CN110607376A - 一种基于dna分子标记的虾夷扇贝活体性别鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于DNA分子标记的虾夷扇贝活体性别鉴定方法。其是通过活体获取虾夷扇贝少量鳃丝，提取DNA，PCR扩增性别特异性DNA分子标记，电泳检测PCR产物中是否存在目的条带，从而实现扇贝活体性别鉴定。本发明提供的性别特异性DNA分子标记为雌性所特有，其核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1。采用PCR引物扩增此分子标记，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定虾夷扇贝的性别，扩增出1859bp特异性条带的样品为雌性，没有该条带的为雄性。该方法可以实现虾夷扇贝活体性别鉴定，方法简单，结果准确，有助于加快虾夷扇贝良种培育进程。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖性别鉴定技术领域，具体涉及一种基于DNA分子标记的虾夷扇贝活体性别鉴定方法。
背景技术
虾夷扇贝是我国北方最重要的海水养殖贝类之一，目前已在渤海及黄海北部形成规模化养殖，近10年来创造了数十亿元的产值。虾夷扇贝为雌雄异体，一般1-2年性成熟，在性腺进入生长期和成熟期时，扇贝性别通过肉眼即可辨认。但当性腺处于未分化期、休止期或增殖期时，性别难以通过肉眼辨认，需要解剖获得性腺，通过组织学切片或基因表达定量分析，实现性别鉴定。然而，在育种过程中，通常需要在保证活体的情况下检测性别。
迄今为止，虾夷扇贝活体性别鉴定方法尚未建立。DNA分子标记是活体性别鉴定的重要工具，在很多水生生物中广泛应用。开发虾夷扇贝性别特异分子标记，发展简单有效且成本低廉的活体性别鉴定方法，不仅有助于加快虾夷扇贝良种培育进程，对贝类性别决定机制的研究也具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于DNA分子标记的虾夷扇贝活体性别鉴定方法，即一种基于DNA分子标记对虾夷扇贝进行活体性别鉴定的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种用于虾夷扇贝性别鉴定的雌性特异性DNA分子标记，所述的DNA分子标记，其核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1或其互补序列。
针对SEQ ID NO:1所示序列设计的引物，所述的引物，其上游引物的序列为SEQ IDNO:2,下游引物的序列为SEQ ID NO:3；
本发明还提供一种虾夷扇贝活体性别鉴定方法，包括如下的步骤：
虾夷扇贝活体性别鉴定方法，它包括以下步骤：
1)从虾夷扇贝的鳃丝组织抽取基因组DNA，
2)检测所提取的基因组DNA是否含有SEQ ID NO:1所示序列或互补序列的条带。
本发明提供的虾夷扇贝活体性别鉴定方法，只需虾夷扇贝的少量鳃丝，即可实现性别鉴定，经验证准确率达100％，存活率与对照组相比无明显差异。与之前基因表达和形态学方法相比，该性别鉴定方法具有活体检测、不依赖于性腺发育程度、简单快速、准确率高等优点，对于虾夷扇贝性控育种和养殖业的发展具有重要意义。
附图说明
图1为利用活体获取的鳃丝提取的DNA电泳结果示意图，图中编号1-16为提取的DNA样品，M表示1kb DNA ladder。
图2为利用活体获取的鳃丝进行性别鉴定的结果示意图，图中雌性个体都能扩增出1859bp特异条带，雄性个体均无法扩增出条带，M表示2kb DNA ladder。
具体实施方式
本发明的基于DNA分子标记的虾夷扇贝活体性别鉴定方法主要包括四个步骤：1.剪取虾夷扇贝的少量鳃丝；2.采用酚氯仿抽提法提取鳃丝基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对DNA进行质量检测；3.采用本发明提供的雌性特异性引物进行PCR扩增；4.电泳检测PCR产物是否含有SEQ ID NO:1所示序列的条带(1859bp)。
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：虾夷扇贝性别特异分子标记的获得
采用经典酚氯仿法提取一个雌性虾夷扇贝闭壳肌的基因组DNA；通过Pabio-Sequel测序仪进行测序，深度为100×；利用Falcon进行序列拼接，获得雌性虾夷扇贝的基因组；通过mauve软件比较雌、雄虾夷扇贝基因组，发现一段序列只存在于雌性个体，而在雄性个体中不存在，这段序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例2：活体检测方法
受检样品取材：取25只虾夷扇贝，采集2根鳃丝，用于DNA提取。
DNA提取：采用经典的酚氯仿法提取基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸定量仪对DNA进行质量检测。图1为利用活体获取的鳃丝提取的DNA电泳结果示意图，图中编号1-16为提取的DNA样品，M表示1kb DNA ladder。
引物合成：根据获得的雌性特异性片段SEQ ID NO:1设计雌性特异性引物进行扩增。具体引物序列见下表。
PCR扩增：将上述引物分别用于PCR扩增所采集的样品。反应体系为：DNA模板100ng，5×HF buffer 4μL；dNTP(10mM)0.6μL；上游引物(2μM)1μL；下游引物(2μM)1μL；Phusion酶0.2μL；灭菌水补至20μL。PCR反应程序为1,98℃30s；2,98℃,10s；3,60℃,15s；4,72℃,1min；2-4,30个循环；5,72℃,5min；6,4℃保存。
扩增结果检测及性别鉴定：配制1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增出特异性条带为雌性个体，扩增不出特异性条带为雄性个体。SIIV引物扩增出的特异性条带长度为1859bp，该方法对虾夷扇贝性别鉴定的准确率可达到100％。上面以举例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一种基于DNA分子标记的虾夷扇贝活体性别鉴定方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1859
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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acacttatgt ggataaacag taagatacac taatgtggat aaactctaat gtggataaac 240
agtaagatac actcatgtgg attaacgctc atgtggataa acagtaaggt acactaatat 300
ggataaacag taaggtactc caatgtggat aaacattaag gtacactaat gtggataaaa 360
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gcaatgtaca ctaatgtgga taaacagtaa ggtacactaa tgtggataaa caataaggta 540
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Claims (6)
1.一种用于虾夷扇贝性别鉴定的雌性特异性DNA分子标记，其特征在于，所述的DNA分子标记的核苷酸片段序列为SEQ ID NO:1或其互补序列。
2.权利要求1所述的分子标记在制备检测虾夷扇贝性别的分子检测试剂盒中的应用。
3.一种用于检测虾夷扇贝性别的分子检测制品，其特征在于，所述的制品是用于检测虾夷扇贝是否存在权利要求1所述的分子标记。
4.一种用于检测权利要求1所述的分子标记的引物对，其特征在于，所述的引物对中，上游引物的序列为SEQ ID NO:2,下游引物的序列为SEQ ID NO:3。
5.一种虾夷扇贝活体性别鉴定方法，其特征在于，所述的方法，是从虾夷扇贝的鳃丝组织抽取基因组DNA，再检测是否存在权利要求1所述的分子标记。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)从虾夷扇贝的鳃丝组织抽取基因组DNA，
2)检测所提取的基因组DNA是否含有SEQ ID NO:1所示序列或互补序列的条带。
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