CN1800414A - 虾夷扇贝pymse005微卫星标记的快速检测方法 - Google Patents

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包振民
汪小龙
战爱斌
惠敏
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Abstract

一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法：首先提取虾夷扇贝的基因组DNA备用；然后用菌落原位杂交法筛选已构建的虾夷扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆测序，再在微卫星核心重复序列的两端设计引物；并使用该引物对虾夷扇贝不同群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，再用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用已有软件Quantity One准确快速地确定每个个体的基因型，而获得虾夷扇贝的遗传多态性图谱。本发明应用于虾夷扇贝遗传图谱的构建、不同群体或者养殖群体的遗传多样性分析和种质鉴定等方面的研究。能够准确、方便、快捷地判读出每个等位基因的大小和每个个体的基因型。

Description

虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法
技术领域：
本发明属于虾夷扇贝DNA分子遗传标记技术，是一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法。
背景技术：
在真核生物基因组中，存在着由1-6个碱基对组成的简单重复序列(SimpleSequence Repeats)，简称SSRs，又称之为微卫星DNA(Microsatellite DNA)。随着分子标记的发展，微卫星标记已经成为国际上主流的标记技术之一。微卫星标记有诸多优点，如：随机分布在整个基因组中，多态性高；可通过PCR迅速扩增，需要的DNA样品量较少，并且重复性好；孟德尔式遗传，共显性标记。因此，微卫星标记在遗传图谱的构建、遗传多样性分析和种质鉴定等方面得到广泛的应用。
在扇贝相关物种的微卫星研究中，仅报道了从海湾扇贝和栉孔扇贝EST数据库中筛选成功的几个位点。Roberts等对29个海湾扇贝EST-SSRs设计引物扩增时发现，其中8个位点没有得到扩增产物或者特异性产物，13个位点没有多态性，筛选成功的位点仅有8个。李红蕾等搜索了栉孔扇贝6935条ESTs，发现42条序列含有微卫星，选取了其中的7条序列设计引物，其中仅有3对引物有望在以后的工作中加以应用。但利用已有的微卫星标记进行虾夷扇贝的分子生物学分析和研究至今没有报道。
发明内容
本发明的目的是提提供一种虾夷扇贝微卫星标记的快速检测方法。
本发明是按照以下操作步骤完成的：首先提取虾夷扇贝的基因组DNA备用；然后用菌落原位杂交法筛选已构建的虾夷扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆测序，再在微卫星核心重复序列的两端设计引物；并使用该引物对虾夷扇贝不同群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，再用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用已有的软件Quantity One准确快速地确定每个个体的基因型，从而获得虾夷扇贝的遗传多态性图谱，准确地检测出每个个体的基因型，从而快速的检测虾夷扇贝每个个体在此微卫星位点的遗传变异。
富集文库-菌落原位杂交得到的阳性克隆序列为：
CCTTAAACAATACGTTCATTAGTGAATAATCACTTAATAGCACTGACAATCAATAAGTATGTTGTATTTGTC
ATTTGGTGATTTTAATGATTAAACGTCCGTCGTATCGTTATTTCTATGTATTTTTATCCGTAGTTCTCCCTGACTA
TTCTCGCTCTATTCTCCCATCGTAGCGCTCTCTCACAGCCAATGACTATACTAAAAATATGATAGTATTAAATTCA
CACAGGCTGCCTTCGCCAGCGCGCTTTCAAACTAAACAATTCATACTCTAGCAGTCGTTATCTATTCTCACTCTTC
ATACTGCAGTCATACTCACTCTCTTCCATTCCCACTGGACCGTCCTTTATCTAGCTCCTTCACGCTGTTCAATTCA
TACCCTATAACTACACTGTAGTACAGAACGGTTGGTGGTTGTACAAATGCTTCATAGTGCTGACTCAAAGTCTTCA
ATTTTTACTGAGCCGTCTTCTCCGTCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTATCTCTCTCTCTCCATTTCAT
CATATTACTTCACCAAAGAACTCTACGTTTGTCATAGTACTACATGTAGCTGATTGTCTTTAATTCTTACTAAACC
TTCTTCATTATTGCTTTCCTAAGATTATTCCATTCATACTCTTTGCGTCATATCATGTTTTAGTTATTTGTTGTAA
ACCTTTTCCTTGTGCTTGCTTGACGTCTTCAATTCGTACTAAAACTCGTCGTCAAAATTTGCTCTCTATTATACTC
ATTAGTACTACCCCAGCCCCTGCGTATTTTATGAAGAATTTACCGACTGCTTT
其中上述序列的微卫星核心重复序列为：(CT)12CCCTAT(CT)5。根据PYMSE005的核心序列两端设计的特异性引物序列分别为：正向引物：5’-AGT ACA GAA CGG TTG GTG GT-3’；反向引物：5’-GAC AAT CAG CTA CAT GTA GTA C-3’，退火温度58℃。
根据已有的酚-氯仿方法提取虾夷扇贝的基因组DNA，并将其稀释为20ng/μl，每个PCR反应体系中加入2μl，反应体系为20μl。
对虾夷扇贝不同群体或者虾夷扇贝个体的基因组DNA进行PCR扩增，其PCR反应条件为：40ng虾夷扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。使用这两对引物时设置的PCR程序参数为：95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准(pUC19/HaeIII)。电泳2-3小时后用浓度为0.15mg/mL的溴化乙锭染色，在凝胶成像系统上紫外成像并对电泳谱带进行分析。利用软件Quantity One对每个个体带进行快速准确的基因型确定。
应用上述方法，可以检测虾夷扇贝的每个个体在此微卫星区域的遗传变异情况。通过电泳图谱和Quantity One软件分析结果，能够准确、方便、快捷地判读出每个等位基因的大小以及每个个体的基因型。
具体实施方式：
下面通过实施例详细叙述本发明。
首先提取虾夷扇贝的基因组DNA备用；然后用菌落原位杂交法筛选已构建的虾夷扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆测序，再在微卫星核心重复序列的两端设计引物；并使用该引物对虾夷扇贝不同群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，再用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；利用已有的软件Quantity One准确快速地确定每个个体的基因型，从而获得虾夷扇贝的遗传多态性图谱，准确地检测出每个个体的基因型，从而快速的检测虾夷扇贝每个个体在此微卫星位点的遗传变异。
1、虾夷扇贝基因组DNA的提取：
取扇贝闭壳肌约0.1克，加入500ml STE裂解缓冲液(NaCl：100mM；EDTA：1mM，PH＝8.0；Tris-Cl，10mM，PH＝8.0)，剪碎，再加入50ml SDS(10％)，以及5ml的蛋白酶K(20mg/ml)，56℃处理，直到裂解液澄清。加入等体积饱和酚(250ml)、氯仿/异戊醇(24∶1)(250ml)，抽提3次。取上清液，加入等体积氯仿/异戊醇(500ml)抽提1次。取上清液，加入50ml NaAc(3M)，缓慢摇匀，加满冰无水乙醇，12000转离心10min。将核酸沉淀于管底。70％乙醇(1000ml)洗涤沉淀并干燥直到乙醇全部挥发。加入100ml的无菌水和少量RNase A，4℃直到DNA全部溶解。紫外分光光度计定量稀释成20ng/ml备用。
2、根据富集文库-菌落原位杂交的结果，阳性克隆测序，其序列为：
CCTTAAACAATACGTTCATTAGTGAATAATCACTTAATAGCACTGACAATCAATAAGTATGTTGTATTTGTCATTT
GGTGATTTTAATGATTAAACGTCCGTCGTATCGTTATTTCTATGTATTTTTATCCGTAGTTCTCCCTGACTATTCT
CGCTCTATTCTCCCATCGTAGCGCTCTCTCACAGCCAATGACTATACTAAAAATATGATAGTATTAAATTCACACA
GGCTGCCTTCGCCAGCGCGCTTTCAAACTAAACAATTCATACTCTAGCAGTCGTTATCTATTCTCACTCTTCATAC
TGCAGTCATACTCACTCTCTTCCATTCCCACTGGACCGTCCTTTATCTAGCTCCTTCACGCTGTTCAATTCATACC
CTATAACTACACTGTAGTACAGAACGGTTGGTGGTTGTACAAATGCTTCATAGTGCTGACTCAAAGTCTTCAATTT
TTACTGAGCCGTCTTCTCCGTCACTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTATCTCTCTCTCTCCATTTCATCATA
TTACTTCACCAAAGAACTCTACGTTTGTCATAGTACTACATGTAGCTGATTGTCTTTAATTCTTACTAAACCTTCT
TCATTATTGCTTTCCTAAGATTATTCCATTCATACTCTTTGCGTCATATCATGTTTTAGTTATTTGTTGTAAACCT
TTTCCTTGTGCTTGCTTGACGTCTTCAATTCGTACTAAAACTCGTCGTCAAAATTTGCTCTCTATTATACTCATTA
GTACTACCCCAGCCCCTGCGTATTTTATGAAGAATTTACCGACTGCTTT
3、微卫星引物的设计：
在虾夷扇贝微卫星富集文库基础上，利用微卫星DNA两侧的序列的保守性设计特异性引物，用于扩增该位点的微卫星片断。由于微卫星核心重复序列重复次数不同，使扩增产物产生了长度的变化而呈现多态性，这是检测微卫星位点的多态性的根源所在。引物设计采用软件Primer Premier 5.0和Oligo 6.44，引物设计采用以下严谨度：(1)引物长度为19-25mer；(2)GC含量40％-60％；(3)退火温度大于50℃；(4)预期PCR产物长度为100-250bp。根据测序结果，位点PYMSE005的特异性PCR引物序列为：正向引物：5’-AGT ACA GAA CGG TTG GTG GT-3’；反向引物：5’-GAC AAT CAG CTA CAT GTAGTA C-3’，退火温度58℃。
4、PCR扩增：
PCR反应体系的组成为：40ng虾夷扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶。PCR反应为30个循环，每个循环包括：95℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
5、PCR产物的检测
PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标佳(pUC19/HaeIII)。电泳完毕后用溴化乙锭(浓度为0.15mg/mL)染色，紫外观察成像并对电泳谱带进行分析。将谱带转换成软件POPGENE 32能够识别的数据，利用软件POPGENE 32对遗传学数据进行计算。
综上所述，本发明具有以下特点：
微卫星标记的核心是根据微卫星重复两端的侧翼序列设计特异性引物，因此本发明的核心是特异性PCR引物；本发明可以准确、方便、快捷电判读出栉孔扇贝PYMSE005位点的每个等位基因的大小以及每个个体的基因型。操作简单，方法简便，结果稳定直观；本发明主要应用于栉孔扇贝遗传图谱的构建、不同地理群体遗传多样性分析和种质鉴定等方面的研究。

Claims (7)

1.一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法，其特征在于：首先提取虾夷扇贝闭壳肌的基因组DNA稀释备用；然后菌落原位杂交法筛选已构建的虾夷扇贝微卫星富集文库，对阳性克隆进行测序，在其微卫星核心重复序列两端设计特异性引物；接着使用该引物对虾夷扇贝不同群体或者群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增，扩增产物用10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；最后利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，即获得虾夷扇贝的遗传多态性图谱。
2.根据权利要求1所述的一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法，其特征在于富集文库—菌落原位杂交得到的阳性克降序列为：
CCTTAAACAATACGTTCATTAGTGAATAATCACTTAATAGCACTGACAATCAATAAGTATG
TTGTATTTGTCATTTGGTGATTTTAATGATTAAACGTCCGTCGTATCGTTATTTCTATGTA
TTTTTATCCGTAGTTCTCCCTGACTATTCTCGCTCTATTCTCCCATCGTAGCGCTCTCTCA
CAGCCAATGACTATACTAAAAATATGATAGTATTAAATTCACACAGGCTGCCTTCGCCAGC
GCGCTTTCAAACTAAACAATTCATACTCTAGCAGTCGTTATCTATTCTCACTCTTCATACT
GCAGTCATACTCACTCTCTTCCATTCCCACTGGACCGTCCTTTATCTAGCTCCTTCACGCT
GTTCAATTCATACCCTATAACTACACTGTAGTACAGAACGGTTGGTGGTTGTACAAATGCT
TCATAGTGCTGACTCAAAGTCTTCAATTTTTACTGAGCCGTCTTCTCCGTCACTCTCTCTC
TCTCTCTCTCTCTCTCCCTATCTCTCTCTCTCCATTTCATCATATTACTTCACCAAAGAAC
TCTACGTTTGTCATAGTACTACATGTAGCTGATTGTCTTTAATTCTTACTAAACCTTCTTC
ATTATTGCTTTCCTAAGATTATTCCATTCATACTCTTTGCGTCATATCATGTTTTAGTTAT
TTGTTGTAAACCTTTTCCTTGTGCTTGCTTGACGTCTTCAATTCGTACTAAAACTCGTCGT
CAAAATTTGCTCTCTATTATACTCATTAGTACTACCCCAGCCCCTGCGTATTTTATGAAGA
ATTTACCGACTGCTTT
3.根据权利要求1所述的一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法，其特征在于微卫星的核心重复序列为：(CT)12CCCTAT(CT)5。
4.根据权利要求1所述的一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法，其特征为：在其核心重复序列两端设计的特异性引物序列分别为：正向引物：5’-AGT ACA GAA CGG TTG GTG GT-3’；反向引物：5’-GACAAT CAG CTA CAT GTA GTA C-3’，退火温度58℃。
5.根据权利要求1所述的一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法，其特征为：将提取好的虾夷扇贝的基因组DNA稀释为20ng/ml，且在每个PCR反应体系中加入2μl，反应体系为20μl。
6.根据权利要求1所述的一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法，其特征为：对虾夷扇贝不同群体或者虾夷扇贝个体的基因组DNA进行的PCR扩增，其PCR反应体系组成为：40ng虾夷扇贝基因组DNA，0.2mmol/L的引物，200mmol/L的dNTPs，200mmol/L的Mg2+，1×PCR反应缓冲液，1U的Taq DNA聚合酶；使用这两对引物时设置的PCR程序参数为：95℃变性45s，60℃退火45s，72℃延伸45s，反应进行30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
7.根据权利要求1所述的一种虾夷扇贝PYMSE005微卫星标记的快速检测方法，其特征为：PCR扩增产物经10％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压为5V/cm，每张胶上包括两个分子量标准——pUC19/HaeIII；电泳2-3小时后用浓度为0.15mg/mL的溴化乙锭染色，凝胶成像系统上紫外成像并对电泳谱带进行分析；最后利用软件Quantity One确定每个个体的基因型。
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