JP2004290211A - 核酸の回収器具および方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】 本件発明は、核酸を含有する生物試料から簡便に核酸の回収をするための核酸の回収器具と方法を提供する。
【解決手段】 シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸捕捉用チップであって、固相が通水部を有し、通水部における固相と固相との平均間隔が、25μm以下となるようにする。
【選択図】 なし

Description

本発明は、核酸の回収装置に関し、核酸を含有する物質からの核酸の回収器具に関する。更に詳しくは、核酸の検査による遺伝子診断のための体液成分からの内因性、或いは、外来性の遺伝子として存在する核酸成分の回収器具に関する。
分子生物学の進歩によって、遺伝子に関する数々の技術が開発され、また、それらの技術により多くの疾患性の遺伝子が分離・同定された。その結果、医療の分野でも、診断、或いは、検査法に分子生物学的な技法が取り入れられ、従来不可能であった診断が可能となったり、検査日数の大幅短縮が達成されつつある。
この急激な進歩は、主として、核酸増幅法、特に、PCR法(polymerase chain reaction:ポリメラーゼ連鎖反応、Saiki et al., Science, 239, 487-491(1988))に依るところが大きい。
PCR法は、溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが可能なため、例えば、血清中に極微量しか存在しないウイルスをそのウイルスの遺伝子である核酸を増幅し検出することにより、間接的に証明できる。
しかし、このPCR法を臨床の場で日常検査に使用した際に、いくつかの問題点が存在する。その中でも特に、前処理における核酸の抽出、精製工程の重要性が指摘されてる(大島ほか, JJCLA, 22(2), 145-150(1997))。これは、核酸精製時に除去し得なかった阻害因子の影響によるものであり、血液中のヘモグロビン、抽出工程で使用される界面活性剤等が知られている。また、抽出工程に関しては、用手法による煩雑な操作と熟練者による多大な労力が必要とされる。そのため、病院の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害となっており、この工程の自動化が熱望されている。
また、分子生物学的な研究を行う機関では、遺伝子組換え操作を行うための材料として、プラスミドDNAが頻繁に使用されているが、省力化の点等から、検査室の場合と同様に、核酸を抽出し精製する工程の自動化が望まれている。
核酸を含有する生物試料から阻害因子を含まない精製度の高い状態で核酸を回収するための既知の方法としては、タンパク質分解酵素の存在下で、生物試料に界面活性剤を作用させ、核酸を遊離状とし、フェノール(及び、クロロフォルム)と混合し、遠心分離器による水相・有機相分離を数回行った後、水相からアルコールにより沈殿物の形で核酸を回収する方法が知られている。しかし、この調製方法は、工程内に劇物であるフェノール等の有機溶剤を使用する、或いは、遠心分離工程を必要するため、遠心分離器のロータへの容器の出し入れや遠心分離後の溶液の分取などの自動化が非常に困難である、という問題が存在する。
特許2680462号には、カオトロピック物質の存在下で核酸と結合する事が可能なシリカ粒子を核酸結合用固相として使用することを示している。この特許2680462には、シリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグアニジンチオシアネート緩衝液とが入った反応容器に、核酸を含む試料を加えて混合し、核酸がシリカ粒子に結合した複合体を遠心分離により沈降させた後、上清を廃棄し、残った複合体に洗浄液を加えて洗浄し、再沈殿させた複合体をエタノール水溶液で洗浄した後アセトンで洗浄し、アセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩衝液を加えて核酸を溶離して回収する方法が記載されている。
また、特開平7-250681号公報は、ガラスパウダー層を2枚のガラス繊維フィルターとメンブランフィルターで挟んだ4重構造の濾過部材を有するカートリッジ容器を用いてDNA抽出液を精製する方法を示している。この特開平7-250681号公報では、調製されたDNA含有培養液を前処理しトラップフィルターに集菌し、溶離用試薬を添加してプラスミドDNAを細胞外に溶出させたものを精製用試料とする。精製工程では、カートリッジ容器に精製用試料とヨウ化ナトリウムを添加し、カートリッジ容器に真空減圧、または、遠心分離処理を行い、カートリッジ容器のガラスパウダー層にプラスミドDNAを吸着させる。次いで、カートリッジ容器に洗浄用緩衝液を添加して真空減圧、または、遠心分離処理により洗浄し、その後、カートリッジ容器に溶出用緩衝液を添加して真空減圧、または、遠心分離処理を行い、プラスミドDNAを溶出する。
さらに、特開平11-266864号公報は、シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕捉用チップによる核酸の精製方法と精製用装置を示している。この方法では、核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続し、固相への核酸の結合を促進する物質と核酸含有試料との混合液を所定容器から液体吸排用可動ノズルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸引し、核酸を固相に結合した後、核酸捕捉用チップ内の液体を排除し、次いで洗浄液を吸引、排出することにより核酸捕捉チップ内を洗浄し、洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、固相から溶離された核酸を含む溶離液を精製品容器に吐出する。
特許2680462号 特開平7-250681号公報 特開平11-266864号公報
上述した先行技術の内、特許2680462号では、劇物であるフェノールの使用は避けられるが、シリカ粒子に核酸を結合した後のシリカ粒子と溶液の分離には遠心分離工程を必要とし、フェノールによる抽出法と同様に遠心分離工程の自動化が問題となる。
また、特開平7-250681号公報に記載の方法では、ガラスパウダー層を2枚のガラス繊維フィルターとメンブランフィルターで挟み込んだカートリッジ容器にする事で、遠心分離処理の工程を真空減圧に置き換えることは可能であり、自動化に適した方法と言えるが、溶液の流れが一方向に限定され、プラスミドDNA、あるいは、溶出溶緩衝液とガラスパウダーの接触効率が低下し、回収効率に悪影響を与える。
さらに、特開平11-266864号公報記載の方法では、固相を内蔵した核酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続する事により、溶液の流れを双方向とする事で、核酸、あるいは、溶離液と固相の接触効率を向上し、かつ、容易に自動化が可能な方法であるが、その核酸捕捉用チップに関して、構成例に関しては記載されているが、より好適な使用形態に関しての記述はなされていなかった。
本発明の目的は、核酸を含有する材料からの迅速、簡便で信頼度の高い核酸回収器具と核酸回収方法の提供にあり、特に、生物試料中に存在する核酸成分の回収に好適な器具と方法の提供にある。
また、本発明の目的は、核酸を含有する材料からの自動化に適した核酸回収器具と核酸回収方法の提供に有り、特に、生物試料中に存在する核酸成分の自動回収に好適な器具と方法の提供にある。
本発明に基づく核酸の回収器具は、好適には、核酸捕捉チップである。本発明は、シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸回収器具において、固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が25μm以下であることを特徴とする。
本発明に基づく核酸の回収器具は、シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸捕捉用チップにおいて、固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が25μm以下である事を特徴とする核酸捕捉チップを用いて、
核酸を含有するサンプルから、核酸を遊離するための第一試薬を混合し、核酸の遊離を促す第一工程と、
遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二a工程と
固相を洗浄するために第二試薬を、圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と二試薬を接触させた後、吐出する第二b工程と
固相、および、核酸捕捉チップ内に残存する、第一試薬、および/または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三a工程と
核酸捕捉チップ内から第三試薬の除去を促すために、核酸捕捉チップ内に通気を行う第三b工程と
残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程と
固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程
を含む事を特徴とする。なお、固相が、粒状物或いは繊維状物からなる場合は、平均孔径は平均間隔のことを意味し、25μm以下であることを特徴とする。
本発明の望ましい実施例では、処理対象の試料が変わる毎に核酸捕捉用チップは、新しいものに交換される。また、第二a、第二b、第三a、第四、第五の各工程では、一旦吸入した溶液を所定の容器に吐出し、再び核酸捕捉用チップ内に吸引する事を繰り返し行い、固相と溶液の接触確立を高くする。なお、第二a、第二b工程での吐出時には、溶液の全量吐出に伴い、泡の発生、再吸引時の吸引抵抗増大等の不具合が発生するため、その全量を吐出せずに、固相部が必ず溶液に接した状態を維持するように制御するのが望ましい。
核酸含有試料としては、全血、血清、喀痰、尿等の生体試料や培養細胞、培養細菌等の生物学的な試料、あるいは、電気泳動後のゲルに保持された状態の核酸、DNA増幅酵素等の反応産物や素精製状態の核酸を含む物質等を対象とすることができる。なお、ここでの核酸とは、2本鎖、1本鎖、あるいは部分的に2本鎖もしくは1本鎖構造を有するデオキシリボ核酸(DNA)及びリボ核酸(RNA)を含む。
核酸捕捉用チップに内蔵される固相は、ガラス粒子、シリカ粒子、石英濾紙、およびその破砕物、石英ウール、珪藻土等、酸化ケイ素を含む物質、あるいはプラスチック等の表面にシリカを被覆した物等、酸化ケイ素を含有するものであれば利用が可能である。固相は、使用中にチップ内への保持を維持することが必要で、チップ内に通水部分を有した状態で設置される必要があり、また、この通水部分は連続していることが望ましい。固相の形状としては、多孔性、粒状、繊維状があり、通水部分における固相と固相との平均間隔とは、多孔性材であれば、その孔内の平均孔径を意味し、粒状物、繊維状物であれば、粒状物間又は繊維状物間の平均間隔のことを意味し、それぞれ25μm以下である。本発明の望ましい固相は、石英ウールで、好ましくは、その両側に石英粒子を燒結して作成した保持材を配置し、固相として使用する石英ウール間の平均間隔を制御する。
なお、ここで石英ウール間の平均間隔とは、石英ウールが円柱状であると仮定し、それを均一に空間内に配置したときにできる、石英ウールと石英ウールの間の平均的な間隔を表し、石英ウールを設置する空間の体積と断面積と長さ、設置する石英ウールの重量と比重と平均直径により決定される。
例えば、石英ウールを設置する部分の形状が半径1.5mmの円柱状で、石英ウールを設置する長さがhであった場合、石英ウールの比重を2.22g/cm、石英ウールの平均半径を4.5μm、設置する石英ウールの量を5mgとした場合、石英ウール間の平均間隔lは、次の式により算出できる。
1[m]=5.04×10−4・h1/2−9.0×10−6
核酸捕捉用チップに圧力変化により吸引と吐出を行わせるための装置としては、核酸捕捉用チップの一端と適合する形状を有し、圧力変化を意図的に付与できる物であれば、特に制限されず、手動のピッペトやシリンジが利用できるが、安定的な核酸回収のためには、吸引量、吐出量、吸引速度、吐出速度等の制御が必要なため、自動装置との組合せが望ましい。
第一工程で使用する試薬としては、核酸含有試料から核酸の遊離を促す事が出来れば使用可能であるが、高粘度な物の使用は望ましくない。また、回収対象とする核酸がRNAの場合には、RNA分解酵素による作用を防ぐため、RNaseインヒビターの添加やグアニジンチオシアネートの使用が望ましい。
第二a工程で使用する試薬としては、シリカを含有する固相への核酸の結合を促進する物質であれば使用可能で、一般にカオトピック試薬と呼ばれるものが使用できる。この際、回収対象がRNAの場合には、第一工程と同様の理由からグアニジンチオシアネートの使用が望ましく、最終濃度は3mol/L以上、最終pHが酸性であることが望ましい。
第三a工程で使用する試薬としては、核酸の固相への結合を維持しつつ、第二工程で使用した核酸の結合を促進する物質を洗浄するものであれば使用可能で、エチルアルコール、イソプロピルアルコール等を70%以上の濃度で使用する方法が公知であるが、回収後の核酸をPCR等に利用する際には、これらの物質が悪影響を与える事が知られており、使用する濃度はその所定の機能を有す範囲で、可能な限り低い濃度で使用する事が望ましい。本発明における望ましい実施例では、それらの点から、25mmol/L 酢酸カリウムを含む50%エチルアルコールを用いる。
第四工程で使用する試薬としては、核酸の固相への結合を可能な限り保持しつつ、第三工程で使用したアルコールを濯ぎ、最終工程への第三工程で使用した試薬の持越しを避ける必要が生じる。本発明における望ましい実施例では、それらの点から50mmol/Lの酢酸カリウムを用い、かつ、液温が20℃以下の状態で使用する。
第五工程で使用する試薬としては、固相から核酸を溶離する作用を有す物質であれば使用可能で、低塩濃度の水溶液や純粋が公知の方法である。本発明の望ましい実施例では、
10mmol/L ビシン(pH8.5)、0.1mmol/L EDTAを用いる。
以下、本発明に基づく一実施例である、核酸回収器具を図1を参照して説明する。
図1は核酸捕捉用チップの構成を示す図である。核酸捕捉用チップ31は、上端が圧力変化を発生させる器具、あるいは、自動装置の接続ノズルの先端に気密に勘合される内径を有しており、下端に向けて徐々に内径が細くなるように形成される。核酸捕捉用チップ31は透明もしくは半透明な合成樹脂からなる。チップ31の先端側には、固相が流出することを防止するため、および、固相の平均間隔を規定するための円板状の阻止部材101aをチップ31の上端より圧入し、固相102を挟む形で、阻止部材101bを固相102が所定の平均間隔を維持できるように設ける。これらの阻止部材101a,101b は、液体及び気体が容易に通過し得る多数の孔を有するが、その孔は固相102の流出を阻止できる大きさである。
阻止部材101a,101bの材質としては、直径約0.1mmの石英粒子を核酸捕捉用チップ31の所定の位置の内径に合わせた形状に焼結させたものを用いる。
固相として石英ウール(東芝ケミカル製、グレードB、ウールの直径 6〜12μm)5mgを用いる。
次に、核酸捕捉用チップと組み合わせて使用する核酸精製用装置を図2〜図7を参照して説明する。図2は一実施例の装置の平面図、図3はその外観図、図4は電気系のブロックダイヤグラム、図5は核酸捕捉用チップを接続した分注器の概略図、図6は液体分注用チップの取り付け動作の説明図、図7はチップを取り外す動作の説明図、である。
図2及び図3において、核酸の精製用装置100は、水平方向(X方向)に移動可能な2本のアーム16、33を具備する。一方のアーム16には、分注ノズル36(図6)を保持するノズルホルダー17がアーム16の長さ方向に沿って水平方向(Y方向)に移動可能に取り付けられている。他方のアーム33には、液体吸排用可動ノズル39(図5)を保持するノズルホルダー34がアーム33の長さ方向に沿って水平方向(Y方向)に移動可能に取り付けられている。ノズルホルダー17、34は、対応するアーム16、33に対し、いずれも上下方向(Z方向)に動作できる。アーム16の水平移動領域とアーム33の水平移動領域とは、部分的にオーバーラップするので、各アームの取り付け高さ位置を違えてある。
本体架台の作業面5には、未使用の多数の分注用チップ15を載置した3個のチップラック14a、14b、14cが所定エリアにセットされる。これらのチップラック14は、図6に示すように、各分注用チップ15を挿入し得る穴を有しており、分注用チップの先端が作業面5又はチップラック底面に接触しないような高さを持った箱形をなす。各チップラック14a、14b、14cは夫々最大48本までの分注用チップ15を保持できる。
また、作業面5には、未使用の多数の核酸捕捉用チップ31を載置したチップラック30が所定エリアにセットされる。チップラック30の形状は、先のチップラック14と同様である。この例ではチップラック30上に最大48本までの核酸捕捉用チップ31を保持できる。
作業面5には、処理対象となる検体、すなわち核酸を含有する試料を収容した検体容器13が複数本ずつ保持される検体ラック12が所定エリアにセットされる。この例では、各検体ラック12は6本の検体容器13を保持できる。また、検体ラック12は8個またはそれ以上の数をセットできる。
また、作業面5には、未使用の処理容器24を多数保持した容器ラック23が所定エリアにセットされる。容器ラック23は、最大48本までの処理容器24を保持できる。さらに、作業面5には、未使用の精製品用容器26を多数保持した容器ラック25が所定エリアにセットされる。この精製品用容器は、精製処理がなされた核酸含有液を試料別に回収するものである。この例では、容器ラック25は、最大48本の精製品用容器26を保持できる。
作業面5には、プライミングの際に分注ノズル36から放出される水を受け入れると共に分注ノズル36のホームポジションとなる液受け部11と、分注作業をする分注チップ15を洗浄するための洗浄部18と、分注ノズル36に接続された分注用チップ15及び液体吸排用可動ノズル39に接続された核酸捕捉用チップ31を夫々のノズルから取り外すためのチップ外し器27と、プライミングの際に液体吸排用可動ノズル39から放出される水を受け入れると共に該可動ノズル39のホームポジションとなる液受け部28と、核酸捕捉用チップ31からの不要な液を排出するための廃液口29とが設けられる。
また、作業面5上の夫々の所定位置には、第三a工程で使用する第三試薬ボトル19、第五工程で使用する第五試薬ボトル20、第一工程で使用する第一試薬ボトル21、第四工程で使用する第四試薬ボトル102、及び第二a、第二b工程で使用する第二試薬ボトル22、等がセットされる。
図6に示すシリンジポンプ10と図5に示すシリンジポンプ32は、それぞれ本体架台に取り付けられており、液体の吸入動作と吐出動作の制御が各ポンプ独自になされる。図6に示すように、ノズルホルダー17に保持された分注ノズル36は、可撓性の管42を介して液体吸排用のシリンダポンプ10に連通されている。分注ノズル36内及び管42内には純水が満たされており、シリンジポンプ10は図示しない純水供給源に接続されている。図5に示すように、ノズルホルダー34に保持された可動ノズル39は、可撓性の管35を介してシリンジポンプ32に接続されている。可動ノズル39内及び管35内には純水が満たされており、シリンジポンプ32は図示しない純水供給源に接続されている。
分注ノズル36への分注用チップ15の接続のための装着及び可動ノズル39への核酸捕捉用チップ31の接続のための装着は、それぞれに対応するチップラック14、30上において、各ノズルを降下してチップをノズルの先端に嵌合することにより達成される。
また、分注ノズル36に接続された分注用チップ15及び可動ノズル39に接続された核酸捕捉用チップ31をそれぞれのノズルから取り外す場合は、チップ外し器27を利用する。図2及び図7に示すように、チップ外し器27は、所定高さ位置に板状部材を有しており、この板状部材には、分注チップ15の頭部52及び核酸捕捉用チップ31の頭部54の外径よりも小さく、且つ分注ノズル36及び可動ノズル39の外径より大きな幅のスリット55が形成されている。スリット55が位置する高さよりも各チップの頭部52,54が低い状態でノズル36,39をスリット内に浸入するように水平移動させ、次いでノズルホルダー17,34を上昇させると頭部52,54が板状部材の下面に当接し、ノズルホルダーの更なる上昇によりチップ15,31がノズルから抜け落ちる。抜け落ちたチップは、チップ廃棄口50(図2)に落下し回収箱(図示せず)内に回収される。
図4に、図2の核酸精製用装置の電気系の構成を示す。動作制御部としてのパーソナルコンピュータ(PC)60には、操作条件及び検体情報を入力するための操作パネルとしてのキーボード61、入力情報や警告情報等を表示するための表示装置としてのCRT62、装置の各機構部を制御する機構制御部65等が接続される。機構制御部65は、シリンジポンプ10に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ71、シリンジポンプ32に吸排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ72、ノズルホルダー17を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ73、ノズルホルダー34を水平移動及び上下動させるためのステッピングモータ74、アーム16を水平移動させるためのACサーボモータ75、アーム33を水平移動させるためのACサーボモータ76等を制御する。精製装置の各部は、所定のプログラムに従って動作される。
次に、使用する固相の平均間隔に違いを持たせた図1に示す核酸捕捉用チップを用い、図2の核酸精製装置により血清中のC型肝炎ウイルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。処理用試料は、WHOのInternational Standardで値付けを行った2次スタンダードC型肝炎血清をC型肝炎陰性の血清で100IU/mLとなるように調製し、図2の装置の検体容器13に分注した。図2の装置の自動操作により、アーム16、ノズルホルダー17により分注用チップ15を取り付け、検体容器13から200μLの試料を吸引し、処理容器24へ分注した。試料分注後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外す。その後、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、第一試薬ボトル21から700μLの第一試薬を吸引し、試料を分注した処理容器24へ吐出し、そのまま、5回吸引・吐出を行い、全量を処理容器24へ吐出し、10分間放置した。なお、ここで第一試薬には、2%Triton X−100 (LKB製)、5.5mol/Lグアニジンチオシアン酸塩(和光純薬工業(株)、生化学用)を含むMES(2−morpholino−ethanesulfonic acid:2−モルホリノエタンスルホン酸、(株)同人化学研究所製)緩衝液を使用した。
吐出後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外す。所定の時間が経過した後、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、第二試薬ボトル22より第二試薬を100μL吸引し、試料と第一試薬の混合液が入った処理容器24へ吐出し、5回吸引・吐出を行い、全量を処理容器24へ吐出した。なお、ここで第二試薬には、1%TritonX−100(LKB製)、5.0mol/Lグアニジンチオシアン酸塩(和光純薬工業(株)製、生化学用)を含むMES((株))同人化学研究所製)緩衝液を使用した。
その間に、アーム33、ノズルホルダー34により核酸捕捉用チップ31を取り付け、試料、第一試薬、第二試薬の混合液を処理容器24から、シリンジ32の動作により吸引した。
吸引後、吸引した混合液を核酸捕捉チップ31の上側の阻止部材101bを混合液が越えない位置まで、処理容器24に吐出し、再び、核酸捕捉チップ31の下側の阻止部材101aを混合液が越えない位置まで吸引する。この吸引と吐出の操作を10回繰り返した後、処理容器24内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材101aを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、液受け29へ核酸捕捉チップ31を移動し、吸引した混合液を保持部材101bを越えない位置まで吐出し次動作まで待機する。
その間に、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、第二試薬ボトル22から800μLの第二試薬を吸引し、処理容器24へ全量を吐出した。吐出後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外す。その間に、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、核酸捕捉チップ31を移動し、第二試薬を混合液の場合と同様の動作により、5回吸引と吐出を繰り返した後、処理容器24内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材101aを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、液受け29へ核酸捕捉チップ31を移動し、吸引した第二試薬を保持部材101bを越えない位置まで吐出し次動作まで待機する。
その間に、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、第三試薬ボトル19から400μLの第三試薬を吸引し、処理容器24へ全量を吐出した。吐出後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外す。その間に、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、核酸捕捉チップ31を移動し、第三試薬を混合液の場合と同様の動作により、3回吸引と吐出を繰り返し、第一回目の洗浄を行う。洗浄後、処理容器24内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材101aを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、液受け29へ核酸捕捉チップ31を移動し、吸引した第三試薬を全量吐出し待機する。
その間に、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、第三試薬ボトル19から800μLの第三試薬を吸引し、処理容器24へ全量を吐出した。
なお、ここで第三試薬には、25mmol/L酢酸カリウム(和光純薬工業(株)製、試薬特級)を含む50%エタノール(和光純薬工業(株)製、試薬特級)を使用した。
吐出後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外す。その間に、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、核酸捕捉チップ31を移動し、第三試薬を3回吸引と吐出を繰り返し、第二回目の洗浄を行う。洗浄後、処理容器24内の混合液を全量吸引し、更に、保持部材101aを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。その後、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、液受け29へ核酸捕捉チップ31を移動し、吸引した第三試薬を全量吐出し、更に、そのままの位置で、空気 1mLを吸引、吐出する操作を10回繰り返し待機する。
上記、第2回目の第三試薬による操作を再度繰り返して行った。なお、この洗浄操作は、必要であれば更に繰り返して行う事ができる。
第三試薬による洗浄操作後、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、第四試薬ボトル102から200μLの第四試薬を吸引し、処理容器24へ全量を吐出した。
なお、ここで第四試薬には、50mmol/L酢酸カリウム(和光純薬工業(株)製、試薬特級)を使用した。
吐出後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外す。その間に、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、核酸捕捉チップ31を移動し、第四試薬を3回、吸引と吐出を繰り返し、固相の濯ぎを行った。濯ぎ後、処理容器24の全量を吸引し、更に、空気を吸引し、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、核酸捕捉チップ31を液受け29へ移動し、全量を吐出し、更に、そのままの位置で、空気1mLを吸引、吐出する操作を10回繰り返し待機する。
第四試薬による濯ぎ後、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、第五試薬ボトル20から60μLの第五試薬を吸引し、処理容器24へ全量を吐出した。
なお、ここで、第五試薬には、0.1mmol/Lエチレンジアミン四酢酸((株))日本ジーン製、遺伝子工学研究用)を含む10mmol/Lビシン((株)同人化学研究所製)緩衝液(PH8.5)を使用した。
吐出後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外す。その間に、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、核酸捕捉チップ31を移動し、第五試薬を20回、吸引と吐出を繰り返し、核酸の溶離を行った。溶離後、核酸捕捉用チップ31内の全量を吐出する。吐出後、アーム33、ノズルホルダー34の制御により、使用した核酸捕捉用チップ31をチップ外し器27の作用により取り外す。その間に、アーム16、ノズルホルダー17により新規に分注用チップ15を取り付け、溶離液の入った処理容器24から全量を吸引し、更に、少量の空気を吸引した後、アーム16、ノズルホルダー17の制御により、精製品用容器26の位置へ分注用チップを移動し、分注チップ15内の全量を精製品容器26へ吐出した。吐出後、アーム16、ノズルホルダー17の動作により使用した分注用チップ15をチップ外し器27の作用により取り外した。
同様の操作を、核酸捕捉用チップ31の固相102の量を一定にし、保持部材101aと保持部材101bの距離を変えて作成した、石英ウール間の平均間隔が異なる核酸捕捉用チップにより行った。
回収後の試料は、Roche社のCOBAS AMPLICORとコバス アンプリコア HCV v2.0試薬により評価を行った。回収したそれぞれの試料48.5μLと、HCVマスターミックスv2.0 41.7μL、HCVマンガン試薬8.3μL、HCV内部コントロール v2.0 1.5μLを混合し、試薬キットに付属の手順所に従い、装置の操作を行い、回収した試料によるHCVの評価を行った。結果を図8に示す。
図8の結果から平均間隔の増加に伴い、同一濃度のC型肝炎ウイルスの回収結果に対して、COBAS AMPLICORの吸光度出力が低下するのが分かる。これは、平均間隔の増加に伴いC型肝炎ウイルスの改修量が減少していることを表しており、平均間隔が21μm以上では、顕著に回収効率が低下することを示している。なお、COBASAMPLICORは吸光度が4.000を越えた場合、*.***と表示されるが、ここでは4.000として計算を行った。
また、上記の平均空間を有す核酸捕捉用チップ31に対して、1mLの溶液を吸引した際の平均流速を測定した。結果を図9に示す。
図9の結果から、平均間隔の減少に伴い平均流速が低下するのが分かる。これには平均間隔を狭めることによって、溶液の吸引、あるいは、吐出時の待ち時間が増大することを意味し、平均間隔の減少は、1試料あたりの装置の処理時間を増大させることになり、装置の稼動効率低下させることになる。
そのため、図8及び図9の結果から、図1の核酸捕捉用チップと図2の装置によりC型肝炎ウイルス遺伝子の回収が実用十分な状態で行えること、核酸捕捉用チップの望ましい平均間隔が13から21μmの範囲であることが分かる。
次に、カオロピック剤を他の物に換えて、図2の核酸精製装置により血清中のB型肝炎ウイルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。
核酸捕捉用チップ31は図1の構造で、石英ウールの石英ウール間の平均間隔が16μmになるように作製した。図2の核酸精製装置100の装置構成は替えずに、第一試薬ボトル21,及び第二試薬ボトル22に入れる試薬の組成を第一工程試薬は2%TritonX−100,6mol/Lグアニジン塩(和光純薬工業(株)製、生化学用)を含むMES((株)同仁化学研究所製)緩衝液に替え、第二工程試薬は5mol/Lグアニジン塩酸塩(和光純薬工業(株)製、生化学用)を含むMES((株))同仁化学研究所製)緩衝液に替えた。第三工程、第四工程、第五工程試薬は、前記のC型肝炎ウイルス遺伝子回収時と同じ組成の物を使用した。
処理用試料は、抗B型肝炎ウイルス抗体に陽性反応を示す血清を使用した。上記核酸捕捉用チップ31と第一工程から第五工程試薬の組合せにより、前記のC型肝炎ウイルス遺伝子回収時と同じ装置動作により、B型肝炎ウイルス遺伝子の回収を行った。回収に要した時間は約20分であった。
また、回収状態を比較するために、既存の方法として、「蛋白質 核酸 酵素」41(5)、458−459(1996)に記述の方法に従って行った。回収に要した時間は1日半であった。
回収後の試料は、宝酒造(株)製のPCR専用試薬キットを使用し、(株)サワデー・テクノロジー社に合成を依頼した増殖用プライマーによりB型肝炎ウイルス遺伝子中の特定の414塩基の増幅を試みた。PCR処理時の遺伝子増幅システムはTP3000(宝酒造(株)製)を使用し、最初に94℃の熱変性を3分間行った後、94℃の熱変性30秒、55℃のアニーリング30秒、72℃の伸張反応30秒を45回繰り返し、更に72℃で10分間加温し、PCR処理を行った。PCR処理後、その一部を3%アガロースゲルにより電気泳動を行い、SYBR GreenI(FMC Bioproducts製)により蛍光染色を行った。この結果、従来法と同程度のPCRの増幅バンドが得られた。これは、従来法と同等の回収効率で、より短時間に目的遺伝子の回収が行えたことを示している。
次に、図2の核酸精製装置により血清中に混在するB型肝炎ウイルスとC型肝炎ウイルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。
核酸捕捉用チップ31は図1の構造で、固相の平均間隔が16μmになるように作製した。処理試料は前記の2種の血清を混合して、混合した状態で各ウイルス濃度が、前記実施時の2倍になるように調製した。
前記のC型肝炎ウイルス遺伝子を回収した時と同じ試薬組成、および、同じ装置動作により遺伝し回収を行い、第五工程試薬のみを分注量を60μlから120μlに替えて実施した。
回収後の試料は、48.5μLを前記のCOBAS AMPLICORによるC型肝炎ウイルス遺伝子の検出に使用し、50μLを前記のPCR処理によるB型肝炎ウイルス遺伝子の検出に使用した。その結果、2種の異なるウイルスを混在した試料から、それぞれの遺伝子を単独で回収した場合と同等の効率で回収できた。これは、混在するウイルスの遺伝子を同時に回収可能であることを示すとともに、RNA(リボ核酸)及びDNA(デオキシリボ核酸)という性質の異なる核酸を同時に回収できることを示している。
本発明の実施例である核酸捕捉用チップの図である。 本発明の実施例である核酸精製用装置の平面図である。 図2の核酸精製用装置の概略外観図である。 図2の実施例における電気系の構成を示すブロックダイヤグラムである。 図2の実施例における核酸捕捉用チップを接続した分注器の概略構成を示す図である。 図2の実施例におけるチップをノズルに取り付ける動作の説明図である。 図2の実施例におけるチップをノズルから取り外す動作の説明図である。 本発明の実施形態1による結果を表すグラフである。 本発明の実施形態1による結果を表すグラフである。
符号の説明
10,32…シリンジポンプ、12…検体ラック、15…分注用チップ、16,33…アーム、17,34…ノズルホルダー、19…洗浄液ボトル、20…溶離液ボトル、22…結合促進剤ボトル、24…処理容器、26…精製品用容器、27…チップ外し器、31,31a,31b…核酸捕捉用チップ、36…分注ノズル、39…液体吸排用可動ノズル

Claims (12)

  1. 圧力変化により吸引と吐出が可能な装置に接続された核酸捕捉用チップであって、該核酸捕捉チップはシリカ含有の固相を液相に接触可能な状態で内蔵され、該固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が25μm以下である核酸捕捉用チップを用いる核酸回収方法であって、
    核酸を含有するサンプルから核酸を遊離するための第一試薬をサンプルと混合し、核酸の遊離を促す第一工程、
    遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、混合液を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二a工程、
    固相を洗浄するために第二試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第二試薬を接触させた後、吐出する第二b工程、
    固相、および、核酸捕捉チップ内に残存する、第一試薬、および/または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三a工程、
    核酸捕捉チップ内から第三試薬の除去を促すために、核酸捕捉チップ内に通気を行う第三b工程、
    残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程、及び
    固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程を含む核酸回収方法。
  2. 請求項1記載の核酸回収方法において、固相が繊維状物からなり、繊維状物と繊維状物との平均間隔が25μm以下である核酸回収方法。
  3. シリカを含有する固相への核酸の結合を促進する促進物質と、核酸を含む混合液から、核酸を回収する核酸回収方法であって、以下の手順を含む方法;
    平均間隔が25μm以下であるシリカ含有固相から成る通水部に、混合液を流す手順;及び
    核酸の固相への結合を維持しつつ促進物質を洗浄する洗浄試薬により、核酸の結合した固相を洗浄する手順。
  4. 請求項3記載の核酸回収方法であって、平均間隔が13μm以上である方法。
  5. 請求項4記載の核酸回収方法であって、固相が繊維状物から成る方法。
  6. 請求項4記載の核酸回収方法であって、固相が石英ウールである方法。
  7. 請求項6記載の核酸回収方法であって、石英ウール間の平均間隔が13μmから21μmである方法。
  8. 請求項6記載の核酸回収方法であって、石英ウールの直径が6μmから12μmである方法。
  9. 請求項4記載の核酸回収方法であって、以下の手順を含む方法;
    固相から核酸を容離する作用を有する物質により、核酸を結合した固相から核酸を容離する手順。
  10. 請求項3記載の核酸回収方法であって、混合液の平均流速が10μL/sから50μL/sである方法。
  11. シリカ含有の固相を液相に接触可能な状態で内蔵され、該固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が25μm以下である核酸回収具を用いる核酸回収方法であって、
    核酸を含有するサンプルから核酸を遊離するための第一試薬をサンプルと混合し、核酸の遊離を促す第一工程、
    遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、混合液を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二a工程、
    固相を洗浄するために第二試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、固相と第二試薬を接触させた後、吐出する第二b工程、
    固相、および、核酸捕捉チップ内に残存する、第一試薬、および/または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三a工程、
    核酸回収具内から第三試薬の除去を促すために、核酸回収具内に通気を行う第三b工程、
    残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程、及び
    固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程を含む核酸回収方法。
  12. シリカ含有の固相を液相に接触可能な状態で内蔵され、該固相が通水部を有し、その通水部における固相と固相との平均間隔が25μm以下である核酸回収具を用いる核酸回収方法であって、
    核酸を含有するサンプルから核酸を遊離するための第一試薬をサンプルと混合し、核酸の遊離を促す第一工程、
    遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、混合液を圧力変化により核酸回収具内に吸引し、固相と混合液を接触させ吐出する第二工程、
    固相、および、該核酸回収具内に残存する、第一試薬、および/または、第二試薬を除去するために、第三試薬を圧力変化により該核酸回収具内に吸引し、固相と第三試薬を接触させた後、吐出する第三工程、
    残存する第三試薬を濯ぐために、第四試薬を圧力変化により該核酸回収具内に吸引し、固相と第四試薬を接触させた後、吐出する第四工程、及び
    固相から核酸を溶離するために、第五試薬を圧力変化により該核酸回収具内に吸引し、固相と第五試薬を接触させた後、吐出する第五工程を含む核酸回収方法。
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