CN103320425B - 一种用于大规模、高通量基因分型的贝类dna快速提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，首先选取少量鳃丝组织作为取样组织，然后进行蛋白消化裂解细胞释放DNA，仅需离心吸取上清弃除沉淀，上清溶液稀释后即可用于后续分子标记分型工作，省略了常规DNA提取方法的蛋白抽提和DNA沉淀等过程，其整个流程可在一小时内完成，具有操作快速简单、提取的DNA质量高且保质期长等优点，可用于SNP等常见分子标记的准确分型；而且仅取用贝类的一两根鳃丝，对贝类生存、生长、发育等影响很小，适用于对大量样本或是珍贵样本的研究工作，是一种优良的适用于贝类的快速有效非致死性的DNA的提取方法。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学核酸提取技术领域，具体涉及一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法。
背景技术
在进行群体遗传学分析和分子育种等研究中，常常需要高通量、大规模地对数量众多的个体进行基因分型，并要求不杀死宝贵的生物体，甚至取样不影响其正常的生长发育。DNA在细胞中一般与蛋白质相结合，DNA的提取过程就是将细胞破碎，去除与DNA结合的蛋白质、多糖和脂类等，最后分离、纯化所需的DNA的过程。对于分子生物学的研究，大部分工作的首要任务就是研究材料DNA的提取，而高质量DNA的获得对于后期数据收集及统计推断等的可靠性具有重要影响。然而，在软体动物中，其会分泌大量的黏多糖及多酚蛋白质等，这些物质在DNA提取过程中很难去除干净，会与DNA一同分离纯化出来，因此获得软体动物高质量的DNA并非易事。为解决这一问题，研究者们具有针对性的提出或改进了一些DNA提取方法，有的试剂公司也推出了一些相关的商业试剂盒，如OmegaBio-Tek公司的Mollusc DNA kit。在贝类中，最常用的DNA提取方法为酚-氯仿异戊醇法，通过多遍的抽提来去除多糖和蛋白质从而获得高质量DNA。然而，这些DNA提取方法一般比较繁琐耗时、需要大量的起始组织量，对于研究个体具有较大的伤害，影响生物后续的生长发育，甚至需将其杀死，因此，这些方法并不适用于活体快速取样或是取样不能将研究个体杀死的研究，如分子标记辅助育种。在贝类中，非致死性取样的方法只在贻贝和牡蛎中有过研究，主要通过剪取外套膜进行组织收集用于后续的遗传学分析，然而最近在贻贝中发现，外套膜的剪除会造成较高的致死率和贝壳畸形。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，本发明以贝类的少量鳃丝作为组织来源，对贝类的正常生长不会造成明显影响，可在1小时之内完成DNA的提取,获得的DNA数量和质量可满足高通量开展SSR、SNP等分子标记的准确基因分型。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：
一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，它包括以下步骤：
（1）、剪取贝类的鳃丝组织为取样组织；
（2）、向剪取的鳃丝组织中加入细胞裂解液，使鳃丝悬浮于所述细胞裂解液中，每毫克鳃丝组织加入100ul裂解液，所述细胞裂解液的组分为：100mM NaCl、10mM Tris-HCl和1mM EDTA，所述细胞裂解液的pH为8.0；再向所述细胞裂解液中添加蛋白酶K和SDS，使蛋白酶K浓度为0.3mg/mL，所述SDS的质量体积比为0.50%；
（3）、将步骤（2）得到的混合液置于37-56℃水浴中消化至裂解液变澄清，消化过程中颠倒混匀使细胞充分裂解；
（4）、将步骤（3）得到的混合液置于沸水浴中煮沸以灭活所述蛋白酶K；
（5）、待步骤（4）的溶液冷却后，离心，吸取上清液即DNA溶液，将DNA溶液稀释后即可用于基因分型工作。
进一步的，所述贝类为双壳贝类。
进一步的，所述步骤（1）中剪取贝类的鳃丝组织操作为：首先轻轻的使两贝壳张开10-15mm的距离，并用拇指或器械撑住，在距鳃丝基部1/3处剪取1-2根鳃丝。
进一步的，所述贝类为活体贝类，剪取1-2根鳃丝对活体贝类的生长生活影响非常小。
进一步的，所述步骤（3）中56℃水浴下消化30分钟。
进一步的，所述步骤（4）中沸水浴煮沸10分钟以灭活蛋白酶K。
进一步的，所述步骤（5）中离心为1,2000转离心10分钟。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明所述贝类DNA提取方法首先选取少量鳃丝组织作为取样组织，然后进行蛋白消化裂解细胞释放DNA，仅需离心吸取上清弃除沉淀，上清溶液稀释后即可用于后续分子标记分型工作，省略了常规DNA提取方法的蛋白抽提和DNA沉淀等过程，其整个流程可在一小时内完成，具有操作快速简单、提取的DNA质量高且保质期长等优点，可用于SNP等常见分子标记的准确分型；而且仅取用贝类的一两根鳃丝，对贝类生存、生长、发育等影响很小，适用于对大量样本或是珍贵样本的研究工作，是一种优良的适用于贝类的快速有效非致死性的DNA的提取方法。
附图说明
图1是本发明所述扇贝鳃丝取样的示意图。
图2本发明所提取的DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果，（a）为本发明新提取DNA样品检测结果；（b）为本发明提取DNA样品保存一年后检测结果，（a）和（b）中1、2和3泳道表示利用本发明提取方法提取到的DNA。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明所述贝类为双壳贝类，所述双壳贝类包括扇贝、贻贝和珠母贝等。本实施例以栉孔扇贝为例通过实施例详细叙述本发明。
本发明所述DNA提取方法具体包括以下步骤：
1、分别剪取30只栉孔扇贝的鳃丝组织，取样如图1所示，具体方法如下：为减少取样对扇贝造成的影响，首先轻缓地使扇贝的两贝壳张开约10mm的距离，并用拇指撑住，用解剖剪在距鳃丝基部三分之一处剪取1-2根鳃丝（2mg），将鳃丝保存于-20°C用于后续研究。对取完鳃丝的扇贝继续进行常规培养观察。
因扇贝的鳃丝组织较多，易于新鲜扇贝的取材，当对于活体扇贝取鳃丝组织时，少量鳃丝的剪取对扇贝的生长影响较小，不会对生物个体造成伤害。
2、在1.5ml EP管中加入200ul STE细胞裂解缓冲液（100mM NaCl；10mMTris-HCl；1 mM EDTA，pH 8.0），将步骤1取下的鳃丝悬浮于所述细胞裂解缓冲液中，并加入3ul蛋白酶K（20mg/ml），10ul质量体积比浓度为10%的SDS溶液。
3、将EP管置于56°C水浴中消化30分钟，每隔一段时间颠倒混匀，使细胞充分裂解。
4、将EP管置于100°C水浴中煮沸10分钟灭活蛋白酶K。
5、待溶液冷却后，将EP管置于离心机中1,2000转离心10分钟，吸取上清液即DNA溶液至一新离心管中，-20°C保存，将DNA溶液稀释100倍后用于SNP分型，这里对于10 ul PCR反应体系加入1ul DNA稀释液作为模板即可。
6、DNA质量评价：经1%琼脂糖凝胶电泳检测，图2a所示，发现所得DNA呈现弥散状，长度分布为0.1-50 kb。于保存-20°C保存一年后，再次通过1%琼脂糖凝胶电泳检测发现DNA并未降解，如图2b所示，证明了利用本发明所得DNA的具有很好的稳定性。
7、SNP分型准确率：分别对30个个体的15个SNP位点利用HRM技术进行分型，SNP位点信息如表1所示，结果显示分型准确率可达到100%，证明了本发明所述DNA提取方法的有效性。
表1:本发明所涉及的15个栉孔扇贝SNP位点信息
对上述剪取少量鳃丝的栉孔扇贝的3个月培养观察发现其与对照组（未剪取鳃丝组织的扇贝）在行为表现及死亡率上无明显差异，证明了本发明技术方案不会对扇贝的正常生长造成明显的影响。
本发明所述DNA提取方法具有操作简单、快速有效、成本低廉的优点，而且经实验证明还具有对贝类损伤非常小的优点，适用于大规模活体贝类的遗传研究工作。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (5)
1.一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）、剪取贝类的鳃丝组织为取样组织；
（2）、向剪取的鳃丝组织中加入细胞裂解液，使鳃丝悬浮于所述细胞裂解液中，每毫克鳃丝组织加入100ul裂解液，所述细胞裂解液的组分为：100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl和1 mM EDTA，所述细胞裂解液的pH 为8.0；再向所述细胞裂解液中添加蛋白酶K和SDS，使蛋白酶K浓度为0.3 mg/mL，所述SDS的质量体积比为0.50%；
（3）、将步骤（2）得到的混合液置于37-56℃水浴中消化至裂解液变澄清，消化过程中颠倒混匀使细胞充分裂解；
（4）、将步骤（3）得到的混合液置于沸水浴中煮沸以灭活所述蛋白酶K；
（5）、待步骤（4）的溶液冷却后，离心，吸取上清液即DNA溶液，将DNA溶液稀释后即可用于基因分型工作；
所述贝类为双壳贝类；
所述步骤（1）中剪取贝类的鳃丝组织操作为：首先轻轻的使两贝壳张开10-15 mm的距离，并用拇指或器械撑住，在距鳃丝基部1/3处剪取1-2根鳃丝。
2.根据权利要求1所述的一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，其特征在于：所述贝类为活体贝类，剪取1-2根鳃丝对活体贝类的生长生活影响非常小。
3.根据权利要求1所述的一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中56℃水浴下消化30分钟。
4.根据权利要求1所述的一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤（4）中沸水浴煮沸10分钟以灭活蛋白酶K。
5.根据权利要求1所述的一种用于大规模、高通量基因分型的贝类DNA快速提取方法，其特征在于：所述步骤（5）中离心为1,2000转离心10分钟。
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