ES2566509T3 - Procesado de muestras - Google Patents

Abstract

Un túbulo (10) para el procesado de muestras, que comprende: un extremo proximal que tiene una Abertura (12) a través de la cual se puede introducir una muestra; un extremo distal, y por lo menos un primer segmento que contiene un substrato, un segundo segmento distal al primer segmento y que contiene tampón de lavado, y un tercer segmento distal al segundo segmento y que contiene por lo menos uno de un reactivo de amplificación, un reactivo de elución y un reactivo de detección, cada uno de los cuales está: - definido por el túbulo (10); - aislado respecto de fluidos, por lo menos en parte mediante un sello rompible (14), de modo que la rotura del sello rompible (14) deja una superficie del túbulo interna que está sustancialmente exenta de obstrucciones al flujo de fluido, - expandible así para recibir un volumen de fluido expulsado de otro segmento; y - apto para ser comprimible de modo a no contener sustancialmente fluido cuando así se comprime.

Description

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Procesado de muestras

DESCRIPCION

En la realizacion de ensayos diagnosticos se requiere frecuentemente la preparacion de las muestras, particularmente en el procesado de muestras biologicas. Una muestra biologica, por ejemplo, sufre tipicamente procesos exigentes intensivos antes que esten en condicion apropiada para un ensayo. La preparacion de muestras apropiada requiere con frecuencia condiciones precisas, tales como temperatures particulares, concentraciones, volumenes de reactivo y, especialmente, la eliminacion de materiales que puedan interferir con el ensayo deseado. Con frecuencia una muestra bruta debe desplazarse a una posicion distante para recibir el procesado apropiado por personal altamente especializado en un puesto de laboratorio altamente controlado. Dispositivos y metodos de procesado convencionales requieren con frecuencia instrumentacion amplia, altamente compleja y sofisticada. Estos factores de procesado de muestras convencional causa necesariamente una demora en el tiempo que resulta, altos costos, integridad de la muestra comprometida y limitaciones sobre la factibilidad de utilizar ensayos de diagnostico en muchos casos.

La US 6.251.660 B1 se refiere a dispositivos y metodos para detectar moleculas diana en muestras biologicas. Segun la US 6.251.660 B1, un ensayo de una muestra biologica se lleva a cabo en una camara que comprende compartimentos multiples. La camara esta construida de material flexible de modo que cada compartimiento pueda ajustarse en forma y tamano. Cada compartimiento se separa del compartimiento adyacente mediante una barrera y puede romperse facilmente mediante aplicacion de presion hidrostatica. Se proporciona un rodillo para aplicar presion progresivamente a un compartimiento dado en la direccion de un compartimiento adyacente hasta que se rompe la barrera y el contenido del compartimiento dado fluye en, y se mezcla con, el contenido del compartimiento adyacente. De este modo pueden llevarse a cabo ensayos de etapas multiples.

La US 3.036.894 se refiere a tumulos de procesado de muestras (vease la figura 6) en donde los compartimientos estan separados mediante abrazaderas en forma de U.

Resumen

El presente invento proporciona un tubulo de procesado de muestras para procesar muestras. El tubulo descrito puede facilitar la preparacion de muestras a traves de multiples etapas de procesado..

En un aspecto un tubulo de procesado de muestras incluye las caractensticas de la reivindicacion 1. En las reivindicaciones dependientes se citan modalidades preferidas adicionales.

El tubulo descrito puede proporcionar ventajas significantes sobre el arte existente. En ciertas modalidades puede pre-enpaquetarse un tubulo con reactivos para un protocolo de procesado de muestras deseado, proporcionando de este modo los materiales para un ensayo completo en un paquete conveniente. En ciertas modalidades se segregan productos de desecho de un objetivo de interes prematuramente en el proceso, de modo que la muestra procesada no entra en contacto con superficies que han entrado en contacto con la muestra no procesada. Por consiguiente es menos probable, que cantidades de vestigio de inhibidores de reaccion presentes en la muestra sin procesar que podnan recubrir las paredes del tubulo, contaminen la muestra procesada.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1A es una vista en alzado frontal de una modalidad de ejemplo de un tubo de muestra que incluye un tubulo. La figura 1B es una vista en seccion transversal de un tubo de muestra dispuesto en el interior de un analizador.

La figura 2A es una vista en seccion transversal de un tubo de muestra que incluye un tubulo. La figura 2B es una vista en perspectiva de otra modalidad de ejemplo de un tubo de muestra.

Las figuras 3A-B son, respectivamente vistas en alzado frontal y lateral de una modalidad de ejemplo de un tubo de muestras.

La figura 4A es una vista en seccion transversal de una modalidad de ejemplo de un tubo de muestra situado en un analizador. La figura 4B es una vista de detalle esquematica de una modalidad de una muestra biologica.

La figura 5A-B son, respectivamente, vistas en seccion transversal y perspectiva de realizaciones de tubos de ejemplo posicionados en los analizadores.

Las figuras 6A-C son vistas en seccion transversal de una realizacion de un dispositivo de recogida de muestras que recibe una muestra.

Las figuras 7A-B son, respectivamente, vistas en seccion transversal y en perspectiva de realizaciones de ejemplo de sistemas de molturacion.

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Las figuras 8-10 son graficas de datos experimentales generados utilizando modalidades de ejemplo seleccionadas de los dispositivos y metodos descritos.

Descripcion detallada

La presente invencion describe dispositivos y metodos para el procesado de muestras. En varias modalidades tubulos segmentados proporcionan un recipiente conveniente para recibir, almacenar, procesar y/o analizar una muestra biologica. En ciertas modalidades, el tubulo segmentado facilita protocolos de procesado de muestras que implican multiples etapas de procesado. En ciertas modalidades puede recogerse una muestra en un tubulo de muestra y luego posicionarse el tubulo en un analizador; luego el analizador puede manipular el tubulo y su contenido para procesar la muestra.

Una modalidad preferida incluye un tubulo flexible que se ha segmentado en compartimientos mediante sellos rompibles. Los segmentos individuales pueden contener varios reactivos y tampones para el procesado de una muestra. Pueden aplicarse abrazaderas y actuadores al tubulo en varias combinaciones y con varios tiempos para dirigir el movimiento del fluido y producir que estallen los sellos rompibles. Este estallido de los sellos rompibles puede dejar una superficie de tubulo interna que este sustancialmente libre de obstrucciones al flujo de fluido. En modalidades preferidas el flujo de la muestra biologica puede dirigirse hacia el extremo distal del tubulo a medida que progresa el proceso, mientras que el flujo de desecho puede forzarse a moverse en la direccion opuesta, hacia la abertura del tubulo en donde entro inicialmente la muestra. Esta entrada de muestra puede sellarse, posiblemente de forma permanente, mediante una tapa con un mecanismo de cierre, y puede disponerse una camara de desecho en la tapa para recibir el desecho para almacenamiento. Un beneficio significante de este metodo es que la muestra procesada no entra en contacto con superficies que han entrado en contacto con la muestra sin procesar. Por consiguiente cantidades de vestigios de inhibidores de reaccion presentes en la muestra sin procesar que podnan recubrir las paredes del tubulo es menos probable que contaminen la muestra procesada.

En algunas modalidades el tubulo puede ser expandible de modo a poder recibir un volumen de fluido de cada uno de los segmentos multiples en un segmento; esto puede permitir que la muestra y reactivos sufran ciertas etapas del proceso en un segmento conduciendo a una estructura mecanica mas simple para llevar a cabo ensayos. Otro beneficio de una modalidad que utilice un tubulo que puede ser asf expandible es que la misma estructura de tubulo puede ser utilizada para empaquetar diferentes volumenes de reactivos dentro de segmentos, permitiendo que el mismo tubulo sea empaquetado en diferentes formas dependiendo del ensayo que ha de llevarse a cabo.

El aparato puede incluir un tubulo flexible transparente 10 (figuras 1A-B, Figuras 2A-E y Figuras 3A-B capaz de ser configurado en una pluralidad de segmentos, tales como 16, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 y/o 190, y siendo sustancialmente aplanados mediante compresion. En una modalidad un tubulo puede tener por lo menos dos segmentos. En una modalidad un tubulo puede tener por lo menos tres segmentos. El tubulo flexible puede proporcionar funcionalidad operativa entre aproximadamente 2°C y 105°C, compatibilidad con muestras, dianas y reactivos, baja permeabilidad al gas, mmimas propiedades de fluorescencia, y/o resiliencia durante repetida compresion y ciclos de flexion. El tubulo puede obtenerse de una variedad de materiales, ejemplos de los cuales incluyen, pero sin limitacion: poliolefinas tales como polipropileno o polietileno, poliuretano, co-polfmeros de poliolefina y/u otros materiales que proporcionen caractensticas apropiadas. Las propiedades del tubulo, tales como transparencia, propiedades de humectacion, lisura superficial, carga superficial y resiliencia termica, pueden afectar la prestacion del tubulo. Estas propiedades pueden ser mejoradas a traves de procesos ejemplificativos tales como: siembra, tratamiento de plasma, adicion de aditivos e irradiacion. En algunas realizaciones puede anadirse un material aditivo al plastico para mejorar las caractensticas seleccionadas. Por ejemplo puede adicionarse un aditivo de deslizamiento, tal como erucamida y/u oleamida; en alguna modalidad puede adicionarse un aditivo llamado "anti- bloque". Un aditivo puede tener una concentracion en el plastico en el rango de alrededor de 0,01% a alrededor de 5,0%.

El tubulo puede fabricarse con una amplia variedad de metodos apropiados tales como extrusion, moldeo por inyeccion y moldeo por soplado. En una modalidad preferida el tubulo se extruye de forma continua. Tecnicas alterativas para la fabricacion del tubulo incluyen, por ejemplo, colada, extrusion o pelfculas sopladas que pueden proporcionar mediante operaciones de procesos secundarios el tubulo apropiado. El material de pared del tubulo puede incluir multiples capas mediante co-extrusion o mediante laminacion de pelfcula. Por ejemplo, una capa interna puede elegirse para alta biocompatibilidad y una capa exterior puede elegirse para baja permabilidad de gas. Como ejemplo adicional la capa interior puede formarse facilmente en un sello rompible 14 (Figuras 2A-B y Figuras 3A-B), tal como un sello desprendible, mientras que la capa exterior puede ser elastica y altamente impermeable. Para uso en la presente descripcion se prefiere que el tubulo tenga un espesor de pared de alrededor de 0,03 mm a alrededor de 0,8 mm, de preferencia de 0,03 mm a alrededor de 0,5 mm, con el tubulo apto para aplanarse sustancialmente con la aplicacion de una presion exterior del orden de 1 atmosfera.

En algunas modalidades el aparato puede tener paredes endurecidas en por lo menos un segmento para permitir la dislocacion de masas de celulas de muestra solida tales como muestras de biopsia o muestras ambientales utilizando trituraciones de molienda. Un ejemplo de estas caractensticas de pared endurecida, como se ilustra en la figura 7A, puede ser superficies internas micro-dentadas 109 en caras opuestas de la pared de tubulo, que estan

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defasadas de modo que comprimiendo el tubulo se produce un movimiento deslizante a lo largo del eje del tubulo. La pared del tubulo en la proximidad de estas superficies molturantes 109 puede ser fortificada utilizando parches de refuerzo obtenidos de un plastico apropiadamente elastico tal como policarbonato o polietilentereftalato. Las superficies internas dentadas pueden obtenerse con materiales similarmente apropiados. En otra modalidad una almohadilla como 214 ilustrada en las figuras 5A-B, que tiene caractenstica de superficie de molienda puede unirse a la pared interna del tubulo. La almohadilla puede obtenerse de material endurecido y la caractenstica superficial puede crearse utilizando metodos mecanicos, electroqmmicos o microelectromecanicos convencionales, de modo que la almohadilla pueda soportar la compresion.

El tubulo de muestra 10 puede dividirse en uno o mas segmentos, 16, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 y/o 190, y/o sub-segmentos 18, 121, 122. En modalidades preferidas los segmentos se definen mediante sellos rompibles 14 para aislar fluidamente segmentos adyacentes. Esta caractenstica de sello puede ser util en la separacion, por ejemplo, de un reactivo seco de un reactivo lfquido hasta que los dos puedan reconstituirse para desempenar un ensayo espedfico, o para separar qmmicamente especies reactivas hasta la reaccion deseada. Como se ilustra en las figuras 3A-B puede formarse un sello rompible 14 en una region del tubulo 10 en donde se han unido sustancialmente paredes opuestas, pero no tan fuertemente como para impedir que las paredes se separen por pelado luego sin estropear de modo significante el tubulo o las superficies previamente selladas. Un sello de esta indole puede denominarse un sello "removible". En una modalidad preferida, la region de sello desprendible puede ser una banda ortogonal al eje del tubulo. Esta puede abarcar una longitud de tubulo en el rango de alrededor de 0,5 mm a 5 mm, de preferencia alrededor de 1 mm a alrededor de 3 mm, mas preferentemente alrededor de 1 mm. El sello abarca de preferencia el ancho total del tubulo de modo que selle el segmento. En algunas modalidades la banda de sello puede variar en altura o forma y/u orientarse en un angulo transversal al eje del tubulo; estas variaciones pueden cambiar las caractensticas de pelado.

Los sellos rompibles 14 pueden crearse entre paredes opuestas del tubulo aplicando una cantidad controlada de energfa al tubulo en la posicion en donde se desea el sello desprendible. Por ejemplo, una cabeza sellante de temperatura controlada puede presionar el tubulo a una presion espedfica contra un yunque fijo durante un intervalo de tiempo espedfico. Pueden elegirse varias combinaciones de temperatura, presion y tiempo para formar un sello de tamano deseado y resistencia al pelado. Puede suministrarse energfa por ejemplo mediante una cabeza sellante de temperatura controlada mantenida a una temperatura constante entre 105°C y 140°C para calentar un material en tubo de polipropileno; un actuador apto para suministrar una presion precisa entre 3 y 100 atmosferas sobre la region de sello deseada; y un sistema de control para impulsar la secuencia del actuador a un tiempo de ciclo espedfico entre 1 y 30 segundos. Utilizando este metodo se han creado sellos satisfactorios en tubulos de polipropileno para abrirse por pelado cuando se someten a una presion interna del orden de 1 atmosfera. Tecnicas alternas para suministrar la energfa de sellado al tubulo incluyen RF y soldadura ultrasonica.

En otras realizaciones pueden utilizarse materiales de tubulo alternos y mezclas de materiales para optimizar la prestacion del sello desprendible. Por ejemplo puede mezclarse dos polfmeros de polipropileno de diferente temperatura de fusion en una relacion tal que la composicion y caractensticas de fusion se optimicen para la formacion del sello desprendible. En adicion a o en lugar de sellos rompibles 14, el tubulo flexible puede tener ademas una o mas puertas de presion 194, que son capaces de abrir reversiblemente y cerrarse durante la operacion de una prueba aplicando una fuerza controlada a un segmento del tubulo flexible.

En un segmento de tubulo puede embeberse un filtro. Ejemplos de filtros 206 y 216 se muestran en la figura 4A y figuras 5A-B, respectivamente. En una modalidad preferida puede formarse un filtro mediante apilado de capas multiples de material de filtro flexible. La capa superior del filtro que contacta directamente una muestra puede tener un tamano de poro seleccionado para filtracion; la capa de fondo del filtro puede incluir un material con tamano de poro mucho mayor para proporcionar una estructura de soporte para la capa mas superior cuando se aplica una presion durante la filtracion. En esta modalidad preferida el filtro puede ser doblado para formar una bolsa, con los bordes de su extremo abierto unidos firmemente a la pared del tubulo. El segmento con la bolsa de filtro puede ser capaz de aplanarse sustancialmente mediante compresion del exterior del tubulo.

En modalidades de ejemplo puede almacenarse uno o mas reactivos como sustancia seca y/o como soluciones lfquidas en segmentos de tubulo. En modalidades en donde pueden almacenarse reactivos en formato seco, soluciones lfquidas pueden almacenarse en segmentos adyacentes para facilitar la reconstitucion de la solucion de reactivo. Ejemplos de reactivos tfpicos incluyen: reactivo de lfsis, tampon de elusion, tampon de lavado, inhibidor de DNase. inhibidor de RNase, inhibidor de proteinasa, agente quelante, reactivo neutralizante, solucion de sal catropica, detergente, tensoactivo, anticoagulante, solucion germinante, isopropanol, solucion de etanol, anticuerpo, sondas de acido nucleico, sondas de acido nucleico peptfdico, y sondas de acido nucleico fosfotioato. En

modalidades en donde uno de los reactivos es una solucion de sal caotropica, un componente preferido es

isocianato de guanidinio o clorhidrato de guanidinio o una combinacion de los mismos. En algunas modalidades el orden en el que los reactivos puede almacenarse en el tubulo respecto a la abertura a traves de la cual se introduce una muestra, refleja el orden en donde los reactivos pueden utilizarse en metodos que utilizan el tubo. En

modalidades preferidas un reactivo incluye una sustancia capaz de ligazon espedfica a un componente

preseleccionado de una muestra. Por ejemplo una sustancia puede ligarse espedficamente a acido nucleico, o una sonda de acido nucleico puede ligarse espedficamente a acidos nucleicos con secuencias de base particulares.

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En otras modalidades de ejemplo puede contenerse un substrato de fase solida en un segmento de tubulo utilizado para capturar uno o mas componentes seleccionados de una muestra (si este componente esta presente en una muestra), tal como un microorganismo objetivo o acidos nucleicos. La capturacion puede ayudar a enriquecer el componente objetivo y separar los inhibidores de reaccion de una muestra. Los substratos pueden ser material de fase solida que puede capturar celulas objetivo, viriones, acidos nucleicos u otros componentes seleccionados bajo condiciones qmmicas y de temperatura definidas, y puede liberar los componentes bajo diferentes condiciones qmmicas y de temperatura.

En algunas modalidades un reactivo puede ser recubierto sobre el substrato. Ejemplos de reactivo recubrible son: receptores, ligandos, anticuerpos, antfgenos, sondas de acidos nucleico, sondas de acido nucleico peptfdico, sondas de acido nucleico fosfotioato, bacteriofagos, sflice, sales caotropicas, proteinasas, inhibidores de DNasas, RNasas, DNasa, inhibidores de RNasa, y soluciones germinantes. En algunas modalidades el substrato puede almacenarse en un segmento seco del tubulo mientras que en otras modalidades puede almacenarse sumergido en un lfquido. En algunas modalidades el orden en el que los reactivos pueden almacenarse en el tubulo respecto al substrato y la abertura a traves de la cual se introduce una muestra, refleja el orden en el que los reactivos y el substrato pueden utilizarse en metodos que utilizan el aparato.

El substrato puede ser: perlas, almohadillas, filtros, laminas, y/o una porcion de superficie de pared de tubulo o una herramienta de recogida. En modalidades en donde el substrato es una pluralidad de perlas, dichas perlas pueden ser perlas de sflice, perlas magneticas, perlas magneticas de sflice, perlas de vidrio, perlas coloidales de nitrocelulosa y perlas coloidales de nitrocelulosa magnetizadas. En algunas modalidades en donde las perlas pueden ser paramagneticas, las perlas pueden ser capturadas mediante un campo magnetico. Ejemplos de reactivos que pueden permitir la adsorcion selectiva de moleculas de acido nucleico a una superficie recubierta grupo-funcional se describen, por ejemplo en las patentes U.S. nums.. 5.705.628; 5.898.071 y 6.534.262. La separacion puede llevarse a cabo manipulando la resistencia ionica y concentracion de polialquilenglicol de la solucion para precipitar selectivamente, y absorber de forma reversible, los acidos nucleicos a una superficie de fase solida.

Cuando estas superficies de fase solida son micropartfculas paramagneticas, las perlas magneticas, a las que se han adsorbido las moleculas de acido nucleico diana, pueden lavarse bajo condiciones que retengan los acidos nucleicos pero no otras moleculas. Las moleculas de acido nucleico aisladas a traves de este procedimiento son apropiadas para: electroforesis capilar, secuenciacion nucleotida, transcripcion inversa, colacion, transfectacion, transduccion, microinyeccion de celulas mamarias, protocolos de terapia de genes, la smtesis en vitro de sondas de ARN, construccion de librena CADN, amplificacion de reaccion por cadena de polimerasa (PCR). Varias comparuas ofrecen sistemas de purificacion de base magnetica, tales como QIAGEN's MagAttract™, Cortex Biochem's MagaZorbR, Roche Applied Science's MagNA Pure LCR, y MagPrepR Silica de Merck & Co. Todos estos kits utilizan partfculs cargadas negativamente y manipulan condiciones de tampon para ligar selectivamente una variedad de acidos nucleicos a las perlas, lavan las perlas y eluyen las perlas en tampones acuosos. Muchos de los productos utilizados por estas comparuas utilizan sales caotropicas para ayudar en la precipitacion de acidos nucleicos sobre las perlas magneticas. Ejemplos se describen en las patentes U.S. nums. 4.427.580, 4.483.920 y 5.234.809.

En algunas modalidades el substrato puede ser una almohadilla 214 o 30 (figuras 5A-B, Figuras 6A-C). En otras realizaciones la almohadilla de substrato puede incluir el papel 35, capas alternas de papeles 34 con diferentes propiedades hidrofobicas, filtros de fibra de vidrio, o filtros de policarbonato con tamanos de poro definidos. En algunas modalidades la almohadilla puede ser un filtro o lamina impermeable 38 para cubrir porcion seleccionada de las superficies de la almohadilla, teniendo dicho filtro un tamano de poro predeterminado. Un dispositivo de filtracion de esta indole puede utilizarse para la separacion de globulos blancos 32 y globulos rojos 33 (u otras partfculas, tales como virus o microorganismos) de sangre entera 31 y/u otras muestras. La almohadilla 214 puede montarse sobre la pared del tubulo (figuras 5A-B) y/o sobre una herramienta de recogida de muestras 26. En algunas realizaciones la almohadilla puede empaparse con una solucion reactiva mientras que en otras modalidades puede recubrirse con reactivos secos.

Modalidades de ejemplo preferidas pueden incluir una disposicion lineal de 2 o mas segmentos de tubulo 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, y/o 190 (figura 1B). Una disposicion lineal facilita mover la muestra y el desecho resultante y apuntar a traves del tubo en una forma controlada. Una muestra biologica bruta puede entrar a traves de una primera abertura 12 (Figura 2B) en un segmento 110 (Figura 1B) del tubulo. Luego, el desecho de la muestra procesada puede moverse de retorno hacia la primera abertura mientras que la diana se empuja hacia el extremo opuesto, minimizando de este modo la contaminacion de la diana mediante inhibidores de reaccion que pueden haberse unido a la pared del tubulo, y confinando la diana a un segmento limpio del tubulo que puede contener reactivos apropiados para ulteriores operaciones de la diana. Algunas modalidades pueden utilizar una pluralidad de por lo menos tres segmentos, conteniendo cada uno por lo menos un reactivo. En algunas modalidades estos segmentos pueden contener reactivos en el orden siguiente: el reactivo en el segundo segmento puede ser un reactivo de lisis, una dilucion o tampon de lavado, o un substrato; el reactivo en el tercer segmento puede ser un substrato, un reactivo de lisis, un tampon de lavado o un reactivo de neutralizacion; el reactivo en cuarto segmento puede ser un tampon de lavado, un tampon de suspension, un reactivo de elucion, o reactivos de amplificacion y deteccion de acido nucleico. En algunas modalidades los tres segmentos pueden disponerse

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continuamente, mientras que en otras modalidades estos tres segmentos pueden separarse por otro segmento o segmentos intermedios.

En algunas modalidades puede incorporarse una puerta de presion 194 para cerrar y abrir de modo selectivo una segunda abertura, situada en el extremo distal del tubulo, para recoger los productos generados durante una prueba del tubulo para ulterior procesado, fuera del tubulo. En algunas modalidades esta segunda abertura puede situarse en un segmento 198 definido por dos puertas de presion 194 y 196 ,para almacenar un producto de los segmentos de procesado de muestras. En algunas modalidades puede proporcionarse una combinacion de un sello rompible y una puerta de presion para transferir el contenido del tubulo a una segunda abertura.

En algunas modalidades un dispositivo de cierre de tubo para cerrar el tubo despues de la entrada de muestra puede incluir una tapa 20 (figura 1B) y/o abrazadera 310. Una interfase o adaptador 52 entre la tapa y la primera abertura del tubulo flexible puede utilizarse para asegurar un sello seguro hermetico. En una modalidad de ejemplo esta interfase puede ser fileteada y puede incluir caractensticas ahusadas 62 sobre la tapa y/o un armazon de tubo apropiadamente ngido 50 de modo que, cuando se sujetan entre sf, los filetes 64 pueden empenar para coincidir las caractensticas ahusadas 62 entre el armazon de tubo y tapa para proporcionar un cierre apropiado. En esta modalidad de ejemplo la tapa puede requerir de A a 1 giro completo para extraerse totalmente o unirse respecto al portatubo. La combinacion de paso de rosca y angulo ahusado en la junta puede seleccionarse para que ambos sean facilmente manufacturados y proporcionen resistencia de retroalimentacion para informar al usuario que se ha creado un sello efectivo. En otras modalidades el dispositivo de cierre de tapa puede incluir acoples de encaje acoples por presion y/o otros tipos de mecanismo de “giro y bloqueo” entre la etapa y el portatubo, y organizaciones similares en donde la tapa este permanentemente unida al tubulo, tal como mediante abisagrado o atado de la tapa.

Tanto la tapa 20 como el armazon de tubo 50 pueden obtenerse de un plastico moldeado por inyeccion tal como polipropileno. El armazon de tubo 50 puede, a su vez, sujetarse al tubo flexible mediante un sello hermetico permanente. La porcion exterior de la tapa puede cubrirse con resaltos o sujeciones de dedos para facilitar su manipulacion. Ademas, la tapa 20 puede incluir un area para union de una marca o etiqueta de identificacion de muestra. Como una alternativa adicional la tapa puede unirse directamente al primer tubo flexible de abertura a traves de un encaje a presion o un collar que comprima la abertura del tubo flexible contra un saliente en la tapa para crear un sello hermetico. El cierre entre la tapa de tubo y el portatubo puede ser anclado o guiado de modo que una herramienta de recogida 36 o caractensticas integradas en la tapa pueda orientarse de forma definitiva con respecto al tubo para facilitar el procesado de muestra y el aplanamiento del tubulo flexible. Ademas, la tapa puede incorporar caractensticas tales como un trinquete o mecanismo de seguridad similar para impedir que la tapa se extraiga despues de haberse instalado en la abertura del tubo flexible.

La tapa 20 utilizada para cerrar el tubulo en algunas modalidades puede contener una cavidad 22 en su interior haciendo que el cuerpo de la tapa sea sustancialmente hueco. En algunas modalidades la porcion hueca se extiende desde la parte superior del cuerpo de tapa hasta un orificio en la base del cuerpo de tapa. Para formar una camara la parte superior de la cavidad puede ser cerrada fijando una cubricion sobre el cuerpo de tapa. La cubricion puede ser construida a partir de la misma pieza que el cuerpo de tapa. La tapa puede incorporar un orificio de aireacion 26 o puede incorporar ademas una barrera de microbios, filtro o un material que se expande para cerrar el orificio de aireacion cuando se expone a un lfquido o temperatura espedfica. El fondo de la camara puede ser abierta de izquierda o cerrada por un septo o valvula rompible. La camara hueca puede incorporar ademas una membrana o septo flexible 24. Este septo flexible puede fabricarse utilizando moldeo por inmersion, moldeo de silicona de inyeccion lfquida, moldeo por soplado, y/u otros metodos apropiados para la creacion de estructuras elastomericas delgadas. El septo flexible puede insertarse en el conjunto de la cavidad del cuerpo de tapa 22 para aislar de modo efectivo la porcion interna del tubo del ambiente exterior despues de disponer la tapa en posicion sobre el tubo. El septo flexible puede disenarse de modo que, en ausencia de presiones aplicadas exteriormente, su rigidez inherente asegura estar en un estado de deformacion conocida preferido. Como modalidad adicional el septo flexible puede sustituirse por un embolo. En una modalidad de ejemplo un cuerpo de tapa de aproximadamente 30 mm de alto por 14 mm de diametro puede moldearse por inyeccion de un termoplastico apropiado y contener una cavidad interna con por lo menos 500 |iL de volumen disponible. La camara en el cuerpo de tapa puede adaptarse para fines utiles tales como retener o dispensar un reactivo, servir como un deposito para retener fluidos de desecho, servir como un espacio de retraccion para una herramienta de recogida integrada, o una combinacion de estos.

La tapa 20 puede tener una herramienta de recogidas integrada 30 (figura 2B) tal como un hisopo, tubo capilar, gotero de lfquidos, bucle de inoculacion, jeringa, almohadilla absorbente, forceps, pala o stick para facilitar la recogida de ifquido y muestras solidas y su insercion en el tubulo. La herramienta de recogida se disena para recoger y depositar una cantidad predeterminada de material en el tubo. Los reactivos pueden almacenarse sobre la propia herramienta de recogida. Por ejemplo, la herramienta de recogida puede incluir un hisopo impregnado con una sal seca de modo que cuando el hisopo se hidrata suspendena la sal fuera del hisopo en solucion. Ademas la herramienta de recogida y tapa pueden disenarse de modo que la porcion de herramienta de recogida se retraiga en el cuerpo de tapa despues de depositar la muestra en el tubulo para dejar los segmentos de tubulo sustancialmente desahogados.

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La camara 22 en la tapa puede configurarse para almacenar un reactivo. Para llevarlo a cabo, por ejemplo, la base de la camara puede ser cerrada por un septo o valvula rompible (no mostrado) de modo que cuando se exprime la tapa, el septo se rompe para liberar el reactivo. Una caractenstica de este tipo sena util, por ejemplo, si la tapa se formara integralmente con una herramienta de recogida tal como un hisopo o stick. En este caso el reactivo liberado de la camara de tapa podna utilizarse para lavar una muestra fuera de la herramienta de recogida a un segmento de tubo o disolver la muestra contenida sobre la herramienta de recogida. Los reactivos pueden tambien desprenderse de la camara de tapa abriendo el septo rompible con el empleo de presion generada por la compresion de un segmento de tubo flexible para forzar fluido del tubo a la camara de tapa. La camara en la tapa puede configurarse para almacenar fluidos de desecho derivados del procesado dentro del tubulo. En una modalidad preferida la base de la camara puede dejarse abierta de modo que cuando se conecta a la primera abertura del tubulo flexible se forma un paso de fluido entre el tubulo y la camara. Cuando se mueve fluido en la camara de tapa el septo flexible 24 contenido dentro puede moverse desde una posicion inicial en ascenso de modo a acomodar el influjo de nuevo fluido. Este movimiento de septo puede facilitarse mediante la incorporacion de un orificio de aireacion 26 sobre la cubricion de cuerpo de tapa.

Despues que se ha transferido fluido en la camara de tapa una abrazadera 310 o actuador 312 puede actuar para comprimir el tubulo y sellar de modo efectivo el volumen de la camara de tapa de los segmentos de tubulo Como una modalidad alternativa, la camara de tapa puede incorporar una puerta de presion o valvula de retencion (no mostrada) para prohibir que flujo de fluido procedente de la camara de tapa vuelva a los segmentos de tubo. Como una alternativa adicional el septo flexible puede omitirse incluyendo la cubricion de camara de tapa una barrera de microbios para permitir el escape libre de gases contenidos pero que retenga todos los volumenes de lfquido y agentes infecciosos en el tubo. Como alternativa adicional el septo flexible puede sustituirse por un embolo que se desplace axialmente en sentido ascendente para acomodar volumenes de fluido adicionales transferidos desde los segmentos de tubo a la camara de tapa. Otros metodos para acomodar desecho fluido dentro de la camara de tapa pueden imaginarse facilmente sin apartarse del alcance del presente invento.

Puede proporcionarse un armazon sustancialmente ngido 50 para soportar el tubulo flexible 10 apropiadamente disenado constrinendo por lo menos dos extremos distales del tubulo. En una modalidad de ejemplo puede proporcionarse un primer constrenimiento para unir permanentemente y sellar el tubulo al armazon entorno de la primera abertura del tubo. Este sello puede crearse soldando el tubulo flexible al armazon utilizando fuentes termicas y/o ultrasonicas. Alternativamente el sello puede crearse utilizando una junta adhesiva fundible por calor con acetato de etilenvinilo, o formando una junta utilizando un epoxi curado por UV u otros adhesivos. En otras modalidades el tubulo puede sellarse mecanicamente o el inserto moldeado con el armazon. Una segunda limitacion puede proporcionarse para unir y sellar el tubulo a la base del armazon. En una modalidad de ejemplo de esta segunda limitacion este extremo del tubulo puede sellarse plano y unirse al armazon ngido mediante tecnicas de soldadura termicas y/o ultrasonicas. Alternativamente esta union y sello puede formarse tambien utilizando adhesivo o medios mecanicos. En una modalidad alternativa el segundo sello puede ser similar al primer sello, estando sustancialmente abierto para facilitar el acceso al contenido del tubulo flexible desde la segunda abertura. Los materiales de tubulo y armazon pueden optimizarse para manufactura de juntas. Por ejemplo, el armazon puede obtenerse de polipropileno que tenga un punto de fusion inferior al del tubulo mas delgado para asegurar una fusion mas uniforme a traves de una o mas zonas soldadas. Para facilitar la soldadura entre el tubulo y el armazon el area de union puede ahusarse o de otro modo configurarse para incluir directores de energfa u otras caractensticas comunmente utilizadas para mejorar la prestacion de la soldadura. En una modalidad de ejemplo el armazon ngido puede obtenerse de cualquier plastico apropiado mediante moldeo por inyeccion siendo sus dimensiones aproximadas de 150 mm de alto por 25 m de ancho.

El armazon ngido 50 puede incorporar varias caractensticas para facilitar la compresion y aplanamiento del tubo flexible. Por ejemplo, en una modalidad de ejemplo, el tubo flexible 10 puede ser constrenido solo en sus dos extremidades axiales para permitir la maxima libertad radial para evitar que dificulte del movimiento radial del tubulo cuando es comprimido. En otra modalidad la compresion puede ser facilitada incluyendo un area de desahogo en el armazon, cerca de la primera abertura del tubo. Esta area de desahogo puede utilizarse para facilitar la transicion del tubulo flexible desde una forma sustancialmente comprimida en los segmentos de tubulo a una forma sustancialmente abierta en la primera apertura. Otras caractensticas utiles del armazon ngido que pueden facilitar la compresion del tubulo flexible pueden incluir un mecanismo de tensionado del tubulo integral. En una modalidad de ejemplo este mecanismo de tension puede fabricarse mediante caractensticas de moldeo tal como resortes de tipo ballesta directamente en el armazon ngido para atraer el tubulo a uno de sus puntos de union con el armazon.

El armazon ngido 50 puede facilitar la identificacion del tubo, manipulacion, carga de muestra e interactuar con la tapa de tubo. Por ejemplo, el armazon puede proporcionar area adicional para identificar el tubo a traves de etiquetas o escritura 80 fijada a este. Los materiales plasticos del armazon pueden ser de color codificado con los materiales de la tapa para ayudar la identificacion del aparato y su funcion. El armazon puede incorporar caractensticas especiales tales como cambios de espesor o claves para guiar su orientacion en un instrumento receptor o durante la fabricacion. El armazon puede interactuar con un manguito 90 o embalaje que cubra o proteja el tubulo flexible de dano por manipulacion accidental, exposicion a la luz y/o exposicion al calor. El cuerpo del armazon ngido puede proporcionar tambien una estructura conveniente para soportar el tubo. El armazon puede tener una herramienta de recogida integral 32 tal como un deflector o deflector o pala para facilitar la recogida de

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muestras en el aparato. El extremo receptor de muestras del armazon puede tambien incorporar una superficie interior ahusada o en forma de embudo para guiar la muestra recogida en el tubo flexible.

En algunas modalidades se contempla un metodo de extraccion de acidos nucleicos de muestras biologicas utilizando el aparato descrito en los parrafos precedentes. En ciertas modalidades la secuencia de eventos en un test de esta indole puede incluir: 1) una muestra biologica recogida con una herramienta de recogida, 2) un tubulo flexible, que puede incluir una pluralidad de segmentos que pueden contener los reactivos requeridos durante el test, y en donde la muestra recogida puede disponerse utilizando una primera abertura en el tubulo, 3) por lo menos un substrato que puede disponerse a una temperatura controlada y/u otras condiciones para capturar organismos diana o acidos nucleicos durante un penodo de incubacion fijado, 4) organismos o moleculas, en la muestra sin procesar que pueden no ligarse al substrato y de este modo pueden extraerse transfiriendo lfquido a un deposito de desechos, 5) almacenar desechos, en un deposito de desechos, que puede segregarse de la diana mediante una abrazadera y/o actuador comprimido contra el tubulo, 6) un tampon de lavado, liberado de otro segmento del tubulo, que puede extraer inhibidores de reaccion, 7) un reactivo de elucion, de otro segmento, que puede liberar la diana unida al substrato despues de incubacion a una temperatura controlada, y 8) acidos nucleicos que pueden detectarse mediante tecnicas bien conocidas por los familiarizados en el arte o recogerse a traves de una segunda abertura en el tubulo. En modalidades de ejemplo el flujo de la muestra puede ser desde la primera abertura hacia el extremo distal del tubulo a medida que progresa el test mientras que el flujo de desecho puede realizarse hacia la abertura de entrada de muestra cerrada del tubulo, en donde una camara de desecho en la tapa del tubulo recibe el desecho para almacenamiento. Por consiguiente, se evita el contacto indeseable entre la muestra procesada y las superficies en un recipiente de reaccion que ha sido tocado por la muestra sin procesar, impidiendo asf la inhibicion de reaccion debido a cantidades de vestigio de inhibidores de reaccion presentes en la muestra sin procesar y que podnan recubrir las paredes del recipiente de reaccion.

Algunas modalidades pueden incorporar el uso de un tubo de ensayo 1, con un tubulo flexible dividido en una pluralidad de segmentos 16, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180 y/o 190, que pueden ser transversales al eje longitudinal del tubulo, y que pueden contener reactivos, tales como los reactivos 210, 221, 230, 240, 250, 260, 270, 280 y/o 290; asf como un analizador, que puede tener una pluralidad de actuadores, tales como los actuadores 312, 322, 332, 342, 352, 3362, 372, 382 y/o 392, abrazaderas tales como las abrazaderas 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380 y/o 390, y bloques, por ejemplo 314, 344 y/o 394 (otros sin numerar para simplificar); oponiendose los actuadores y abrazaderas, para procesar una muestra.

Se pueden utilizar varias combinaciones de estos actuadores, abrazaderas, y/o bloques para abrazar de modo efectivo el tubulo cerrado segregando por tanto fluido. En modalidades de ejemplo, por lo menos uno de los actuadores o bloques puede tener un elemento de control termico para control de la temperatura del segmento de tubulo para procesado de muestras. El aparato de procesado de muestras puede tener ademas una fuente de campo magnetico 430 apta para aplicar un campo magnetico a un segmento. El aparato de procesado de muestras puede tener ademas un dispositivo de deteccion 492, tal como fotometro o un CCD, para controlar una reaccion que tenga lugar o se complete dentro del tubulo.

El uso combinado del tubo y el analizador puede facilitar muchas operaciones de procesado de muestras. La recogida de una muestra, tal como sangre, saliva, suero, tierra, biopsia de tejido, heces u otras muestras solidas o lfquidas, puede llevarse a cabo utilizando un utensilio de recogida de muestras 30 que puede ser incorporado en la tapa 20, o aspectos 32 sobre el armazon de tubo 50. Despues de haberse recogido una cantidad apropiada de la muestra la tapa puede disponerse sobre la primera abertura del tubo para cerrar el tubo y depositar la muestra en el primer segmento. Despues de esta etapa la muestra contenida en la herramienta de recogida puede separarse por lavado o resuspenderse con reactivos contenidos en camaras separadas dentro de la tapa mediante compresion de una porcion de la tapa. Luego el tubo puede cargarse en el analizador para ulterior procesado. Caractensticas de identificacion, tales como codigo de barras o etiqueta RF pueden estar presentes sobre el tubo para designar la identidad de la muestra en forma que pueda leerse por el analizador y/o un usuario.

La apertura de un sello rompible de un segmento del tubulo puede llevarse a cabo aplicando presion al tubulo flexible para separar de forma irreversible las superficies unidas de la pared del tubulo. Puede utilizarse un actuador para aplicar la presion requerida para comprimir los segmentos de tubulo que contienen fluido para abrir un sello rompible. En modalidades en donde el segmento es delimitado por dos sello rompibles, A y B. El analizador puede de preferencia romper el sello A protegiendo ffsicamente la region de sello B con un actuador o abrazadera para impedir que el sello B se rompa mientras se aplica presion al segmento para romper el sello A. Alternativamente, el sello A puede abrirse de preferencia aplicando presion al segmento adyacente al sello A en una forma precisa de modo que; el sello A se abre primero por la presion creada en el segmento adyacente; despues que el sello A se rompe, la presion entre los dos segmentos cae sustancialmente debido al volumen adicional, combinado del segmento; la presion reducida en el segmento combinado es insuficiente para romper el sello B. Este metodo puede utilizarse para abrir sellos rompibles uno cada vez sin utilizar actuador protector y/o abrazadera. Como alternativa adicional la adherencia del sello A puede ser inferior a la del sello B de modo que el sello A puede romperse a una presion inferior que el sello B.

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Un proceso para mover fluido de un segmento a otro segmento puede incluir, por ejemplo, liberar una abrazadera en un extremo del primer segmento, que comprende una abrazadera en el otro extremo del primer segmento, liberar un actuador en el segundo segmento y que comprende un actuador en el primer segmento para mover el lfquido del primer segmento al segundo segmento. Alternativamente la abrazadera puede omitirse o abrirse despues de liberar el actuador del segundo segmento.

Un proceso de mezcla de dos sustancias, en donde por lo menos uno es lfquido, dispuesto en segmentos adyacentes puede llevarse a cabo: liberando la abrazadera entre los dos segmentos, moviendo el lfquido contenido en el primer segmento, a traves de un sello rompible abierto al segundo segmento; y comprendiendo alternativamente el segundo segmento y el primer segmento para fluir el lfquido entre los segmentos.

Puede llevarse a cabo una agitacion comprimiendo y descomprimiendo alternativamente un segmento tubular con un actuador, mientras que ambas abrazaderas que flanquean el actuador estan comprimiendo el tubulo. En otra modalidad la agitacion puede obtenerse moviendo alternativamente lfquido entre por lo menos dos segmentos.

En realizaciones en donde un segmento de tubulo puede contener un lfquido que tiene un volumen que excede el volumen requerido para un protocolo, un procedimiento de ajustar el volumen del lfquido en el segmento puede ejecutarse: comprimiendo el segmento de tubulo para reducir el huelgo entre las paredes del tubulo para fijar el volumen del segmento hasta un nivel deseado y permitir que el lfquido excedente fluya al segmento adyacente, pasando una abrazadera en el extremo del segmento o actuador adyacente; cierre del segmento de tubulo con la abrazadera o actuador, resultando en un volumen ajustado de lfquido que queda en el segmento.

Un procedimiento para eliminar burbujas de aire puede incluir la agitacion de un segmento que contiene lfquido burbujeante. Otro procedimiento de suprimir burbujas de aire puede incluir agitar un primer segmento que contiene lfquido mientras se cierra un segundo segmento; apertura del segundo segmento y mover el lfquido del primer segmento al segundo segmento; agitar el segundo segmento y ajustar una posicion del segundo actuador para mover la interfase lfquido-aire en la proximidad o por encima del extremo superior del segundo segmento, abrazando luego el extremo superior del segundo segmento para formar un segmento totalmente lfquido infundido sin burbujas de aire.

Un proceso de dilucion puede llevarse a cabo utilizando el proceso de movimiento de lfquido en donde uno de los segmentos incluye un diluente y el otro incluye una sustancia que ha de diluirse.

Un proceso de reconstitucion de un reactivo a partir de componentes secos y lfquidos almacenados por separado en diferentes segmentos o sub-segmentos de tubulo puede incluir comprimir el segmento o sub-segmento de tubulo que contiene los componentes lfquidos para abrir el sello rompible que conecta con el segmento de reactivo seco, mover el lfquido en el segmento o sub-segmento de reactivo seco y mezclar el reactivo seco y componentes lfquidos utilizando el proceso de mezclado.

La filtracion puede llevarse a cabo utilizando un filtro 206 (figura 4a) dispuesto entre dos segmentos o dos sub- segmentos. Por ejemplo, una muestra de sangre entera puede depositarse en un primer segmento con una bolsa de filtro. Puede seleccionarse un tamano de poro del filtro para la filtracion de celulas de sangre. Una abrazadera 300 puede luego cerrar el extremo del segmento opuesto a la bolsa de filtro y un actuador 302 puede comprimir el primer segmento para generar presion para conducir el flujo de plasma a traves del filtro a un segundo segmento. En otra modalidad, un reactivo de coagulacion, agregacion o aglutinacion, tal como anticuerpo 204 contra antfgenos superficiales de globulos rojos 202, un coagulado de globulos rojos, puede utilizarse para inducir la ligazon de globulos rojos-globulos rojos para formar grupos antes de la filtracion. El tamano de poro del filtro puede seleccionarse para bloquear los grupos mientras que permite que celulas no agregadas fluyan a su traves. La aplicacion de presion sobre el primer segmento que contiene grupos de globulos rojos y sangre puede enriquecer los globulos blancos 208 en el segundo segmento.

En ciertas modalidades puede llevarse a cabo un proceso de molturacion utilizando un actuador para comprimir y descomprimir alternativamente un segmento de tubulo que tiene una pared endurecida con una superficie interna a modo de microdientes 109 (figura 7A) y de este modo romper una muestra solida, tal como muestra de tejido de biopsia, dentro del segmento de tubulo. En otra modalidad puede utilizarse pequenas perlas de vidrio con la muestra solida para mejorar la prestacion de molturacion. En otra modalidad una rueda de molturacion 450 accionada por un motor 452 puede utilizarse para formar una molturacion rotacional sobre la muestra en el segmento de tubulo y accionar el movimiento de perlas de vidrio y una muestra biologica 200 para mejorar la prestacion de molturacion. La temperatura de un reactivo lfquido en el segmento puede seleccionarse de modo que mejore el resultado de molturacion.

La incubacion del contenido en un segmento puede obtenerse ajustando el actuador correspondiente y/o temperatura de bloque y aplicando presion al segmento para asegurar un suficiente contacto superficial entre la pared del tubulo del segmento y el actuador y el bloque, y llevando el contenido del segmento de tubulo a sustancialmente la misma temperatura que la temperatura del actuador circundante y/o bloque. La incubacion

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puede conducirse en todas las condiciones del proceso mientras que las temperaturas de todos los segmentos implicados se fijen segun se requiera.

La rapida rampa de temperatura para incubacion puede obtenerse incubando un fluido en un primer segmento a una primera temperatura y fijando una segunda temperatura para un segundo segmento adjuntando el primer segmento, despues flanqueantes de existir, para formar una canal para formar un canal de capa fina con un huelgo de alrededor de 1 a alrededor de 500 de terminar la incubacion a la primera temperatura, se mueve rapidamente el lfquido del primer segmento al segundo segmento y se incuba a la segunda temperatura.

Puede producirse un flujo que se conduce a traves de un proceso de canal de flujo comprimiendo el tubulo con un actuador posicionado centralmente, y sus abrazaderas flanqueantes, de existir, para formar un canal de flujo de capa delgada con un huelgo de alrededor de 1 a alrededor de 500 |im, de preferencia de alrededor de 5 a alrededor de 500 |im a traves del segmento. Los actuadores adyacentes comprimen suavemente sobre los segmentos adyacentes en comunicacion de lfquido con el canal de flujo para generar una presion interna defasada para asegurar un huelgo sustancialmente uniforme del canal de flujo de capa delgada. Los dos actuadores flanqueantes pueden luego comprimir alternativamente y liberar presion sobre el tubulo sobre sus respectivos segmentos para generar flujo a un ratio de flujo controlado. Puede incorporarse sensores de flujo opcional, presion y/o fuerza para facultar el control de bucle cerrado del comportamiento de flujo. El proceso de flujo-canal puede utilizarse en lavado, mejora de la eficiencia de ligazon del substrato y deteccion.

Puede utilizarse un proceso de inmovilizacion de perla magnetica y re-suspension para separar las perlas del lfquido de muestra. El campo magnetico generado por una fuente magnetica 430 (Figura 1B) puede aplicarse a un segmento 130 que contiene unas suspension de perlas magneticas 230 para capturar e inmobilizar las perlas hacia la pared del tubo. Puede utilizarse un proceso de agitacion durante el proceso de captura. En otra modalidad puede formarse un canal de flujo sobre el segmento con el campo magnetico aplicado, y pueden capturarse perlas magneticas bajo flujo para aumentar la eficacia de captura. Para la re-suspension de perlas inmobilizadas, puede desconectarse el campo magnetico o apagarse y puede utilizarse para re-suspension un proceso de agitacion o de canal de flujo.

Un proceso de lavado para eliminar desechos residuales e inhibidores de reaccion de un substrato puede llevarse a cabo utilizando tres etapas basicas primero un actuador puede comprimir un segmento que contiene el substrato, tal como perlas inmobilizadas o una lamina, para eliminar sustancialmente lfquido de este segmento. Segundo, puede moverse un tampon de lavado al segmento utilizando un proceso similar al de reconstitucion de un reactivo a partir de componentes secos y lfquidos. Para substratos a base de perlas puede utilizarse un proceso de re-suspension de perlas seguido de recaptura de perlas sobre la pared del tubulo. Tercero, despues de un proceso de mezcla o agitacion el actuador puede comprimir el segmento para eliminar el lfquido de lavado utilizado del segmento. En otra modalidad puede formarse un canal de flujo en el segmento que contiene un substrato, que puede ser perlas inmobilizadas o una lamina. Se genera a traves del canal de flujo con el substrato un lavado de flujo unidireccional, que tiene caractensticas laminares. Por ultimo todos los actuadores y abrazaderas, de existir, pueden cerrarse para eliminar sustancialmente todo el lfquido de los segmentos. En una modalidad adicional puede utilizarse una combinacion del lavado basado en dilucion y el lavado basado en flujo laminar para la mejora adicional de la eficacia del lavado.

La lisis puede obtenerse calentando una muestra a una temperatura fijada o utilizando una combinacion de calor ya gentes qrnmicos para romper membranas de celulas abiertas, paredes de celula o partfculas de virus sin recubrir. En otra modalidad la lisis puede obtenerse utilizando un reactivo qrnmico, tal como proteinasa K, y una solucion de sal caotropica. Dichos reactivos qrnmicos pueden almacenarse en uno o mas segmentos de tubulo y combinarse con la muestra utilizando los procesos antes descritos. En algunas modalidades pueden combinarse procesos multiples tales como lisis de celulas qrnmicas, molturacion mecanica y calentamiento, paras romper muestra solida, por ejemplo tejido recogido de biopsia, para maximizar la prestacion.

La captura de micro-organismos diana puede obtenerse utilizando un substrato. En una modalidad la superficie del substrato puede recubrirse con por lo menos un reactivo de union, tal como un anticuerpo, ligando o receptor contra un antfgeno, receptor o ligando sobre la superficie del organismo diana (ASA), un acido nucleico (NA), un acido nucleico peptfdico (PNA) y fosfotioato (PT) sonda de acido nucleico para capturar una secuencia diana de acido nucleico espedfica complementaria a la sonda o un organismo diana. En otra modalidad la superficie puede seleccionarse para que tenga, o se recubra para formar, una superficie cargada electrostaticamente (CE), tal como superficie recubierta de resina de intercambio de sflice o iones, para capturar de forma reversible sustancialmente solo acidos nucleicos. En algunas modalidades el substrato puede pre-envasarse en un segmento tubular o sub- segmento en formato seco, y puede empaquetarse en otro segmento un tampon de ligazon de lfquido. El substrato y el tampon puede reconstituirse utilizando los procesos antes citados.

En algunas modalidades puede utilizarse un reactivo de un segmento contiguo para diluir la muestra antes de incubacion clon el substrato. En algunas modalidades el organismo diana puede capturarse por el substrato antes del lisado de los microorganismos; mientras que en otras modalidades puede llevarse a cabo una etapa de lisis antes de la etapa de captura de dianas. En modalidades preferidas la incubacion del substrato en agitacion puede

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llevarse a cabo a una temperatura deseada, por ejemplo, a 4°C para captura de bacterias vivas, o temperatura ambiente para captura viral. La captura puede ser seguida de un proceso de lavado para eliminar los residuos y componentes indeseados de la muestra del segmento de tubulo.

En algunas modalidades pueden utilizarse perlas magneticas como el substrato para la captura de dianas y puede utilizarse un proceso de inmobilizacion de perlas magneticas y re-suspension para separar las perlas del lfquido de muestra. En otras modalidades en donde el substrato puede ser una almohadilla 30 o una lamina 214 (Figuras 5A- B), el substrato 30 y 214 puede incorporarse en la herramienta de recogida 36 y/o puede adherirse sobre la pared del tubulo en un segmento.

La elucion puede obtenerse mediante calentamiento y/o incubacion del substrato en una solucion en un segmento de tubulo a una temperatura elevada. Las temperaturas preferidas para elucion son de 50°C a 95°C. En otra modalidad la elucion puede obtenerse cambiando el pH de la solucion en donde se suspende o embebe el substrato. Por ejemplo, en una modalidad de ejemplo el pH de la solucion de lavado puede estar comprendida entre 4 y 5,5 mientras la del tampon de elucion puede estar entre 8 y 9.

Un proceso de germinacion de esporas puede conducirse mezclando una muestra que contiene esporas bacterianas con solucion de germinacion e incubando la mezclad a una condicion apropiada. La solucion germinante puede contener por lo menos una de L-alanina, inosina, L-fenilalanina, y/o L-prolina asf como cierto medio de crecimiento rico para permitir crecimiento parcial de las celulas pre-vegetativas liberadas de las esporas. Las temperaturas de incubacion preferidas para la germinacion oscilan entre 20°C y 37°C. Con el recubrimiento del substrato con un anticuerpo anti-esporas, pueden enriquecerse selectivamente celulas vegetativas a partir de una muestra que contiene esporas vivas y/o muertas. Las esporas vivas pueden liberar una pluralidad de celulas vegetativas del substrato, que puede luego procesarse para detectar secuencias de acido nucleico caractensticas de las especies bacterianas. En algunas modalidades la solucion germinante puede absorberse en una almohadilla.

En ciertas modalidades pueden procesarse adicionalmente acidos nucleicos extrafdos de muestras biologicas amplificando los acidos nucleicos con el empleo de por lo menos un metodo del grupo reaccion de cadena de polimerasa (RCP), replicacion en circulo rodante (RCA), reaccion de cadena de ligasa (LCR), amplificacion mediada por transcripcion (AMT), amplificacion basada en secuencia de acido nucleico (ABSAN) y reaccion de amplificacion de desplazamiento filamentoso (SDAR). En algunas modalidades los acidos nucleicos extrafdos del organismo pueden ser acidos ribonucleicos (ARN) y su procesamiento puede incluir una transcripcion inversa acoplada y reaccion de cadena de polimerasa (RT-PCR) utilizando combinaciones de enzimas tales como Tth polimerasa y Taq polimerasa o transcriptasa inversa y Taq polimerasa. En algunas modalidades sondas de acido nucleico de mella circular pueden circularizarse utilizando T4 ADN ligasa o AmpligaseR y acidos nucleicos de grna, tales como objetivos ADN o ARN, seguido de la deteccion de la formacion de sondas circularizadas cerradas despues de un proceso de seccion in Vitro. Esta deteccion puede realizarse a traves de PCR, TMA, RCA, LCR, NASBa o SDAR utilizando enzimas conocidas por los familiares con el arte. En modalidades de ejemplo la amplificacion de los acidos nucleicos puede detectarse en tiempo real utilizando sondas de acido nucleico con etiquetado fluorescente o ADN intercalando colorantes asf como un fotometro o dispositivo acoplado con carga en el analizador molecular para detectar el aumento en fluorescencia durante la amplificacion de acido nucleico. Estas sondas etiquetadas fluorescentemente usan esquemas de deteccion bien conocidos por lo familiarizados con el arte (o sea, TaqManR, molecular beaconsR sondas de transferencia de energfa de resonancia fluorescente (FRET), sondas scorpionR) y generalmente uso de atrapamiento de fluorescencia asf como la liberacion de transferencia de energfa de atrapamiento o fluorescencia de un reportero a otro para detectar la smtesis o presencia de acidos nucleicos espedficos.

Una deteccion en tiempo real de una senal procedente de un segmento de tubulo puede obtenerse utilizando un sensor 492 (Figura 1B), tal como un fotometro, un espectrometro, un CCD, conectado a un bloque, tal como el bloque 490. En modalidades de ejemplo puede aplicarse presion mediante un actuador 392 sobre el segmento de tubulo 190 para definir apropiadamente la forma del segmento de tubulo. El formato de la senal puede ser una intensidad de una luz en cierta longitud de onda, tal como una luz fluorescente, un espectro, y/o una imagen de celulas o elementos sinteticos tal como puntos cuanticos. Para la deteccion fluorescente puede utilizarse una excitacion de luz del sistema optico para iluminar una reaccion, y puede detectarse mediante el fotometro una emision de luz. Para detectar una pluralidad de senales que tengan longitudes de onda espedficas, pueden detectarse en serie o en paralelo senales de longitud de onda diferentes mediante canales de deteccion dedicada o un espectrometro.

Los dispositivos y metodos descritos pueden aplicarse ampliamente como muchas otras aplicaciones de prueba de muestras biologicas. Acidos nucleicos aislados de muestras de biopsia de tejido que circundan tumores extrafdos mediante un cirujano pueden utilizarse para detectar tejidos pre-cancerosos. En estas aplicaciones pueden detectarse mutaciones de puntos calientes en genes supresores de tumor y proto-oncogenes utilizando tecnicas de genotipos bien conocidas por los familiarizados con el arte. Los tejidos precancerosos tienen con frecuencia mutaciones somaticas que puede identificarse facilmente comparando el resultado de la prueba de genotipo con la muestra de la biopsia para el genotipo del paciente utilizando sangre entera como fuente de acidos nucleicos. Pueden utilizarse acidos nucleicos aislados de globulos blancos para detectar variantes geneticas y mutaciones de

lmea germinal utilizando tecnicas geneticas bien conocidas con los familiarizados con el arte. Ejemplos de estas mutaciones son los aproximadamente 25 mutantes conocidos del gen CFTR recomendado para la diagnosis prenatal por el American College of Medical Genetics y el American College of Obstetricians and Gynecologists. Ejemplos de variantes geneticas son alelos de alta frecuencia en dehidrogenasa de glucosa-6-fosfato que influencia 5 sensibilidad para agentes terapeuticos, como el medicamento antimaliarico Primaquine.

Otro ejemplo de variaciones geneticas con relevancia clmica son alelos que pertenecen a riesgos incrementados de condiciones patologicas, como el alelo de Factor V Leiden y el riesgo incrementado de trombosis venosa. Acidos nucleicos aislados de bacterias pueden utilizarse para detectar secuencias que codifican genes para evaluar la 10 patogenicidad de una cepa bacteriana. Ejemplos de estos genes son el Factor Letal, el Antfgeno Protector A, y los genes de factor de Edema sobre el plasmido PXO1 de Bacillus anthracis y el antfgeno Capsular A, B, y C sobre el plasmido PXO2 del B. Anthracis. La presencia de estas secuencias permite que los investigadores distingan entre B. Anthracis y bacterias inofensivas de la tierra. Los acidos nucleicos aislados de virus ARN pueden utilizarse para detectar genes que codifican secuencias para detectar la presencia o ausencia de un virus o cuantificar un virus para 15 guiar el tratamiento terapeutico de individuos infectados.

Una utilidad particularmente significante de estos ensayos es la deteccion del virus de inmunodeficiencia humano (VIH), para guiar terapia anti-retroviral. Los acidos nucleicos aislados de virus de ADN pueden utilizarse para detectar secuencias que codifican genes para detectar la presencia o ausencia de un virus en la sangre antes de su 20 empleo en la fabricacion de productos derivados de la sangre. La deteccion del virus de hepatitis B en piletas de muestras de sangre es un ejemplo bien conocido de esta utilidad para los familiares en el arte. La presencia de verotoxin Escherichia coli en carne molida de vacuno es un buen ejemplo del potencial de usos agncolas del aparato. La deteccion del virus Norwalk sobre superficies es un ejemplo de una aplicacion de control del ambiente de salud publica.

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EJEMPLOS

Ejemplo 1. Aislamiento de ADN genomico y deteccion de sangre completa

30 El aislamiento de ADN y deteccion de secuencia de ADN puede llevarse a cabo en un tubo 1 (figura 1b), que incluye un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos removibles y que contienen reactivos pre- empaquetados, y una tapa 20, que tiene un deposito de desecho 22 alojado en esta. El primer segmento 110 del tubulo puede recibir la muestra de sangre completa. El segundo segmento puede contener tampon de dilucion con 40 |il de solucion salina fosfatada (SSF) 221 (que puede contener 137 mM de NaCl, 2,7 mM DE KCL, 4,3 mM de 35 Na2HPO4, 1,4 mM de KH2PO4, PH 7,3) y 250 |ig de proteinasa seca K 222, que puede alojarse en un sub-segmento

121 y dos 122 respectivamente, separado por un sello desprendible 125. El tercer segmento 130 puede contener 50 |il de tampon de lisis 230 que puede contener sales caotropicas que pueden contener 4,7 M de clorhidrato de guanidinio, 10 mM de urea, 10mM de GTris HCl, pH 5,7, y 2% de triton X-100. El cuarto segmento 140 puede contener 500 mg de perlas de sflice magneticas 240, tales como perlas MagPrepR (Merck & Co), suspendidas en 80 40 |il de isopropanol. Estas perlas pueden ligar DNA en presencia de sales caotropicas y alcohol. El quinto segmento

150 puede contener 80 |il de tampon de lavado 250 (que puede contener etanol al 50%, 20 mM de NaCl, 10 mM de Tris HCl, pH7,5). El sexto segmento 160 puede contener 80 |il 20mM de acido 2-morfolinoetansulfonico (MES) tampon 260, PH 5,3. El pH del tampon MES puede ajustarse de modo que pueda ser lo suficientemente bajo para evitar la elucion del ADN de las perlas. El septimo segmento 170 puede contener 80 |il de tampon de elucion 270 (10 45 mM de Tris HCl, pH 8,5: un ejemplo de un tampon apropiado para PCR). El pH del tampon de elucion puede ajustarse de modo que pueda ser lo suficientemente alto para eluir el DNA de la superficie de las perlas en el tampon. El octavo segmento 180 puede contener uracil-N-glicosilasa seca (ING) 280. El noveno segmento 190 puede contener reactivos PCR secos 290 (que pueden contener 10 mmol de cada uno de los trifosfatos deoxinucleotidos (dNTPs): trifosfato de deoxiadenosina (dATP), trifosfato de deoxicitosina (dCTP) y trifosfato de 50 deoxiguninosina (dGTP); 20 nmol de trifosfato de deoxiuridina (dUTP), 2,5 |imol de KCl, 200 nmol de MgCh, 1-5 unidades de polimerasa de ADN Taq, y 20-100 pmol de cada uno de los cebadores oligonucleotidos, y 6-25 pmol de sonda TaqMan). El extremo 194 del segmento 190 puede sellarse de forma permanente o contener una puerta de presion para recoger los productos de la reaccion de amplificacion para confirmar los resultados de una prueba de genotipado mediante secuenciacion de ADN o alguna otra prueba conocida por los expertos en el arte.

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1. Lisis de muestra. Todas las abrazaderas, excepto la primera abrazadera 310, pueden cerrarse sobre el tubulo. El primer actuador 312 puede comprender el primer segmento 110 para ajustar el volumen de sangre 210 para retener alrededor de 10 |il en el segmento, y luego la primera abrazadera 310 puede comprimir el tubulo para cerrar el segmento. El segundo actuador 322 puede luego comprimir el segundo segmento 120 (subsegmentos 121 y 122) 60 para romper el sello desprendible 125 y mezcla PBS 221 con proteinasa K 222. La segunda abrazadera 320 puede luego abrirse y el segundo actuador puede comprimir el segundo segmento para abrir el sello desprendible. El primer y segundo actuadores pueden ademas comprimir alternativamente los segmentos para mezclar el tampon de dilucion con la muestra de sangre. El analizador puede cerrar el primer actuador 312 y la segunda abrazadera 320 para mover la muestra diluida al segundo segmento 120, y mover la tercera abrazadera 330 para abrir el actuador 65 322 y 332 para comprimir alternativamente los segmentos de tubulo 130 y 120 para abrir el sello desprendible entre

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los segmentos para mezclar el tampon de lisis 230 con la muestra diluida, e incubar la mezclas a 50°C durante 5 minutos. La temperatura de incubacion puede mantenerse mediante contacto entre el tubulo y los elementos termicos incorporados dentro de los actuadores y/o bloques opuestos a los actuadores.

2. Captura de acido nucleico. Despues de incubacion la cuarta abrazadera 340 puede abrirse y el cuarto actuador 342 puede comprimir el cuarto segmento 140 para abrir el sello removible y mezclar las perlas de sflice magneticas suspendidas en isopropanol 240 con el lisado en los segmentos 130 yl2o. Los actuadores 322 y 332 con un actuador adyacente 312 o 342 pueden comprimir alternativamente sus segmentos respectivos para agitar e incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente para facilitar que el ADN se ligue a las perlas de sflice magneticas. Luego puede generarse un campo magnetico mediante una fuente magnetica 430 cerca del segmento 130 para capturar las perlas en suspension. El actuador 322 y 332 puede comprimir alternadamente el segmento 120 y 130 para capturar perlas. Como alternativa el actuador 332 puede comprimir el segmento 130 para formar un canal de flujo, y dos actuador flanqueantes 322 y 342 pueden comprimir sus respectivos segmentos alternadamente para aumentar la eficacia de captura. Sustancialmente todas las perlas pueden inmobilizarse sobre la pared del segmento 130, luego los actuadores y abrazaderas del actuador 342 a la abrazadera 310 pueden abrirse y cerrarse de forma secuencial para mover la muestra no ligada y desecho al deposito de desecho 22.

3. Lavado. Un proceso de lavado puede seguir al proceso de captura con el fin de eliminar desechos residuales e inhibidores de reaccion de las perlas y los segmentos debieran utilizarse para ulterior procesado de muestras. En esta modalidad puede utilizarse un lavado a base de dilucion con el tampon de lavado de etanol y puede utilizarse un lavado a base de flujo de capa delgada con el tampon de lavado MES. Las abrazaderas 350 y el actuador 342 pueden abrirse primero y luego el actuador 352 puede cerrarse para mover el tampon de etanol 250 al segmento 240, seguido del cierre de la abrazadera 350. Con el empleo del mismo procedimiento sobre los segmentos 140 y 130, puede moverse el tampon de etanol al segmento 130. Puede eliminarse el campo magnetico; el actuador 332 y por lo menos un actuador adyacente pueden comprimirse alternadamente contra sus respectivos segmentos para generar flujo para resuspender las perlas. El campo magnetico puede luego activarse para capturar sustancialmente todas las perlas y el lfquido puede llevarse al deposito de desechos utilizando los procesos antes indicados. Despues de completar el primer lavado puede moverse el tampon de lavado MES del segmento 160 al 140. El actuador 332 y abrazadera 340 y 330 pueden soltarse suavemente para formar un canal de flujo de capa delgada a traves del segmento 130. El actuador 342 puede comprimirse suavemente sobre el segmento 140 para generar cierta presion interna para asegurar un huelgo sustancialmente uniforme del canal de flujo de capa delgada. El actuador 342 puede luego comprimir suavemente el tubulo, y el actuador 322 puede liberar el tubulo para asegurar un flujo esencialmente laminar del tampon de lavado a traves del canal de flujo. Cuando se completa el lavado pueden cerrarse los actuadores y mordazas y moverse todo el desecho al deposito de desechos 22.

4. Elucion de acido nucleico. El tampon de elucion 270 puede luego moverse del segmento 170 al 130 utilizando un procedimiento similar al antes indicado. El campo magnetico puede eliminarse y las perlas pueden resuspenderse en el tampon de elucion y bajo flujo entre los segmentos 130 y 140. La suspension de perlas puede incubarse a 95°C bajo flujo estacionario o condiciones de agitacion durante 2 minutos. El campo magnetico puede activarse y sustancialmente todas las perlas pueden inmobilizarse, y la solucion de acido nucleico eluido puede moverse al segmento 170 mediante abertura secuencial y cierre de los actuadores y abrazaderas. El actuador 372 puede comprimir el segmento 170 para ajustar el volumen de la solucion de acido nucleico a 50 |il y luego puede cerrarse la abrazadera 370 contra el tubulo para completar el proceso de extraccion de ADN.

5. Amplificacion y deteccion de acido nucleico. La solucion de acido nucleico puede luego transferirse al segmento 180, se mezcla y se incuba con UNG 280 a 37° durante 5 minutos para degradar cualquier producto PCR contaminante que pueda haber estado presente en la muestra biologica. Despues de la incubacion la temperatura puede aumentarse hasta 95°C para desnaturalizar ADN y UNG durante 2 minutos. La solucion de acido nucleico puede luego ser transferida al segmento 190, y se mezcla con reactivo PCR 290 a 60° C para iniciar el comienzo en caliente de PCR. Un ensayo de amplificacion tfpico de temperatura-2 de 50 ciclos de 95°C durante 2 segundos y 60°C durante 15 segundos puede llevarse a cabo fijando el segmento 180 a 95°C y el segmento 190 a 60°C, y transfiriendo la mezcla reaccional entre los segmentos de forma alternativa cerrando y abriendo el actuador 382 y 392. Un ensayo de amplificacion de temperatura-3 tfpico de 50 ciclos de 95°C durante 2 segundos, 60°C durante 10 segundos y 72°C durante 10 segundos puede conducirse fijando el segmento 170 a 95C, el segmento 180 a 72°C y el segmento 190 a 60°C, y transfiriendo alternativamente la mezcla reaccional entre los segmentos cerrando y abriendo los actuadores 372, 382 y 392. Puede montarse un sensor de deteccion 492, tal como un fotometro, sobre el bloque 394 para controlar la emision de fluorescencia en tiempo real procedente del colorante reportero a traves de una porcion de la pared del tubulo. Despues de completar un ensayo los resultados de prueba pueden ser reportados y la muestra puede transferirse al segmento 198 a traves de la puerta de presion 194 mediante la compresion del segmento 190 para ulterior procesado.

Se cargaron diez microlitros de sangre entera humana tratado con acido tetraacetico de etilendiamina (EDTA) recien preparado en un tubo de muestras pre-empaquetado y se proceso en un analizador como se describe en el texto. La deteccion se llevo a cabo con una sonda TaqMan Minor Groove Binder etiquetada VICR complementaria al gen hemocromatosis (HFE) de tipo salvaje y una sonda de ligante TaqMan Minor Groove etiquetada FAM complementaria al mutante C282Y. La figura 8 muestra los resultados de tres experimentos independientes y un

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control negativo en donde se omitio el ADN molde. Como estas muestras contuvieron solo alelos HFE de tipo salvaje solo se muestran vestigios de fluorescencia VIC.

Ejemplo 2. Aislamiento de ADN genomico y deteccion de muestra de hisopo

El aislamiento de ADN y la deteccion de la secuencia de ADN puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados mediante sellos removibles y conteniendo reactivos preenvasados, y una tapa 20, que tiene un deposito de desechos 22 alojado en esta y adicionalmente un hisopo que sobresale de la abertura de la tapa. Todos los reactivos pre-empaquetados pueden ser identicos a los del ejemplo 1, a excepcion de que un sub-segmento 121 del segundo segmento 120 puede contener 50|il de tampon de dilucion PBS.

El hisopo de la tapa 20 puede utilizarse para recoger una muestra de la cavidad oral, una superficie, u otras muestras desinfectables conocidas por el experto en el arte. Despues de la recogida la tapa puede casar con el tubulo, introduciendo la muestra del hisopo en el primer segmento 110. El tubulo puede luego insertarse en un analizador. Todas las abrazaderas, excepto la primera abrazadera 310 pueden cerrarse sobre el tubulo. El segundo actuador 322 puede comprimir el segundo segmento 120 (subsegmentos 121 y 122) para romper el sello desprendible 125 y mezclar PBS 221 con proteinasa K 222. Luego puede abrirse la segunda abrazadera 320 y el segundo actuador comprime el segundo segmento para abrir el sello removible y mover el PBS y los reactivos de proteinasa K al primer segmento 110. La abrazadera 320 puede cerrarse y el primer actuador 312 se comprime y libera alternadamente para eluir la muestra del hisopo de la punta del hisopo. Despues de eluirse la muestra el primer actuador 312 puede comprimir el primer segmento 110 y la abrazadera 320 y segundo actuador 322 pueden abrirse para permitir la transferencia de la muestra elrnda al segundo segmento. El segundo actuador 322 puede luego comprimir el segundo segmento 120 para ajustar el volumen de muestra elrnda hasta alrededor de 50 |il, y la segunda abrazadera 320 puede luego comprimir el tubulo para cerrar el segmento. Todas las etapas de procesado de muestra subsiguientes son similares a las descritos en el ejemplo 1.

Un hisopo esteril con punta de rayon (Copan Italia) se raspo contra el interior de la mejilla de donador para recoger celulas epiteliales bucales. El hisopo se sumergio en 20|il de PBS y se agito energicamente para suspender celulas. Se cargaron diez microlttros de celulas suspendidas en tubulo de muestra pre-empaquetado y se proceso en un analizador como se describe en el texto. La deteccion se llevo a cabo con sonda TaqMan Minor Groove Binder etiquetada VIC complementaria con el gen HFE tipo salvaje, y una sonda etiquetada fAm complementaria con el mutante 282Y del gen HFE (figura 9).

Ejemplo 3. Aislamiento de ADN bacteriano de plasma

El aislamiento de ADN y deteccion de secuencia de ADN de plasma puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos removibles y que contienen reactivos pre- empaquetados, y una tapa 20, que tiene un deposito de desechos 22 alojado en esta. Todos los reactivos pre- empaquetados pueden ser identicos a los del ejemplo 1,excepto que el sub-segmento 121 del segundo segmento 120 puede contener 50|il de tampon de dilucion PBS, el tercer segmento 130 puede contener 100|il de tampon de lisis 230, y el cuarto segmento 140 puede contener 500 |ig de perlas magneticas de sflice suspendidas en 130 |il de isopropanol. Para deteccion de ADN bacteriano, sobre 10 |il de plasma puede cargarse dentro el primer segmento 110. La muestra puede procesarse utilizando los reactivos pre-envasados con los pasos de procesado de muestras descritos en el ejemplo 1.

Se diluyen aproximadamente 105 celulas de E. coli 0157:H7 hasta un volumen de 10 |ill en plasma humano utilizado para el ensayo. La extraccion y deteccion de ADN se llevo a cabo en el analizador como se ha descrito. Se utilizo para la deteccion una sonda etiquetada FAM que reconoce el gen Stx1 de 0157:H7. La figura 19 muestra los resultados con un control negativo en donde se omitio E. Coli O157:H7 ADN.

Ejemplo 4. Aislamiento de ARN viral y deteccion de plasma

El aislamiento de ARN y deteccion de la secuencia de ARN de plasma puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos removibles y que contienen reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20 que tiene un deposito de desechos 22 alojado en esta. Todos los reactivos pre-empaquetados pueden ser identicos a los del ejemplo 3, a excepcion de que el cuarto segmento 140 puede contener una membrana de sflice, lamina de sflice, malla de fibra de sflice dimensionado para acoplarse enteramente dentro del segmento, asf como 130 |il de isopropanol; y el noveno segmento 190 puede contener reactivos de RT-PCR 290 que pueden incluir 10 nmol de cada uno de; dATP, dCTP y dGTP; 20 nmol dUTP, 2,5 limol de KCl, 200 nmol de MgCh, 1-5 unidades de Tth ADN polimerasa, y 20-100 pmol de cada uno de los oligonucleotidos cebador, y 6-25 pmol de sonda TaqMan, con o sin 1-5 unidades de Taq ADN polimerasa.

Para aislamiento y deteccion de acido nucleico viral, sobre 50 |il de plasma puede cargarse el primer segmento 110. La muestra puede luego procesarse utilizando los reactivos pre-empaquetados con las etapas de procesado de

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muestras descritas en el ejemplo 1, con la excepcion de una etapa de captura de acido nucleico modificado y una etapa de transcripcion inversa adicional. Para la etapa de captura de acido nucleico puede abrirse la abrazadera 340 y el cuarto actuador 342 puede comprimir el cuarto segmento 140 para abrir el sello desprendible y dejar que el lisado 230 entre en contacto con la membrana de sflice en isopropanol 240 en el segmento 130. Los actuadores 332 y 342 pueden comprimir alternadamente sus segmentos respectivos para agitar e incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente para facilitar la ligazon de acido nucleico a la membrana de sflice. Despues den la captura de acido nucleico el actuador 342 puede comprimir el segmento 140 y el desecho lfquido puede moverse al deposito de desechos. La abrazadera 330 puede cerrarse y los actuadores 332, 342 y 352 pueden formar un canal de flujo en los segmentos 130, 140 y 150 para permitir que el etanol lave el tampon para lavar el substrato. Todas las etapas de procesado de muestras subsiguiente pueden ser las mismas que en el ejemplo 3. La etapa de transcripcion inversa adicional puede producirse antes de la amplificacion de PCR e incluye incubacion del ARN extrafdo con reactivos RT-PCR en el noveno segmento 190 a 65°C durante 10 minutos.

Ejemplo 5. Aislamiento de ADN bacterial y deteccion de sangre entera

El aislamiento de ADN y deteccion de secuencia de ADN de sangre entera puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y que contiene reactivos pre-empaquetados y una tapa 20 que tiene un deposito de desechos 22 alojado. El sub-segmento 21 del segundo segmento 120 puede contener 50 |il de tampon de dilucion PBS, el tercer segmento 130 puede contener 100 |il de tampon de lisis 230, y el cuarto segmento 140 puede contener 10 |il de perlas magneticas tales como DynabeadsR (Dynal Biotech), conjugado para 104 a 107 copias de una sonda de acido nucleico peptfdico (APN), suspendido en tampon de hibridizacion (100 |il) de SXSSC/0,1 M EDTA). Todos los otros reactivos-pre- empaquetados pueden ser los mismos que se ha descrito en el ejemplo 1.

Para aislamiento y deteccion de acido nucleico bacteriano puede cargarse, en el primer segmento 110, 50 |il de sangre entera. La muestra puede luego procesarse utilizando los reactivos pre-empaquetados con las etapas de procesado de muestras descritas en el ejemplo 1, con la excepcion de una etapa de captura de acido nucleico modificado. Para la etapa de captura de acido nucleico se abre la cuarta abrazadera 340 y el cuarto actuador puede comprimir el cuarto segmento 140 para abrir el sello desprendible y mezclar las perlas magneticas acopladas a PNA suspendidas en tampon de hibridizacion 240 con el lisado en el segmento 130. Los actuadores 322 y 332 con un actuador adyacente 312 o 342 pueden comprimir alternadamente sus respectivos segmentos para agitar e incubar la mezcla durante 15 minutos a temperatura ambiente para facilitar la hibridizacion del ADN a las sondas de PNA acopladas a las perlas magneticas. La muestra puede luego procesarse utilizando los reactivos preempaquetados con las etapas de procesado de muestras descritas en el ejemplo 1.

Ejemplo 6. Aislamiento de ARN viral y deteccion de sangre entera.

El aislamiento de ARN viral y deteccion de secuencia ARN de plasma puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y conteniendo reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20 que tiene un deposito de desechos 22 alojado. Todos los reactivos pre- empaquetados pueden ser identicos a los del ejemplo 5, excepto que el noveno segmento 190 puede contener reactivos RT-PCR secados 290 que pueden incluir10 mmol de cada uno de dATP, dCTP y dGTP, 20 mmol de dUTP, 25 |imol de KCl, 200 nmol de MgCh, 1,5 unidades de Taq ADN polimerasa, 1-5 unidades de Tth ADN polimerasa, y 20-100 pmol de cada uno de los cebadores oligonucleotidos, y 6-25 pmol de sonda Taq-Man. Para aislamiento y deteccion de ARN viral se carga sobre 50|il de sangre entera en el primer segmento 110. La muestra puede luego procesarse utilizando los reactivos preempaquetados con las etapas de procesado de muestras descrito en el ejemplo 1, con la excepcion de una etapa de transcripcion inversa adicional, antes de amplificacion, en donde se incuba el ARN extrafdo con reactivos de RT-PCR en el noveno segmento 190 a 65°C durante 10 minutos.

Ejemplo 7. Aislamiento bacteriologico utilizando enriquecimiento inmunomagnetico de sangre entera

El aislamiento de ADN bacterial y deteccion de secuencia de ADN de sangre entera puede llevarse a cabo en el tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y que contienen reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20, que tiene un deposito de desechos 22 alojado. El segundo segmento 120 puede contener perlas magneticas, tales como Dynabeads, revestidas con un anticuerpo de captura espedfico para epitopo bacteriano. El tercer segmento 130 puede contener 100 |il de tampon PBS 230 utilizado para controlar el pH de la muestra y diluir la concentracion de globulos rojos para asegurar la ligazon eficiente por el anticuerpo de captura. El cuarto segmento 140 puede contener amortiguador de lisis de globulos rojos incluyendo sales secas (1 |imol de KHCO3, 15 |imol de NH4Cl) y 100 |il de 0,1 mM de EDTA, tampon de pH 8,0 alojado en dos subsegmentos separados por sello desprendible. El quinto segmento 150 y sexto segmento 160 puede contener 80 |il de tampon de lavado PBS, respectivamente. Todos los otros reactivos pre-empaquetados son identicos a los del ejemplo 1.

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Para deteccion de bacterias en sangre entera puede cargarse ene el primer segmento 110 mas de 50 |il de sangre entera. Luego se cierra el tubulo mediante una tapa 20 y se inserta en un analizador. El procesado de muestras incluye las etapas siguientes.

1. Captura de celulas diana. Pueden cerrarse sobre el tubulo todas las abrazaderas, exceptuando laa primera abrazadera 310. El primer actuador 312 puede comprender el primer segmento 110 para ajustar el volumen de sangre 210 a alrededor de 50 |il restantes en el segmento, y luego la primera abrazadera 310 puede comprender el tubulo para cerrar el segmento. El tercer actuador 332 puede luego comprimir el tercer segmento 130 para romper el sello desprendible entre el segmento 130 y el segmento 120 para mezclar el tampon PBS con el anticuerpo acoplado a perlas magneticas para reconstituir una solucion de captura. La segunda mordaza 320 puede luego abrirse y el primer actuador 312 puede comprimir el segmento 110 para mover la muestra de sangre al segundo segmento 120 y tercer segmento 130. Los segundos actuadores 322 y tercer actuador 332 pueden luego comprimir alternadamente los segmentos para mezclar la solucion de captura con muestras de sangre mientras que se incuba la mezcla a 4°C durante 15-30 minutos para facilitar la union del anticuerpo a las celulas diana. Luego puede aplicarse un campo magnetico generado por una fuente magnetica 430 sobre el segmento 130 para capturar las perlas en suspension. El actuador 322 y 332 pueden comprimir alternadamente el segmento 120 y 130 para capturar perlas. Despues que se han inmobilizado sustancialmente todas las perlas sobre la pared del segmento 130, los actuadores y abrazaderas del actuador 332 a la abrazadera 310 pueden abrirse y cerrar secuencialmente para mover la muestra no ligada y desecho al deposito de desechos 22.

2. Lisis de celulas de sangre roja. Despues de captura diana, se abre la cuarta abrazadera 340 y el cuarto actuador puede comprimir el cuarto segmento 140 para reconstituir el tampon de lisis de globulos rojos y mover el tampon al segmento 230. El campo magnetico generado por una fuente magnetica 430 puede eliminarse para permitir la resuspension de perlas. El actuador 322 y 332 puede comprimir alternadamente sus segmentos respectivos para agitar e incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente para facilitar la lisis de celulas de sangre rojo restante en la muestra. Luego puede aplicarse el campo magnetico al segmento 130 para capturar las perlas en suspension. Despues que se han inmobilizado sustancialmente todas las perlas sobre la pared del segmento 130, la muestra sin ligar y desecho pueden llevarse al deposito de desechos 22.

3. Lavado. Despues de la etapa de ligazon pueden seguir dos procesos de lavado. Ambos pueden utilizarse tampon de lavado PBS pre-envasado en segmentos 150 y 160. El lavado puede producirse mediante lavado de dilucion de base utilizando el proceso antes descrito.

4. Elucion de acido nucleico. La elucion puede producirse con el procedimiento descrito en el ejemplo 1. La suspension de perlas puede incubarse a 95C bajo condiciones estacionarias, de flujo o agitacion durante 2-5 minutos para lisar las celulas diana capturadas y liberar ADN.

5. Amplificacion y deteccion de acido nucleico. La deteccion de PCR en tiempo real puede ocurrir mediante el mismo proceso que se ha descrito en el ejemplo 1.

Ejemplo 8. Aislamiento de ARN viral utilizando enriquecimiento inmunomagnetico de sangre entera

El aislamiento de ARN viral y deteccion secuencial a partir de sangre entera puede llevarse acabo en un tubo 1, que incluye un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y que contienen reactivos pre-empaquetados y una tapa 20 que tiene un deposito de desechos 22 alojada en esta. Todos los reactivos pre-empaquetados pueden ser identicos a los del ejemplo 5, a excepcion de que el segundo segmento 120 puede contener perlas magneticas secas, tal como Dynabeads recubiertas con un anticuerpo de captura espedfico para un epitopo viral, y el noveno segmento 190 puede contener neactivos de RT-PCR 290 que pueden incluir 10 mmol de MgCh, 1,54 unidades de polimerasa de ADN Taq, 1-5 unidades de polimerasa de ADN Tth, y 20-100 pmol de cada uno de los cebadores oligonucleotidos, y 6-26 pmol de sonda TaqMan. Para aislamiento de ARN viral y deteccion de secuencia, sobre 50 |il de sangre entera puede cargarse en el primer segmento 110. La muestra puede luego procesarse utilizando los reactivos pre-empaquetados con las etapas de procesado de muestras descrito en el ejemplo 7, con la excepcion de una etapa de captura de diana modificada y una etapa de transcripcion inversa adicional. Para la etapa de captura de diana puede llevarse a cabo a temperatura ambiente durante 5 minutos en los segmentos 120 y 130 captura de virion mediante perlas magneticas acopladas a anticuerpo. La etapa transcripcion inversa puede producirse antes de la amplificacion e incluye la incubacion del ARN extrafdo con los reactivos RT-PCR en el noveno segmento 190 a 65°C durante 10 minutos.

Ejemplo 9. Genotipado multiplex de ADN humano con sondas candado y analisis de curva de fusion

El aislamiento de ADN y deteccion de secuencia de ADN de sangre entera puede llevarse a cabo en un tubo 1, que incluye un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y conteniendo reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20, que tiene un deposito de desechos 22 alojado en esta. Todos los reactivos pre- empaquetados pueden ser identicos a los expuestos en el ejemplo 1, con la excepcion del octavo segmento 180 y el noveno segmento 190. El octavo segmento 180 puede incluir dos sub-segmentos separados por sello desprendible; el primer sub-segmento puede contener sondas candado secas y ligasa de ADN T4, y el segundo sub-segmento

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puede contener exonucleasa seca I y exonucleasa III. El noveno segmento 190 puede contener reactivos UNG y PCR secos 290 (que pueden incluir 200 |imol de cada uno de los 3 dNTPs, 100 pmol de cada uno de los oligonucleotidos utilizados mediante PCR, 400 |imol de dUTP, 1 nmol de KCl, 0,1 nmol de MgCh, 5 unidades de polimerasa de Taq ADN y opcionalmente 12,5 pmol de sonda TaqMan o baliza molecular).

Para genotipado, puede cargarse sobre 10 |il de entero en el primer segmento 110. La muestra puede luego procesarse utilizando los reactivos pre-empaquetados con las etapas de procesado de muestras descritas en el ejemplo 1, con la excepcion de la amplificacion de acido nucleico y etapa de deteccion. Despues de completarse la extraccion de acido nucleico en el septimo segmento 170, el actuador 372 puede ajustar el volumen de solucion de acido nucleico en el segmento 170 a aproximadamente 5-15 |il, mientas que el resto de la solucion de acido nucleico se mantiene en el segmento 160, segregado del segmento 170 mediante la abrazadera 370. El actuador 372 puede luego comprimir el segmento 170 para romper el sello desprendible entre el segmento 170 y 180, mientras que mantiene el sello desprendible entre el primer y segundo sub-segmentos del segmento 180. Los acidos nucleicos extrafdos pueden mezclarse con ligasa de DNA T4 y sondas candado en el primer sub-segmento del segmneto 180, y la mezcla puede moverse al segmento 170. La solucion de acido nucleico, sonda candado y ligasa T4 pueden incubarse en el segmento 170 a 37°C durante 15 minutos. La mezcla puede luego moverse al octavo segmento 180 para romper el sello desprendible del segundo sub-segmento del segmento 180 para incubar los acidos nucleicos con Exonucleasa I y Exonucleasa III a 37°C durante 5 minutos para degradar todos los fragmentos de ADN lineal. Despues de incubacion la solucion puede calentarse hasta 95°C en el octavo segmento 180 para inactivar las exonucleasas y ligasa T4. La solucion puede luego transferirse al noveno segmento 190 para mezclarse con reactivos UNG y PCR secos. El UNG degrada cualquier producto PCR contaminante que pueda haber estado presente cuando se introdujo la muestra, y lineariza las sondas candado circularizadas para facilitar la amplificacion de las secuencias reporteras. La amplificacion de PCR puede llevarse a cabo como se ha descrito en el ejemplo 1. Un sensor de deteccion 492 montado sobre el bloque 394 puede controlar la emision de fluorescencia en tiempo real del colorante reportero a traves de una porcion de la pared de tubulo. El analisis de curva de fusion pede llevarse a cabo para identificar los objetivos. Alternativamente la muestra puede transferirse al segmento 198 a traves de la puerta de presion 194 para ulterior deteccion sobre una microdisposicion de acido nucleico u otras tecnicas de deteccion conocidas por el experto en el arte.

Ejemplo 10. Aislamiento de esporas bacterianas vivas y germinacion

El aislamiento de ADN y deteccion de la secuencia de ADN de muestra de esporas de torunda superficiales puede llevarse as cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y conteniendo reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20 que tiene un deposito de desechos 22 alojado en esta y adicionalmente una torunda que sobresale de la abertura de la tapa. El primer segmento 110 del tubulo puede incluir dos sub-segmentos separados por un sello desprendible; el primer sub-segmento puede adaptarse para alojar una muestra de torunda, y el segundo sub-segmento puede contener 80|il de tampon de lavado PBS que tiene un pH apropiado para permitir la ligazon eficiente de las esporas mediante el anticuerpo de captura. El segundo segmento 120 puede contener substrato solido sobre donde puede recubrirse anticuerpos antiesporas; en donde los anticuerpos tienen una alta afinidad para epitopos sobre la espora y baja afinidad para epitopos sobre la celula germinada. El segundo segmento puede pre-empaquetarse adicionalmente con un volumen de gas para facilitar la rotura del sello desprendible entre los segmentos 120 y 110. El tercer segmento 130 puede contener 50 |il de reactivos de germinacion de esporas 230 que pueden incluir medio de infusion Brain Heart (Difco), His 50 mM, Tyr 1 mM, Inosina 2mM, Ala 200 mM y Ser 200 mM. El cuarto segmento 140 puede contener 50 |il de tampon de lisis 240 conteniendo sales caotropicas que incluyen 4,7 M de clorhidrato de guanidinio, 10 mM de urea, 10 mM de Tris HCL, pH 5,7, y 2% de triton X-100. El quinto segmento 150 puede contener 500 |ig de perlas de sflice magneticas 240, tal como perlas MagPrepR (Merck & Co), suspendidas de 80|il de isopropanol. El sexto segmento 160 puede contener 80 |il de tampon de lavado (etanol 250 al 50%, 20 mM de NaCl, 10 mM de tris HCl, pH 7,5).El septimo segmento 170 puede contener 80 |il de tampon MES 20 mM, pH 5,3. El octavo segmento 180 puede contener 80 |il de tampon de elucion 280 (10 mM de Tris HCl, pH 8,5) . El noveno elemento 190 puede contener reactivos de UNG seco y PCR secado 290 (que puede incluir 10 nmol de cada uno de dATP, dCTP, y dGTP, y dGTP; 20 nmol de dUTP, 2,5 |imol de KCl, 200 nmol de MgCh, 1,5 unidades de polimerasa de ADN Taq y 20-100 pmol de cada uno de los cebadores oligonucleotidos, y 6-25 pmol de sonda TaqMan.

Para deteccion esporas vivas, la torunda integrada en la capa 20 puede utilizarse para recoger una muestra. Despues de la recogida la tapa puede hacerse coincidir con el tubulo, introduciendo la muestra de torunda en el primer segmento 110. El tubulo puede luego insertarse en un analizador. El procesado de muestras puede incluir los pasos siguientes.

1. Germinacion de esporas Todas las abrazaderas, excepto la primera abrazadera 310 pueden cerrarse sobre el tubulo. El primer actuador 312 se comprime sobre el primer segmento 110 para romper el sello desprendible entre el primer y segundo sub-siguiente del segmento 110 para liberar el tampon de lavado PBS. El primer actuador 310 puede luego comprimir y descomprimir alternadamente el segmento 110 para lavar esporas de la cabeza de torunda utilizando el tampon pBs. Despues de suspension de las esporas en PBS, el actuador 322 puede comprimir el segmento 120 para reventar el sello desprendible entre los segmentos 110 y 120 y permitir que la suspension de

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esporas se mueva al segmento 120. La abrazadera 320 puede cerrarse y el actuador 322 puede comprimir alternadamente el segmento 120 para facilitar la ligazon de la espora al anticuerpo. Despues de incubacion el desecho Kquido puede llevarse al deposito de desechos. Luego el actuador 332 puede comprimir el segmento 130 para reventar el sello desprendible entre los segmentos 120 y 130 para permitir que se incube la solucion de germinacion con las esporas capturadas a 37°C durante 13 minutos con agitacion en el segmento 120. Las celulas germinadas no se ligaran mediante el anticuerpo de esporas espedfico y se suspenderan en la solucion.

2. Captura de acido nucleico. Despues de germinacion puede abrirse la cuarta abrazadera 340 y comprimir el cuarto actuador 342 el cuarto segmento 140 para abrir el sello desprendible y mezclar el tampon de lisis con las celulas germinadas. Luego la quinta abrazadera 350 puede abrirse y el quinto actuador 352 comprimir el segmento 150 para mover las perlas de sflice magneticas suspendidas en isopropanol 240 al segmento 130 para mezclarse con el lisado. Los actuadores 332 y 342 pueden comprimir alternativamente sus respectivos segmentos para agitar e incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente para facilitar la ligazon de ADN a las perlas de sflice magneticas. Luego el campo magnetico generado por una fuente magnetica 430 puede aplicarse sobre el segmento 130 para capturar las perlas en suspension. El actuador 332 y 342 pueden comprimir alternadamente el segmento 130 y 140 para capturar perlas. Despues que sustancialmente todas las perlas se inmovilizan sobre la pared del segmento 130, la muestra desligada y desecho pueden moverse al deposito de desechos 22.

3. Lavado. El tampon de lavado de etanol en el segmento 160 y el tampon MES en el segmento 170 puede utilizarse para lavar las perlas inmobilizadas. En los segmentos 120 y 130 puede llevarse a cabo un lavado a base de dilucion mediante los actuadores 322 y 332 como se describe en el ejemplo 1. Alternativamente puede llevarse a cabo en los segmentos 120, 130 y 140 un lavado basado en flujo de capa delgada mediante los actuadores 322, 332 y 342 como se describe en el ejemplo 1.

4. Elucion de acido nucleico. El tampon de elucion 270 puede moverse del segmento 180 a 130 para elucion de ADN como se describe en el ejemplo 1.

5. Amplificacion y deteccion de acido nucleico. La solucion de acido nucleico puede luego transferirse al segmento 190 y mezclarse con reactivos UNG y PCR secos. La incubacion de la mezcla reaccional a 37°C durante 5 minutos permite que UNG degrade cualquier producto de PCR contaminante Despues la incubacion de la mezcla reaccional puede transferirse al segmento 180 para desnaturalizacion a 95°C durante 2 minutos. La solucion de acido nucleico puede luego transferirse al segmento 190 para incubacion a 60°C para iniciar PCR de arranque en caliente. Un ensayo de amplificacion tfpico de 2-temperatura de 50 ciclos de 95°C durante 2 segundos y 60°C durante 15 segundos puede conducirse fijando el segmento 180 a 95°C y el segmento 190 a 60°C, y transfiriendo la mezcla reaccional entre los segmentos alternadamente cerrando y abriendo el actuador 382 y 392. Un ensayo de amplificacion tfpico de 3-temperatura de 50 ciclos de 95° C durante 2 segundos, 60°C durante 10 segundos, y 72°C durante 10 segundos puede llevarse a cabo fijando el segmento 170 a 95°C, el segmento 180 a 72°C y el segmento 190 a 60°C, y transfiriendo alternadamente la mezcla reaccional entre los segmentos cerrando y abriendo los actuadores 372 y 392. Un sensor de deteccion 492, tal como un fotometro puede montarse sobre el bloque 394 para controlar la emision de fluorescencia en tiempo real procedente del colorante reportero a traves de la pared del tubulo. Despues de completado un ensayo los resultados de prueba pueden ser reportados y la muestra puede ser transferida al segmento 198 a traves de la puerta de presion 194 comprimiendo el segmento 190 para procesado siguiente.

Ejemplo 11. Genotipado multiplex de ADN humano de muestra de tejido solida.

En una onceava modalidad el aislamiento de ADN y deteccion de secuencia de ADN de muestra de tejido solida puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y conteniendo reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20, que tiene un deposito de desechos 22 alojado en esta. El primer segmento 1210 del tubulo puede adaptarse para recibir una muestra de tejido solida y tiene paredes resistentes con superficies internas a modo de microdientes para facilitar la molturacion del tejido. El segundo segmento 120 puede contener 250 |ig de proteinasa seca K 222. El tercer segmento 130 puede contener 100 |il de tampon de lisis 230 conteniendo sales caotropicas que incluyen 4,7 M de clorhidrato de guanidinio, 10 mM de urea, 10 mM de HCl Tris, pH 5,7, y 2% de triton X-100. Los segmentos cuarto 140, quinto 150, sexto 160 y septimo 170 pueden contener los mismos reactivos que en el ejemplo 1. El octavo segmento 180 puede incluir dos sub-segmentos separados por un sello desprendible, el primer sub-segmento puede contener sondas candado y ligasa de ADN T4 280, y el segundo sub-segmento puede contener exonucleasa seca I y exonucleasa III. El noveno segmento 190 puede contener reactivos UNG y PCR secos 290 (que pueden incluir 200 |imol de cada uno de los 3 dNTPs, 100 pmol de cada uno de los oligonucleotidos utitlizados mediante PCR, 400 |imol de dUTP, 1nmol de KCl, 0,1 nmol de MgCh, 5 unidades de polimerasa de ADN Taq y opcionalmente 12,5 pmol de sonda TaqMan).

Para un ensayo de deteccion de mutacion puede cargarse en el primer segmento de 1 mg a 50 mg de muestra de tejido solida. Luego puede cerrarse el tubulo mediante una tapa 20 e insertarse en un analizador. A continuacion pueden cerrarse todas las abrazaderas sobre el tubulo. La abrazadera 330 puede abrirse y el tercer actuador 332 comprimir el tercer segmento 130 para romper el sello desprendible entre el segmento 120 y 130 para mezclar el tampon de lisis 230 con proteinasa K. La segunda abrazadera 320 puede abrirse luego y el segundo actuador

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puede comprimir el segundo segmento para abrir el sello desprendible e introducir solucion de lisis en la muestra de tejido solida en el segmento 110. La segunda abrazadera 320 puede cerrarse y el primer actuador 312 puede comprimir y descomprimir el segmento 110, facilitando la homogeneizacion de la muestra de tejido solida con los microdientes sobre la superficie de la pared del tubulo. El elemento termico que contacta el segmento 110 puede fijarse a 50-68°C para aumentar la eficacia de digestion de proteinasa. Despues que la muestra de tejido se ha homogeneizado suficientemente puede moverse el homogeneizado al segmento 120 y las perlas de sflice magneticas suspendidas en isopropanol del segmento 140 puede moverse al segmento 130. Los actuadores 3223 y 332 pueden comprimir alternadamente sus segmentos respectivos para mezclar el homogeneizado con laz suspension de perlas para facilitar la ligazon del ADN a las perlas de sflice magneticas. Luego el campo magnetico generado por una fuente magnetica 430 puede aplicarse al segmento 130 para capturar las perlas en suspension. Los actuadores 322 y 332 pueden comprimir alternadamente los segmentos 120 y 130 para capturar perlas en el campo magnetico. Como alternativa, el actuador 332 puede comprimir el segmento 130 para formar un canal de flujo y dos actuadores flanqueantes 322 y 342 pueden comprimir los segmentos respectivos alternadamente para aumentar la eficiencia de captura. Despues que se han inmobilizado sustancialmente todas las perlas sobre la pared del segmento 130, los actuadores y abrazaderas del actuador 342 a la abrazadera 310 pueden abrirse y cerrarse secuencialmente para mover la muestra no ligada y desecharla al deposito de desechos 22. Las etapas de lavado subsiguiente y elucion de acido nucleico pueden producirse con el procedimiento descrito en el ejemplo 1. La amplificacion y deteccion de acido nucleico puede producirse mediante el proceso de ensayo de sonda candado como se describe en el ejemplo 9.

Ejemplo 12. Separacion de plasma y deteccion de virus de sangre entera

En una quinta modalidad el aislamiento de ARN y deteccion de secuencia de sangre entera puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene nueve segmentos separados por sellos desprendibles y conteniendo reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20 que tiene un deposito de desechos 22 alojado en esta. El primer segmento 110 del tubulo puede incluir dos sub-segmentos separados por un sello desprendible; el primer sub-segmento puede adaptarse para recibir una muestra de sangre entera, y el segundo sub-segmento puede contener un coagulante, tal como trombina, o un anticuerpo de globulos rojos multivalente. El primer segmento puede contener ademas en su base en el segundo sub-segmento una o una pluralidad de bolsas de filtro embebidos de tamano de poro preferentemente entre 1 |im y 10 |im. El tamano de poro del filtro puede ser de modo que no puedan pasar sustancialmente globulos rojos y solo pueda pasar plasma. El segundo segmento 120 puede contener 80 |il de tampon de dilucion PBS. El tercer segmento 130 puede contener 250 |ig de proteinasa seca K y 60 |il de tampon de lisis (4,7 M de clorhidrato de guanidinio, 10 mM de urea, 10 mM de HCl Tris, pH 5,7 y 2% de triton X-100) alojado en dos sub-segmentos separados por un sello desprendible. Los segmentos cuarto 140, quinto 150, sexto 160, septimo 170 y octavo 180 pueden contener los mismos reactivos que en el ejemplo 1. El noveno segmento 190 puede contener reactivos de RT-PCR 290 que pueden incluir 10 nmol de cada uno de: dATP, dCTP y dGTP; 20 nmol de dUTP, 25 |imol de KCl, 200 nmol de MgCh, 1,5 unidades de polimerasa de Taq ADN polimerasa, 1,5 unidades de Tth ADN polimerasa y 20-100 pmol de cada uno de los oligonucleotidos cebador y 6-25 pmol de sonda TaqMan.

Para separacion de plasma dentro del tubulo puede cargarse en el primer segmento 110 aproximadamente 300 |il de sangre entera. Todas las abrazaderas pueden cerrarse y el actuador 312 puede comprimir el segmento 110 para que estalle el sello desprendible entre los sub-segmentos y permitir la mezcla de la muestra de sangre con anticuerpo de anti-globulos rojos multi-valente o coagulante. El actuador 312 puede comprimir y descomprimir alternadamente el segmento 110 para facilitar la union de anticuerpo a globulos rojos y la formacion de agregados de celulas. El actuador 322 puede comprimir el segmento 120 para que estalle el sello desprendible entre el segmento 120 y 110 y mover el tampon de dilucion al segmento 110 para la mezcla con muestra de sangre. Despues de agregarse una cantidad suficiente de globulos rojos el actuador 312 puede comprimir suavemente el segmento 110 para conducir la muestra de sangre a traves del filtro embebido, mientras que el actuador 322 puede descomprimir lentamente el segmento 120 para crear succion desde el otro lateral del filtro. Despues de la separacion de plasma la abrazadera 320 puede cerrarse y el actuador 332 puede comprimir el segmento 130 para reconstituir proteinasa seca K en el tampon de lisis. La abrazadera 330 puede luego abrirse y el actuador 322 puede comprimir el segmento 120 para mezclar la muestra de plasma con el tampon de lisis e incubar la mezcla a 50°C durante 5 minutos en el segmento 130. Para virus de ADN, la captura de acido nucleico subsiguiente, lavado, elucion, y etapas de amplificacion y deteccion, puede ser igual que lo descrito en el ejemplo 1. Puede adicionarse una etapa de transcripcion inversa antes de la amplificacion, en donde el ARN extrafdo se incuba con reactivos de RT-PCR en el noveno segmento 190 a 65°C durante 10 minutos.

Ejemplo 13. Aislamiento de ADN genomico y deteccion de sangre entera recogida sobre matrices a base de algodon

En una treceava modalidad, el aislamiento de ADN y deteccion de secuencia de ADN puede llevarse a cabo en un tubo 1, incluyendo un tubulo flexible 10 que tiene cuatro segmentos separados por sellos desprendibles y que contienen reactivos pre-empaquetados, y una tapa 20, que puede tener un deposito de desechos 22 alojado en esta. El primer segmento 110 del tubulo puede recibir la muestra de sangre total recogida sobre matrices a base de

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algodon, tal como Whatman BPC 180 y papel FTAR, papel Scheicher y Schuell 903R e IsoCodeR. El segundo segmento 120 puede contener tampon de lavado incluyendo 40 |il de agua destilada 220. El tercer segmento 130 puede contener 80 |il de tampon de elucion(10 mM Tris HCl, pH 8,5) o agua destilada 230. El cuarto segmento 140 puede contener UNG seco y reactivos de PCR secos 240 (que pueden contener 10 mmol de cada uno de 3 dNTPs: dATP, dCTP y dGTP; 20 nmol de DUTP, 2,5 |imol de KCl, 200 nmol de MgCh, 1,5 unidades de polimerasa de ADN Taq y 20-100 pmol de cada uno de los cebadores oligonucleotidos, y 6-25 pmol de sonda TaqMan). El extremo del segmento 140 puede sellarse de forma permanente.

Para genotipacion puede absorberse sangre entera, tal como la recogida mediante puncion digital u otros medios sobre matrices a base de algodon 30 unidas a la tapa de tubulo de muestras 20 a traves del conectador 36. El tubo puede luego cerrarse mediante una etapa 20 e insertarse en un analizador.

El procesado de muestras incluye las etapas siguientes.

1. Lisis de muestras. Todas las abrazaderas, a excepcion de la primera abrazadera 310 pueden cerrarse sobre el tubulo. El primer actuador 312 puede comprender el primer segmento 110 para ajustar la distancia del actuador 312 a las matrices a base de algodon 30 en el segmento, y luego la primera abrazadera 310 puede comprender el tubulo para cerrar el segmento. El primer segmento puede incubarse a 95°C durante 5 minutos para secar la muestra de sangre. Luego la temperatura del segmento puede dejarse enfriar hasta temperatura ambiente. El proceso de secado puede lisar celulas de sangre entera y realzar el ligado de protemas de plasma e inhibidores de PCR a las matrices de algodon. La temperatura de incubacion puede mantenerse mediante contacto entre el tubulo y los elementos termicos incorporados dentro de los actuadores y/o bloques opuestos a los actuadores.

2. Lavado. Puede seguir un proceso de lavado al proceso de calentamiento con el fin de eliminar residuos lavables e inhibidores de PCR de las matrices y los segmentos que se utilizanan para ulterior proceso de muestreo. En esta modalidad puede utilizarse un lavado a base de dilucion o un lavado a base de flujo de capa fina. Para lavado a base de dilucion las abrazaderas 320 pueden abrirse primero y luego puede cerrarse el actuador 322 para mover el tampon de lavado 220 al segmento 210 seguido del cierre de la abrazadera 320. El primer actuador 312 puede agitar las matrices a base de algodon a traves de una accion repetida de compresion y relajamiento para liberar componentes de protema de plasma sin ligar e inhibidor PCR durante 3 minutos a temperatura ambiente. Despues de completado el lavado puede eliminarse el tampon de lavado del segmento 110 para pasar al deposito de desechos 22 alojado en la tapa 20. El actuador 312, abrazaderas 310 y 320 pueden liberarse suavemente para formar un canal de flujo de capa delgada a traves del segmento 110. El actuador 322 puede ejercer suave compresion sobre el segmento 120 para generar cierta presion interna para asegurar un huelgo sustancialmente uniforme del canal de flujo de capa delgada. El actuador 322 puede luego comprimir el tubulo para generar flujo esencialmente laminar del tampon de lavado a traves del canal de flujo. Cuando se completa el lavado los actuadores y abrazaderas pueden ejercer compresion sobre los segmentos y sustancialmente todo el desecho puede moverse para entrar en el deposito de desechos 22.

3. Elucion de acido nucleico. El tampon de elucion 230 puede luego moverse del segmento 130 al 110 utilizando un proceso similar al mencionado antes. La matriz a base de algodon puede incubarse a 95°C bajo condiciones estacionarias, de flujo o agitacion durante 2 minutos. El elrndo puede luego moverse al segmento 130. El actuador 332 puede comprimir el segmento 130 para ajustar el volumen de la solucion de acido nucleico elrnda hasta 50 |il y luego puede cerrarse la abrazadera 330 contra el tubulo para completar el proceso de extraccion de ADN.

4. Amplificacion y deteccion de acido nucleico. La solucion de acido nucleico puede luego transferirse al segmento 140, mezclarse, e incubarse con reactivo UNG y PCR 240 a 37°C durante 5 minutos para degradar cualquier producto de PCR contaminante que pueda haber estado presente cuando se introdujo la muestra. Despues de incubacion la temperatura puede aumentarse hasta 95°C para desnaturalizar el ADN durante 2 minutos seguido de reaccion de PCR. Un ensayo de amplificacion de 2-temperatura tfpico de 50 ciclos a 95°C durante 2 segundos y 60°C durante 9-15 segundos puede llevarse a cabo disponiendo el segmento 180 a 95°C y el segmento 190 a 60°C, y transfiriendo la mezcla reaccional entre los segmentos alternadamente cerrando y abriendo el actuador 332 y 342. Un ensayo de amplificacion de 3-temperatura tfpico de 50 ciclos de 95°C durante 2 segundos, 60°C durante 8-10 segundos y 72°C durante 8-12 segundos puede conducirse disponiendo el segmento 120 a 95°C, el segmento 130 a 72°C y el segmento 140 a 60°C, y transfiriendo alternadamente la mezcla reaccional entre los segmentos mediante cierre y abertura de los actuadores 322, 332 y 342. Un sensor de deteccion, tal como un fotometro 492 puede montarse sobre el bloque 344 para controlar la emision de fluorescencia en tiempo real del colorante reportero a traves de la pared de tubulo.

Claims (14)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un tubulo (10) para el procesado de muestras, que comprende:

   un extremo proximal que tiene una Abertura (12) a traves de la cual se puede introducir una muestra; un extremo distal, y por lo menos un primer segmento que contiene un substrato, un segundo segmento distal al primer segmento y que contiene tampon de lavado, y

   un tercer segmento distal al segundo segmento y que contiene por lo menos uno de un reactivo de amplificacion, un reactivo de elucion y un reactivo de deteccion, cada uno de los cuales esta:

   - definido por el tubulo (10);

   - aislado respecto de fluidos, por lo menos en parte mediante un sello rompible (14), de modo que la rotura del sello rompible (14) deja una superficie del tubulo interna que esta sustancialmente exenta de obstrucciones al flujo de fluido,

   - expandible asf para recibir un volumen de fluido expulsado de otro segmento; y

   - apto para ser comprimible de modo a no contener sustancialmente fluido cuando asf se comprime.
2. 2. El tubulo de la reivindicacion 1, en donde por lo menos una porcion del tubulo es transparente.
3. 3. El tubulo de la reivindicacion 1, que comprende ademas un substrato en donde el substrato comprende una almohadilla formada por lo menos en parte a partir de un material absorbente que comprende por lo menos papel, film, filtro, espuma, malla y matriz fibrosa.
4. 4. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas por lo menos un tampon de dilucion, tampon de suspension, substrato, reactivo de lisis, reactivo de neutralizacion, reactivo de elucion y reactivo de germinacion.
5. 5. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde por lo menos un reactivo comprende un tampon de elucion que incluye por lo menos un tampon Tris, agua y tampon apropiado para reaccion en cadena por polimerasa.
6. 6. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde por lo menos un reactivo comprende un reactivo de lisis que incluye por lo menos uno de una sal guanidinio, una sal caotropica, un reactivo de lisis de eritrocitos, un detergente, un quelante, un reactivo de germinacion de esporas, hidroxido sodico, proteinasa K, inhibidor de DNase, RNase, inhibidor de RNase, anticoagulante, coagulante, una aproteasa, una solucion germinante y un tensioactivo.
7. 7. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde por lo menos un reactivo comprende un reactivo de germinacion incluyendo medio de fusion corazon-cerebro y por lo menos uno de L-alanina, inosina, L- fenilalanina, L-serina y L-prolina.
8. 8. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde por lo menos un sello rompible es un sello desprendible.
9. 9. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde cada sello rompible es un sello desprendible.
10. 10. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los segmentos forman una disposicion sustancialmente lineal.
11. 11. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los segmentos forman una disposicion contigua.
12. 12. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas una tapa para cerrar la abertura (12).
13. 13. El tubulo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende ademas un armazon al que se monta el tubulo.
14. 14. El tubulo de la reivindicacion 13, en donde el armazon comprende una interfase, recibiendo la interfase una abertura del tubulo.