CN110373410A - 一种核酸快速裂解液及制备工艺以及其应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种核酸快速裂解液，其包括如下试剂：盐离子溶液、去污剂及蛋白酶K；所述的盐离子溶液包括20 mM Tris‑HCl、400mM NaCl及1 mM EDTA；所述的去污剂成分为10%SDS；所述的蛋白酶K含量为20mg/mL；所述的盐离子溶液中的Tris‑HCl溶液为碱性。本发明还提供了所述的核酸快速裂解液的制备工艺及其应用方法。本发明的核酸快速裂解系统的高稳定性可实现任何组织样本的裂解，且裂解的DNA样本适用于下游PCR靶点片段的扩增需求，显示了较高的稳定性，裂解液可以快速裂解释放生物材料中的核酸DNA，且不影响核酸DNA的用途。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，尤其涉及从生物材料中裂解、检测及核酸应用，特别是一种核酸快速裂解液及制备工艺以及其应用方法。
背景技术
对于利用核酸扩增技术进行分子诊断的主要挑战是扩增前含核酸材料的预处理以及繁杂的核酸提取步骤。目前广泛使用的基于二氧化硅和基于磁珠的技术存在着诸多缺陷，包括效率过低(≤10％)；还有需要针对特定靶标类型进行优化，造成一种样品类型的提取过程通常与其它样品类型不相容；而利用酚氯仿的方法虽然回收率高，但是由于提取液组分的毒性高而限制了其使用范围。重要的是，现行的所有方法均需要进行反复的离心，提取步骤繁杂、耗费时间长、需要特定的设备。
直接PCR（Direct PCR）即直接用未纯化的样本进行PCR扩增，无需核酸纯化步骤，只需微量的原始样本作为PCR反应的模板，为DNA扩增带来前所未有的便捷，节约了大量时间和成本。
目前，直接PCR包含核酸快速抽提和PCR扩增两部分。PCR扩增改造经济成本高，具有一定的技术难度；而经典核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程，传统的裂解液几乎都含有盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等) 和去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等)。盐的主要作用除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)外，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如 NaCl) 等。去污剂则是通过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。最简单的核酸裂解液是水，复杂一点的裂解液会含有Triton X-100、甲酰胺等，更复杂的裂解液会含有诸如Chelex 100 之类的能吸附部分杂质的介质，操作较为简单，多使用温度的变化来实现样品的裂解，如煮沸、或高低温的差异变化等。
发明内容
本发明的目的是适应PCR扩增需求，从核酸裂解液入手，提出的一种核酸快速裂解液及制备工艺以及该核酸快速裂解液的应用方法，核酸快速裂解（15min）系统的高稳定性可实现任何组织样本的裂解，且裂解的DNA样本适用于下游PCR靶点片段的扩增需求，显示了较高的稳定性。
为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的一种核酸快速裂解液，其包括如下试剂：盐离子溶液、去污剂及蛋白酶K；所述的盐离子溶液包括20 mM Tris-HCl、400mM NaCl及1 mM EDTA；所述的去污剂成分为10%SDS；所述的蛋白酶K含量为20mg/mL；所述的盐离子溶液中的Tris-HCl溶液为碱性。
优选的，所述的盐离子溶液中的Tris-HCl溶液的pH为7.6。
根据本发明的另一目的，本发明的所述的核酸快速裂解液的制备工艺包括如下步骤：
S1、制备核酸裂解液组分A，包括：20 mM Tris-HCl pH 7.6、400mM NaCl、1 mM EDTA及10% SDS去污剂；以及，
S2、制备核酸裂解液组分B，包含蛋白酶K试剂，成分配比为20mg/mL。
根据本发明的另一目的，本发明的核酸裂解液裂解血液中DNA的应用方法包括如下步骤：
步骤1：取样本于1.5mL EP管中；
步骤2：加入A组分溶液100μL及组分B溶液2μL混匀；
步骤3：将混合溶液在65℃水浴处理15分钟，取出12000转/分钟离心5分钟，取上清即为裂解的血液DNA；以及，
步骤4：进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压130V，电泳时间20分钟。
优选的，所述的步骤1中的样本为动物组织样本或血液样本。
与现有技术相比，本发明的核酸快速裂解系统的高稳定性可实现任何组织样本的裂解，且裂解的DNA样本适用于下游PCR靶点片段的扩增需求，显示了较高的稳定性，重要的是，起始DNA量的1/10至1/1000即可满足PCR扩增检测的目的；而且裂解液可以快速裂解释放生物材料中的核酸DNA，且不影响核酸DNA的用途，应用操作较为简单。
附图说明
图1所示为利用本发明的核酸快速裂解液裂解的血液样本中核酸DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中1泳道为血液组织DNA、2泳道DNA Marker；
图2所示为利用本发明的核酸快速裂解液裂解的动物组织样本核酸DNA的琼脂糖凝胶电泳检测图，其中1泳道为DNA Marker，2-13泳道依次是阳性对照，裂解的为小鼠心脏、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脚趾、鼠尾、骨骼、毛组织的核酸DNA。
具体实施方式
为使对本发明的目的、构造、特征、及其功能有进一步的了解，兹配合实施例详细说明如下。
本发明的一种核酸快速裂解液，其包括如下试剂：盐离子溶液、去污剂及蛋白酶K；所述的盐离子溶液包括20 mM Tris-HCl、400mM NaCl及1 mM EDTA；所述的去污剂成分为10%SDS；所述的蛋白酶K含量为20mg/mL；所述的盐离子溶液中的Tris-HCl溶液为碱性。在一优选的实施方式中，所述的盐离子溶液中的Tris-HCl溶液的pH为7.6。
本发明的核酸裂解试剂，其中的盐离子溶液中的成分Tris碱，用于提供核酸裂解的盐离子环境，其pH为碱性；盐离子溶液中的成分NaCl，用于维持核酸结构的稳定；盐离子溶液中的成分EDTA，用于抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏。
本发明的核酸裂解试剂，其中的去污剂成分为SDS，用于使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。
本发明的核酸裂解试剂，其中的蛋白酶K用于降解生物材料中的蛋白质。
根据本发明的另一目的，本发明的所述的核酸快速裂解液的制备工艺包括如下步骤：
S1、制备核酸裂解液组分A，包括：20 mM Tris-HCl pH 7.6、400mM NaCl、1 mM EDTA及10% SDS去污剂；以及，
S2、制备核酸裂解液组分B，包含蛋白酶K试剂，成分配比为20mg/mL。
根据本发明的另一目的，本发明的核酸裂解液裂解血液中DNA的应用方法包括如下步骤：
步骤1：取样本于1.5mL EP管中；
步骤2：加入A组分溶液100μL及组分B溶液2μL混匀；
步骤3：将混合溶液在65℃水浴处理15分钟，取出12000转/分钟离心5分钟，取上清即为裂解的血液DNA；以及，
步骤4：进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压130V，电泳时间20分钟。
优选的，所述的步骤1中的样本为5mg动物组织样本或20-30μL的血液样本。
结合图1和图2，其是利用本发明的核酸快速裂解液分别对动物血液样本和动物组织样本进行实际裂解实验的检测结果。
实施例1：
实验步骤：
1. 取血液样本25 μL于1.5mL EP管中；
2. 加入组分A核酸裂解液100μL及组分B核酸裂解液2μL混匀；
3. 将混合液在65℃水浴处理15分钟，取出，用转速为12000r/min的离心机离心5分钟，取上清液即为裂解的血液DNA；
4.进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压130V，电泳时间20分钟。
图1为裂解的血液样本核酸DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的结果图，其中1泳道为血液组织DNA，2泳道为DNA Marker。
实施例2：
实验步骤：
1. 取动物组织样本（9例）各5mg于1.5mL EP管中；
2. 加入组分A核酸裂解液100μL及组分B核酸裂解液2μL混匀；
3. 将混合液在65℃水浴处理15分钟，取出，用转速为12000r/min的离心机离心5分钟，取上清液即为裂解的血液DNA；
4. 进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压130V，电泳时间20分钟。
图2为裂解的动物组织样本核酸DNA的琼脂糖凝胶电泳检测的结果图，其中1泳道为DNA Marker，2～13泳道依次是阳性对照，裂解的分别是小鼠的心脏、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉、脚趾、鼠尾、骨骼、毛组织的核酸DNA。
综上所述，本发明的一种核酸快速裂解液，包括提供核酸裂解环境的盐离子成分、去污剂及蛋白酶K成分，核酸快速裂解系统的高稳定性可实现任何组织样本的裂解，且裂解地DNA样本适用于下游PCR靶点片段的扩增需求，显示了较高的稳定性，重要的是，起始DNA量的1/10至1/1000即可满足PCR扩增检测的目的；核酸快速裂解释放生物材料中的核酸DNA，但是不影响核酸DNA的用途，且操作较为简单；去污剂成分为10%SDS，使得蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相连的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中；核酸快速裂解液的制备，为DNA扩增带来前所未有的便捷，节约了大量的时间和成本。
本发明已由上述相关实施例加以描述，然而上述实施例仅为实施本发明的范例。必需指出的是，已揭露的实施例并未限制本发明的范围。相反地，在不脱离本发明的精神和范围内所作的更动与润饰，均属本发明的专利保护范围。
Claims (5)
1.一种核酸快速裂解液，其特征在于，所述的核酸快速裂解液包括如下试剂：盐离子溶液、去污剂及蛋白酶K；所述的盐离子溶液包括20 mM Tris-HCl、400mM NaCl及1 mM EDTA；所述的去污剂成分为10%SDS；所述的蛋白酶K含量为20mg/mL；所述的盐离子溶液中的Tris-HCl溶液为碱性。
2.如权利要求1所述的一种核酸快速裂解液，其特征在于，所述的盐离子溶液中的Tris-HCl溶液的pH为7.6。
3.一种制备如权利要求1或2所述的核酸快速裂解液的制备工艺，其特征在于，所述的制备工艺包括如下步骤：
S1、制备核酸裂解液组分A，包括：20 mM Tris-HCl pH 7.6、400mM NaCl、1 mM EDTA及10% SDS去污剂；以及，
S2、制备核酸裂解液组分B，包含蛋白酶K试剂，成分配比为20mg/mL。
4.一种应用如权利要求1或2所述的核酸快速裂解液的方法，其特征在于，所述的应用方法包括如下步骤：
步骤1：取样本于1.5mL EP管中；
步骤2：加入A组分溶液100μL及组分B溶液2μL混匀；
步骤3：将混合溶液在65℃水浴处理15分钟，取出12000转/分钟离心5分钟，取上清即为裂解的血液DNA；以及，
步骤4：进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，稳定电压130V，电泳时间20分钟。
5.如权利要求所述的一种应用如权利要求1或2所述的核酸快速裂解液的方法，其特征在于，所述的步骤1中的样本为动物组织样本或血液样本。
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- 2019-06-12 CN CN201910504457.9A patent/CN110373410A/zh active Pending
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