JP2004290211A - 核酸の回収器具および方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 本件発明は、核酸を含有する生物試料から簡便に核酸の回収をするための核酸の回収器具と方法を提供する。
【解決手段】 シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸捕捉用チップであって、固相が通水部を有し、通水部における固相と固相との平均間隔が、２５μｍ以下となるようにする。
【選択図】 なし

Description

本発明は、核酸の回収装置に関し、核酸を含有する物質からの核酸の回収器具に関する。更に詳しくは、核酸の検査による遺伝子診断のための体液成分からの内因性、或いは、外来性の遺伝子として存在する核酸成分の回収器具に関する。

分子生物学の進歩によって、遺伝子に関する数々の技術が開発され、また、それらの技術により多くの疾患性の遺伝子が分離・同定された。その結果、医療の分野でも、診断、或いは、検査法に分子生物学的な技法が取り入れられ、従来不可能であった診断が可能となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつある。

この急激な進歩は、主として、核酸増幅法、特に、PCR法（polymerase chain reaction：ポリメラーゼ連鎖反応、Saiki et al., Science, 239, 487-491(1988)）に依るところが大きい。

PCR法は、溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、例えば、血清中に極微量しか存在しないウイルスをそのウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することにより、間接的に証明できる。

しかし、このPCR法を臨床の場で日常検査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その中でも特に、前処理における核酸の抽出、精製工程の重要性が指摘されてる(大島ほか, JJCLA, 22(2), 145-150(1997))。これは、核酸精製時に除去し得なかった阻害因子の影響によるものであり、血液中のヘモグロビン、抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。また、抽出工程に関しては、用手法による煩雑な操作と熟練者による多大な労力が必要とされる。そのため、病院の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害となっており、この工程の自動化が熱望されている。

また、分子生物学的な研究を行う機関では、遺伝子組換え操作を行うための材料として、プラスミドDNAが頻繁に使用されているが、省力化の点等から、検査室の場合と同様に、核酸を抽出し精製する工程の自動化が望まれている。

核酸を含有する生物試料から阻害因子を含まない精製度の高い状態で核酸を回収するための既知の方法としては、タンパク質分解酵素の存在下で、生物試料に界面活性剤を作用させ、核酸を遊離状とし、フェノール（及び、クロロフォルム）と混合し、遠心分離器による水相・有機相分離を数回行った後、水相からアルコールにより沈殿物の形で核酸を回収する方法が知られている。しかし、この調製方法は、工程内に劇物であるフェノール等の有機溶剤を使用する、或いは、遠心分離工程を必要するため、遠心分離器のロータへの容器の出し入れや遠心分離後の溶液の分取などの自動化が非常に困難である、という問題が存在する。

特許2680462号には、カオトロピック物質の存在下で核酸と結合する事が可能なシリカ粒子を核酸結合用固相として使用することを示している。この特許2680462には、シリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニジンチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に結合した複合体を遠心分離により沈降させた後、上清を廃棄し、残った複合体に洗浄液を加えて洗浄し、再沈殿させた複合体をエタノール水溶液で洗浄した後アセトンで洗浄し、アセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する方法が記載されている。

また、特開平7-250681号公報は、ガラスパウダー層を2枚のガラス繊維フィルターとメンブランフィルターで挟んだ4重構造の濾過部材を有するカートリッジ容器を用いてDNA抽出液を精製する方法を示している。この特開平7-250681号公報では、調製されたDNA含有培養液を前処理しトラップフィルターに集菌し、溶離用試薬を添加してプラスミドDNAを細胞外に溶出させたものを精製用試料とする。精製工程では、カートリッジ容器に精製用試料とヨウ化ナトリウムを添加し、カートリッジ容器に真空減圧、または、遠心分離処理を行い、カートリッジ容器のガラスパウダー層にプラスミドDNAを吸着させる。次いで、カートリッジ容器に洗浄用緩衝液を添加して真空減圧、または、遠心分離処理により洗浄し、その後、カートリッジ容器に溶出用緩衝液を添加して真空減圧、または、遠心分離処理を行い、プラスミドDNAを溶出する。

さらに、特開平11-266864号公報は、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップによる核酸の精製方法と精製用装置を示している。この方法では、核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続し、固相への核酸の結合を促進する物質と核酸含有試料との混合液を所定容器から液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸引し、核酸を固相に結合した後、核酸捕捉用チップ内の液体を排除し、次いで洗浄液を吸引、排出することにより核酸捕捉チップ内を洗浄し、洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、固相から溶離された核酸を含む溶離液を精製品容器に吐出する。

特許2680462号 特開平7-250681号公報 特開平11-266864号公報

上述した先行技術の内、特許2680462号では、劇物であるフェノールの使用は避けられるが、シリカ粒子に核酸を結合した後のシリカ粒子と溶液の分離には遠心分離工程を必要とし、フェノールによる抽出法と同様に遠心分離工程の自動化が問題となる。

また、特開平7-250681号公報に記載の方法では、ガラスパウダー層を2枚のガラス繊維フィルターとメンブランフィルターで挟み込んだカートリッジ容器にする事で、遠心分離処理の工程を真空減圧に置き換えることは可能であり、自動化に適した方法と言えるが、溶液の流れが一方向に限定され、プラスミドDNA、あるいは、溶出溶緩衝液とガラスパウダーの接触効率が低下し、回収効率に悪影響を与える。

さらに、特開平11-266864号公報記載の方法では、固相を内蔵した核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続する事により、溶液の流れを双方向とする事で、核酸、あるいは、溶離液と固相の接触効率を向上し、かつ、容易に自動化が可能な方法であるが、その核酸捕捉用チップに関して、構成例に関しては記載されているが、より好適な使用形態に関しての記述はなされていなかった。

本発明の目的は、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で信頼度の高い核酸回収器具と核酸回収方法の提供にあり、特に、生物試料中に存在する核酸成分の回収に好適な器具と方法の提供にある。

また、本発明の目的は、核酸を含有する材料からの自動化に適した核酸回収器具と核酸回収方法の提供に有り、特に、生物試料中に存在する核酸成分の自動回収に好適な器具と方法の提供にある。

本発明に基づく核酸の回収器具は、好適には、核酸捕捉チップである。本発明は、シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸回収器具において、固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が２５μｍ以下であることを特徴とする。

本発明に基づく核酸の回収器具は、シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸捕捉用チップにおいて、固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が２５μｍ以下である事を特徴とする核酸捕捉チップを用いて、
核酸を含有するサンプルから、核酸を遊離するための第一試薬を混合し、核酸の遊離を促す第一工程と、
遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二ａ工程と
固相を洗浄するために第二試薬を、圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と二試薬を接触させた後、吐出する第二ｂ工程と
固相、および、核酸捕捉チップ内に残存する、第一試薬、および／または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三ａ工程と
核酸捕捉チップ内から第三試薬の除去を促すために、核酸捕捉チップ内に通気を行う第三ｂ工程と
残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程と
固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程
を含む事を特徴とする。なお、固相が、粒状物或いは繊維状物からなる場合は、平均孔径は平均間隔のことを意味し、２５μｍ以下であることを特徴とする。

本発明の望ましい実施例では、処理対象の試料が変わる毎に核酸捕捉用チップは、新しいものに交換される。また、第二ａ、第二ｂ、第三ａ、第四、第五の各工程では、一旦吸入した溶液を所定の容器に吐出し、再び核酸捕捉用チップ内に吸引する事を繰り返し行い、固相と溶液の接触確立を高くする。なお、第二ａ、第二ｂ工程での吐出時には、溶液の全量吐出に伴い、泡の発生、再吸引時の吸引抵抗増大等の不具合が発生するため、その全量を吐出せずに、固相部が必ず溶液に接した状態を維持するように制御するのが望ましい。

核酸含有試料としては、全血、血清、喀痰、尿等の生体試料や培養細胞、培養細菌等の生物学的な試料、あるいは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核酸、ＤＮＡ増幅酵素等の反応産物や素精製状態の核酸を含む物質等を対象とすることができる。なお、ここでの核酸とは、２本鎖、１本鎖、あるいは部分的に２本鎖もしくは１本鎖構造を有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む。

核酸捕捉用チップに内蔵される固相は、ガラス粒子、シリカ粒子、石英濾紙、およびその破砕物、石英ウール、珪藻土等、酸化ケイ素を含む物質、あるいはプラスチック等の表面にシリカを被覆した物等、酸化ケイ素を含有するものであれば利用が可能である。固相は、使用中にチップ内への保持を維持することが必要で、チップ内に通水部分を有した状態で設置される必要があり、また、この通水部分は連続していることが望ましい。固相の形状としては、多孔性、粒状、繊維状があり、通水部分における固相と固相との平均間隔とは、多孔性材であれば、その孔内の平均孔径を意味し、粒状物、繊維状物であれば、粒状物間又は繊維状物間の平均間隔のことを意味し、それぞれ２５μｍ以下である。本発明の望ましい固相は、石英ウールで、好ましくは、その両側に石英粒子を燒結して作成した保持材を配置し、固相として使用する石英ウール間の平均間隔を制御する。

なお、ここで石英ウール間の平均間隔とは、石英ウールが円柱状であると仮定し、それを均一に空間内に配置したときにできる、石英ウールと石英ウールの間の平均的な間隔を表し、石英ウールを設置する空間の体積と断面積と長さ、設置する石英ウールの重量と比重と平均直径により決定される。

例えば、石英ウールを設置する部分の形状が半径１．５ｍｍの円柱状で、石英ウールを設置する長さがｈであった場合、石英ウールの比重を２．２２ｇ／ｃｍ^３、石英ウールの平均半径を４．５μｍ、設置する石英ウールの量を５ｍｇとした場合、石英ウール間の平均間隔ｌは、次の式により算出できる。
1［ｍ］＝５．０４×１０^−４・ｈ^１／２−９．０×１０^−６

核酸捕捉用チップに圧力変化により吸引と吐出を行わせるための装置としては、核酸捕捉用チップの一端と適合する形状を有し、圧力変化を意図的に付与できる物であれば、特に制限されず、手動のピッペトやシリンジが利用できるが、安定的な核酸回収のためには、吸引量、吐出量、吸引速度、吐出速度等の制御が必要なため、自動装置との組合せが望ましい。

第一工程で使用する試薬としては、核酸含有試料から核酸の遊離を促す事が出来れば使用可能であるが、高粘度な物の使用は望ましくない。また、回収対象とする核酸がＲＮＡの場合には、ＲＮＡ分解酵素による作用を防ぐため、ＲＮａｓｅインヒビターの添加やグアニジンチオシアネートの使用が望ましい。

第二ａ工程で使用する試薬としては、シリカを含有する固相への核酸の結合を促進する物質であれば使用可能で、一般にカオトピック試薬と呼ばれるものが使用できる。この際、回収対象がＲＮＡの場合には、第一工程と同様の理由からグアニジンチオシアネートの使用が望ましく、最終濃度は３ｍｏｌ／Ｌ以上、最終ｐＨが酸性であることが望ましい。

第三ａ工程で使用する試薬としては、核酸の固相への結合を維持しつつ、第二工程で使用した核酸の結合を促進する物質を洗浄するものであれば使用可能で、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等を７０％以上の濃度で使用する方法が公知であるが、回収後の核酸をPCR等に利用する際には、これらの物質が悪影響を与える事が知られており、使用する濃度はその所定の機能を有す範囲で、可能な限り低い濃度で使用する事が望ましい。本発明における望ましい実施例では、それらの点から、２５ｍｍｏｌ／Ｌ 酢酸カリウムを含む５０％エチルアルコールを用いる。

第四工程で使用する試薬としては、核酸の固相への結合を可能な限り保持しつつ、第三工程で使用したアルコールを濯ぎ、最終工程への第三工程で使用した試薬の持越しを避ける必要が生じる。本発明における望ましい実施例では、それらの点から５０ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸カリウムを用い、かつ、液温が２０℃以下の状態で使用する。

第五工程で使用する試薬としては、固相から核酸を溶離する作用を有す物質であれば使用可能で、低塩濃度の水溶液や純粋が公知の方法である。本発明の望ましい実施例では、
１０ｍｍｏｌ／Ｌ ビシン(ｐＨ８．５)、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡを用いる。

以下、本発明に基づく一実施例である、核酸回収器具を図１を参照して説明する。
図１は核酸捕捉用チップの構成を示す図である。核酸捕捉用チップ３１は、上端が圧力変化を発生させる器具、あるいは、自動装置の接続ノズルの先端に気密に勘合される内径を有しており、下端に向けて徐々に内径が細くなるように形成される。核酸捕捉用チップ３１は透明もしくは半透明な合成樹脂からなる。チップ３１の先端側には、固相が流出することを防止するため、および、固相の平均間隔を規定するための円板状の阻止部材１０１ａをチップ３１の上端より圧入し、固相１０２を挟む形で、阻止部材１０１ｂを固相１０２が所定の平均間隔を維持できるように設ける。これらの阻止部材１０１ａ，１０１ｂ は、液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その孔は固相１０２の流出を阻止できる大きさである。

阻止部材１０１ａ，１０１ｂの材質としては、直径約０．１ｍｍの石英粒子を核酸捕捉用チップ３１の所定の位置の内径に合わせた形状に焼結させたものを用いる。
固相として石英ウール（東芝ケミカル製、グレードＢ、ウールの直径 ６〜１２μｍ）５ｍｇを用いる。

次に、核酸捕捉用チップと組み合わせて使用する核酸精製用装置を図２〜図７を参照して説明する。図２は一実施例の装置の平面図、図３はその外観図、図４は電気系のブロックダイヤグラム、図５は核酸捕捉用チップを接続した分注器の概略図、図６は液体分注用チップの取り付け動作の説明図、図７はチップを取り外す動作の説明図、である。

図２及び図３において、核酸の精製用装置１００は、水平方向（Ｘ方向）に移動可能な２本のアーム１６、３３を具備する。一方のアーム１６には、分注ノズル３６（図６）を保持するノズルホルダー１７がアーム１６の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。他方のアーム３３には、液体吸排用可動ノズル３９（図５）を保持するノズルホルダー３４がアーム３３の長さ方向に沿って水平方向（Ｙ方向）に移動可能に取り付けられている。ノズルホルダー１７、３４は、対応するアーム１６、３３に対し、いずれも上下方向（Ｚ方向）に動作できる。アーム１６の水平移動領域とアーム３３の水平移動領域とは、部分的にオーバーラップするので、各アームの取り付け高さ位置を違えてある。

本体架台の作業面５には、未使用の多数の分注用チップ１５を載置した３個のチップラック１４ａ、１４ｂ、１４ｃが所定エリアにセットされる。これらのチップラック１４は、図６に示すように、各分注用チップ１５を挿入し得る穴を有しており、分注用チップの先端が作業面５又はチップラック底面に接触しないような高さを持った箱形をなす。各チップラック１４ａ、１４ｂ、１４ｃは夫々最大４８本までの分注用チップ１５を保持できる。

また、作業面５には、未使用の多数の核酸捕捉用チップ３１を載置したチップラック３０が所定エリアにセットされる。チップラック３０の形状は、先のチップラック１４と同様である。この例ではチップラック３０上に最大４８本までの核酸捕捉用チップ３１を保持できる。

作業面５には、処理対象となる検体、すなわち核酸を含有する試料を収容した検体容器１３が複数本ずつ保持される検体ラック１２が所定エリアにセットされる。この例では、各検体ラック１２は６本の検体容器１３を保持できる。また、検体ラック１２は８個またはそれ以上の数をセットできる。

また、作業面５には、未使用の処理容器２４を多数保持した容器ラック２３が所定エリアにセットされる。容器ラック２３は、最大４８本までの処理容器２４を保持できる。さらに、作業面５には、未使用の精製品用容器２６を多数保持した容器ラック２５が所定エリアにセットされる。この精製品用容器は、精製処理がなされた核酸含有液を試料別に回収するものである。この例では、容器ラック２５は、最大４８本の精製品用容器２６を保持できる。

作業面５には、プライミングの際に分注ノズル３６から放出される水を受け入れると共に分注ノズル３６のホームポジションとなる液受け部１１と、分注作業をする分注チップ１５を洗浄するための洗浄部１８と、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及び液体吸排用可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チップ３１を夫々のノズルから取り外すためのチップ外し器２７と、プライミングの際に液体吸排用可動ノズル３９から放出される水を受け入れると共に該可動ノズル３９のホームポジションとなる液受け部２８と、核酸捕捉用チップ３１からの不要な液を排出するための廃液口２９とが設けられる。

また、作業面５上の夫々の所定位置には、第三ａ工程で使用する第三試薬ボトル１９、第五工程で使用する第五試薬ボトル２０、第一工程で使用する第一試薬ボトル２１、第四工程で使用する第四試薬ボトル１０２、及び第二ａ、第二ｂ工程で使用する第二試薬ボトル２２、等がセットされる。

図６に示すシリンジポンプ１０と図５に示すシリンジポンプ３２は、それぞれ本体架台に取り付けられており、液体の吸入動作と吐出動作の制御が各ポンプ独自になされる。図６に示すように、ノズルホルダー１７に保持された分注ノズル３６は、可撓性の管４２を介して液体吸排用のシリンダポンプ１０に連通されている。分注ノズル３６内及び管４２内には純水が満たされており、シリンジポンプ１０は図示しない純水供給源に接続されている。図５に示すように、ノズルホルダー３４に保持された可動ノズル３９は、可撓性の管３５を介してシリンジポンプ３２に接続されている。可動ノズル３９内及び管３５内には純水が満たされており、シリンジポンプ３２は図示しない純水供給源に接続されている。

分注ノズル３６への分注用チップ１５の接続のための装着及び可動ノズル３９への核酸捕捉用チップ３１の接続のための装着は、それぞれに対応するチップラック１４、３０上において、各ノズルを降下してチップをノズルの先端に嵌合することにより達成される。

また、分注ノズル３６に接続された分注用チップ１５及び可動ノズル３９に接続された核酸捕捉用チップ３１をそれぞれのノズルから取り外す場合は、チップ外し器２７を利用する。図２及び図７に示すように、チップ外し器２７は、所定高さ位置に板状部材を有しており、この板状部材には、分注チップ１５の頭部５２及び核酸捕捉用チップ３１の頭部５４の外径よりも小さく、且つ分注ノズル３６及び可動ノズル３９の外径より大きな幅のスリット５５が形成されている。スリット５５が位置する高さよりも各チップの頭部５２，５４が低い状態でノズル３６，３９をスリット内に浸入するように水平移動させ、次いでノズルホルダー１７，３４を上昇させると頭部５２，５４が板状部材の下面に当接し、ノズルホルダーの更なる上昇によりチップ１５，３１がノズルから抜け落ちる。抜け落ちたチップは、チップ廃棄口５０（図２）に落下し回収箱（図示せず）内に回収される。

図４に、図２の核酸精製用装置の電気系の構成を示す。動作制御部としてのパーソナルコンピュータ（ＰＣ）６０には、操作条件及び検体情報を入力するための操作パネルとしてのキーボード６１、入力情報や警告情報等を表示するための表示装置としてのＣＲＴ６２、装置の各機構部を制御する機構制御部６５等が接続される。機構制御部６５は、シリンジポンプ１０に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ７１、シリンジポンプ３２に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ７２、ノズルホルダー１７を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７３、ノズルホルダー３４を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ７４、アーム１６を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７５、アーム３３を水平移動させるためのＡＣサーボモータ７６等を制御する。精製装置の各部は、所定のプログラムに従って動作される。

次に、使用する固相の平均間隔に違いを持たせた図１に示す核酸捕捉用チップを用い、図２の核酸精製装置により血清中のＣ型肝炎ウイルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。処理用試料は、ＷＨＯのＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄで値付けを行った２次スタンダードＣ型肝炎血清をＣ型肝炎陰性の血清で１００ＩＵ／ｍＬとなるように調製し、図２の装置の検体容器１３に分注した。図２の装置の自動操作により、アーム１６、ノズルホルダー１７により分注用チップ１５を取り付け、検体容器１３から２００μＬの試料を吸引し、処理容器２４へ分注した。試料分注後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外す。その後、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、第一試薬ボトル２１から７００μＬの第一試薬を吸引し、試料を分注した処理容器２４へ吐出し、そのまま、５回吸引・吐出を行い、全量を処理容器２４へ吐出し、１０分間放置した。なお、ここで第一試薬には、２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ （ＬＫＢ製）、５．５ｍｏｌ／Ｌグアニジンチオシアン酸塩（和光純薬工業（株）、生化学用）を含むＭＥＳ（２−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ−ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：２−モルホリノエタンスルホン酸、（株）同人化学研究所製）緩衝液を使用した。

吐出後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外す。所定の時間が経過した後、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、第二試薬ボトル２２より第二試薬を１００μＬ吸引し、試料と第一試薬の混合液が入った処理容器２４へ吐出し、５回吸引・吐出を行い、全量を処理容器２４へ吐出した。なお、ここで第二試薬には、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＬＫＢ製）、５．０ｍｏｌ／Ｌグアニジンチオシアン酸塩（和光純薬工業（株）製、生化学用）を含むＭＥＳ（（株））同人化学研究所製）緩衝液を使用した。

その間に、アーム３３、ノズルホルダー３４により核酸捕捉用チップ３１を取り付け、試料、第一試薬、第二試薬の混合液を処理容器２４から、シリンジ３２の動作により吸引した。

吸引後、吸引した混合液を核酸捕捉チップ３１の上側の阻止部材１０１ｂを混合液が越えない位置まで、処理容器２４に吐出し、再び、核酸捕捉チップ３１の下側の阻止部材１０１ａを混合液が越えない位置まで吸引する。この吸引と吐出の操作を１０回繰り返した後、処理容器２４内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材１０１ａを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、液受け２９へ核酸捕捉チップ３１を移動し、吸引した混合液を保持部材１０１ｂを越えない位置まで吐出し次動作まで待機する。

その間に、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、第二試薬ボトル２２から８００μＬの第二試薬を吸引し、処理容器２４へ全量を吐出した。吐出後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外す。その間に、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、核酸捕捉チップ３１を移動し、第二試薬を混合液の場合と同様の動作により、５回吸引と吐出を繰り返した後、処理容器２４内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材１０１ａを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、液受け２９へ核酸捕捉チップ３１を移動し、吸引した第二試薬を保持部材１０１ｂを越えない位置まで吐出し次動作まで待機する。

その間に、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、第三試薬ボトル１９から４００μＬの第三試薬を吸引し、処理容器２４へ全量を吐出した。吐出後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外す。その間に、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、核酸捕捉チップ３１を移動し、第三試薬を混合液の場合と同様の動作により、３回吸引と吐出を繰り返し、第一回目の洗浄を行う。洗浄後、処理容器２４内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材１０１ａを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、液受け２９へ核酸捕捉チップ３１を移動し、吸引した第三試薬を全量吐出し待機する。

その間に、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、第三試薬ボトル１９から８００μＬの第三試薬を吸引し、処理容器２４へ全量を吐出した。
なお、ここで第三試薬には、２５ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム（和光純薬工業（株）製、試薬特級）を含む５０％エタノール（和光純薬工業（株）製、試薬特級）を使用した。

吐出後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外す。その間に、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、核酸捕捉チップ３１を移動し、第三試薬を３回吸引と吐出を繰り返し、第二回目の洗浄を行う。洗浄後、処理容器２４内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材１０１ａを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、液受け２９へ核酸捕捉チップ３１を移動し、吸引した第三試薬を全量吐出し、更に、そのままの位置で、空気 １ｍＬを吸引、吐出する操作を１０回繰り返し待機する。

上記、第２回目の第三試薬による操作を再度繰り返して行った。なお、この洗浄操作は、必要であれば更に繰り返して行う事ができる。

第三試薬による洗浄操作後、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、第四試薬ボトル１０２から２００μＬの第四試薬を吸引し、処理容器２４へ全量を吐出した。
なお、ここで第四試薬には、５０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム（和光純薬工業（株）製、試薬特級）を使用した。

吐出後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外す。その間に、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、核酸捕捉チップ３１を移動し、第四試薬を３回、吸引と吐出を繰り返し、固相の濯ぎを行った。濯ぎ後、処理容器２４の全量を吸引し、更に、空気を吸引し、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、核酸捕捉チップ３１を液受け２９へ移動し、全量を吐出し、更に、そのままの位置で、空気１ｍＬを吸引、吐出する操作を１０回繰り返し待機する。

第四試薬による濯ぎ後、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、第五試薬ボトル２０から６０μＬの第五試薬を吸引し、処理容器２４へ全量を吐出した。

なお、ここで、第五試薬には、０．１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（（株））日本ジーン製、遺伝子工学研究用）を含む１０ｍｍｏｌ／Ｌビシン（（株）同人化学研究所製）緩衝液（ＰＨ８．５）を使用した。

吐出後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外す。その間に、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、核酸捕捉チップ３１を移動し、第五試薬を２０回、吸引と吐出を繰り返し、核酸の溶離を行った。溶離後、核酸捕捉用チップ３１内の全量を吐出する。吐出後、アーム３３、ノズルホルダー３４の制御により、使用した核酸捕捉用チップ３１をチップ外し器２７の作用により取り外す。その間に、アーム１６、ノズルホルダー１７により新規に分注用チップ１５を取り付け、溶離液の入った処理容器２４から全量を吸引し、更に、少量の空気を吸引した後、アーム１６、ノズルホルダー１７の制御により、精製品用容器２６の位置へ分注用チップを移動し、分注チップ１５内の全量を精製品容器２６へ吐出した。吐出後、アーム１６、ノズルホルダー１７の動作により使用した分注用チップ１５をチップ外し器２７の作用により取り外した。

同様の操作を、核酸捕捉用チップ３１の固相１０２の量を一定にし、保持部材１０１ａと保持部材１０１ｂの距離を変えて作成した、石英ウール間の平均間隔が異なる核酸捕捉用チップにより行った。

回収後の試料は、Ｒｏｃｈｅ社のＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲとコバス アンプリコア ＨＣＶ ｖ２.０試薬により評価を行った。回収したそれぞれの試料４８.５μＬと、ＨＣＶマスターミックスｖ２.０ ４１.７μＬ、ＨＣＶマンガン試薬８.３μＬ、ＨＣＶ内部コントロール ｖ２.０ １.５μＬを混合し、試薬キットに付属の手順所に従い、装置の操作を行い、回収した試料によるＨＣＶの評価を行った。結果を図８に示す。

図８の結果から平均間隔の増加に伴い、同一濃度のＣ型肝炎ウイルスの回収結果に対して、ＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲの吸光度出力が低下するのが分かる。これは、平均間隔の増加に伴いＣ型肝炎ウイルスの改修量が減少していることを表しており、平均間隔が２１μｍ以上では、顕著に回収効率が低下することを示している。なお、ＣＯＢＡＳＡＭＰＬＩＣＯＲは吸光度が４.０００を越えた場合、＊．＊＊＊と表示されるが、ここでは４．０００として計算を行った。

また、上記の平均空間を有す核酸捕捉用チップ３１に対して、１ｍＬの溶液を吸引した際の平均流速を測定した。結果を図９に示す。

図９の結果から、平均間隔の減少に伴い平均流速が低下するのが分かる。これには平均間隔を狭めることによって、溶液の吸引、あるいは、吐出時の待ち時間が増大することを意味し、平均間隔の減少は、１試料あたりの装置の処理時間を増大させることになり、装置の稼動効率低下させることになる。

そのため、図８及び図９の結果から、図１の核酸捕捉用チップと図２の装置によりＣ型肝炎ウイルス遺伝子の回収が実用十分な状態で行えること、核酸捕捉用チップの望ましい平均間隔が１３から２１μｍの範囲であることが分かる。

次に、カオロピック剤を他の物に換えて、図２の核酸精製装置により血清中のＢ型肝炎ウイルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。

核酸捕捉用チップ３１は図１の構造で、石英ウールの石英ウール間の平均間隔が１６μｍになるように作製した。図２の核酸精製装置１００の装置構成は替えずに、第一試薬ボトル２１，及び第二試薬ボトル２２に入れる試薬の組成を第一工程試薬は２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，６ｍｏｌ／Ｌグアニジン塩（和光純薬工業（株）製、生化学用）を含むＭＥＳ（（株）同仁化学研究所製）緩衝液に替え、第二工程試薬は５mol／Ｌグアニジン塩酸塩（和光純薬工業（株）製、生化学用）を含むＭＥＳ（（株））同仁化学研究所製）緩衝液に替えた。第三工程、第四工程、第五工程試薬は、前記のＣ型肝炎ウイルス遺伝子回収時と同じ組成の物を使用した。

処理用試料は、抗Ｂ型肝炎ウイルス抗体に陽性反応を示す血清を使用した。上記核酸捕捉用チップ３１と第一工程から第五工程試薬の組合せにより、前記のＣ型肝炎ウイルス遺伝子回収時と同じ装置動作により、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子の回収を行った。回収に要した時間は約２０分であった。

また、回収状態を比較するために、既存の方法として、「蛋白質 核酸 酵素」４１（５）、４５８−４５９（１９９６）に記述の方法に従って行った。回収に要した時間は１日半であった。

回収後の試料は、宝酒造（株）製のＰＣＲ専用試薬キットを使用し、（株）サワデー・テクノロジー社に合成を依頼した増殖用プライマーによりＢ型肝炎ウイルス遺伝子中の特定の４１４塩基の増幅を試みた。ＰＣＲ処理時の遺伝子増幅システムはＴＰ３０００（宝酒造（株）製）を使用し、最初に９４℃の熱変性を３分間行った後、９４℃の熱変性３０秒、５５℃のアニーリング３０秒、７２℃の伸張反応３０秒を４５回繰り返し、更に７２℃で１０分間加温し、ＰＣＲ処理を行った。ＰＣＲ処理後、その一部を３％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＩ（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ製）により蛍光染色を行った。この結果、従来法と同程度のＰＣＲの増幅バンドが得られた。これは、従来法と同等の回収効率で、より短時間に目的遺伝子の回収が行えたことを示している。

次に、図２の核酸精製装置により血清中に混在するＢ型肝炎ウイルスとＣ型肝炎ウイルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。

核酸捕捉用チップ３１は図１の構造で、固相の平均間隔が１６μｍになるように作製した。処理試料は前記の２種の血清を混合して、混合した状態で各ウイルス濃度が、前記実施時の２倍になるように調製した。

前記のＣ型肝炎ウイルス遺伝子を回収した時と同じ試薬組成、および、同じ装置動作により遺伝し回収を行い、第五工程試薬のみを分注量を６０μｌから１２０μｌに替えて実施した。

回収後の試料は、４８．５μＬを前記のＣＯＢＡＳ ＡＭＰＬＩＣＯＲによるＣ型肝炎ウイルス遺伝子の検出に使用し、５０μＬを前記のＰＣＲ処理によるＢ型肝炎ウイルス遺伝子の検出に使用した。その結果、２種の異なるウイルスを混在した試料から、それぞれの遺伝子を単独で回収した場合と同等の効率で回収できた。これは、混在するウイルスの遺伝子を同時に回収可能であることを示すとともに、ＲＮＡ（リボ核酸）及びＤＮＡ（デオキシリボ核酸）という性質の異なる核酸を同時に回収できることを示している。

本発明の実施例である核酸捕捉用チップの図である。 本発明の実施例である核酸精製用装置の平面図である。 図２の核酸精製用装置の概略外観図である。 図２の実施例における電気系の構成を示すブロックダイヤグラムである。 図２の実施例における核酸捕捉用チップを接続した分注器の概略構成を示す図である。 図２の実施例におけるチップをノズルに取り付ける動作の説明図である。 図２の実施例におけるチップをノズルから取り外す動作の説明図である。 本発明の実施形態1による結果を表すグラフである。 本発明の実施形態1による結果を表すグラフである。

符号の説明

１０，３２…シリンジポンプ、１２…検体ラック、１５…分注用チップ、１６，３３…アーム、１７，３４…ノズルホルダー、１９…洗浄液ボトル、２０…溶離液ボトル、２２…結合促進剤ボトル、２４…処理容器、２６…精製品用容器、２７…チップ外し器、３１，３１ａ，３１ｂ…核酸捕捉用チップ、３６…分注ノズル、３９…液体吸排用可動ノズル

Claims (12)

1. 圧力変化により吸引と吐出が可能な装置に接続された核酸捕捉用チップであって、該核酸捕捉チップはシリカ含有の固相を液相に接触可能な状態で内蔵され、該固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が２５μｍ以下である核酸捕捉用チップを用いる核酸回収方法であって、
   核酸を含有するサンプルから核酸を遊離するための第一試薬をサンプルと混合し、核酸の遊離を促す第一工程、
   遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、混合液を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二ａ工程、
   固相を洗浄するために第二試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第二試薬を接触させた後、吐出する第二ｂ工程、
   固相、および、核酸捕捉チップ内に残存する、第一試薬、および／または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三ａ工程、
   核酸捕捉チップ内から第三試薬の除去を促すために、核酸捕捉チップ内に通気を行う第三ｂ工程、
   残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程、及び
   固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程を含む核酸回収方法。
2. 請求項１記載の核酸回収方法において、固相が繊維状物からなり、繊維状物と繊維状物との平均間隔が２５μm以下である核酸回収方法。
3. シリカを含有する固相への核酸の結合を促進する促進物質と、核酸を含む混合液から、核酸を回収する核酸回収方法であって、以下の手順を含む方法；
   平均間隔が２５μm以下であるシリカ含有固相から成る通水部に、混合液を流す手順；及び
   核酸の固相への結合を維持しつつ促進物質を洗浄する洗浄試薬により、核酸の結合した固相を洗浄する手順。
4. 請求項３記載の核酸回収方法であって、平均間隔が１３μm以上である方法。
5. 請求項４記載の核酸回収方法であって、固相が繊維状物から成る方法。
6. 請求項４記載の核酸回収方法であって、固相が石英ウールである方法。
7. 請求項６記載の核酸回収方法であって、石英ウール間の平均間隔が１３μmから２１μmである方法。
8. 請求項６記載の核酸回収方法であって、石英ウールの直径が６μmから１２μmである方法。
9. 請求項４記載の核酸回収方法であって、以下の手順を含む方法；
   固相から核酸を容離する作用を有する物質により、核酸を結合した固相から核酸を容離する手順。
10. 請求項３記載の核酸回収方法であって、混合液の平均流速が10μL／ｓから50μL／ｓである方法。
11. シリカ含有の固相を液相に接触可能な状態で内蔵され、該固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が２５μｍ以下である核酸回収具を用いる核酸回収方法であって、
    核酸を含有するサンプルから核酸を遊離するための第一試薬をサンプルと混合し、核酸の遊離を促す第一工程、
    遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、混合液を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二ａ工程、
    固相を洗浄するために第二試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第二試薬を接触させた後、吐出する第二ｂ工程、
    固相、および、核酸捕捉チップ内に残存する、第一試薬、および／または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三ａ工程、
    核酸回収具内から第三試薬の除去を促すために、核酸回収具内に通気を行う第三ｂ工程、
    残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程、及び
    固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程を含む核酸回収方法。
12. シリカ含有の固相を液相に接触可能な状態で内蔵され、該固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が２５μｍ以下である核酸回収具を用いる核酸回収方法であって、
    核酸を含有するサンプルから核酸を遊離するための第一試薬をサンプルと混合し、核酸の遊離を促す第一工程、
    遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、混合液を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二工程、
    固相、および、該核酸回収具内に残存する、第一試薬、および／または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により該核酸回収具内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三工程、
    残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により該核酸回収具内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程、及び
    固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により該核酸回収具内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程を含む核酸回収方法。

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