CN1749264A - 核酸提取方法以及核酸游离方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的涉及简便而且快速地从生物材料中游离并提取核酸。本发明涉及核酸提取技术，其包括：使含有细胞的生物材料通过固相载体而分离细胞，然后使该细胞和细胞溶解试剂的混合液通过该固相载体而游离细胞中的核酸，再将该游离核酸和核酸结合试剂的混合液通过该固相载体，使核酸与固相载体结合。作为具有固相载体的器具，可举出例如在注射器内部固定有固相载体的器具，通过注射器加减压力，将溶液从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，使溶液通过固相载体。固相载体优选其内部具有多个水通路的固相和由纤维状物质构成的网状固相，并且在溶解从含有细胞的生物试料中分离的细胞使核酸游离后，能结合核酸。

Description

核酸提取方法以及核酸游离方法
技术领域
本发明涉及从生物材料中提取核酸的技术。例如，涉及从全血中含有的白细胞中回收RNA的技术。
背景技术
由核酸分析得到的基因信息在医疗、临床检查、医药品产业、食品产业等各种领域得到充分利用。在该核酸分析中，从血液、血清、尿等生物材料含有的细胞中分离、精制核酸的核酸提取操作是必须的前处理，并且要求被提取的核酸具有高纯度，不含有影响核酸性状的物质和防碍核酸分析的主要物质。
作为核酸提取方法，通常包括非专利文献B.vogelstein and D.Gillespie，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76(2)，615-619(1979)中报道的基于在离液序列高(chaotropic)的试剂的存在下核酸结合到硅石上的性质的方法，或者专利文献特开2001-95572号公报、特开2002-360245号公报中公开的基于在有机溶剂的存在下核酸结合到硅石上的性质的方法。
但是，为了提取高精制度的核酸，优选从生物材料中分离细胞，再溶解细胞使核酸处于游离状态后进行核酸提取。
例如，在非专利文献QlAamp RNA Blood Mini protocol and troubleshooting、2001年10月中公开了从血液中除去红细胞后，从分离得到的白细胞中提取RNA的核酸提取技术。具体是首先用红细胞溶解液溶解血液中的红细胞，然后通过离心操作分离白细胞。然后再向分离得到的白细胞中添加具有蛋白质变性作用和RNA分解酶失活作用的离液序列高的(chaotropic)盐溶液，使用机械均质器溶解白细胞。最后，向白细胞溶解液中添加乙醇，使其与硅石质固相载体接触，RNA结合到固相载体上，洗涤除去杂质后，从固相载体上洗脱RNA。
发明内容
非专利文献QlAamp RNA Blood Mini protocol and trouble shooting 2000年10月公开的核酸提取方法能得到高纯度的核酸，但有必要使用离心机、机械均质器和核酸提取器具等不同装置和器具，使核酸提取操作变得复杂，并且核酸提取需要时间。核酸提取越是需要时间，提取核酸的性状受到影响的问题就越明显。
所以本发明的目的涉及简便而且短时间地从生物材料中游离并提取核酸。
本发明涉及核酸提取技术，其包括：使含有细胞的生物材料通过固相载体而分离细胞，然后使该细胞和细胞溶解试剂的混合液通过该固相载体而游离细胞中的核酸，再将该游离核酸和核酸结合试剂的混合液通过该固相载体，使核酸与固相载体结合。
本发明还涉及一种核酸提取技术，该技术是使细胞和细胞溶解试剂的混合液通过固相载体而游离细胞中的核酸，然后将该游离核酸和核酸结合试剂的混合液通过该固相载体，使核酸与固相载体结合。
另外，本发明还涉及一种核酸游离技术，该技术是将含有细胞的生物材料通过固相载体借以分离细胞，然后将该细胞和细胞溶解试剂的混合液通过该固相载体使细胞中的核酸游离。
作为具有固相载体的器具，可举出例如在注射器内部固定有固相载体的器具、在管尖前端固定有固相载体的器具、或在可在离心机中使用的旋转柱上固定有固相载体的器具等。在注射器内部固定有固相载体的器具是通过注射器加减压力，将溶液从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，使溶液通过固相载体。在管尖前端固定有固相载体的器具，是通过与管尖连接的移液器(pipettor)或注射器加减压力将溶液从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，使溶液通过固相载体。另外，在可在离心机中使用的旋转柱上固定有固相载体的器具，利用离心力将溶液从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，使溶液通过固相载体。
固相载体优选其内部具有多个水通路的固相和由纤维状物质构成的网状固相，并且能从含有细胞的生物体材料中捕捉细胞。另外，优选能通过含有离液序列高的物质等的核酸结合试剂的作用使核酸结合的固相。例如，优选由玻璃纤维、玻璃粒子、硅石粒子、石英棉或以上物质的粉碎物、硅藻土等含有氧化硅的物质构成，并且具有多个最大孔径是2微米～20微米的孔。另外，在这些物质中还可以配合由聚丙烯、聚酯、尼龙等纤维和粒子构成的、具有多个最大孔径是2微米～20微米的孔的物质。
利用本发明能从生物材料中容易且快速地进行核酸的游离和提取。
附图说明
图1表示提取用注射器的概略截面图。
图2表示提取用注射器的概略斜视图。
图3表示固定在提取用注射器内的固相载体的概略截面图。
图4表示侧面有孔的提取用注射器的概略截面图。
图5表示侧面有孔的提取用注射器的概略斜视图。
图6表示提取用旋转柱的概略截面图。
图7表示提取用旋转柱的概略斜视图。
其中，
10注射器本体          20柱塞          30喷嘴          40固相载体单元          41固相载体
42、43保持构件        44支持部        50侧面孔        60柱本体                70溶液接收器
101、701圆筒部        102、702开口部  103、703底部    104保持部               105、
301连接部             201柱塞本体     202安装部       203密封片               204突起
302筒状部。
具体实施方式
下面针对上述以及其他的本发明的新颖特征和效果，参照附图进行说明。另外，附图专门用于说明，并不是限定本发明。
实施例
本实施例是核酸提取方法，该方法由从生物材料中分离细胞的第一工序、溶解细胞使核酸呈游离状态的第二工序、使核酸与固相载体结合，洗涤除去杂质，然后从固相载体上洗脱核酸的第三工序组成。在本实施例中，利用保持有一个固相载体的器具实施第一工序、第二工序和第三工序，不仅使操作简化、而且使核酸提取在短时间内完成。换言之，第一工序和第二工序利用保持有规定的固相载体的器具实施，使操作简化、并使得核酸提取在短时间内完成。换言之，第二工序和第三工序利用保持有规定的固相载体的器具实施，使操作简化、并使得核酸提取在短时间内完成。
用于本实施例的具有固相载体的器具，例如是在注射器内部固定有固相载体的器具、在管尖前端固定有固相载体的器具、或在可在离心机中使用的旋转柱上固定有固相载体的器具等。在注射器内部固定有固相载体的器具，是通过注射器加减压力将溶液从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，使溶液通过固相载体。在管尖前端固定有固相载体的器具，是通过与管尖连接的移液器和注射器加减压力将溶液从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，使溶液通过固相载体。另外，在可在离心机中使用的旋转柱内部固定有固相载体的器具，利用离心力将溶液从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，使溶液通过固相载体。
固相载体优选由玻璃纤维、玻璃粒子、硅石粒子、石英棉或以上物质的粉碎物、硅藻土等含有氧化硅的物质构成，并且具有多个最大孔径是2微米～20微米的孔。另外，在这些物质中还可以配合由聚丙烯、聚酯、尼龙等纤维和粒子构成的、具有多个最大孔径是2微米～20微米的孔的物质。
另外，利用保持有规定的固相载体的器具只实施第一工序和第二工序的情况下，可以单独使用由聚丙烯、聚酯、尼龙等纤维和粒子构成的、具有多个最大孔径是2微米～20微米的孔的物质。
下面对本实施例中核酸提取的基本步骤和用于核酸提取的试料及试剂进行说明。
第一工序是从生物材料中分离细胞的工序。在第一工序中，利用保持有固相载体的器具使溶液状态的生物材料从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间，通过固相载体的内部，从而使生物材料中含有的细胞在固相载体表面以及内部被捕捉。
作为含有具有核酸的细胞的生物材料，包括含有白细胞的全血、含有细菌类的痰、尿、粪便、培养细菌等，或培养细胞等。例如，在全血中，以全血中含有的白细胞的DNA、或RNA作为对象，从全血中分离白细胞的情况下，优选进行用氯化铵溶液和食盐水溶解红细胞的前处理。
第二工序是溶解细胞使核酸呈游离状态的工序。在第二工序中，利用完成第一工序的器具，使含有离液序列高的试剂的溶液通过固相载体的内部，从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间。由此，固相载体捕捉的细胞被该溶液润湿，化学性溶解细胞，同时与固相载体接触促进物理性溶解，从而使核酸呈游离状态。
作为离液序列高的试剂可以使用碘化钠、碘化钾、硫氰酸钠、硫氰酸胍、盐酸胍。另外，除了离液序列高的试剂以外，还可以添加表面活性剂和蛋白质分解酶。
第三工序是使核酸与固相载体结合，洗涤除去杂质，然后从固相载体上洗脱核酸的工序。在第三工序中，向经过第二工序的含有离液序列高的试剂的溶液中添加有机溶剂，混合。然后利用完成第二工序的器具，使含有游离状态的核酸、离液序列高的试剂和有机溶剂的混合溶液通过固相载体的内部，从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间。通过此操作，核酸结合到固相载体上。作为有机溶剂，可以使用从脂肪族醇、脂肪族醚、脂肪族酯、脂肪族酮中选择的1种或2种或2种以上具有碳原子数为2～10个的化合物的组合。作为脂肪族醇，优选使用乙醇、异丙醇、丙醇、丁醇。作为脂肪族醚，优选使用乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、丙二醇二甲醚、丙二醇二乙醚、二乙二醇二甲醚、二乙二醇二乙醚。作为脂肪族酯，优选使用丙二醇单甲醚乙酸酯、乳酸乙酯。作为脂肪族酮，优选使用丙酮、羟基丙酮、甲基酮。
接下来，针对结合有核酸的器具，使洗涤液通过固相载体的内部，从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间。由此洗涤除去结合在固相载体上的杂质。作为洗涤液，为了不溶解与固相载体结合的核酸，并且能有效地除去非特异性结合物，使用含有乙醇等有机溶剂的低盐浓度缓冲液。另外，还可以向含有乙醇等有机溶剂的低盐浓度缓冲液中加入离液序列高的试剂和表面活性剂。
接下来，针对已经洗涤除去杂质的上述器具，使洗脱溶液通过固相载体的内部，从被固相载体隔开的一侧空间移至另一侧空间。通过此操作，洗脱与固相载体结合的核酸。作为洗脱溶液，为了有效洗脱结合于固相上的核酸，并且不影响核酸的性状，使用经过除去核酸分解酶、或经过核酸分解酶失活处理的纯水和/或低盐浓度缓冲液等。
实施例1
在本实施例中，作为保持有固相载体的器具，使用保持有固相载体的提取用注射器，从全血中提取RNA。以下针对其内容进行说明。
<保持有固相载体的器具>
图1表示提取用注射器的概略截面图。图2表示提取用注射器的概略斜视图。图3表示固定在提取用注射器内的固相载体的概略截面图。下面参照图1～图3，对提取用注射器进行说明。
提取用注射器是在Terumo公司(テルモ社)生产的30毫升注射器(密封式lock type)的注射器内部固定有固相载体的器具。提取用注射器由注射器本体10、柱塞20、喷嘴30以及固相载体单元40构成。喷嘴一侧称为下侧，柱塞一侧称上侧。
注射器本体10具有：圆筒状的圆筒部101、上端的开口部102、下端的底部103、设计在开口部102周围的帽檐形的保持部104、为连接设计在底部103的喷嘴的连接部105。
柱塞20包括柱塞本体201和密封片203。密封片203作为柱塞本体201之外的构件而形成，安装在柱塞本体201下端的安装部202。密封片203下端具有圆锥状突起204。
喷嘴30包括上端的连接部301和向下延伸的筒状部302。喷嘴的连接部301与注射器本体的连接部105通过螺丝连接起来。
注射器本体10以及柱塞本体201由聚丙烯形成，密封片203由橡胶形成，喷嘴30由不锈钢形成。
固相载体单元40由圆板状固相载体41、配置在固相载体41上侧和下侧的2个圆板状保持构件42、43以及圆筒状支持部44构成。保持构件42、43以及圆筒状支持部44由聚丙烯形成。
固相载体41使用的是将构成Whatman社生产的玻璃纤维滤纸(GMF150)的疏层分取下来后，在将该疏层2张重叠的状态下，利用冲压机状刀具打穿成圆板形状的物质。玻璃纤维滤纸(GMF150)具有2.0微米的粒子保持能，由最大孔径为2.0微米左右的密层和最大孔径为10微米左右的疏层构成。在本实施例中，利用保持有固相载体的器具，由于将溶液多次吸入排出，只使用疏层而提高了通液性，并且重叠数张，由此细胞捕捉效率提高。
<生物材料>
生物材料使用含有白细胞的人全血，以白细胞的RNA作为提取对象。
<试剂>
红细胞溶解液：155mM氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.1mM EDTA
离液序列高的溶液：4M硫氰酸胍，8mM MES-KOH(pH5.5)
有机溶剂：50％二乙二醇二甲醚水溶液
洗涤液：80％乙醇水溶液
洗脱液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1mM EDTA
<容器>
提取用容器：50毫升离心沉降管(聚丙烯制)
精制品用容器：5毫升离心沉降管(聚丙烯制)
<核酸提取工序>
核酸提取工序的步骤如下所示。
1.将2毫升人全血分注入提取用容器。
2.向提取用容器中添加10毫升红细胞溶解液，与人全血混合。
3.将混合液在冰上孵育5分钟。
4.用提取用注射器吸入混合液并排出，弃掉溶液。
5.用提取用注射器吸入2毫升离液序列高的溶液，并排出，重复5次，将溶液排出到提取用容器中。
6.向排出到提取用容器中的离液序列高的溶液中添加2毫升有机溶剂，混合。
7.用提取用注射器吸入混合液并排出，重复5次，弃掉溶液。
8.用提取用注射器吸入10毫升洗涤液并排出，重复3次，弃掉溶液。
9.用提取用注射器吸入10毫升洗涤液并排出，重复3次，弃掉溶液。
10.用提取用注射器吸入2毫升洗脱液并排出，重复10次，将溶液排除精制品用容器中。
<提取结果>
本实施例中提取核酸的浓度及纯度、提取操作所需要的时间如表1所示。核酸浓度与以往的方法比较略有降低，核酸纯度相同。所需要的时间与以往的方法比较大幅度缩短。但是，以往的方法使用QIAGEN社生产的RNA提取试剂盒(QIAamp RNA Blood Mini Kit)，按照操作说明书进行提取操作。具体是用离心机从血液中分离白细胞，用旋转柱方式的细胞粉碎器具溶解白细胞，用旋转柱方式的保持有固相载体的器具进行核酸的结合、洗涤以及洗脱。提取核酸的浓度是利用分光光度计测定在核酸的最大吸收波长260纳米处的吸光度，以1A260＝40微克/毫升换算。核酸纯度是以260纳米处吸光度与在作为杂质的蛋白质的吸收波长280纳米处吸光度的比值(A260/A280)计算。通常在核酸纯度高的情况下，A260/A280的值为1.7～1.9。
以往从全血中提取RNA的情况下，在各工序中需要使用离心机、机械均质器、核酸精制试剂盒等器具，因此提取操作复杂，操作需要长时间。但是，在本实施例中，利过提取注射器这一个器具进行全部工序，不仅简化了提取操作，而且能够大幅度缩短操作所需要的时间。另外，缩短该操作所需要的时间，具有能减轻由于RNA分解酶在提取操作过程中对RNA性状的影响的效果。因而，尽管提取核酸浓度与以往相比有所降低，但简化操作、大幅度缩短提取操作所需要的时间的效果明显。
实施例2
在本实施例中，使用侧面有孔的保持有固相载体的提取用注射器作为保持有固相载体的器具，从全血中提取RNA。以下以与实施例1的不同点为中心对其内容进行说明。
<保持有固相载体的器具>
图4表示侧面有孔的提取用注射器的概略截面图。图5表示侧面有孔的提取用注射器的概略斜视图。下面参照图4、图5，对提取用注射器进行说明。
侧面有孔的提取用注射器是，针对[实施例1]的提取用注射器，在其注射器本体10的圆筒部101的侧面追加加工侧面孔50，并且改变固相载体41而成。
侧面有孔的提取用注射器的侧面孔50，设置在比固相载体单元40的最上部高、并且比将柱塞20升到最高处状态时的密封片203的圆锥状突起204的最下部低的位置。侧面孔50的直径是使移液器等的前端进入那样的大小。侧面有孔的提取用注射器是在柱塞20升到最高处状态时，能用移液器等从侧面孔50向注射器本体10的内部注入溶液。然后通过下降柱塞20，能使注入的溶液通过固相载体而排出。
固相载体41使用的是利用冲压机状刀具将Whatman社生产的玻璃纤维滤纸(GMF150)打穿成圆板形状的物质。另外，将构成玻璃纤维滤纸(GMF150)的密层和疏层的疏相侧作为上部设置在固相载体单元40上。在本实施例中，利用保持有固相载体的器具，由于以一个方向排出溶液，使用密层能提高细胞捕捉效率，而且将疏层设置在密层的上侧，防止了固相载体的堵塞。
<生物材料>
与实施例1相同。
<试剂>
红细胞溶解液：155mM氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.1mM EDTA
离液序列高的溶液：4M硫氰酸胍，8mM MES-KOH(pH5.5)
有机溶剂：50％二乙二醇二甲醚水溶液
洗涤液：80％乙醇水溶液
洗脱液：10mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.1mM EDTA
<容器>
与实施例1相同。
<核酸提取工序>
核酸提取工序的步骤如下所示。
1.将2毫升人全血分注入提取用容器。
2.向提取用容器中添加10毫升红细胞溶解液，与人全血混合。
3.将混合液在冰上孵育5分钟。
4.在将侧面有孔的提取用注射器的柱塞升至最上部的状态下，用移液器从侧面孔将混合液注入注射器内部。
5.将侧面有孔的提取用注射器的柱塞向下压，排出注射器内部的混合液。
6.在将侧面有孔的提取用注射器的柱塞升至最上部的状态下，用移液器从侧面孔将红细胞溶解液注入注射器内部。
7.将侧面有孔的提取用注射器的柱塞向下压，排出注射器内部的红细胞溶解液。
8.用提取用注射器吸入2毫升离液序列高的溶液，并排出，重复5次，排出到提取用容器中。
9.向排出在提取用容器中的离液序列高的溶液中添加2毫升有机溶剂，混合。
10.用提取用注射器吸入混合液并排出，重复5次，弃掉溶液。
11.用提取用注射器吸入10毫升洗涤液并排出，重复3次，弃掉溶液。
12.用提取用注射器吸入10毫升洗涤液并排出，重复3次，弃掉溶液。
13.用提取用注射器吸入2毫升洗脱液并排出，重复10次，将溶液排出到精制品用容器中。
<提取结果>
本实施例中提取核酸的浓度及纯度、提取操作所需要的时间如表1所示。核酸浓度与实施例1比较增加，与以往的方法基本相同。核酸纯度与所需要的时间与实施例1相当。
在本实施例中，由于使用侧面有孔的提取用注射器，在从血液中分离白细胞的工序中，以从注射器内部到外部一个方向使血液和红细胞溶解液的混合液通过密孔径的固相载体。这样提高了白细胞的分离效率，增加了提取核酸的浓度。
实施例3
在本实施例中，作为保持有固相载体器具，使用保持有固相载体的提取用旋转柱，从全血中提取RNA。以下以与实施例1、2的不同点为中心对其内容进行说明。
<保持固相载体的器具>
图6表示提取用旋转柱的概略截面图。图7表示提取用旋转柱的概略斜视图。下面，参照图6和图7对提取用旋转柱进行说明。
提取用旋转柱由柱本体60、固相载体单元40、溶液接收器70构成。柱本体侧被称为下侧，溶液接收器侧被称为上侧。
柱本体60包括圆筒状的圆筒部101、上端的开口部102、下端的底部103、设计在开口部102周围的帽檐形的保持部104。
固相载体单元40与提取用注射器相同。
溶液接收器70包括圆筒状的圆筒部701、上端的开口部702、下端的底部703。圆筒部701的内径比柱本体的圆筒部101的外径大，上端的开口部702的外径比帽檐状的保持部104的短径小。
柱本体60和溶液接收器70由聚丙烯形成。
向提取用旋转柱的柱本体60的内部注入溶液，然后在离心机上离心，使柱本体内部的溶液通过固相载体，从柱本体60的开口部落入溶液接收器。固相载体与实施例2相同。
<生物材料>
与实施例1相同。
<试剂>
与实施例1相同。
<容器>
与实施例1相同。
<离心机>
离心机：Himac CR5B2(日立工机)
<核酸提取工序>
核酸提取工序的步骤如下所示。
1.将2毫升人全血分注入提取用容器。
2.向提取用容器中添加10毫升红细胞溶解液，与人全血混合。
3.将混合液在冰上孵育5分钟。
4.将混合液从提取用旋转柱上部注入柱本体内部。
5.将提取用旋转柱放入离心机中，以200×g离心1分钟。
6.弃掉溶液接收器内的溶液，将5毫升红细胞溶解液从提取用旋转柱上部注入柱本体内部。
7.将提取用旋转柱放入离心机中，以300×g离心1分钟。
8.弃掉溶液接收器内的溶液，将2毫升离液序列高的溶液从提取用旋转柱上部注入柱本体内部。
9.将提取用旋转柱放入离心机中，以2000×g离心2分钟。
10.向接收容器的溶液中添加2毫升有机溶剂，混合，从提取用旋转柱上部注入柱本体内部。
11.将提取用旋转柱放入离心机中，以2000×g离心2分钟。
12.弃掉溶液接收器内的溶液，将10毫升洗涤液从提取用旋转柱上部注入柱本体内部。
13.将提取用旋转柱放入离心机中，以2000×g离心2分钟。
14.弃掉溶液接收器内的溶液，将10毫升洗涤液从提取用旋转柱上部注入柱本体内部。
15.将提取用旋转柱放入离心机中，以3000×g离心5分钟。
16.弃掉溶液接收器内的溶液，配置一个新的溶液接收器，将2毫升洗脱液从提取用旋转柱上部注入柱本体内部。
17.将提取用旋转柱放入离心机中，以2000×g离心2分钟。
18.将溶液接收器内的溶液注入精制品用容器。
<提取结果>
本实施例中提取核酸的浓度及纯度、提取操作所需要的时间如表1所示。提取核酸的浓度、纯度与实施例2几乎相同。所需要的时间比实施例1长。
在本实施例中，通过使用提取用旋转柱，利用离心机，以从柱本体内部到外部一个方向使全部工序的溶液通过密孔径的固相载体。因此所需要的时间比实施例1延长，但省去了实施例1的吸排操作，减轻了操作的劳动量。
实施例4
在本实施例中，作为保持有固相载体器具，使用保持有固相载体的分离、溶解用注射器，从全血中分离白细胞，溶解白细胞而游离RNA后，利用RNA提取试剂盒提取RNA。以下以与实施例1、2、3的不同点为中心对其内容进行说明。
<保持有固相载体的器具>
本实施例中使用的保持有固相载体的分离、溶解用注射器是，对于实施例2的侧面有孔的提取用注射器，其固相载体41由聚丙烯微细纤维的集合体构成、测定的最大孔径约为5微米的过滤器状物体。在本实施例中，利用分离、溶解用注射器的固相载体，只进行白细胞的捕捉和溶解，不进行核酸的结合。因而，作为固相载体不使用在离液序列高的试剂和有机溶剂存在下具有与核酸相结合的能力的玻璃纤维滤纸，而使用具有白细胞捕捉能力和溶解能力的利用聚丙烯纤维的过滤器。除聚丙烯以外，聚酯、尼龙等，由于具有细胞吸附性，因而与玻璃纤维滤纸等的固相载体比较，白细胞的捕捉效率高。
<生物材料>
与实施例1相同。
<试剂>
红细胞溶解液：155mM氯化铵，10mM碳酸氢钾，0.1mM EDTA
离液序列高的溶液：RLT Buffer(QIAGEN)
有机溶剂：70％乙醇水溶液
 <容器>
提取用容器：50毫升离心沉降管(聚丙烯制)
<RNA提取试剂盒>
QIAamp RNA Blood Mini Kit(QIAGEN)
<核酸提取工序>
核酸提取工序的步骤如下所示。
1.将2毫升人全血分注入提取用容器。
2.向提取用容器中添加10毫升红细胞溶解液，与人全血混合。
3.在将分离、溶解用注射器的柱塞升至最上部的状态下，用移液器从侧面孔将混合液注入注射器内部。
4.将分离、溶解用注射器的柱塞向下压，排出注射器内部的混合液。
5.在将分离、溶解用注射器的柱塞升至最上部的状态下，用移液器从侧面孔将红细胞溶解液注入注射器内部。
6.将分离、溶解用注射器的柱塞向下压，排出注射器内部的红细胞溶解液。
7.用分离、溶解用注射器吸入2毫升离液序列高的溶液，并排出，重复5次，排出到提取用容器中。
8.向排出在提取用容器中的离液序列高的溶液中添加2毫升有机溶剂，混合。
9.下面按照市售RNA提取试剂盒的操作方法进行。但洗脱液为2毫升。
<提取结果>
本实施例中提取核酸的浓度及纯度、提取操作所需要的时间如表1所示。提取核酸的浓度与以往方法比较变高，核酸纯度相当。所需时间与实施例3相当。
在本方法中，通过使用分离、溶解用注射器，从全血中分离白细胞，再溶解白细胞而使核酸游离。该操作是利用RNA提取试剂盒进行核酸提取的前处理。利用分离、溶解用注射器进行的白细胞的分离，比实施例2的方法和RNA提取试剂盒的操作说明书所述的离心分离方法具有更高的白细胞分离效果。作为分离、溶解用注射器的固相载体，使用白细胞吸附效率比玻璃纤维滤纸高的聚丙烯制过滤器。这样得到的提取核酸的浓度，与以往方法比较，得到增加。
表1
  核酸提取方法   实施例1   实施例2   实施例3   实施例4   以往方法
  核酸浓度(微克/毫升)   2.08   2.50   2.35   2.84   2.75
  核酸纯度(A260/A280)   1.92   1.91   1.92   1.90   1.89
  所需要的时间(分)   15   15   25   25   50

Claims (20)

1.一种核酸提取方法，其是将含有细胞的生物材料通过多孔性固相，然后将被所述多孔性固相捕捉的细胞和溶解细胞的溶解试剂混合，使得到的第一混合液通过所述多孔性固相，再将含有从所述细胞中游离的核酸的上述第一混合液与能使核酸结合在所述多孔性固相上的结合试剂混合，使得到的第二混合液通过所述多孔性固相的方法。
2.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其中所述多孔性固相的最大孔径是2～20微米。
3.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其中使用内藏所述多孔性固相而对其内部划分的配管，利用压力变化使所述生物材料、所述第一混合液以及所述第二混合液从配管的一端吸入排出。
4.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其中使用内藏所述多孔性固相而对其内部划分的配管，利用离心力使生物材料、所述第一混合液以及所述第二混合液从配管的一侧移至另一侧。
5.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其中所述多孔性固相含有玻璃纤维滤纸、玻璃粒子、硅石粒子或石英棉。
6.根据权利要求1所述的核酸提取方法，其中所述多孔性固相含有聚丙烯纤维和/或粒子、聚酯纤维和/或粒子、或尼龙纤维和/或粒子。
7.根据权利要求1所述的核酸提取方法，含有所述细胞的生物材料是全血，所述细胞是白细胞，所述核酸是RNA。
8.一种核酸提取方法，其是将细胞和溶解细胞的溶解试剂混合，使得到的第一混合液通过所述多孔性固相，然后将含有从所述细胞中游离的核酸的所述第一混合液、和能使核酸结合在所述多孔性固相上的结合试剂混合，使得到的第二混合液通过所述多孔性固相的方法。
9.根据权利要求8所述的核酸提取方法，其中所述多孔性固相的最大孔径是2～20微米。
10.根据权利要求8所述的核酸提取方法，其中使用内藏所述多孔性固相而对其内部划分的配管，利用压力变化使所述生物材料、所述第一混合液以及所述第二混合液从配管的一端吸入排出。
11.根据权利要求8所述的核酸提取方法，其中使用内藏所述多孔性固相而对其内部划分的配管，利用离心力使生物材料、所述第一混合液以及所述第二混合液从配管的一侧移至另一侧。
12.根据权利要求8所述的核酸提取方法，其中所述多孔性固相含有玻璃纤维滤纸、玻璃粒子、硅石粒子或石英棉。
13.根据权利要求8所述的核酸提取方法，其中所述细胞是白细胞，所述核酸是RNA。
14.一种核酸游离方法，其是将含有细胞的生物材料通过多孔性固相，然后将被所述多孔性固相捕捉的细胞和溶解细胞的溶解试剂混合，使所得到的混合液通过所述多孔性固相的方法。
15.根据权利要求14所述的核酸游离方法，其中所述多孔性固相的最大孔径是2～20微米。
16.根据权利要求14所述的核酸游离方法，其中使用内藏所述多孔性固相而对其内部划分的配管，利用压力变化使所述生物材料以及所述混合液从配管的一端吸入排出。
17.根据权利要求14所述的核酸游离方法，其中使用内藏所述多孔性固相而对其内部划分的配管，利用离心力使生物材料以及所述混合液从配管的一端吸入排出。
18.根据权利要求14所述的核酸游离方法，其中所述多孔性固相含有玻璃纤维滤纸、玻璃粒子、硅石粒子或石英棉。
19.根据权利要求14所述的核酸游离方法，其中所述多孔性固相含有聚丙烯纤维和/或粒子、聚酯纤维和/或粒子、或尼龙纤维和/或粒子。
20.根据权利要求14所述的核酸游离方法，其中含有所述细胞的生物材料是全血。
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