CN105176972A - 一种快速提取全血基因组dna的装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速提取全血基因组DNA的装置，包括有一体化成型的毛细采集管、全血细胞裂解区、流体控制管，还包括有与所述流体控制管相配合的抽吸装置，所述全血细胞裂解区由聚丙烯丝束填充；本发明首次使用聚丙烯丝束/毛细管实现了末梢血基因组DNA提取，本发明的装置和方法操作简单、效率高，无需特殊仪器，实现了基于微流控芯片的全血基因组DNA“样品进-结果出”的目的，所提取的基因组DNA适合于分子诊断的测序、杂交、等温扩增等一系列实验。

Description

一种快速提取全血基因组DNA的装置及其方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种快速提取全血基因组DNA的装置及其方法。

背景技术

核酸是以核苷酸为基本单位的重要生物分子，广泛存在于所有动物、植物细胞、微生物及生物体内。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)。核酸是一切生物细胞的基本成分，也对生物体的生长、发育、繁殖、遗传及变异等重大生命现象起主宰作用。核酸在实践应用方面有极重要的作用，现已发现许多遗传性疾病、肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。因此，对核酸结构、功能与调控的认识是人类在分子水平研究遗传、进化和疾病诊断的基础。目前，核酸研究已成为生命科学中的与多学科广泛交叉、渗透的研究热点及发展前沿。核酸抽提是许多临床、法医学应用及遗传学分析的前提，通过DNA或RNA的提取及纯化过程，消除或减小其他杂质(蛋白质、多糖及脂肪等)对核酸扩增反应的影响。传统的DNA提取方法是自1950年后相继发展起来的固相萃取法(Solid-PhaseExtraction，SPE)和液-液萃取法(酚氯仿法)。这些方法操作步骤繁琐，所使用的提取试剂具有毒害性，限制了其在临床上的推广应用。目前普遍使用的硅胶膜离心柱法，虽简化了操作步骤，但大片段DNA强力结合于膜上，难洗脱，导致离心过柱时DNA易断裂，影响下游实验包括测序、克隆、PCR、转化、微注射、转染和微阵列分析。静脉血为目前普遍用于全血基因组DNA提取的样本，静脉采血可能发生皮下出血或局部红肿、局部皮肤过敏反应、误穿刺入动脉及采血失败等并发症。此外，婴幼儿静脉采血难度比较大，因此，亟需开发一种快速、高效、适合于临床床旁检测的微量全血基因组的提取装置和方法。微流控芯片技术是指操作微小网络通道中流体的科学技术。与常规的实验技术相比，此技术极大降低了试剂的消耗量、降低成本同时产生极少的废液，而且在微流体通道中，传热、传质速度比常规体系快，反应时间或分析时间都大大缩短。目前，许多研究利用微流控技术实现了微量全血基因组DNA的提取，但都需特殊辅助设备，仍采用静脉血作为检测样本，不能实现末梢全血基因组DNA提取的POCT。

发明内容

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种集末梢血采集，全血基因组核酸提取及纯化的装置和相应方法，实现微量全血基因组DNA的快速、高效提取。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种快速提取全血基因组DNA的装置，包括有一体化成型的毛细采集管、全血细胞裂解区、流体控制管，还包括有与所述流体控制管相配合的抽吸装置，所述全血细胞裂解区由聚丙烯丝束填充。

为了进一步完善和优化上述的装置，本发明采取的技术措施还包括：

优选地，上述毛细采集管、全血细胞裂解区以及流体控制管均为玻璃材料制作。

优选地，上述抽吸装置为橡胶滴头，即胶头滴管的滴头。

优选地，还包括能够密封毛细采集管的采集管封管器，以及能够密封流体控制管的控制管封管器。

优选地，上述毛细采集管长2-6cm，管壁厚度为0.1-0.4mm，内径为0.5-0.7mm；更优选地，上述毛细采集管长度为4cm，内径为0.5mm，外径为0.7mm，管壁厚度为0.1mm。

优选地，上述流体控制管长1-3cm，管壁厚度为0.1-0.4mm，内径为1-1.2mm；更优选地，上述流体控制管长2cm，内径为1mm，外径为1.2mm，管壁厚度为0.1mm。

优选地，上述全血细胞裂解区管壁厚度为0.1-0.4mmm，容积为100-130μl；更优选地，全血细胞裂解区为直径6mm的圆球形(以外壁计算)，管壁厚度为0.2mm。

另一方面，本发明还提供一种快速提取全血基因组DNA的方法，使用上述装置进行，包括以下步骤：

步骤一，利用毛细采集管采集末梢血5-20μl，使用抽吸装置将采集的末梢血吸入全血细胞裂解区中；

步骤二，利用抽吸装置将10-40μl裂解液吸入全血细胞裂解区中进行细胞裂解，裂解温度为56℃，持续10分钟；

步骤三，利用抽吸装置将15-60μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区中。

步骤四，利用抽吸装置将100-130μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解区进行漂洗，漂洗过程反复进行2-5次；

步骤五，利用抽吸装置将25-100μl去离子水吸入全血细胞裂解区将DNA洗脱，获得全血基因组DNA；

其中，所述步骤二中裂解液中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mMEDTA，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K。

为了进一步优化上述的方法，本发明所采取的技术措施还包括：

优选地，上述步骤一中采集末梢血为10μl，上述步骤二中利用抽吸装置将20μl裂解液吸入全血细胞裂解区中进行细胞裂解。

优选地，上述步骤三中利用抽吸装置将30μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区中，上述步骤五中利用抽吸装置将50μl去离子水吸入全血细胞裂解区将DNA洗脱，获得全血基因组DNA。

聚丙烯丝束具有无毒、无味，耐热、化学性能好，不吸水，常见的酸、碱等有机溶剂对它几乎不起作用等特点。聚丙烯丝束具有多孔隙结构可作为滤材，广泛作为香烟中滤嘴，对烟气中焦油、烟碱(俗称尼古丁)、一氧化碳等物质进行吸附过滤。

一方面，本发明采用无水乙醇沉淀DNA，DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。另一方面，在pH为8的裂解液中，DNA分子带负电荷，一定浓度的NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。因此，乙醇沉淀DNA时，一定浓度NaCl进一步促进了DNA聚合沉淀。DNA吸附在若干疏水性的聚丙烯丝束大孔隙里之后再用75％乙醇漂洗，将盐、多糖、蛋白等杂质被去除，DNA仍然吸附在聚丙烯丝束上。最后，用去离子水进行洗脱，溶于水的DNA从聚丙烯丝束上解离，从而得到纯化的基因组DNA。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明首次使用聚丙烯丝束/毛细管实现了末梢血基因组DNA提取，本发明的装置和方法操作简单、效率高，无需特殊仪器，实现了基于微流控芯片的全血基因组DNA“样品进-结果出”的目的，所提取的基因组DNA适合于分子诊断的测序、杂交、等温扩增等一系列实验。

附图说明

图1为本发明的一种快速提取全血基因组DNA的装置的结构示意图；

图2为本发明装置中全血细胞裂解区填充的聚丙烯丝束的单根丝束10微米刻度下的扫描电镜结果；

图3为本发明装置中全血细胞裂解区填充的聚丙烯丝束的单根丝束0.2微米刻度下的扫描电镜结果；

图4为琼脂糖凝胶电泳分析提取的基因组DNA结果图。

具体实施方式

图1为本发明的一种快速提取全血基因组DNA的装置的结构示意图，其中的附图标记为毛细采集管1、全血细胞裂解区2、流体控制管3、抽吸装置4、采集管封管器5、控制管封管器6。

本发明提供了一种快速提取全血基因组DNA的装置，包括有一体化成型的毛细采集管1、全血细胞裂解区2、流体控制管3，还包括有与所述流体控制管3相配合的抽吸装置4，所述全血细胞裂解区2由聚丙烯丝束填充。

本发明的装置主体毛细管采用玻璃材质，经毛细管拉针器制作而成。

聚丙烯丝束具有无毒、无味，耐热、化学性能好，不吸水，常见的酸、碱等有机溶剂对它几乎不起作用等特点。聚丙烯丝束具有多孔隙结构可作为滤材，广泛作为香烟中滤嘴，对烟气中焦油、烟碱(俗称尼古丁)、一氧化碳等物质进行吸附过滤。本发明采用聚丙烯丝束结合毛细管提取末梢血基因组DNA。聚丙烯丝束的扫描电镜结果见图2和图3(单根丝束表面的电镜结果)，可见聚丙烯丝束表面具有多孔隙结构，其极高的孔密度和孔隙率的特点，在一定的条件下可高效吸附DNA。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例一

操作人员采血员利用毛细采集管1刺入受试者皮肤采集末梢血5μl，使用抽吸装置4将采集的末梢血全部吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将10μl裂解液吸入全血细胞裂解区2中进行细胞裂解，使用采集管封管器5、控制管封管器6分别密封毛细采集管1和流体控制管3，56℃持续10分钟；然后去除封管器5及封管器6，利用抽吸装置4将15μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将100μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解区2进行漂洗，漂洗过程反复进行2次；最后，利用抽吸装置4将25μl去离子水吸入全血细胞裂解区2将DNA洗脱，收集洗脱液；利用获得的全血基因组DNA进行下一步的测定。

裂解液pH为8，其中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mMEDTA，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K。

实施例二

操作人员采血员利用毛细采集管1刺入受试者皮肤采集末梢血10μl，使用抽吸装置4将采集的末梢血全部吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将20μl裂解液吸入全血细胞裂解区2中进行细胞裂解，使用采集管封管器5、控制管封管器6分别密封毛细采集管1和流体控制管3，56℃持续10分钟，裂解液pH为8，其中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mMEDTA，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K；然后利用抽吸装置4将30μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将110μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解区2进行漂洗，漂洗过程反复进行3次；最后，利用抽吸装置4将50μl去离子水吸入全血细胞裂解区2将DNA洗脱，收集洗脱液；利用获得的全血基因组DNA进行下一步的测定。

实施例三

操作人员采血员利用毛细采集管1刺入受试者皮肤采集末梢血20μl，使用抽吸装置4将采集的末梢血全部吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将40μl裂解液吸入全血细胞裂解区2中进行细胞裂解，使用采集管封管器5、控制管封管器6分别密封毛细采集管1和流体控制管3，56℃持续10分钟，裂解液pH为8，其中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mMEDTA，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K；然后去除封管器5及封管器6，利用抽吸装置4将60μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区2中；利用抽吸装置4将110μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解区2进行漂洗，漂洗过程反复进行5次；最后，利用抽吸装置4将100μl去离子水吸入全血细胞裂解区2将DNA洗脱，收集洗脱液；利用获得的全血基因组DNA进行下一步的测定。

利用琼脂糖凝胶电泳分析上述实施例提取的基因组DNA结果见图4。M泳道为λDNA/HindⅢ电泳结果；1泳道为λDNA的电泳结果(50kb)；2，3，4泳道分别对应于实施例一、实施例二和实施例三末梢血提取的DNA电泳结果。利用本发明的装置和方法提取的基因组DNA为30-50kb的单一电泳条带，显示了DNA的完整性。

本发明首次使用聚丙烯丝束/毛细管实现了末梢血基因组DNA提取，本发明的装置和方法操作简单、效率高，无需特殊仪器，实现了基于微流控芯片的全血基因组DNA“样品进-结果出”的目的，所提取的基因组DNA适合于分子诊断的测序、杂交、等温扩增等一系列实验。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种快速提取全血基因组DNA的装置，其特征在于，包括有一体化成型的毛细采集管(1)、全血细胞裂解区(2)、流体控制管(3)，还包括有与所述流体控制管(3)相配合的抽吸装置(4)，所述全血细胞裂解区(2)由聚丙烯丝束填充。

2.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述毛细采集管(1)、全血细胞裂解区(2)以及流体控制管(3)均为玻璃材料制作。

3.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，所述抽吸装置(4)为橡胶滴头。

4.根据权利要求1所述的装置，其特征在于，还包括能够密封毛细采集管(1)的采集管封管器(5)，以及能够密封流体控制管(3)的控制管封管器(6)。

5.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述毛细采集管(1)长2-6cm，管壁厚度为0.1-0.4mm，内径为0.5-0.7mm。

6.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述流体控制管(3)长1-3cm，管壁厚度为0.1-0.4mm，内径为1-1.2mm。

7.根据权利要求1或2所述的装置，其特征在于，所述全血细胞裂解区(2)管壁厚度为0.1-0.4mmm，容积为100-130μl。

8.一种快速提取全血基因组DNA的方法，其特征在于，使用如权利要求1-7任意一项所述装置进行，包括以下步骤：

步骤一，利用毛细采集管(1)采集末梢血5-20μl，使用抽吸装置(4)将采集的末梢血吸入全血细胞裂解区(2)中；

步骤二，利用抽吸装置(4)将10-40μl裂解液吸入全血细胞裂解区(2)中进行细胞裂解，裂解温度为56℃，持续10分钟；

步骤三，利用抽吸装置(4)将15-60μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区(2)中；

步骤四，利用抽吸装置(4)将100-130μl的75％乙醇吸入全血细胞裂解区(2)进行漂洗，漂洗过程反复进行2-5次；

步骤五，利用抽吸装置(4)将25-100μl去离子水吸入全血细胞裂解区(2)将DNA洗脱，获得全血基因组DNA；

其中，所述步骤二中裂解液pH为8，其中的组分和浓度为：10mMTris-Cl，15mMNaCl，10mMEDTA，0.4％SDS，200μg/ml蛋白酶K。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤一中采集末梢血为10μl，所述步骤二中利用抽吸装置(4)将20μl裂解液吸入全血细胞裂解区(2)中进行细胞裂解。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤三中利用抽吸装置(4)将30μl无水乙醇吸入全血细胞裂解区(2)中，所述步骤五中利用抽吸装置(4)将50μl去离子水吸入全血细胞裂解区(2)将DNA洗脱，获得全血基因组DNA。