WO2002078846A1 - Instrument et procede de recolte d'acides nucleiques - Google Patents

Instrument et procede de recolte d'acides nucleiques Download PDF

Info

Publication number
WO2002078846A1
WO2002078846A1 PCT/JP2001/011212 JP0111212W WO02078846A1 WO 2002078846 A1 WO2002078846 A1 WO 2002078846A1 JP 0111212 W JP0111212 W JP 0111212W WO 02078846 A1 WO02078846 A1 WO 02078846A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
reagent
solid phase
chip
discharging
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/011212
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toshinari Sakurai
Toshiaki Yokobayashi
Original Assignee
Hitachi, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hitachi, Ltd. filed Critical Hitachi, Ltd.
Priority to EP01274056A priority Critical patent/EP1374997B1/en
Priority to US10/468,598 priority patent/US20040122222A1/en
Priority to DE60121477T priority patent/DE60121477T2/de
Priority to KR10-2003-7009955A priority patent/KR100505380B1/ko
Priority to JP2002577100A priority patent/JP3619514B2/ja
Publication of WO2002078846A1 publication Critical patent/WO2002078846A1/ja

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N35/1081—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices characterised by the means for relatively moving the transfer device and the containers in an horizontal plane
    • G01N35/109—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices characterised by the means for relatively moving the transfer device and the containers in an horizontal plane with two horizontal degrees of freedom
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/02—Burettes; Pipettes
    • B01L3/0275—Interchangeable or disposable dispensing tips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F2101/00—Mixing characterised by the nature of the mixed materials or by the application field
    • B01F2101/23—Mixing of laboratory samples e.g. in preparation of analysing or testing properties of materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0631—Purification arrangements, e.g. solid phase extraction [SPE]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
    • G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/103—General features of the devices using disposable tips
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
    • G01N2035/1058—General features of the devices using the transfer device for another function for mixing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/0099—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor comprising robots or similar manipulators
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/02—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations
    • G01N35/028—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor using a plurality of sample containers moved by a conveyor system past one or more treatment or analysis stations having reaction cells in the form of microtitration plates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N35/1004—Cleaning sample transfer devices
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25375—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.]
    • Y10T436/255—Liberation or purification of sample or separation of material from a sample [e.g., filtering, centrifuging, etc.] including use of a solid sorbent, semipermeable membrane, or liquid extraction

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus for recovering nucleic acid, and to an apparatus for recovering nucleic acid from a substance containing nucleic acid. More specifically, the present invention relates to a device for recovering a nucleic acid component present as an endogenous or exogenous gene from a body fluid component for genetic diagnosis by a nucleic acid test.
  • the PCR method can amplify nucleic acids in a solution in a sequence-specific manner.For example, a virus that is present only in trace amounts in serum can be indirectly detected by amplifying the nucleic acid that is the gene of the virus. Can be proved.
  • Known methods for recovering nucleic acids from biological samples containing nucleic acids in a highly purified state that do not contain inhibitors include a method in which a surfactant is allowed to act on a biological sample in the presence of a proteolytic enzyme.
  • this preparation method uses an organic solvent such as phenol which is a deleterious substance in the process, or requires a centrifugal separation process.
  • Patent 2680462 discloses that silica particles capable of binding to a nucleic acid in the presence of a chaotropic substance are used as a solid phase for binding a nucleic acid.
  • This patent 2680462 discloses a composite in which a nucleic acid-containing sample is added to a reaction vessel containing a suspension of silica particles and a guanidine thionate buffer as a chaotropic substance, mixed, and the nucleic acid is bound to the silica particles.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-250681 discloses a method of purifying a DNA extract using a cartridge container having a quadruple-structured filter member in which a glass powder layer is sandwiched between two glass fiber filters and a membrane filter. Is shown.
  • the prepared DNA-containing culture solution is pretreated, the bacteria are collected overnight in a trapfill, and an elution reagent is added to elute the plasmid DNA out of the cells. Use as a sample.
  • a sample for purification and sodium iodide are added to the cartridge container, and the cartridge container is subjected to vacuum depressurization or centrifugation to adsorb plasmid DNA to the glass powder layer of the cartridge container.
  • a washing buffer is added to the cartridge container, and the cartridge is washed by vacuum decompression or centrifugation.
  • an elution buffer is added to the cartridge container, and vacuum decompression or centrifugation is performed. Elute the plasmid DNA.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-266864 discloses a nucleic acid trap containing a silica-containing solid phase.
  • 1 shows a method and an apparatus for purifying nucleic acids using a trapping chip.
  • a nucleic acid capturing chip is detachably connected to a movable nozzle for sucking and discharging liquid, and a liquid mixture of a sample containing nucleic acid and a substance that promotes binding of nucleic acid to a solid phase is sucked and ejected from a predetermined container.
  • Patent 2680462 avoids the use of phenol, which is a deleterious substance, but requires a centrifugation step to separate the silica particles from the solution after binding nucleic acids to the silica particles. As with the extraction method, automation of the centrifugation step becomes a problem.
  • the centrifugal separation process is performed under reduced pressure by forming a glass powder layer in a cartridge container sandwiched between two glass fiber filters and a membrane filter. It can be said that this method is suitable for automation, but the flow of the solution is limited to one direction, the contact efficiency between the plasmid DNA or the elution buffer and the glass powder is reduced, and the recovery efficiency is reduced. Adversely affect
  • the flow of the solution is made bidirectional by detachably connecting the nucleic acid capturing chip containing the solid phase to the movable nozzle for sucking and discharging the liquid. It is a method that can improve the efficiency of contact between nucleic acid or eluent and solid phase and can be easily automated. No description was given of the form.
  • An object of the present invention is to provide a quick, simple, and highly reliable instrument for recovering nucleic acid and a method for recovering nucleic acid from a nucleic acid-containing material, and in particular, an instrument suitable for recovering a nucleic acid component present in a biological sample. And in providing the method.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid recovery method suitable for automation from a nucleic acid-containing material. It is an object of the present invention to provide a collection device and a nucleic acid recovery method, and in particular, to provide a device and a method suitable for automatic recovery of a nucleic acid component present in a biological sample. Means for solving the problem
  • the nucleic acid recovery device is preferably a nucleic acid capture chip.
  • the present invention relates to a nucleic acid recovery instrument incorporating a silica-containing solid phase in a state capable of contacting a liquid, wherein the solid phase has a water passage, and the average distance between the solid phase and the solid phase in the water passage. Is less than 25 m.
  • a nucleic acid recovery device is a nucleic acid capturing chip containing a silica-containing solid phase in a state capable of contacting a liquid, wherein the solid phase has a water passage, and the solid phase in the water passage is Using a nucleic acid capture chip characterized in that the average distance from the solid phase is 25 m or less,
  • the mixture After mixing the liquid containing the released nucleic acid with the second reagent, the mixture is suctioned into the nucleic acid capturing chip by a pressure change, and the solid phase and the mixed solution are brought into contact with each other and discharged.
  • a third reagent is aspirated into the nucleic acid capturing chip by a pressure change, and the solid phase and the third reagent are removed. After contacting the reagent, the third step a
  • the average pore size means an average interval, and is characterized by being 25 m or less.
  • the nucleic acid capturing chip is replaced with a new one each time the sample to be processed changes. In each of the second a, the second b, the third a, the fourth, and the fifth steps, the solution once inhaled is discharged into a predetermined container, and the solution is again sucked into the nucleic acid capturing chip. Increase the probability of contact between the solid phase and the solution.
  • FIG. 1 is a diagram of a nucleic acid capturing chip according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a plan view of an apparatus for purifying nucleic acid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic external view of the nucleic acid purification apparatus of FIG.
  • FIG. 4 is a block diagram showing a configuration of an electric system in the embodiment of FIG.
  • FIG. 5 is a diagram showing a schematic configuration of a dispenser to which a nucleic acid capturing chip in the embodiment of FIG. 2 is connected.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram of the operation of attaching the chip to the nozzle in the embodiment of FIG.
  • FIG. 7 is an explanatory diagram of the operation of removing the chip from the nozzle in the embodiment of FIG.
  • FIG. 8 is a graph showing a result according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing a result according to the first embodiment of the present invention. Explanation of reference numerals
  • nucleic acid-containing samples include biological samples such as whole blood, serum, sputum, and urine, cultured cells
  • Targets include biological samples such as cultured bacteria, or nucleic acids retained in gels after electrophoresis, reaction products such as DNA amplification enzymes, and substances containing partially purified nucleic acids.
  • the nucleic acid includes a double-stranded, single-stranded, or partially-double- or single-stranded deoxyliponucleic acid (DNA) and a ribonucleic acid (RNA).
  • the solid phase built into the chip for nucleic acid capture contains glass particles, silica particles, quartz filter paper and its crushed material, quartz wool, diatomaceous earth, etc., a substance containing silicon oxide, or silica on the surface of plastic, etc. It can be used if it contains silicon oxide, such as a coated product.
  • the solid phase must be maintained in the chip during use, must be installed with a water-permeable part inside the chip, and this water-permeable part must be continuous Is desirable.
  • the shape of the solid phase is porous, granular, or fibrous, and the average distance between the solid phases in the water-permeable portion means the average pore diameter in the pores of a porous material if it is a porous material.
  • the preferred solid phase of the present invention is quartz wool, preferably with a holding material made by sintering quartz particles on both sides to control the average spacing between the quartz wools used as the solid phase.
  • the average spacing between quartz wools is defined as the average spacing between quartz wools that can be formed when quartz wools are assumed to be cylindrical and uniformly arranged in space. It is determined by the volume, cross-sectional area and length of the space where quartz wool is installed, and the weight, specific gravity and average diameter of the quartz wool to be installed.
  • the average spacing between the quartz wools can be calculated by the following formula.
  • nucleic acid capture 5 0 4 X 1 0- 4 ⁇ h 1/2 -. 9 as the 0 X 1 0- 6 device for causing discharge and suction by the pressure change in the nucleic acid capturing tip, nucleic acid capture It is not particularly limited as long as it has a shape compatible with one end of the application tip and can intentionally apply a pressure change, and a manual pipette syringe can be used. For efficient nucleic acid recovery, it is necessary to control the suction amount, the discharge amount, the suction speed, the discharge speed, and the like. Therefore, the combination with an automatic device is desirable.
  • the reagent used in the first step can be used if it can promote the release of nucleic acid from the nucleic acid-containing sample, but the use of a highly viscous substance is not desirable.
  • the nucleic acid to be recovered is RNA
  • any substance that promotes the binding of nucleic acid to a solid phase containing silylation can be used, and a substance generally called a chaotopic reagent can be used.
  • a substance generally called a chaotopic reagent can be used.
  • the final concentration should be 3 mo1 ZL or more and the final pH should be acidic. desirable.
  • any reagent that can wash the substance that promotes the binding of the nucleic acid used in the second step while maintaining the binding of the nucleic acid to the solid phase can be used. It is known to use isopropyl alcohol or the like at a concentration of 70% or more.However, when using the recovered nucleic acids for PCR, etc., these substances are known to have an adverse effect. It is desirable to use the concentration as low as possible within the range having the specified function. In these respects, the preferred embodiment of the present invention uses 50% ethyl alcohol containing 25 mmol / L potassium acetate.
  • the reagent used in the fourth step is to rinse the alcohol used in the third step and carry over the reagent used in the third step to the final step, while keeping the binding of the nucleic acid to the solid phase as much as possible. There is a need to avoid.
  • 5 Ommo 1 L of potassium acetate is used, and the liquid temperature is 20 and the following conditions are used.
  • any substance having an action of eluting nucleic acid from the solid phase can be used, and an aqueous solution having a low salt concentration or pure is a known method.
  • an aqueous solution having a low salt concentration or pure is a known method.
  • lOmmol ZL picin (pH 8.5), 0.1 lmmo1 / L EDTA is used.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a nucleic acid capturing chip.
  • the tip 31 of the nucleic acid capturing chip 31 has an inner diameter that is tightly fitted to the tip of the connection nozzle of an automatic device or a device that generates a pressure change, so that the inner diameter gradually decreases toward the lower end.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is made of a transparent or translucent synthetic resin.
  • a disc-shaped blocking member 101 a is provided from the upper end of the tip 31 to prevent the solid phase from flowing out and to define the average interval between the solid phases.
  • the blocking member 101b is press-fitted so as to sandwich the solid phase 102 so that the solid phase 102 can maintain a predetermined average interval.
  • These blocking members 1Ola, 101b have a number of holes through which liquids and gases can easily pass, and the holes are large enough to prevent the outflow of the solid phase 102.
  • the material of the blocking members 1Ola and 101b a material obtained by sintering quartz particles having a diameter of about 0.1 mm and matching the inner diameter of a predetermined position of the nucleic acid capturing chip 31 is used.
  • FIGS. Fig. 2 is a plan view of the device of one embodiment
  • Fig. 3 is its external view
  • Fig. 4 is a block diagram of an electric system
  • Fig. 5 is a schematic diagram of a dispenser connected to a nucleic acid capturing chip
  • Fig. 6 is a liquid dispenser.
  • FIG. 7 is an explanatory view of the mounting operation of the injection tip
  • FIG. 2 and 3 the nucleic acid purification apparatus 100 has two arms 16 and 33 movable in the horizontal direction (X direction).
  • a nozzle holder 17 holding a dispensing nozzle 36 (FIG. 6) is mounted on one arm 16 so as to be movable in the horizontal direction (Y direction) along the length of the arm 16. .
  • the other arm 33 has a nozzle holder 34 for holding the movable nozzle 3 9 (Fig. 5) for sucking and discharging liquid.
  • Each of the nozzle holders 17 and 34 can move in the vertical direction (Z direction) with respect to the corresponding arms 16 and 33. Since the horizontal movement area of the arm 16 and the horizontal movement area of the arm 33 partially overlap, the mounting height position of each arm is different.
  • each tip rack 14a, 14b, 14c On the work surface 5 of the main body stand, three chip racks 14a, 14b, and 14c on which a large number of unused dispensing tips 15 are placed are set in a predetermined area. As shown in FIG. 6, these tip racks 14 have holes into which each dispensing tip 15 can be inserted, and the tip of the dispensing tip does not contact the work surface 5 or the bottom surface of the tip rack. It is shaped like a box with a different height. Each tip rack 14a, 14b, 14c can hold up to 48 dispensing tips 15, respectively. Further, on the work surface 5, a chip rack 30 on which a large number of unused nucleic acid capturing chips 31 are placed is set in a predetermined area.
  • the shape of the tip rack 30 is the same as the tip rack 14 described above. In this example, a maximum of 48 nucleic acid capturing chips 31 can be held on the chip rack 30.
  • a sample rack 12 holding a plurality of sample containers 13 each containing a sample to be processed, that is, a sample containing nucleic acid is set in a predetermined area. In this example, each sample rack 12 can hold six sample containers 13. In addition, eight or more sample racks 12 can be set.
  • a container rack 23 holding many unused processing containers 24 is set in a predetermined area. The container rack 23 can hold up to 48 processing containers 24. Further, on the work surface 5, a container rack 23 holding many unused purified product containers 26 is set in a predetermined area.
  • This purified product container collects the purified nucleic acid-containing liquid for each sample.
  • the container rack 25 can hold up to 48 refined product containers 26.
  • the work surface 5 receives the water discharged from the dispensing nozzle 36 at the time of priming, and the liquid receiving portion 11 serving as the home position of the dispensing nozzle 36, and dispensing for dispensing work.
  • the washing part 18 for washing the chip 15, the dispensing tip 15 connected to the dispensing nozzle 36, and the nucleic acid trapping chip 31 connected to the liquid suction / discharge movable nozzle 39 are combined.
  • the syringe pump 10 shown in FIG. 6 and the syringe pump 32 shown in FIG. 5 are respectively mounted on the main frame, and control of the liquid suction operation and the discharge operation is performed independently of each pump.
  • the dispensing nozzle 36 held by the nozzle holder 17 is connected to a liquid pump cylinder pump 10 via a flexible tube 42. Pure water is filled in the dispensing nozzle 36 and the pipe 42, and the syringe pump 10 is connected to a pure water supply source (not shown).
  • a movable nozzle 39 held by a nozzle holder 34 is connected to a syringe pump 32 via a flexible tube 35.
  • Pure water is filled in the movable nozzle 39 and the pipe 35, and the syringe pump 32 is connected to a pure water supply source (not shown).
  • the mounting for connecting the dispensing tip 15 to the dispensing nozzle 36 and the mounting for connecting the nucleic acid capturing chip 31 to the movable nozzle 39 are performed in the corresponding chip racks 14, 3. This is achieved by lowering each nozzle and fitting the tip to the tip of the nozzle.
  • Dispensing tip connected to dispensing nozzle 36 To remove the nucleic acid capturing chip 31 connected to the movable nozzle 15 and the movable nozzle 39 from the respective nozzles, use a chip remover 27. As shown in FIGS.
  • the chip remover 27 has a plate-like member at a predetermined height position, and the plate-like member has a head 52 and a head 52 of the dispensing tip 15.
  • a slit 55 having a width smaller than the outer diameter of the head 54 of the nucleic acid capturing chip 31 and larger than the outer diameters of the dispensing nozzle 36 and the movable nozzle 39 is formed.
  • FIG. 4 shows the configuration of the electrical system of the nucleic acid purification device shown in Fig. 2.
  • a personal computer (PC) 60 as an operation control unit has a keyboard 61 as an operation panel for inputting operation conditions and sample information, and a CRT as a display device for displaying input information and warning information.
  • 62 a mechanism control section 65 for controlling each mechanism section of the apparatus, and the like.
  • the mechanism control unit 65 includes a stepping motor 7 for driving the piston for causing the syringe pump 10 to perform suction and discharge operations, and a stepping motor 7 for driving the piston for causing the syringe pump 32 to perform suction and discharge operations.
  • Each part of the refiner is operated according to a specified program.
  • the hepatitis C virus gene in the serum was recovered by using the nucleic acid purification device shown in Fig. 2 using the nucleic acid capture chip shown in Fig. 1 with different average intervals of the solid phases used. An experimental example will be described.
  • Samples for treatment were prepared from the secondary standard hepatitis C serum, which was priced according to the WHO International Standard, at 100 IU / mL with hepatitis C-negative serum. Dispensed into sample container 13. By the automatic operation of the apparatus shown in FIG. 2, the dispensing tip 15 was attached by the arm 16 and the nozzle holder 17, and a 200 / 200L sample was sucked from the sample container 13 and dispensed to the processing container 24. After sample dispensing, the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is removed by the action of the tip remover 27.
  • a new dispensing tip 15 is attached by the arm 16 and the nozzle holder 17, 700 L of the first reagent is aspirated from the first reagent bottle 21, and discharged to the processing container 24 where the sample has been dispensed, and The suction and discharge were performed five times, and the entire amount was discharged into the processing container 24 and left for 10 minutes.
  • the first reagent includes 2% Triton on X-100 (manufactured by LKB), 5.5mo] guanidine thiocyanate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry)
  • MES 2-morpho 1 in ethanesulfonic acid: 2-morpholinoethanesulfonic acid, manufactured by Dojindo Chemical Laboratories
  • the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is removed by the action of the tip removing device 27. After a predetermined time has elapsed, a new dispensing tip 15 is attached by the arm 16 and the nozzle holder 17, 100 L of the second reagent is aspirated from the second reagent bottle 22, and the mixed solution of the sample and the first reagent enters. Then, the mixture was discharged into the processing container 24, and suction and discharge were performed 5 times, and the entire amount was discharged into the processing container 24.
  • the second reagent includes 1% TritonX-100 (manufactured by LKB) and 5.0 mo 1 ZL guanidine thiocyanate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., for biochemistry).
  • MES manufactured by Dojin Chemical Laboratory
  • the nucleic acid capturing chip 31 was attached by the arm 33 and the nozzle holder 34, and the mixture of the sample, the first reagent, and the second reagent was sucked from the processing container 24 by the operation of the syringe 32.
  • the suctioned mixed solution is discharged into the processing container 24 until the mixed solution does not exceed the blocking member 10 1 b on the upper side of the nucleic acid capturing chip 31, and is again returned under the nucleic acid capturing chip 31.
  • the suction member 101 on the side is sucked to a position where the mixture does not exceed.
  • the suction and discharge operations are repeated 10 times, the entire amount of the mixed solution in the processing container 24 is sucked, and further, the air is sucked to a position where the mixed solution does not exceed the holding member 101a.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the liquid receiver 29, and the sucked mixed liquid is discharged to a position not exceeding the holding member 101b and waits for the next operation.
  • a new dispensing tip 15 is attached by the arm 16 and the nozzle holder 17, and 800 L of the second reagent is aspirated from the second reagent bottle 19, and the entire amount is transferred to the processing container 24.
  • the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is removed by the action of the tip remover 27.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is moved, and after the suction and discharge are repeated five times by the same operation as in the case of the mixed solution of the second reagent, The entire amount of the mixed liquid in the processing container 24 is sucked, and further, air is sucked to a position where the mixed liquid does not exceed the holding member 101a. Then, under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34, the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the liquid receiver 29, and the sucked second reagent is discharged to a position not exceeding the holding member 101b. Wait until.
  • a new dispensing tip 15 is attached by the arm 16 and the nozzle holder 17, and 400 L of the third reagent is sucked from the third reagent bottle 19 to the processing vessel 24. The entire amount was discharged.
  • the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is removed by the action of the tip remover 27.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is moved under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34, and the suction and discharge are repeated three times by the same operation as in the case of the mixed solution of the third reagent. Perform a second wash.
  • the whole amount of the mixed solution in the processing container 24 is sucked, and further, the air is sucked to a position where the mixed solution does not exceed the holding member 101a. Thereafter, under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34, the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the liquid receiver 29, and the suctioned third reagent is discharged in its entirety and is on standby.
  • the third reagent is 50% ethanol containing 25 mm o 1 ZL potassium acetate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade reagent) and 50% ethanol (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade reagent) It was used.
  • the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is removed by the action of the tip remover 27.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is moved under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34, and the third reagent is repeatedly suctioned and discharged three times to perform the second washing. After the washing, the entire amount of the mixed solution in the processing container 24 is sucked, and further, air is sucked to a position where the mixed solution does not exceed the holding member 101a. Thereafter, under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34, the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the liquid receiver 29, the entire amount of the sucked third reagent is discharged, and the air lm L is sucked at the same position. The discharge operation is repeated 10 times and then waits.
  • the second operation with the third reagent was repeated again. This washing operation can be further repeated if necessary.
  • a new dispensing tip 15 is attached by the arm 16 and the nozzle holder 17, and the fourth reagent bottle 102 to 200; L of the fourth reagent is aspirated. The entire amount was discharged into the processing container 24.
  • 5 Ommo 1 ZL potassium acetate (special grade reagent, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is removed by the action of the tip remover 27.
  • the nucleic acid capturing chip 31 was moved under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34, and the fourth reagent was repeatedly suctioned and discharged three times to rinse the solid phase.
  • the entire amount of the processing container 24 is suctioned, and further, air is sucked, and the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the liquid receiver 29 by controlling the arm 33 and the nozzle holder 34, and the entire amount is discharged. Further, the operation of sucking and discharging the air lmL is repeated 10 times at the position as it is, and waits.
  • the fifth reagent includes 0.1 lmmo 1 ZL ethylenediaminetetraacetic acid (manufactured by Nippon Gene, for genetic engineering research) and 1 Ommo 1 / L bicine (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc.) ) A buffer solution (PH8.5) was used.
  • the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is removed by the action of the tip removing device 27.
  • the nucleic acid capturing chip 31 was moved under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34, and the fifth reagent was repeatedly sucked and discharged 20 times to elute the nucleic acid. After the elution, the entire amount in the nucleic acid capturing chip 31 is discharged. After the discharge, the used nucleic acid capturing chip 31 is removed by the operation of the chip removing device 27 under the control of the arm 33 and the nozzle holder 34.
  • a new dispensing tip 15 is attached by the arm 16 and the nozzle holder 17, and the whole amount is sucked from the processing vessel 24 containing the eluate, and a small amount of air is sucked.
  • the dispensing tip was moved to the position of the purified product container 26, and the entire amount in the dispensing tip 15 was discharged to the purified product container 26.
  • the dispensing tip 15 used by the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 was removed by the action of the tip remover 27.
  • a similar operation was performed by changing the distance between the holding member 101a and the holding member 101b while keeping the amount of the solid phase 102 of the nucleic acid capturing chip 31 constant, and the nucleic acid capturing chip having a different average spacing between quartz wools. was performed.
  • the collected samples were evaluated using 0-116 companies (: # 883 AMPL I COR and Cobas Amplicor HCV V2.0 reagent. Each of the collected samples, 48.5 ⁇ L, and HC Mix the V-mass Yuichi mix V 2.0 41.7, HCV manganese reagent 8.3 iL, HCV internal control V 2.0 1.5, and operate the device according to the procedure attached to the reagent kit. HCV was evaluated, and the results are shown in FIG.
  • Figs. 8 and 9 indicate that the hepatitis C virus gene can be recovered in a practically sufficient state using the nucleic acid capturing chip of Fig. 1 and the device of Fig. 2, and that the nucleic acid capturing chip is desirable. It can be seen that the average interval ranges from 13 to 21 / zm.
  • a description will be given of an example of an experiment in which the hepatitis B virus gene in the serum was recovered using the nucleic acid purification apparatus shown in FIG.
  • the nucleic acid capturing chip 31 has the structure shown in FIG. 1, and was manufactured such that the average interval between quartz wools was 16 tm.
  • the composition of the reagents to be placed in the first reagent bottle 21 and the second reagent bottle 22 was changed to the first step without changing the configuration of the nucleic acid purification device 100 in Fig. 2.
  • the reagent was 2% TritonX-100, 6 mo 1 ZL guanidine.
  • MES containing salt manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Serum that showed a positive reaction to anti-hepatitis B virus antibody was used as a sample for treatment.
  • the hepatitis B virus gene was recovered by the same device operation as in the above-mentioned recovery of the hepatitis C virus gene. The time required for recovery was about 20 minutes.
  • the collected sample was collected from a specific hepatitis B virus gene using a PCR reagent kit manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. Amplification of 414 bases was attempted.
  • the gene amplification system used in the PCR process was TP 3000 (Takara Shuzo Co., Ltd.). After first heat denaturation at 94 ° C for 3 minutes, heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds and 55 Annealing for 30 seconds and extension reaction of 72 for 30 seconds were repeated 45 times, followed by heating at 72 for 10 minutes and PCR treatment.
  • the nucleic acid-capturing chip 31 had the structure shown in FIG. 1 and was manufactured such that the average interval between the solid phases was 16 m.
  • the treated sample was prepared by mixing the above-mentioned two types of sera so that the concentration of each virus was twice as high as that in the above-mentioned operation in the mixed state.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

明 細 書
核酸の回収器具および方法 技術分野
本発明は、 核酸の回収装置に関し、 核酸を含有する物質からの核酸の回収 器具に関する。 更に詳しくは、 核酸の検査による遺伝子診断のための体液成分か らの内因性、 或いは、 外来性の遺伝子として存在する核酸成分の回収器具に関す る。 技術背景
分子生物学の進歩によって、 遺伝子に関する数々の技術が開発され、 また、 それらの技術により多くの疾患性の遺伝子が分離'同定された。 その結果、 医療の 分野でも、 診断、 或いは、 検査法に分子生物学的な技法が取り入れられ、 従来不 可能であった診断が可能となったり、 検査日数の大幅短縮が達成されつつある。
この急激な進歩は、 主として、 核酸増幅法、 特に、 PCR法 （polymerase chain reaction：ポリメラ一ゼ連鎖反応、 Saiki et al., Science, 239， 487-491(1988)) に 依るところが大きい。 PCR法は、 溶液中の核酸を配列特異的に増幅することが可 能なため、 例えば、 血清中に極微量しか存在しないウィルスを そのウィルスの 遺伝子である核酸を増幅し検出することにより、 間接的に証明できる。
しかし、 この PCR法を臨床の場で日常検査に使用した際に、 いくつかの問 題点が存在する。 その中でも特に、 前処理における核酸の抽出、 精製工程の重要 性が指摘されてる (大島ほか， JJCLA, 22(2), 145-150(1997))。 これは、 核酸精製時に 除去し得なかった阻害因子の影響によるものであり、 血液中のヘモグロビン、 抽 出工程で使用される界面活性剤等が知られている。 また、 抽出工程に関しては、 用手法による煩雑な操作と熟練者による多大な労力が必要とされる。 そのため、 病院の検査室へ新規に遺伝子検査を導入する際の障害となっており、 この工程の 自動化が熱望されている。
また、 分子生物学的な研究を行う機関では、 遺伝子組換え操作を行うため の材料として、 プラスミド DNAが頻繁に使用されているが、 省力化の点等から、 検査室の場合と同様に、 核酸を抽出し精製する工程の自動化が望まれている。
核酸を含有する生物試料から阻害因子を含まない精製度の高い状態で核酸 を回収するための既知の方法としては、 タンパク質分解酵素の存在下で、 生物試 料に界面活性剤を作用させ、 核酸を遊離状とし、 フエノール （及び、 クロロフォ ルム） と混合し、 遠心分離器による水相 ·有機相分離を数回行った後、 水相から アルコールにより沈殿物の形で核酸を回収する方法が知られている。 しかし、 こ の調製方法は、 工程内に劇物であるフエノール等の有機溶剤を使用する、 或いは、 遠心分離工程を必要するため、 遠心分離器のロー夕への容器の出し入れや遠心分 離後の溶液の分取などの自動化が非常に困難である、 という問題が存在する。
特許 2680462には、 カオトロピック物質の存在下で核酸と結合する事が可 能なシリカ粒子を核酸結合用固相として使用することを示している。 この特許 2680462には、 'シリカ粒子の懸濁液とカオトロピック物質としてのグァニジンチォ シァネ一卜緩衝液とが入った反応容器に、 核酸を含む試料を加えて混合し、 核酸 がシリカ粒子に結合した複合体を遠心分離により沈降させた後、 上清を廃棄し、 残った複合体に洗浄液を加えて洗浄し、 再沈殿させた複合体をエタノール水溶液 で洗浄した後アセトンで洗浄し、 アセトンを除去して乾燥した複合体に溶離用緩 衝液を加えて核酸を溶離して回収する方法が記載されている。
また、 特開平 7-250681号公報は、 ガラスパウダー層を 2枚のガラス繊維 フィルタ一とメンブランフィルタ一で挟んだ 4重構造の濾過部材を有するカート リッジ容器を用いて DNA抽出液を精製する方法を示している。 この特開平 7- 250681号公報では、 調製された DNA含有培養液を前処理しトラップフィル夕一に 集菌し、 溶離用試薬を添加してプラスミド DNAを細胞外に溶出させたものを精製 用試料とする。 精製工程では、 カートリッジ容器に精製用試料とヨウ化ナトリウ ムを添加し、 カートリッジ容器に真空減圧、 または、 遠心分離処理を行い、 カー トリッジ容器のガラスパウダー層にプラスミド DNAを吸着させる。 次いで、 カー トリッジ容器に洗浄用緩衝液を添加して真空減圧、 または、 遠心分離処理により 洗浄し、 その後、 カートリッジ容器に溶出用緩衝液を添加して真空減圧、 または、 遠心分離処理を行い、 プラスミド DNAを溶出する。
さらに、 特開平 11- 266864号公報は、 シリカ含有の固相を内蔵した核酸捕 捉用チップによる核酸の精製方法と精製用装置を示している。 この方法では、 核 酸捕捉用チップを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続し、 固相への核酸の結 合を促進する物質と核酸含有試料との混合液を所定容器から液体吸排用可動ノズ ルに接続された核酸捕捉用チップ内に吸引し、 核酸を固相に結合した後、 核酸捕 捉用チップ内の液体を排除し、 次いで洗浄液を吸引、 排出することにより核酸捕 捉チップ内を洗浄し、 洗浄後の核酸捕捉用チップ内に溶離液を吸入し、 固相から 溶離された核酸を含む溶離液を精製品容器に吐出する。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
上述した先行技術の内、 特許 2680462では、 劇物であるフエノールの使 用は避けられるが、 シリカ粒子に核酸を結合した後のシリカ粒子と溶液の分離に は遠心分離工程を必要とし、 フエノールによる抽出法と同様に遠心分離工程の自 動化が問題となる。
また、 特開平 7-250681号公報に記載の方法では、 ガラスパウダー層を 2枚のガラス 繊維フィル夕一とメンブランフィル夕一で挟み込んだカートリッジ容器にする事 で、 遠心分離処理の工程を真空減圧に置き換えることは可能であり、 自動化に適 した方法と言えるが、 溶液の流れが一方向に限定され、 プラスミド DNA、 あるい は、 溶出溶緩衝液とガラスパウダーの接触効率が低下し、 回収効率に悪影響を与 える。
さらに、 特開平 11-266864号公報記載の方法では、 固相を内蔵した核酸捕捉用チッ プを液体吸排用可動ノズルに脱着可能に接続する事により、 溶液の流れを双方向 とする事で、 核酸、 あるいは、 溶離液と固相の接触効率を向上し、 かつ、 容易に 自動化が可能な方法であるが、 その核酸捕捉用チップに関して、 構成例に関して は記載されているが、 より好適な使用形態に関しての記述はなされていなかった。
本発明の目的は、 核酸を含有する材料からの迅速、 簡便で信頼度の高い核 酸回収器具と核酸回収方法の提供にあり、 特に、 生物試料中に存在する核酸成分 の回収に好適な器具と方法の提供にある。
また、 本発明の目的は、 核酸を含有する材料からの自動化に適した核酸回 収器具と核酸回収方法の提供に有り、 特に、 生物試料中に存在する核酸成分の自 動回収に好適な器具と方法の提供にある。 課題を解決するための手段
本発明に基づく核酸の回収器具は、 好適には、 核酸捕捉チップである。 本 発明は、 シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸回収器具にお いて、 固相が通水部を有し、 その通水部における固相と固相との平均間隔が 2 5 m以下であることを特徴とする。
本発明に基づく核酸の回収器具は、 シリカ含有の固相を液体に接触可能な 状態で内蔵した核酸捕捉用チップにおいて、 固相が通水部を有し、 その通水部に おける固相と固相との平均間隔が 2 5 m以下である事を特徴とする核酸捕捉 チップを用いて、
核酸を含有するサンプルから、 核酸を遊離するための第一試薬を混合し、 核酸の 遊離を促す第一工程と、
遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、 圧力変化により核酸捕捉チップ 内に吸引し、 固相と混合液を接触させ吐出する第二 a工程と
固相を洗浄するために第二試薬を、 圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、 固相と第二試薬を接触させた後、 吐出する第二 b工程と
固相、 および、 核酸捕捉チップ内に残存する、 第一試薬、 および/または、 第二 試薬を除去するために、 第三試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、 固相と第三試薬を接触させた後、 吐出する第三 a工程と
核酸捕捉チップ内から第三試薬の除去を促すために、 核酸捕捉チップ内に通気を 行う第三 b工程と
残存する第三試薬を濯ぐために、 第四試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に 吸引し、 固相と第四試薬を接触させた後、 吐出する第四工程と
固相から核酸を溶離するために、 第五試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に 吸引し、 固相と第五試薬を接触させた後、 吐出する第五工程
を含む事を特徴とする。 なお、 固相が、 粒状物或いは繊維状物からなる場合は、 平均孔径は平均間隔のことを意味し、 2 5 m以下であることを特徴とする。 本発明の望ましい実施例では、 処理対象の試料が変わる毎に核酸捕捉用 チップは、 新しいものに交換される。 また、 第二 a、 第二 b、 第三 a、 第四、 第 五の各工程では、 一旦吸入した溶液を所定の容器に吐出し、 再び核酸捕捉用チッ プ内に吸引する事を繰り返し行い、 固相と溶液の接触確立を高くする。 なお、 第 二 a、 第二 b工程での吐出時には、 溶液の全量吐出に伴い、 泡の発生、 再吸引時 の吸引抵抗増大等の不具合が発生するため、 その全量を吐出せずに、 固相部が必 ず溶液に接した状態を維持するように制御するのが望ましい。 図面の簡単な説明
図 1は本発明の実施例である核酸捕捉用チップの図である。
図 2は本発明の実施例である核酸精製用装置の平面図である。
図 3は図 2の核酸精製用装置の概略外観図である。
図 4は図 2の実施例における電気系の構成を示すプロックダイヤグラムである。 図 5は図 2の実施例における核酸捕捉用チップを接続した分注器の概略構成を示 す図である。
図 6は図 2の実施例におけるチップをノズルに取り付ける動作の説明図である。 図 7は図 2の実施例におけるチップをノズルから取り外す動作の説明図である。 図 8は本発明の実施形態 1による結果を表すグラフである。
図 9は本発明の実施形態 1による結果を表すグラフである。 符号の説明
1 0 , 3 2…シリンジポンプ、 1 2…検体ラック、 1 5…分注用チップ、 1 6， 3 3…アーム、 1 7 , 3 4…ノズルホルダー、 1 9…洗浄液ボトル、 2 0…溶離 液ボトル、 2 2…結合促進剤ボトル、 2 4…処理容器、 2 6…精製品用容器、 2 7…チップ外し器、 3 1 , 3 1 a , 3 1 b…核酸捕捉用チップ、 3 6…分注ノズ ル、 3 9…液体吸排用可動ノズル
発明の実施するための最良の形態
核酸含有試料としては、 全血、 血清、 喀痰、 尿等の生体試料や培養細胞、 培養細菌等の生物学的な試料、 あるいは、 電気泳動後のゲルに保持された状態の 核酸、 D N A増幅酵素等の反応産物や素精製状態の核酸を含む物質等を対象とす ることができる。 なお、 ここでの核酸とは、 2本鎖、 1本鎖、 あるいは部分的に 2本鎖もしくは 1本鎖構造を有するデォキシリポ核酸 （D N A) 及びリボ核酸 （ R N A) を含む。
核酸捕捉用チップに内蔵される固相は、 ガラス粒子、 シリカ粒子、 石英濾 紙、 およびその破砕物、 石英ウール、 珪藻土等、 酸化ケィ素を含む物質、 あるい はプラスチック等の表面にシリカを被覆した物等、 酸化ケィ素を含有するもので あれば利用が可能である。 固相は、 使用中にチップ内への保持を維持することが 必要で、 チップ内に通水部分を有した状態で設置される必要があり、 また、 この 通水部分は連続していることが望ましい。 固相の形状としては、 多孔性、 粒状、 繊維状があり、 通水部分における固相と固相との平均間隔とは、 多孔性材であれ ば、 その孔内の平均孔径を意味し、 粒状物、 繊維状物であれば、 粒状物間又は繊 維状物間の平均間隔のことを意味し、 それぞれ 2 5 m以下である。 本発明の望 ましい固相は、 石英ウールで、 好ましくは、 その両側に石英粒子を燒結して作成 した保持材を配置し、 固相として使用する石英ウール間の平均間隔を制御する。
なお、 ここで石英ウール間の平均間隔とは、 石英ウールが円柱状であると 仮定し、 それを均一に空間内に配置したときにできる、 石英ウールと石英ウール の間の平均的な間隔を表し、 石英ウールを設置する空間の体積と断面積と長さ、 設置する石英ウールの重量と比重と平均直径により決定される。
例えば、 石英ウールを設置する部分の形状が半径 1 . 5 mmの円柱状で、 石英ウールを設置する長さが hであった場合、 石英ウールの比重を 2 . 2 2 g Z c m 3、 石英ウールの平均半径を 4 . 5 ^ m, 設置する石英ウールの量を 5 m gと した場合、 石英ウール間の平均間隔パま、 次の式により算出できる。
1 [m] = 5 . 0 4 X 1 0— 4 · h 1 / 2— 9 . 0 X 1 0— 6 核酸捕捉用チップに圧力変化により吸引と吐出を行わせるための装置としては、 核酸捕捉用チップの一端と適合する形状を有し、 圧力変化を意図的に付与できる 物であれば、 特に制限されず、 手動のピッぺトゃシリンジが利用できるが、 安定 的な核酸回収のためには、 吸引量、 吐出量、 吸引速度、 吐出速度等の制御が必要 なため、 自動装置との組合せが望ましい。
第一工程で使用する試薬としては、 核酸含有試料から核酸の遊離を促す事 が出来れば使用可能であるが、 高粘度な物の使用は望ましくない。 また、 回収対 象とする核酸が RNAの場合には、 RNA分解酵素による作用を防ぐため、 RN a s eインヒビ夕一の添加やグァニジンチオシァネートの使用が望ましい。
第二 a工程で使用する試薬としては、 シリ力を含有する固相への核酸の結 合を促進する物質であれば使用可能で、 一般にカオトピック試薬と呼ばれるもの が使用できる。 この際、 回収対象が RNAの場合には、 第一工程と同様の理由か らグァ二ジンチオシァネートの使用が望ましく、 最終濃度は 3 mo 1 ZL以上、 最終 p Hが酸性であることが望ましい。
第三 a工程で使用する試薬としては、 核酸の固相への結合を維持しつつ、 第二工程で使用した核酸の結合を促進する物質を洗浄するものであれば使用可能 で、 エチルアルコール、 イソプロピルアルコール等を 70%以上の濃度で使用す る方法が公知であるが、 回収後の核酸を PCR等に利用する際には、 これらの物質が 悪影響を与える事が知られており、 使用する濃度はその所定の機能を有す範囲で、 可能な限り低い濃度で使用する事が望ましい。 本発明における望ましい実施例で は、 それらの点から、 25mmo l /L 酢酸カリウムを含む 50 %ェチルアルコ 一リレを用いる。
第四工程で使用する試薬としては、 核酸の固相への結合を可能な限り保持 しつつ、 第三工程で使用したアルコールを濯ぎ、 最終工程への第三工程で使用し た試薬の持越しを避ける必要が生じる。 本発明における望ましい実施例では、 そ れらの点から 5 Ommo 1ノ Lの酢酸カリウムを用い、 かつ、 液温が 20で以下 の状態で使用する。
第五工程で使用する試薬としては、 固相から核酸を溶離する作用を有す物 質であれば使用可能で、 低塩濃度の水溶液や純粋が公知の方法である。 本発明の 望ましい実施例では、 l Ommo l ZL ピシン（pH8. 5)、 0. lmmo 1 / L EDTAを用いる。 以下、 本発明に基づく一実施例である、 核酸回収器具を図 1を参照して説 明する。
図 1は核酸捕捉用チップの構成を示す図である。 核酸捕捉用チップ 3 1は、 上端 が圧力変化を発生させる器具、 あるいは、 自動装置の接続ノズルの先端に気密に 勘合される内径を有しており、 下端に向けて徐々に内径が細くなるように形成さ れる。 核酸捕捉用チップ 3 1 は透明もしくは半透明な合成樹脂からなる。 チップ 3 1 の先端側には、 固相が流出することを防止するため、 および、 固相の平均間 隔を規定するための円板状の阻止部材 1 0 1 a をチップ 3 1の上端より圧入し、 固相 1 0 2を挟む形で、 阻止部材 1 0 1 b を固相 1 0 2が所定の平均間隔を維持 できるように設ける。 これらの阻止部材 1 O l a , 1 0 1 b は、 液体及び気体 が容易に通過し得る多数の孔を有するが、 その孔は固相 1 0 2の流出を阻止でき る大きさである。
阻止部材 1 O l a , 1 0 1 b の材質としては、 直径約 0. 1mmの石英粒子を 核酸捕捉用チップ 3 1の所定の位置の内径に合わせた形状に焼結させたものを用 いる。
固相として石英ウール （東芝ケミカル製、 グレード B、 ウールの直径 6〜 1 2 m) 5mgを用レ る。 次に、 核酸捕捉用チップと組み合わせて使用する核酸精製用装置を図 2〜図 7を 参照して説明する。 図 2は一実施例の装置の平面図、 図 3はその外観図、 図 4は 電気系のプロックダイヤグラム、 図 5は核酸捕捉用チップを接続した分注器の概 略図、 図 6は液体分注用チップの取り付け動作の説明図、 図 7はチップを取り外 す動作の説明図、 である。 図 2 及び図 3 において、 核酸の精製用装置 1 0 0 は、 水平方向 （X 方向） に 移動可能な 2 本のアーム 1 6 、 3 3 を具備する。 一方のアーム 1 6 には、 分 注ノズル 3 6 (図 6 ) を保持するノズルホルダー 1 7 がアーム 1 6 の長さ方 向に沿って水平方向 （Y 方向） に移動可能に取り付けられている。 他方のアーム 3 3 には、 液体吸排用可動ノズル 3 9 (図 5 ) を保持するノズルホルダー 34 がアーム 33の長さ方向に沿って水平方向 （Y 方向） に移動可能に取り付けられ ている。 ノズルホルダー 17 、 34 は、 対応するアーム 16 、 33 に対し、 いずれも上下方向 （Z 方向） に動作できる。 アーム 16 の水平移動領域とァー ム 33 の水平移動領域とは、 部分的にオーバ一ラップするので、 各アームの取り 付け高さ位置を違えてある。 本体架台の作業面 5 には、 未使用の多数の分注用チップ 15 を載置した 3 個の チップラック 14 a 、 14b 、 14 c が所定エリアにセットされる。 これらの チップラック 14 は、 図 6 に示すように、 各分注用チップ 15 を揷入し得る穴 を有しており、 分注用チップの先端が作業面 5 又はチップラック底面に接触しな いような高さを持った箱形をなす。 各チップラック 14 a 、 14b 、 14 c は 夫々最大 48 本までの分注用チップ 15 を保持できる。 また、 作業面 5 には、 未使用の多数の核酸捕捉用チップ 31 を載置したチップ ラック 30 が所定エリアにセットされる。 チップラック 30 の形状は、 先の チップラック 14 と同様である。 この例ではチップラック 30 上に最大 48 本 までの核酸捕捉用チップ 31 を保持できる。 作業面 5 には、 処理対象となる検体、 すなわち核酸を含有する試料を収容した検 体容器 13 が複数本ずつ保持される検体ラック 12 が所定エリアにセットされ る。 この例では、 各検体ラック 12 は 6 本の検体容器 13 を保持できる。 また、 検体ラック 12 は 8 個またはそれ以上の数をセットできる。 また、 作業面 5 には、 未使用の処理容器 24 を多数保持した容器ラック 23 が 所定エリアにセットされる。 容器ラック 23 は、 最大 48 本までの処理容器 2 4を保持できる。 さらに、 作業面 5 には、 未使用の精製品用容器 26 を多数保 持した容器ラック 23 が所定エリアにセットされる。 この精製品用容器は、 精製 処理がなされた核酸含有液を試料別に回収するものである。 この例では、 容器 ラック 25 は、 最大 48 本の精製品用容器 26 を保持できる。 作業面 5 には、 プライミングの際に分注ノズル 3 6 から放出される水を受け入 れると共に分注ノズル 3 6 のホームポジションとなる液受け部 1 1 と、 分注作 業をする分注チップ 1 5 を洗浄するための洗浄部 1 8 と、 分注ノズル 3 6 に接 続された分注用チップ 1 5 及び液体吸排用可動ノズル 3 9 に接続された核酸捕 捉用チップ 3 1 を夫々のノズルから取り外すためのチップ外し器 2 7 と、 プラ イミングの際に液体吸排用可動ノズル 3 9 から放出される水を受け入れると共に 該可動ノズル 3 9 のホームポジションとなる液受け部 2 8 と、 核酸捕捉用チッ プ 3 1 からの不要な液を排出するための廃液口 2 9 とが設けられる。 また、 作業面 5 上の夫々の所定位置には、 第三 a工程で使用する第三試薬ボトル 1 9 、 第五工程で使用する第五試薬ボトル 2 0 、 第一工程で使用する第一試薬 ボトル 2 1 、 第四工程で使用する第四試薬ボトル 1 0 2 、 及び第二 a、 第二 b 工程で使用する第二試薬ボトル 2 2、 等がセッ卜される。
図 6 に示すシリンジポンプ 1 0 と図 5 に示すシリンジポンプ 3 2 は、 それぞ れ本体架台に取り付けられており、 液体の吸入動作と吐出動作の制御が各ポンプ 独自になされる。 図 6 に示すように、 ノズルホルダー 1 7 に保持された分注ノ ズル 3 6 は、 可撓性の管 4 2 を介して液体吸排用のシリンダポンプ 1 0 に連通 されている。 分注ノズル 3 6 内及び管 4 2 内には純水が満たされており、 シリ ンジポンプ 1 0 は図示しない純水供給源に接続されている。 図 5 に示すように、 ノズルホルダー 3 4 に保持された可動ノズル 3 9 は、 可撓性の管 3 5 を介して シリンジポンプ 3 2 に接続されている。 可動ノズル 3 9 内及び管 3 5 内には純 水が満たされており、 シリンジポンプ 3 2 は図示しない純水供給源に接続されて いる。 分注ノズル 3 6 への分注用チップ 1 5 の接続のための装着及び可動ノズル 3 9 への核酸捕捉用チップ 3 1 の接続のための装着は、 それぞれに対応するチップ ラック 1 4 、 3 0 上において、 各ノズルを降下してチップをノズルの先端に嵌 合することにより達成される。 また、 分注ノズル 3 6 に接続された分注用チップ 1 5及び可動ノズル 3 9 に接続された核酸捕捉用チップ 3 1 をそれぞれのノズ ルから取り外す場合は、 チップ外し器 2 7 を利用する。 図 2 及び図 7 に示すよ うに、 チップ外し器 2 7 は、 所定高さ位置に板状部材を有しており、 この板状部 材には、 分注チップ 1 5 の頭部 5 2 及び核酸捕捉用チップ 3 1 の頭部 5 4 の 外径よりも小さく、 且つ分注ノズル 3 6 及び可動ノズル 3 9 の外径より大きな 幅のスリット 5 5 が形成されている。 スリット 5 5 が位置する高さよりも各 チップの頭部 5 2 , 5 4 が低い状態でノズル 3 6 , 3 9 をスリツト内に浸入 するように水平移動させ、 次いでノズルホルダー 1 7 ， 3 4 を上昇させると頭 部 5 2 ， 5 4 が板状部材の下面に当接し、 ノズルホルダーの更なる上昇により チップ 1 5 , 3 1 がノズルか
ら抜け落ちる。 抜け落ちたチップは、 チップ廃棄口 5 0 (図 2 ) に落下し回収 箱
(図示せず） 内に回収される。 図 4 に、 図 2 の核酸精製用装置の電気系の構成を示す。 動作制御部としての パーソナルコンピュータ （P C ) 6 0 には、 操作条件及び検体情報を入力する ための操作パネルとしてのキーボード 6 1 、 入力情報や警告情報等を表示するた めの表示装置としての C R T 6 2 、 装置の各機構部を制御する機構制御部 6 5 等が接続される。 機構制御部 6 5 は、 シリンジポンプ 1 0 に吸排動作を行わせ るためのピストン駆動用のステッピングモー夕 7 1 、 シリンジポンプ 3 2 に吸 排動作を行わせるためのピストン駆動用のステッピングモータ 7 2 、 ノズルホル ダー 1 7 を水平移動及び上下動させるためのステッピングモー夕 7 3 、 ノズル ホルダー 3 4 を水平移動及び上下動させるためのステッピングモ一夕 7 4 、 アーム 1 6 を水平移動させるための A C サーボモー夕 7 5 、 アーム 3 3 を水 平移動させるための A Cサーボモータ 7 6 等を制御する。 精製装置の各部は、 所 定のプログラムに従って動作される。 次に、 使用する固相の平均間隔に違いを持たせた図 1に示す核酸捕捉用チップを 用い、 図 2の核酸精製装置により血清中の C型肝炎ウィルスの遺伝子を回収した 際の実験例を説明する。 処理用試料は、 WHOの I n t e r n a t i on a l S t a n d a r dで値付けを行った 2次スタンダード C型肝炎血清を C型肝炎陰性 の血清で 100 I U/mLとなるように調製し、 図 2の装置の検体容器 13に分 注した。 図 2の装置の自動操作により、 アーム 16、 ノズルホルダ一 17により 分注用チップ 15を取り付け、 検体容器 1 3から 200 /^Lの試料を吸引し、 処 理容器 24へ分注した。 試料分注後、 アーム 16、 ノズルホルダー 17の動作に より使用した分注用チップ 15をチップ外し器 27の作用により取り外す。 その 後、 アーム 16、 ノズルホルダー 17により新規に分注用チップ 15を取り付け、 第一試薬ボトル 21から 700 Lの第一試薬を吸引し、 試料を分注した処理容 器 24へ吐出し、 そのまま、 5回吸引 '吐出を行い、 全量を処理容器 24へ吐出 し、 10分間放置した。 なお、 ここで第一試薬には、 2%T r i t on X- 1 00 (LKB製） 、 5. 5mo 】 グァニジンチォシアン酸塩 （和光純薬ェ 業 （株） 、 生化学用） を含む ME S (2 -mo r p h o 1 i n o-e t h an e s u l f on i c a c i d : 2—モルホリノエタンスルホン酸、 （株） 同人化 学研究所製） 緩衝液を使用した。
吐出後、 アーム 16、 ノズルホルダー 1 7の動作により使用した分注用チップ 1 5をチップ外し器 27の作用により取り外す。 所定の時間が経過した後、 アーム 16、 ノズルホルダー 17により新規に分注用チップ 15を取り付け、 第二試薬 ボトル 22より第二試薬を 100 L吸引し、 試料と第一試薬の混合液が入った 処理容器 24へ吐出し、 5回吸引 ·吐出を行い、 全量を処理容器 24へ吐出した。 なお、 ここで第二試薬には、 1 %T r i t o nX— 100 (LKB製） 、 5. 0 mo 1 ZLグァニジンチォシアン酸塩 （和光純薬工業 （株） 製、 生化学用） を含 む MES ( (株） ） 同人化学研究所製） 緩衝液を使用した。 その間に、 アーム 33、 ノズルホルダー 34により核酸捕捉用チップ 31を取り 付け、 試料、 第一試薬、 第二試薬の混合液を処理容器 24から、 シリンジ 32の 動作により吸引した。
吸引後、 吸引した混合液を核酸捕捉チップ 31の上側の阻止部材 10 1 bを混合 液が越えない位置まで、 処理容器 24に吐出し、 再び、 核酸捕捉チップ 31の下 側の阻止部材 1 0 1 aを混合液が越えない位置まで吸引する。 この吸引と吐出の 操作を 1 0回繰り返した後、 処理容器 2 4内の混合液を全量吸引し、 更に、 保持 部材 1 0 1 aを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。 その後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の制御により、 液受け 2 9へ核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 吸引した混合液を保持部材 1 0 1 bを越えない位置まで吐出し次動作まで待機す る。
その間に、 アーム 1 6、 ノズルホルダー 1 7により新規に分注用チップ 1 5を取 り付け、 第二試薬ボトル 1 9から 8 0 0 Lの第二試薬を吸引し、 処理容器 2 4 へ全量を吐出した。 吐出後、 アーム 1 6、 ノズルホルダー 1 7の動作により使用 した分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7の作用により取り外す。 その間に、 ァ —ム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の制御により、 核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 第 二試薬を混合液の場合と同様の動作により、 5回吸引と吐出を繰り返した後、 処 理容器 2 4内の混合液を全量吸引し、 更に、 保持部材 1 0 1 aを混合液が越えな い位置まで空気を吸引する。 その後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の制御に より、 液受け 2 9へ核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 吸引した第二試薬を保持部材 1 0 1 bを越えない位置まで吐出し次動作まで待機する。
その間に、 アーム 1 6、 ノズルホルダ一 1 7により新規に分注用チップ 1 5を取 り付け、 第三試薬ボトル 1 9から 4 0 0 Lの第三試薬を吸引し、 処理容器 2 4 へ全量を吐出した。 吐出後、 アーム 1 6、 ノズルホルダー 1 7の動作により使用 した分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7の作用により取り外す。 その間に、 ァ ーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の制御により、 核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 第 三試薬を混合液の場合と同様の動作により、 3回吸引と吐出を繰り返し、 第一回 目の洗浄を行う。 洗浄後、 処理容器 2 4内の混合液を全量吸引し、 更に、 保持部 材 1 0 1 aを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。 その後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の制御により、 液受け 2 9へ核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 吸引した第三試薬を全量吐出し待機する。
その間に、 アーム 1 6、 ノズルホルダー 1 7により新規に分注用チップ 1 5を取 り付け、 第三試薬ポトル 1 9から 8 0 0 の第三試薬を吸引し、 処理容器 2 4 へ全量を吐出した。 なお、 ここで第三試薬には、 2 5 mm o 1 ZL酢酸カリウム （和光純薬工業 （株 ) 製、 試薬特級） を含む 5 0 %エタノール （和光純薬工業 （株） 製、 試薬特級） を使用した。 吐出後、 アーム 1 6、 ノズルホルダ一 1 7の動作により使用した分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7の作用により取り外す。 その間に、 アーム 3 3、 ノズルホ ルダ一 3 4の制御により、 核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 第三試薬を 3回吸引と 吐出を繰り返し、 第二回目の洗浄を行う。 洗浄後、 処理容器 2 4内の混合液を全 量吸引し、 更に、 保持部材 1 0 1 aを混合液が越えない位置まで空気を吸引する。 その後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の制御により、 液受け 2 9へ核酸捕捉 チップ 3 1を移動し、 吸引した第三試薬を全量吐出し、 更に、 そのままの位置で、 空気 l m Lを吸引、 吐出する操作を 1 0回繰り返し待機する。
上記、 第 2回目の第三試薬による操作を再度繰り返して行った。 なお、 この洗浄 操作は、 必要であれば更に繰り返して行う事ができる。
第三試薬による洗浄操作後、 アーム 1 6、 ノズルホルダー 1 7により新規に分注 用チップ 1 5を取り付け、 第四試薬ボトル 1 0 2から 2 0 0； Lの第四試薬を吸 引し、 処理容器 2 4へ全量を吐出した。
なお、 ここで第四試薬には、 5 O mm o 1 ZL酢酸カリウム （和光純薬工業 （株 ) 製、 試薬特級） を使用した。
吐出後、 アーム 1 6、 ノズルホルダ一 1 7の動作により使用した分注用チップ 1 5をチップ外し器 2 7の作用により取り外す。 その間に、 アーム 3 3、 ノズルホ ルダー 3 4の制御により、 核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 第四試薬を 3回、 吸引 と吐出を繰り返し、 固相の濯ぎを行った。 濯ぎ後、 処理容器 2 4の全量を吸引し、 更に、 空気を吸引し、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の制御により、 核酸捕捉 チップ 3 1を液受け 2 9へ移動し、 全量を吐出し、 更に、 そのままの位置で、 空 気 l m Lを吸引、 吐出する操作を 1 0回繰り返し待機する。
第四試薬による濯ぎ後、 アーム 1 6、 ノズルホルダ一 1 7により新規に分注用チ ップ 1 5を取り付け、 第五試薬ポトル 2 0から 6 0 Lの第五試薬を吸引し、 処 理容器 2 4へ全量を吐出した。 なお、 ここで、 第五試薬には、 0. lmmo 1 ZLエチレンジァミン四酢酸 （ （ 株） ） 日本ジーン製、 遺伝子工学研究用） を含む 1 Ommo 1 /Lビシン （ （株 ) 同人化学研究所製） 緩衝液 （PH8. 5) を使用した。 吐出後、 アーム 16、 ノズルホルダー 17の動作により使用した分注用チップ 1 5をチップ外し器 27の作用により取り外す。 その間に、 アーム 33、 ノズルホ ルダー 34の制御により、 核酸捕捉チップ 3 1を移動し、 第五試薬を 20回、 吸 引と吐出を繰り返し、 核酸の溶離を行った。 溶離後、 核酸捕捉用チップ 31内の 全量を吐出する。 吐出後、 アーム 33、 ノズルホルダー 34の制御により、 使用 した核酸捕捉用チップ 3 1をチップ外し器 27の作用により取り外す。 その間に、 アーム 16、 ノズルホルダー 17により新規に分注用チップ 1 5を取り付け、 溶 離液の入った処理容器 24から全量を吸引し、 更に、 少量の空気を吸引した後、 アーム 16、 ノズルホルダー 17の制御により、 精製品用容器 26の位置へ分注 用チップを移動し、 分注チップ 15内の全量を精製品容器 26へ吐出した。 吐出 後、 アーム 16、 ノズルホルダー 17の動作により使用した分注用チップ 15を チップ外し器 27の作用により取り外した。
同様の操作を、 核酸捕捉用チップ 31の固相 102の量を一定にし、 保持部材 1 01 aと保持部材 101 bの距離を変えて作成した、 石英ウール間の平均間隔が 異なる核酸捕捉用チップにより行った。
回収後の試料は、 0 じ 11 6社の（：〇8八3 AMPL I CORとコバス アンプ リコア HCV V 2. 0試薬により評価を行った。 回収したそれぞれの試料 48. 5 ^Lと、 HC Vマス夕一ミックス V 2. 0 41. 7 , HCVマンガン試薬 8.3 iL, HCV内部コントロール V 2.0 1. 5 を混合し、 試薬キットに 付属の手順所に従い、 装置の操作を行い、 回収した試料による HCVの評価を行 つた。 結果を図 8に示す。
図 8の結果から平均間隔の増加に伴い、 同一濃度の C型肝炎ウィルスの回収結果 に対して、 COBAS AMPL I CORの吸光度出力が低下するのが分かる。 こ れは、 平均間隔の増加に伴い C型肝炎ウィルスの改修量が減少していることを表 しており、 平均間隔が 21 ^m以上では、 顕著に回収効率が低下することを示し ている。 なお、 COBAS AMP L I CORは吸光度が 4. 000を越えた場合、 *. * * *と表示されるが、 ここでは 4. 000として計算を行った。
また、 上記の平均空間を有す核酸捕捉用チップ 31に対して、 lmLの溶液を吸 引した際の平均流速を測定した。 結果を図 9に示す。
図 9の結果から、 平均間隔の減少に伴い平均流速が低下するのが分かる。 これに は平均間隔を狭めることによって、 溶液の吸引、 あるいは、 吐出時の待ち時間が 増大することを意味し、 平均間隔の減少は、 1試料あたりの装置の処理時間を増 大させることになり、 装置の稼動効率低下させることになる。
そのため、 図 8及び図 9の結果から、 図 1の核酸捕捉用チップと図 2の装置によ り C型肝炎ウィルス遺伝子の回収が実用十分な状態で行えること、 核酸捕捉用チ ップの望ましい平均間隔が 13から 21 /zmの範囲であることが分かる。 次に、 にカオ口ピック剤を他の物に換えて、 図 2の核酸精製装置により血清中の B型肝炎ウィルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。
核酸捕捉用チップ 31は図 1の構造で、 石英ウールの石英ウール間の平均間隔が 16 _tmになるように作製した。 図 2の核酸精製装置 100の装置構成は替えず に、 第一試薬ボトル 21, 及び第二試薬ボトル 22入れる試薬の組成を第一工程 試薬は 2% T r i t onX— 100, 6 m o 1 ZLグァニジン塩 （和光純薬ェ 業 （株） 製、 生化学用） を含む ME S ( (株） 同仁化学研究所製） 緩衝液に替え、 第二工程試薬は SmolZLグァニジン塩酸塩 （和光純薬工業 （株） 製、 生化学用） を含む ME S ( (株） ） 同仁化学研究所製） 緩衝液に替えた。 第三工程、 第四ェ 程、 第五工程試薬は、 前記の C型肝炎ウィルス遺伝子回収時と同じ組成の物を使 用した。
処理用試料は、 抗 B型肝炎ウィルス抗体に陽性反応を示す血清を使用した。 上記 核酸捕捉用チップ 3 1と第一工程から第五工程試薬の組合せにより、 前記の C型 肝炎ウィルス遺伝子回収時と同じ装置動作により、 B型肝炎ウィルス遺伝子の回 収を行った。 回収に要した時間は約 20分であった。
また、 回収状態を比較するために、 既存の方法として、 蛋白質 核酸 酵素、 4 1 (5) 、 458 -459 (1996) に記述の方法に従って行った。 回収に要
】6 した時間は 1日半であった。
回収後の試料は、 宝酒造 （株） 製の PCR専用試薬キットを使用し、 （株） サヮ デー ·テクノロジ一社に合成を依頼した増殖用プライマ一により B型肝炎ウィル ス遺伝子中の特定の 414塩基の増幅を試みた。 PCR処理時の遺伝子増幅シス テムは TP 3000 (宝酒造 （株） 製） を使用し、 最初に 94°Cの熱変性を 3分 間行つた後、 94 °Cの熱変性 30秒、 55でのアニーリング 30秒、 72 の伸 張反応 30秒を 45回繰り返し、 更に 72でで 10分間加温し、 PCR処理を行 つた。 PCR処理後、 その一部を 3%ァガロースゲルにより電気永動を行い、 S YBR G r e e n l (FMC B i o p r o du c t s製） により蛍光染色を 行った。 この結果、 従来法と同程度の PCRの増幅バンドが得られた。 これは、 従来法と同等の回収効率で、 より短時間に目的遺伝子の回収が行えたことを示し ている。 次に、 図 2の核酸精製装置により血清中に混在する B型肝炎ウィルスと C型肝炎 ウィルスの遺伝子を回収した際の実験例を説明する。
核酸捕捉用チップ 31は図 1の構造で、 固相の平均間隔が 16 ^mになるように 作製した。 処理試料は前記の 2種の血清を混合して、 混合した状態で各ウィルス 濃度が、 前記実施時の 2倍になるように調製した。
前記の C型肝炎ウィルス遺伝子を回収した時と同じ試薬組成、 および、 同じ装置 動作により遺伝し回収を行い、 第五工程試薬のみを分注量を 60 1から 120 1に替えて実施した。
回収後の試料は、 48. 5 /Lを前記の COB AS AMP L I CORによる C 型肝炎ウィルス遺伝子の検出に使用し、 5 0 Lを前記の P C R処理による B型 肝炎ウィルス遺伝子の検出に使用した。 その結果、 2種の異なるウィルスを混在 した試料から、 それぞれの遺伝子を単独で回収した場合と同等の効率で回収でき た。 これは、 混在するウィルスの遺伝子を同時に回収可能であることを示すとと もに、 RNA (リボ核酸） 及び DNA (デォキシリボ核酸） という性質の異なる 核酸を同時に回収できることを示している。

Claims

請求の範囲
1 . シリカ含有の固相を液体に接触可能な状態で内蔵した核酸回収器具であって、 固相が多数の通水部を有し、 その通水部における固相と固相との平均間隔が 2 5 / m以下であることを特徴とする核酸回収器具。
2 . 請求の範囲第 1項に記載の核酸回収器具において、
固相が繊維状物からなり、 繊維状物間の平均間隔が 2 5 以下であることを特 徴とする、 核酸回収器具。
3 . 請求の範囲第 2項に記載の核酸回収具において、 繊維状物が石英ウールであ ることを特徴とする核酸回収器具。
4 . 請求の範囲第 3項に記載の核酸回収器具において、 石英ウール間の平均間隔 が 1 3 mから 2 1 mであることを特徴とする核酸回収器具。
5 . 請求の範囲第 4項に記載の核酸回収器具において、 石英ウールの直径が 6 mから 1 2； a mである事を特徴とする核酸回収器具。
6 . 請求の範囲第 2項〜第 5項に記載の核酸回収器具において、
前記繊維状物の距離を保持するために、 流体流通可能な阻止部剤で、 固相を挟み 込んだ形状とする事を特徴とする核酸回収器具。
7 . 請求の範囲第 5項に記載の核酸回収器具において、
阻止部剤の材質が石英粒子を焼結した物である事を特徴とする核酸回収器具。
8 . 請求の範囲第 1項〜第 7項に記載の核酸回収器具が核酸捕捉チップであるこ とを特徴とする核酸回収器具
9 . 圧力変化により吸引と吐出が可能な装置に接続された核酸捕捉用チップで あって、 該核酸捕捉チップはシリカ含有の固相を液相に接触可能な状態で内蔵さ れ、 該固相が通水部を有し、 その通水部における固相と固相との平均間隔が 2 5 ； a m以下である核酸捕捉用チップを用いる核酸回収方法であって、
核酸を含有するサンプルから核酸を遊離するための第一試薬をサンプルと混合し、 核酸の遊離を促す第一工程と、
遊離した核酸を含む液と第二試薬を混合した後、 混合液を圧力変化により核酸捕 捉チップ内に吸引し、 固相と混合液を接触させ吐出する第二 a工程と、 固相を洗浄するために第二試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、 固 相と第二試薬を接触させた後、 吐出する第二 b工程と、
固相、 および、 核酸捕捉チップ内に残存する、 第一試薬、 および または、 第二 試薬を除去するために、 第三試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に吸引し、 固相と第三試薬を接触させた後、 吐出する第三 a工程と、
核酸捕捉チップ内から第三試薬の除去を促すために、 核酸捕捉チップ内に通気を 行う第三 b工程と
残存する第三試薬を濯ぐために、 第四試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に 吸引し、 固相と第四試薬を接触させた後、 吐出する第四工程と
固相から核酸を溶離するために、 第五試薬を圧力変化により核酸捕捉チップ内に 吸引し、 固相と第五試薬を接触させた後、 吐出する第五工程を含む核酸回収方法。
1 0 . 請求の範囲第 9項に記載の核酸回収方法において、 固相が繊維状物からな り、 繊維状物と繊維状物との平均距離が 2 5 / m以下であることを特徴とする核 酸回収方法。
PCT/JP2001/011212 2001-03-28 2001-12-20 Instrument et procede de recolte d'acides nucleiques WO2002078846A1 (fr)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01274056A EP1374997B1 (en) 2001-03-28 2001-12-20 Instrument and method for collecting nucleic acids
US10/468,598 US20040122222A1 (en) 2001-03-28 2001-12-20 Instrument and method for collecting nucleic acids
DE60121477T DE60121477T2 (de) 2001-03-28 2001-12-20 Vorrichtung und verfahren zum auffangen von nukleinsäuren
KR10-2003-7009955A KR100505380B1 (ko) 2001-03-28 2001-12-20 핵산의 회수기구 및 방법
JP2002577100A JP3619514B2 (ja) 2001-03-28 2001-12-20 核酸の回収器具および方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/JP2001/002577 WO2002078847A1 (fr) 2001-03-28 2001-03-28 Instrument et procede permettant de recuperer de l'acide nucleique
JPPCT/JP01/02577 2001-03-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002078846A1 true WO2002078846A1 (fr) 2002-10-10

Family

ID=11737173

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/002577 WO2002078847A1 (fr) 2001-03-28 2001-03-28 Instrument et procede permettant de recuperer de l'acide nucleique
PCT/JP2001/011212 WO2002078846A1 (fr) 2001-03-28 2001-12-20 Instrument et procede de recolte d'acides nucleiques

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/002577 WO2002078847A1 (fr) 2001-03-28 2001-03-28 Instrument et procede permettant de recuperer de l'acide nucleique

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20040122222A1 (ja)
EP (1) EP1374997B1 (ja)
JP (3) JP3619514B2 (ja)
KR (1) KR100505380B1 (ja)
DE (1) DE60121477T2 (ja)
WO (2) WO2002078847A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004337108A (ja) * 2003-05-16 2004-12-02 Hitachi High-Technologies Corp 核酸精製装置、核酸捕捉用チップ、及び核酸精製方法
EP1564300A1 (en) * 2002-11-13 2005-08-17 Hitachi High-Technologies Corporation Hethod of amplifying nucleic acid and apparatus therefor
JP2005241299A (ja) * 2004-02-24 2005-09-08 Hitachi High-Technologies Corp 核酸回収器具、その部品、及び核酸回収器具の生産方法
JP2007124952A (ja) * 2005-11-04 2007-05-24 Hitachi High-Technologies Corp 核酸精製方法及び核酸精製器具
WO2011158815A1 (ja) * 2010-06-18 2011-12-22 東洋紡績株式会社 抗酸菌の溶菌とその核酸の分離を同時に行う方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7470546B2 (en) * 2000-05-31 2008-12-30 Infineon Technologies Ag Method and arrangement for taking up a first medium, which is present in a first phase, into a capillary device
ES2566509T3 (es) * 2003-02-05 2016-04-13 Iquum, Inc. Procesado de muestras
DE602004004955T2 (de) * 2003-08-20 2007-12-06 Sysmex Corp. Probenanalysegerät und eine Vorrichtung zur Detektion von Nukleinsäuren
US20050175499A1 (en) * 2004-02-06 2005-08-11 Quest Diagnostics Investments Incorporated Method of reducing cross sample contamination during filter sampling
DE602005022196D1 (de) * 2004-07-23 2010-08-19 Biosystem Dev Llc Vorrichtung für einen immunoassay und verfahren zu ihrer verwendung
US20060166223A1 (en) * 2005-01-26 2006-07-27 Reed Michael W DNA purification and analysis on nanoengineered surfaces
JP2006311803A (ja) * 2005-05-06 2006-11-16 Hitachi High-Technologies Corp 核酸精製方法、及び核酸精製器具
US8163535B2 (en) * 2006-06-26 2012-04-24 Blood Cell Storage, Inc. Devices and processes for nucleic acid extraction
US7608399B2 (en) * 2006-06-26 2009-10-27 Blood Cell Storage, Inc. Device and method for extraction and analysis of nucleic acids from biological samples
US8012349B2 (en) 2006-11-20 2011-09-06 Orbital Biosciences, Llc Small volume unitary molded filters and supports for adsorbent beds
US7759112B2 (en) * 2007-10-31 2010-07-20 Akonni Biosystems, Inc. Apparatus, system, and method for purifying nucleic acids
US10125388B2 (en) 2007-10-31 2018-11-13 Akonni Biosystems, Inc. Integrated sample processing system
US9428746B2 (en) 2007-10-31 2016-08-30 Akonni Biosystems, Inc. Method and kit for purifying nucleic acids
US20090111193A1 (en) * 2007-10-31 2009-04-30 Cooney Christopher G Sample preparation device
CA2742598A1 (en) * 2008-11-04 2010-05-14 Blood Cell Storage, Inc. Nucleic acid extraction on curved glass surfaces
GB201010237D0 (en) * 2010-06-18 2010-07-21 Lgc Ltd Methods and apparatuses
EP2455764A1 (en) * 2010-11-18 2012-05-23 BTP TECNO S.r.l. Diagnostic apparatus for organic samples analysis
WO2012159063A2 (en) 2011-05-19 2012-11-22 Blood Cell Strorage, Inc. Gravity flow fluidic device for nucleic acid extraction
KR20140066567A (ko) 2012-11-23 2014-06-02 주식회사 엘지화학 리튬 이차전지용 전해액 및 이를 포함하는 리튬 이차전지
US10429403B2 (en) 2014-06-17 2019-10-01 Yamaha Hatsudoki Kabushiki Kaisha Head device for mounting dispensing tip thereon, and movement device using same
EP3441740B1 (en) * 2016-04-07 2020-09-23 Tanabe Engineering Corporation Powder collector, powder collecting device, and automatic powder collecting system

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0268946A2 (en) * 1986-11-22 1988-06-01 DIAGEN Institut für molekularbiologische Diagnostik GmbH Method for separating long-chain nucleic acids
EP0389063A2 (en) * 1989-03-23 1990-09-26 Akzo Nobel N.V. Process for isolating nucleic acid
JPH11127854A (ja) * 1997-10-28 1999-05-18 Hitachi Ltd 核酸の回収方法及び装置
US5910246A (en) * 1995-04-01 1999-06-08 Boehringer Mannheim Gmbh Device for isolating nucleic acids
JPH11266864A (ja) * 1998-03-19 1999-10-05 Hitachi Ltd 核酸の精製方法および精製用装置

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4014605A1 (de) * 1990-05-07 1991-11-14 Kronwald Separationstechnik Gm Mehrteiliger chromatographiesaeulenanschluss
DE4321904B4 (de) * 1993-07-01 2013-05-16 Qiagen Gmbh Verfahren zur chromatographischen Reinigung und Trennung von Nucleinsäuregemischen
CN100365017C (zh) * 1994-09-20 2008-01-30 日立化成工业株式会社 肺炎衣原体抗原多肽
US5939259A (en) * 1997-04-09 1999-08-17 Schleicher & Schuell, Inc. Methods and devices for collecting and storing clinical samples for genetic analysis
EP0943619B1 (en) * 1998-03-19 2004-11-10 Hitachi, Ltd. Chip for use in nucleic acid separation, structural element and process for forming the structural element
JP2000175683A (ja) 1998-03-19 2000-06-27 Hitachi Ltd 核酸分離に用いるチップと構造体の形成方法
JP3490329B2 (ja) * 1999-03-04 2004-01-26 株式会社日立製作所 核酸分離容器、核酸分離容器の製造方法及び核酸の分離方法
JP2000336098A (ja) * 1999-05-28 2000-12-05 Hitachi Ltd 核酸精製装置
JP2000350577A (ja) * 1999-06-09 2000-12-19 Aloka Co Ltd 核酸断片の分離方法及び核酸シークエンス前処理方法並びに装置

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0268946A2 (en) * 1986-11-22 1988-06-01 DIAGEN Institut für molekularbiologische Diagnostik GmbH Method for separating long-chain nucleic acids
EP0389063A2 (en) * 1989-03-23 1990-09-26 Akzo Nobel N.V. Process for isolating nucleic acid
US5910246A (en) * 1995-04-01 1999-06-08 Boehringer Mannheim Gmbh Device for isolating nucleic acids
JPH11127854A (ja) * 1997-10-28 1999-05-18 Hitachi Ltd 核酸の回収方法及び装置
JPH11266864A (ja) * 1998-03-19 1999-10-05 Hitachi Ltd 核酸の精製方法および精製用装置

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP1374997A4 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1564300A1 (en) * 2002-11-13 2005-08-17 Hitachi High-Technologies Corporation Hethod of amplifying nucleic acid and apparatus therefor
EP1564300A4 (en) * 2002-11-13 2007-09-05 Hitachi High Tech Corp PROCESS FOR NUCLEIC ACID AMPLIFICATION AND DEVICE THEREFOR
JP2004337108A (ja) * 2003-05-16 2004-12-02 Hitachi High-Technologies Corp 核酸精製装置、核酸捕捉用チップ、及び核酸精製方法
JP2005241299A (ja) * 2004-02-24 2005-09-08 Hitachi High-Technologies Corp 核酸回収器具、その部品、及び核酸回収器具の生産方法
JP2007124952A (ja) * 2005-11-04 2007-05-24 Hitachi High-Technologies Corp 核酸精製方法及び核酸精製器具
JP4699868B2 (ja) * 2005-11-04 2011-06-15 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸精製方法及び核酸精製器具
US8048681B2 (en) 2005-11-04 2011-11-01 Hitachi High-Technologies Corporation Methods for nucleic acid isolation and instruments for nucleic acid isolation
WO2011158815A1 (ja) * 2010-06-18 2011-12-22 東洋紡績株式会社 抗酸菌の溶菌とその核酸の分離を同時に行う方法
JP5773280B2 (ja) * 2010-06-18 2015-09-02 東洋紡株式会社 抗酸菌の溶菌とその核酸の分離を同時に行う方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP3619514B2 (ja) 2005-02-09
US8183054B2 (en) 2012-05-22
JP2004290211A (ja) 2004-10-21
DE60121477T2 (de) 2007-02-15
JP2005110687A (ja) 2005-04-28
KR20030078897A (ko) 2003-10-08
JP4081468B2 (ja) 2008-04-23
DE60121477D1 (de) 2006-08-24
EP1374997B1 (en) 2006-07-12
WO2002078847A1 (fr) 2002-10-10
US20040122222A1 (en) 2004-06-24
JPWO2002078846A1 (ja) 2004-07-22
US20110015381A1 (en) 2011-01-20
JP3663207B2 (ja) 2005-06-22
EP1374997A1 (en) 2004-01-02
KR100505380B1 (ko) 2005-07-29
EP1374997A4 (en) 2004-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3619514B2 (ja) 核酸の回収器具および方法
CN108103057B (zh) 用于纯化核酸的方法和试剂盒
JPH11266864A (ja) 核酸の精製方法および精製用装置
JP5977921B2 (ja) 核酸を精製することを目的とした装置、システムおよび方法
JP3630493B2 (ja) 分注機を利用した液体処理方法およびその装置
JP3425902B2 (ja) 検体の前処理装置
US20030006193A1 (en) Apparatus for purifying nucleic acids and proteins
KR20090107927A (ko) 자동정제장치, 멀티 웰 플레이트 키트 및 생물학적 시료로부터 핵산을 추출하는 방법
EP2017339A1 (en) Nucleic acid purification instrument
JP2006311803A (ja) 核酸精製方法、及び核酸精製器具
US20070269829A1 (en) Instrument and method for nucleic acid isolation
JP4025399B2 (ja) 核酸の回収方法及び装置
US6492162B1 (en) Apparatus for the recovery of nucleic acids
JP2002191351A (ja) 核酸の精製用装置および核酸捕捉用チップ
US20030060620A1 (en) Methods and apparatus for the recovery of nucleic acids
EP1454983A1 (en) Process for recovery of nucleic acids
JP3776320B2 (ja) 複数の核酸を同一固相で回収する方法及び装置
EP1437407B1 (en) Apparatus for collecting nucleic acid and method of collecting nucleic acid
WO2004048564A1 (ja) 検体前処理デバイス
US20060228736A1 (en) Blood testing method, nucleic acid extraction method, and nucleic acid extraction device
JP2004298195A (ja) 核酸の回収方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): JP KR US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020037009955

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001274056

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2002577100

Country of ref document: JP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020037009955

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001274056

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10468598

Country of ref document: US

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1020037009955

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2001274056

Country of ref document: EP