CN110734968B

CN110734968B - 一种用于鉴定方格星虫遗传性别的探针及方法

Info

Publication number: CN110734968B
Application number: CN201911036273.0A
Authority: CN
Inventors: 李文华; 吴雅琴; 陈琪薇
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: CN110734968A

Abstract

本发明公开一种用于鉴定方格星虫遗传性别的探针及方法，本发明通过高通量测序手段，经生物信息学分析鉴定出一条雌性特异的基因片段，序列为SEQ ID NO：1，根据该基因片段设计鉴定方格星虫遗传性别的特异性引物F1和R1，该引物只在雌性个体中有扩增产物。本发明不受方格星虫的发育时期、个体大小等因素的限制，提取一定量的体腔液就可快速、准确、有效地区分方格星虫遗传性别；以及无需杀死虫体，遗传性别鉴定后的虫体仍可用于生产繁殖实践需要。本发明能够有效地促进方格星虫人工繁殖技术的提高，对于方格星虫养殖实践有着重要的理论意义和应用价值。

Description

一种用于鉴定方格星虫遗传性别的探针及方法

技术领域

本发明涉及水产生物技术和水产养殖领域中的海洋星虫遗传性别鉴定和性别控制技术，具体涉及一种鉴定方格星虫遗传性别的方法及探针。

背景技术

方格星虫(Sipunculus nudus)俗称“沙虫”，广泛分布于我国东南沿海，是一种名贵的海产珍品。该种生物味道鲜美、营养丰富，具有重要的食用和药用价值。生产上所用的方格星虫主要来自于天然捕捞，但是，因过度开采及环境污染，星虫资源急剧下降，因此亟需进一步探索方格星虫的繁殖机制来改善人工繁育技术，以满足生产需要。

方格星虫为体外受精，雌雄异体，性成熟最短时间为11个月，其生殖腺分布于翻吻肌基部，腺体细小，肉眼难以识别，仅在排卵期明显。全年都可以在其体腔中观察到生殖细胞，生殖细胞的发育随季节的变化而变化。星虫动物的配子发生过程比较特别，原生殖细胞在发育早期便以单细胞或细胞团的形式从性腺脱落进入到体腔液中继续发育至成熟，发育成熟后进入肾管。发育成熟的方格星虫，雄性个体肾管内为乳白色的精子，雌性个体肾管内为暗红色的卵子。雌雄个体外形相似，没有明显的第二性征，无法直接从外形上判断雌雄。在养殖实践中，可以透过半透明的体壁观察肾管颜色来区分雌雄个体。

在生殖细胞发育成熟之前，方格星虫的雌虫和雄虫难以从外观上进行区分，且不存在异形性染色体。在生殖细胞发生之后，虽然可以通过抽取体腔液的方式，从细胞学的角度进行区分，但对于经验不丰富者来说，在实际鉴定中会出现假阴性，从而对雄性和雌性个体的鉴定造成误判，这给方格星虫人工育种技术的开发带来了极大困难。因此，开发方格星虫雌性特异分子探针，有助于揭示其生殖相关的分子机理，在分子水平上掌握其生殖的基本规律及其调控机制，以期有效地促进人工繁殖技术的提高，对于方格星虫养殖实践有着重要的理论意义和应用价值。

此外，目前尚未见关于方格星虫雌性特异分子探针及其应用相关的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于鉴定方格星虫遗传性别的探针及方法，本发明不受方格星虫的发育时期、个体大小等因素的限制，提取一定量的体腔液就可实现性别的准确鉴定，为方格星虫的性别控制、人工育种提供一种技术手段。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于鉴定方格星虫遗传性别的探针，包括引物F1：GCAGATTCTTCGGGTACTGTTC，引物R1：AGGAGAGATGGTTGTGGGACT。

一种鉴定方格星虫遗传性别的方法，包括以下步骤：

(1)抽取方格星虫体腔液，用于mRNA的提取；

(2)在体腔液中按1：5比例加入Trizol溶液(Takara公司)，在4℃下离心；

(3)加入的氯仿，混匀，室温下静置；然后于4℃下离心；

(4)取上清，加入异丙醇，混匀，离心；

(5)弃上清，加入75％乙醇，混匀，离心；

(6)弃上清，在酒精灯附近将离心管晾干，晾干后加入50μl水，溶解所获得的mRNA，使用Nanodrop1000定量，并进行琼脂糖凝胶电泳确定mRNA质量；

(7)使用cDNA合成试剂盒进行逆转录；

(8)采用所述的引物F1和R1进行PCR扩增；

(9)PCR产物琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物加入适量上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统拍照并记录，扩增出现明显条带为雌性个体，而扩增不出条带的为雄性个体。

优选地，所述PCR扩增体系如下：

PCR反应程序为：95℃预变性30秒，95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，39个循环，72℃延伸2分钟。

本发明的有益效果：

本发明设计的特异性引物可以实现不受方格星虫的发育时期、个体大小等因素的限制，提取一定量的体腔液就可快速、准确、有效地区分方格星虫遗传性别；本发明无需杀死虫体，遗传性别鉴定后的虫体仍可用于生产繁殖实践需要。本发明能够有效地促进方格星虫人工繁殖技术的提高，对于方格星虫养殖实践有着重要的理论意义和应用价值。

附图说明

图1为引物F1和R1扩增出的方格星虫雌性个体和雄性个体PCR产物的2％琼脂糖凝胶电泳图，大小为206bp，♀代表遗传雌虫，♂代表遗传雄虫，M代表DNA分子量标准DL2000。

具体实施方式

以下通过具体实施方式本发明的技术方案进行进一步的说明和描述：

本发明所用仪器未注明生产厂商，均为可以通过常规市购获得。本发明包括方格星虫雌性特异基因片段的筛选、方格星虫雌性特异基因片段的引物序列和方格星虫遗传性别的鉴定三个方面。

一、方格星虫雌性特异基因片段的筛选

本发明实施例所用的雌性特异基因片段SEQ ID NO：1来源于华侨大学分子药物教育部工程中心完成的方格星虫转录组测序结果，其序列为：

GCAGATTCTTCGGGTACTGTTCGTGACGTCATGGCCAGAAAAAACCGTGAAGGCACCGTTGGCCAAAGTGTTGTCACACATGATCTGTTGATCGGGACTGACTTGCGTGACCTTGAGCGTCCGGTTGTAACCTTGGTCTGTGATTTCCAGGTATCTGAACACTCTGTTCTGCTGGTACAGCGCCCAGTCCCACAACCATCTCTCCT。

本发明以SEQ ID NO：1为出发点，建立方格星虫性别特异分子探针。

二、方格星虫雌性特异基因片段的引物序列

基于上述雌性特异基因片段SEQ ID NO：1，使用Primer3.0软件分别针对上述基因片段设计上下游引物F1(SEQ ID NO：2)、R1(SEQ ID NO：3)，然后将设计好的引物序列发送至基因合成公司合成引物。

针对序列SEQ ID NO：1的上下游引物序列为：

F1：GCAGATTCTTCGGGTACTGTTC(SEQ ID NO：2)；

R1：AGGAGAGATGGTTGTGGGACT(SEQ ID NO：3)。

三、方格星虫遗传性别的鉴定和测定

从厦门第八海鲜市场随机挑选方格星虫30条，运至华侨大学泛华科技大楼暂养，抽取少量体腔液，基于细胞学形态鉴定雌雄，并标记；之后抽取少量体腔液用于mRNA的提取。具体操作方法为：

1、在体腔液中按1：5比例的加入Trizol溶液(Takara公司)，在4℃下，12000g离心10分钟；

2、加入200μl氯仿(国药)，混匀，室温下静置3分钟；然后于4℃下，12000g离心20分钟；

3、取上清，加入300μl异丙醇(国药)，混匀，12000g离心10分钟；

4、弃上清，加入1ml 75％乙醇(国药)，混匀，7500g离心5分钟；

5、弃上清，在酒精灯附近将离心管晾干，晾干后加入50μl水，溶解所获得的mRNA，使用Nanodrop1000(Thermo，美国)定量，并进行琼脂糖凝胶电泳确定mRNA质量；

6、使用cDNA合成试剂盒(Invitrogen，美国)进行逆转录，具体参照说明书进行；

7、采用特异引物F1(SEQ ID NO：2)和R1(SEQ ID NO：3)进行PCR扩增，扩增体系(总体积20μl)如下：

PCR反应程序为：95℃预变性30秒，95℃30秒，58℃30秒，72℃30秒，39个循环，72℃延伸2分钟；

8、PCR产物琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物加入适量上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统拍照并记录；上述引物在雌性个体中扩增出明显的条带，而在雄性个体扩增不出条带，见图1。

性别鉴定结果由扩增条带的大小和有无来判定，判定结果的准确性通过解剖后的组织细胞学观察予以确认。使用本发明的方法对已知性别的雌虫和雄虫进行了遗传性别鉴定，在雌性个体中扩增出大小为206bp(图1)的阳性产物，PCR产物条带清晰。对扩增出的雌性特异基因片段切胶回收、连接、克隆及测序，测序结果显示扩增出的雌性特异基因片段正是本发明所筛选出的方格星虫雌性特异基因片段，从而说明本发明的特异性基因片段鉴定方格星虫遗传性别的有效性。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 一种用于鉴定方格星虫遗传性别的探针及方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 206

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcagattctt cgggtactgt tcgtgacgtc atggccagaa aaaaccgtga aggcaccgtt 60

ggccaaagtg ttgtcacaca tgatctgttg atcgggactg acttgcgtga ccttgagcgt 120

ccggttgtaa ccttggtctg tgatttccag gtatctgaac actctgttct gctggtacag 180

cgcccagtcc cacaaccatc tctcct 206

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcagattctt cgggtactgt tc 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aggagagatg gttgtgggac t 21

Claims

1.一种用于鉴定方格星虫遗传性别的探针，其特征在于，探针包括引物F1：GCAGATTCTTCGGGTACTGTTC，引物R1：AGGAGAGATGGTTGTGGGACT。

2.一种用于鉴定方格星虫遗传性别的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）抽取方格星虫体腔液，用于提取mRNA；

（2）在体腔液中按1：5比例加入Trizol溶液，在4℃下离心；

（3）加入的氯仿，混匀，室温下静置；然后于4℃下离心；

（4）取上清，加入异丙醇，混匀，离心；

（5）弃上清，加入75%乙醇，混匀，离心；

（6）弃上清，在酒精灯附近将离心管晾干，晾干后加入水，溶解所获得的mRNA，使用Nanodrop1000定量，并进行琼脂糖凝胶电泳确定mRNA质量；

（7）使用cDNA合成试剂盒进行逆转录；

（8）采用权利要求1所述的引物F1和R1进行PCR扩增；

（9）PCR产物琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物加入上样缓冲液，进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统拍照并记录，扩增出现明显条带为雌性个体，而扩增不出条带的为雄性个体。

3.如权利要求2所述的一种用于鉴定方格星虫遗传性别的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系如下：

总体积20 μl

cDNA模板 1 μl

F1（10 pmol/μl） 0.5 μl

R1（10 pmol/μl） 0.5 μl

2xTaq buffer mix（Vazyme） 10 μl

无菌水 15 μl，

PCR反应程序为：95℃预变性30秒，95℃ 30秒，58℃ 30秒，72℃ 30秒，39个循环，72℃延伸2分钟。