将预扩增产物稀释45倍，作为选择性扩增的模板。用含酶切位点MseI的引物和含酶切位点EcoRI的引物进行扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基。PCR反应分为三步：第一步进行1个循环：92-94℃，30秒；63-65℃，30秒；70-72℃，1分钟；第二步进行12个循环：92-94℃，30秒；65-54℃，30秒；70-72℃，1分钟；第三步进行23个循环——92-94℃，30秒；54-56℃，30秒；70-72℃，1分钟。扩增产物加入适量的变性剂，94℃变性5分钟，立即置于冰上。

(5)、电泳分析：

将变性好的扩增产物用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件：电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时。总共用了64个引物组合对20尾圆斑星鲽雌性个体和20尾圆斑星鲽雄性个体的基因组DNA进行了AFLP分析，用SAGA软件分析电泳图谱后，筛选出产生特异片段的引物组合两个，这两个引物组合共产生了两条雌性特异的DNA片段。

3)性别特异分子标记的筛选：

总共用64个引物组合(即8个M序列引物分别与8个E序列引物进行组合，这些引物购自美国Life Technologies公司)对20尾圆斑星鲽雌性个体和20尾圆斑星鲽雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，这64个引物组合的核苷酸序列见表1。20尾雌性个体为性成熟的雌性亲鱼，20尾雄性个体为能挤得出精液的雄性亲鱼。

表1 64个AFLP引物组合的核苷酸序列

通过SAGA软件分析筛选出两个引物组合产生了两条雌性特异的DNA片段(图1、图2)，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在：其中商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4扩增出一条533bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF533；商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8扩增出一条长度为218bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF218。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记，即可用于遗传性别鉴定。

2、圆斑星鲽性别特异分子标记的序列：包括：1)、雌性特异AFLP片段的回收；2)、AFLP片段的克隆；3)、雌性特异分子标记的序列。

1)、雌性特异AFLP片段的回收

根据雌性特异AFLP标记的筛选结果，选取能分别扩增533bp、218bp雌性特异AFLP条带的引物组合，进行AFLP扩增，然后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分别获得533bp、218bp的雌性特异AFLP条带，用无污染的刀片切下含有目的DNA片段的聚丙烯酰胺凝胶，加20μl超纯水，50℃溶解约1.5小时，得到了微量的DNA，回收目的片段备用。

2)、AFLP片段的克隆

采用商品化的pMD 18-T连接试剂盒将回收的雌性特异AFLP片段，克隆到pMD 18-T载体中，采用标准的CaCl₂转化方法将连接产物转化感受态细菌，将转化产物涂布LB培养皿，37℃过夜培养。次日，用灭菌的牙签挑取单菌落，投入1ml LB(含氨卞青霉素)液体培养基中，37℃，250rpm过夜培养。然后采用PCR法筛选目的克隆，从每个样品中取1μl菌液做为模板，用所对应的选择性扩增的引物和反应程序进行扩增，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。

3)、雌性特异分子标记的序列

选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析。将来自5个阳性克隆的相同长度的雌性特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，其同源性分别为99.56％、99.78％，表明各个个体得到的条带是同一个序列。两条序列之间也没有同源性。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。圆斑星鲽雌性特异AFLP片段的核苷酸序列(示于图3、图4)。

二、遗传性别鉴定方法

应用上面建立的鳍条DNA提取技术提取DNA，这种方法不用杀鱼，为非损伤性技术，适于推广应用；然后再用上面筛选出来的能产生圆斑星鲽雌性特异DNA片段(VevaF533或VevaF218)的AFLP引物(商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4或商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8，这两个引物组合中的任意一个组合)对基因组DNA进行AFLP分析，电泳证实DNA条带的有无，如果M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出533bp的特异DNA片段，或者M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出218bp的雌性特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有该片段的个体则可认为是遗传上的雄性个体。通过这种方法就可以鉴定圆斑星鲽的遗传性别，为圆斑星鲽性别控制和全雌育种研究提供技术手段。这种方法准确、可靠，在圆斑星鲽性别控制和单性育种中具有重要应用价值(图5)。

序列表

<110>中国水产科学研究院黄海水产研究所

<120>圆斑星鲽性别特异分子标记及遗传性别鉴定方法

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>533、218

<212>DNA

<213>圆斑星鲽(Verasper variegates)

<400>1

Claims (3)

1.一种圆斑星鲽性别特异分子标记筛选方法，其特征在于它的筛选方法，包括：(1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取；(2)、基因组DNA的AFLP分析；(3)、性别特异分子标记的筛选：

(1)、圆斑星鲽鳍条DNA的提取：

剪取重约10mg鳍条置于600μl裂解液中匀浆，加终浓度为18-22mg/ml的蛋白酶K和终浓度为95-105μg/ml的RNaseA，于55℃水浴消化至澄清；加入600μl的酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1混合物抽提，充分混匀后离心12000rpm，10min；吸取上清液再次抽提、离心；最后，用1000μl的冰乙醇沉淀DNA，经70％乙醇洗涤和自然干燥后，用TE溶解，将DNA保存在-20℃备用；

所述的裂解液组成为10mM Tris-HCl，pH 8.0；100mM EDTA，pH 8.0；100mM NaCl；0.5％SDS；

所述的基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.76-1.80；

(2)、基因组DNA的AFLP分析：

基因组DNA的AFLP分析主要包括如下步骤：第一步对DNA模板进行酶切，第二步是将特异接头连接到酶切片段上，第三步是进行预扩增，第四步是进行选择性扩增，第五步是电泳分析；

所述的对DNA模板进行酶切，其方法是：先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA 6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶；

所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是：向上面的酶切反应混合液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4DNA连接酶，20℃孵育20小时；

所述的预扩增，其方法是：将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增；

所述的选择性扩增：其方法是：将预扩增产物稀释45倍，作为选择性扩增的模板；用荧光标记的EcoRI引物和MseI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基；向PCR扩增产物中加入适量的变性剂，于94℃变性5分钟后立即置于冰上待用；总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离；

所述的电泳分析，其方法是：将变性好的扩增产物用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；电泳条件：电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时；然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析；

(3)、性别特异分子标记的筛选：

总共用64个引物组合(即8个M序列引物分别与8个E序列引物进行组合，这些引物购自美国Life Technologies公司)对20尾圆斑星鲽雌性个体和20尾圆斑星鲽雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出两个引物组合产生了两条雌性特异的DNA片段，这些片段在雄性个体基因组DNA中不存在：其中商品名为M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4扩增出一条533bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF533；商品名为M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8扩增出一条长度为218bp的雌性特异DNA片段，命名为VevaF218；将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异DNA标记。

2.一组圆斑星鲽性别特异分子标记，其特征在于它的序列为：VevaF533：

GACTGCGTACCAATTCACCCTCCTTTTAGCTCAGTTTTGGTCTCCACCAGCTTGTGAGAAAGAT

ATTTGTCTCTTTAGCTGCTACGTGTTCTACTTTTTTTTAGCAGCTCATTGTTTGCGTGTCTTCT

GGAGCTGGACAGGTCGTGCACAGCGGGTTTTTATCTTTACTGAAAAGCAGCTGCCTGCCGCTGC

TGGCATCGGCGTTGATGAGAGGGCTGAGACTCGTGCTGAGACTCGTGCGCACACAGATGGTCTG

CTCGTGCAAGGAGTGAAACACTGAAGTGATCCTCTGCAGAGAAGCCTTCTCTCTCACTACAGGG

CAAATCAGCATTATAAAACCATTACGATGCCAAGGTGCATGCACACCTGGCTTTCAAACGGAGA

GGCAGGTGGATTTATTGCATGTCACTCCCATAATCTGCAGAATCCGAAGGTGAGGCACACGATC

TCAGGGCTGGAGTGAAAAGCATCAGCTGTTGGCTTTTTTCATTTATCTTCATTCATATGCAGAA

AGCTGTTACTCAGGACTCATC；

VevaF218：

GATGAGTCCTGAGTAACATGCTAACAGGCTCGTGTTAACTTCCGTTGTGTGGATGGATTCCATC

TGTTCGGCTTGCATTCCAACTAAAGGAGGCTATCAGCGAGCTAACGATGCAGGAGCTAACAGCG

AGCTAACGGATACACGGCAGCTACAAGACAAACCGAGCTAACCGAGCTAAAGGCTAGATAAACA

CATTACACCTGAATTGGTACGCAGTC。

3.一种圆斑星鲽遗传性别鉴定方法，其特征在于它的方法是：

剪取待测圆斑星鲽的鳍条，应用权利要求1(1)中建立的鳍条DNA提取方法提取DNA，再用权利要求1(3)中筛选出来的M-CAG和E-ACC的引物组合M3-E4，或M-CAT和E-AGG的引物组合M4-E8对基因组DNA进行AFLP分析，电泳证实DNA条带的有无，如果M-CAG和E-ACC的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出533bp的雌性特异DNA片段，或者M-CAT和E-AGG的引物组合在某一尾鱼的基因组DNA中扩增出218bp的雌性特异DNA片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有该片段的个体则可认为是遗传上的雄性个体。

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