KR102041333B1 - 세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산의 추출 방법 - Google Patents

세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산의 추출 방법 Download PDF

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Abstract

세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산의 추출 방법이 제공된다. 핵산의 추출 방법은 (a) 세포벽이 용해된 세포 용해물을 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 용해물에서 핵산을 분리 및 수집하는 단계를 포함한다.

Description

세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산의 추출 방법{CELL LYSIS COMPOSITION AND METHOD OF EXTRACTING NUCLEIC ACID USING THE SAME}
본 발명은 세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산의 추출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 구강 유래 세포 용해 조성물 및 구강 유래 세포의 핵산 추출 방법에 관한 것이다.
핵산 단편은 세균, 곰팡이, 바이러스 또는 세포 등으로부터 추출될 수 있다. 추출된 핵산 단편은 그 단편이 속하는 전체 단백질이나 펩타이드의 유전자 구성을 파악하거나, 다른 연구 분석에 사용되는 등 다방면의 생명공학 산업에 응용될 수 있다.
일반적으로 핵산은 소듐 도데실 설페이트 등의 계면활성제 및 아세트산칼륨 등의 염 수용액의 존재 하에서 세포벽을 용해한 뒤 클로로포름 등으로 추출되어 단백질 기타 세포 내 물질로부터 분리 및 정제될 수 있다.
한편, 구강(oral cavity)은 입술부터 목구멍의 인두 시작 부위까지 연결되는 신체 기관을 의미한다. 구강은 소화관의 입구로서 음식물을 섭취하는 기능, 소리를 내는 구음 기능 및 음식의 맛을 느끼는 미각 기능을 담당하는 매우 중요한 기관이다. 구강은 세균, 곰팡이, 바이러스, 원생동물 등이 서식하기 좋은 조건을 갖추고 있다. 구강 내는 적절한 온도와 습도를 유지하고, 치은열구액, 상피세포 파편, 타액 성분 및 음식물의 잔사 등이 존재하여 구강 내 세균 증식을 용이하게 한다. 이러한 구강 내 서식하는 세균을 통칭하여 구강 세균(oral bacteria)이라고 한다. 대표적인 구강 세균의 예로는 아그레가티박터 악티노마이세템코미탄스(Aggregatibacter actinomycetemcomitans), 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 터너렐라 포시티아(Tannerella forsythia), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 프레보텔라 인터미디아(Prevotella intermedia), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 파비모나스 미크라(Parvimonas micra), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 프레보텔라 니그레센스(Prevotella nigrescens), 유박테리움 노다툼(Eubacterium nodatum), 익케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis), 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 스트렙토코커스 소브리누스(Streptococcus sobrinus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스테필로코쿠스 우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 페카리스(Enterococcus faecalis), 악티노마이세스 비스코서스(Actinomyces viscosus) 등을 들 수 있다.
구강 내에 상주하는 구강 세균은 다양한 구강 질환(oral diseases)를 유발하는 것으로 알려져 있다. 구강 질환(oral diseases)은 구강 내 점막, 입술, 치아, 잇몸, 혀, 턱, 침샘, 턱관절, 얼굴근육 및 입 주변 피부 등의 신체 기관에 발생하는 질환의 총칭이다. 구강 세균이 유발하는 구강 질환으로는 흔히 충치라 불리우는 치아 우식증(dental caries), 치은염(gingivitis) 및 치주염(periodontitis) 등과 같은 치주 질환(periodontal disease), 아프타성 구내 궤양(aphthous canker sore), 헤르페스성 구내염(herpes cold sore), 편평태선(leukoplakia), 베체트 증후군(Behcet's syndrome), 구순포진, 대상포진, 수족구병, 구강 칸디다증(oral candidiasis), 균상설(fissured tongue), 설모증, 지도형설, 방사선 점막염 등의 구내염(stomatitis), 천포창(pemphigus), 유사천포창(bullous pemphigoid), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)과 같은 자가면역 질환, 나아가 구강암(oral cancer) 등을 예시할 수 있다.
최근 유럽 치주 학회와 미국 치주 학회는 구강 내 병원성 세균이 혈류를 타고 몸속의 주요 장기에 침투하여 새로운 감염을 일으키고 증상을 악화시킨다고 발표한 바 있다. 미국 치근막학회 등의 보고에 따르면 구강 내 병원성 세균이 있을 경우 심혈관계 질환 발생률이 2.2배 증가하고, 심장 질환 발생률이 2.7배 발생할 수 있다. 이러한 구강 세균이 일으키는 감염에 대한 인식이 증가함에 따라 미국 치주 학회에서는 한명에게 구강 세균이 발견될 경우 가족 구성원 전체에 대해 구강 세균 검사를 받도록 권고하고 있는 실정이다.
정확하고 재현성 있는 분자 진단(molecular diagnostics)을 위해서는 검체, 예컨대 구강 내 점막 및/또는 구강 세균 등의 안전한 수송 및 보존이 매우 중요하다. 그러나 검체의 안정적인 수송 및 보존에 관한 연구 개발은 미비한 실정이다.
이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 종래 세포 용해 방법에 비하여 효율적인 방법으로 세포 벽을 용해시킬 수 있는 세포 용해 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 종래 핵산 추출 방법에 비하여 효율적인 방법으로 핵산을 추출할 수 있는 핵산의 추출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법은 (a) 세포벽이 용해된 세포 용해물을 준비하는 단계; 및 (b) 상기 세포 용해물에서 핵산을 분리 및 수집하는 단계를 포함한다.
상기 세포 용해물은 피검자로부터 채취된 세포 수집물 및 세포 용해 조성물을 포함할 수 있다.
상기 세포 용해 조성물은, 구아니딘염산(guanidine-HCL) 또는 구아니딘티오시아네이트(guanidine-SCN), 아세트산나트륨, 에틸렌다이아민테트라아세트산, 비이온성 계면활성제, 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다.
또, 상기 세포 용해물은 염화세틸피리디늄, 살리실산메틸 및 글리세린 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 세포 용해물을 준비하는 단계는, 채취된 세포 수집물 및 상기 세포 용해 조성물이 혼합된 상기 세포 용해물이 수용되어 밀폐된 검체 용기를 준비하는 단계, 및 상기 검체 용기를 개방하여 상기 세포 용해물을 공기 중에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 검체 용기는 절개된 시트 부분을 포함하고, 상기 세포 용해물은 상기 절개된 시트 부분과 맞닿을 수 있다.
상기 세포 용해물에서 핵산을 분리 및 수집하는 단계는, 컬럼에 상기 세포 용해물을 로딩하는 단계, 상기 컬럼을 세척하는 단계, 및 상기 세척된 컬럼으로부터 핵산을 용리하는 단계를 포함할 수 있다.
또, 상기 컬럼에 로딩하는 단계에서 컬럼에 부착되는 세포 용해물은, 상기 검체 용기에 수용되어 있던 세포 용해물을 그대로 사용될 수 있다.
또한, 상기 용리하는 단계에서 사용되는 용리 조성물은, Tris-HCL 완충액, TE 완충액, 아쿠아 비데스트(aqua bidest) 및 PCR 완충액 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 다른 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 용해 조성물은 구아니딘염산(guanidine-HCL); 아지드화나트륨(sodium azide); 및 비이온성 계면활성제를 포함한다.
상기 세포 용해 조성물은 아세트산나트륨 및 에틸렌다이아민테트라아세트산을 더 포함할 수 있다.
상기 세포 용해 조성물은, 상기 구아니딘염산 4.0M 내지 6.0M, 상기 아세트산나트륨 0.2M 내지 0.5M, 상기 에틸렌다이아민테트라아세트산 3mM 내지 6mM, 상기 아지드화나트륨 0.05 중량% 내지 0.3 중량%, 및 비이온성 계면활성제 0.3 중량% 내지 0.5 중량%을 포함할 수 있다.
기타 실시예의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2는 도 1의 세포 용해물을 준비하는 단계에서 사용되는 검체 용기의 단면사시도이다.
도 3은 실험예 1에 따른 결과를 나타낸 이미지이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, '및/또는'은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 또, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 '포함한다(comprises)' 및/또는 '포함하는(comprising)'은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
또, '내지'를 사용하여 나타낸 수치 범위는 그 앞과 뒤에 기재된 값을 각각 하한과 상한으로서 포함하는 수치 범위를 의미한다. '약' 또는 '대략'은 그 뒤에 기재된 값 또는 수치 범위의 20% 이내의 값 또는 수치 범위를 의미한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 기술적 용어 및 과학적 용어를 포함하는 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.
본 명세서에서, '플라스미드'는 인위적으로 조합되어 복제될 수 있는 유전자를 가진 원형 유전자를 의미한다. 또, '용해' 내지는 '세포 용해'는 세포벽을 파괴하여 세포질 용액의 유출을 유도하는 것을 의미한다.
세포 용해 조성물은 검체 내 단백질의 핵산(DNA 및/또는 RNA) 추출에 사용되는 세포 용해액 내지는 세포 용해 버퍼일 수 있다. 예를 들어, 피검자로부터 채취된 검체(타액 등)의 전처리액일 수 있다. 본 실시예에 따른 핵산 추출 방법에서 상기 핵산은 DNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다.
세포 용해 조성물은 구아니딘염산(guanidine-HCL), 아세트산나트륨(sodium acetate), 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 및 비이온성 계면활성제를 포함하고, 아지드화나트륨(sodium azide)을 더 포함할 수 있다.
예시적인 실시예에서, 세포 용해 조성물은 구아니딘염산 약 4.0M 내지 6.0M, 아세트산나트륨 약 0.2M 내지 0.5M, 에틸렌다이아민테트라아세트산 약 3mM 내지 6mM을 포함할 수 있다. 또, 세포 용해 조성물은 전체 중량에 대하여 약 0.3 중량% 내지 0.5 중량%의 비이온성 계면활성제 및 0.05 중량% 내지 0.3 중량%의 아지드화나트륨을 포함할 수 있다.
상기 구아니딘염산은 세포벽 용해 물질로서, 단백질을 변성시킬 수 있다. 예를 들어, 구아니딘염산은 카오트로픽 염의 기능을 수행할 수 있다. 또, 아세트산나트륨은 세포벽 용해 물질로서 기능할 수 있다. 세포벽 용해 기능을 갖는 물질로 구아니딘티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 염화리튬(lithium chloride) 등이 알려져 있으나, 본 발명의 발명자들은 구아니딘염산과 아세트산나트륨의 병용 사용을 통해 구강 점막 및/또는 구강 내 세균 등의 외부 단백질층을 효과적으로 용해하고, 보존 안정성을 개선할 수 있음을 발견하였다.
본 실시예에 따른 세포 용해 조성물의 구아니딘염산의 농도는 약 4.0M 내지 6.0M, 또는 약 4.5M 내지 5.5M일 수 있다. 특히 구아니딘염산의 농도가 4.5M 내지 5.5M 범위 내이면 고순도의 핵산 추출이 가능하다. 또, 구아니딘염산의 농도가 아세트산나트륨 농도의 약 8배 내지 30배 범위에 있게 함으로써, 검체가 세포 용해 조성물에 혼합되어 세포벽이 용해된 후 장시간, 예컨대 30일 이상 상온에서 보관되는 경우에도 침전물이 발생하는 것을 방지할 수 있다.
에틸렌다이아민테트라아세트산은 세포 벽 용해 후에 유출되는 핵산 분해 효소 또는 단백질 분해 효소의 불활성화에 기여할 수 있다. 즉, 에틸렌다이아민테트라아세트산은 세포벽이 용해된 후 발생한 잔해(debris) 이온, 예컨대 2가 이온 등을 안정화시켜 검체와 세포 용해 조성물의 혼합물(세포 용해물)의 안정화에 기여할 수 있다. 본 실시예에 따른 에틸렌다이아민테트라아세트산의 농도는 약 3mM 내지 6mM, 또는 약 3mM 내지 5.5mM일 수 있다.
비이온성 계면활성제는 구아니딘염산 및/또는 아세트산나트륨과 함께 세포벽의 분해를 보조할 수 있다. 또, 세포 용해 조성물의 보존 안정성을 향상시킬 수 있다. 후술할 바와 같이, 본 실시예에 따른 세포 용해 조성물은 세포벽의 용해 및 용해된 세포 용해물의 보존 버퍼로 이용될 수 있다. 세포벽의 용해 단계에서부터 비이온성 계면활성제의 존재 하에서 보존되게 구성함으로써 뉴클라제에 의한 핵산 손상을 최소화할 수 있다.
비이온성 계면활성제는 폴리에틸렌글리콜계 비이온성 계면활성제 및 다가알코올계 비이온성 계면활성제 등을 포함할 수 있다. 비이온성 계면활성제의 예로는 Triton X-100, 트윈 20, 트윈 40, 트윈 60, 트윈 65, 트윈 80 등을 들 수 있다.
예를 들어 본 실시예에 따른 비이온성 계면활성제로는 트윈 20이 사용될 수 있다. 또, 트윈 20의 농도는 세포 용해 조성물 전체 중량에 대하여 약 0.3 중량% 내지 0.5 중량%일 수 있다. 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나, 비이온성 계면활성제의 함량 범위가 상기와 같을 때 PCR 반응을 촉진할 수 있다.
아지드화나트륨은 세포 용해 조성물의 보존 안정성, 특히 검체 단백질의 세포벽이 용해한 후 세포 용해물의 보존 안정성의 작용에 기여할 수 있다. 또, 아지드화나트륨은 세포 용해물 내 세포벽 잔해 이온의 존재에도 불구하고 장시간 동안 DNA 등이 변성되는 것을 방지할 수 있다.
본 실시예에 따른 세포 용해 조성물의 아지드화나트륨의 농도는 약 0.05 중량% 내지 0.3 중량% 또는 약 0.1 중량% 내지 0.25 중량%일 수 있다. 아지드화나트륨의 농도가 0.05 중량% 미만이면 세포 용해물이 장시간, 예컨대 30일 이상의 보존 안정성 효과가 미비할 수 있다. 또, 아지드화나트륨의 농도가 0.3 중량% 초과이면 세포벽 용해 기능이 저하될 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 세포 용해 조성물 및 이를 이용한 핵산의 추출 방법에 대하여 더욱 상세하게 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 핵산의 추출 방법을 나타낸 순서도이다.
본 실시예에 따른 핵산의 추출 방법은 세포벽이 용해된 세포 용해물을 준비하는 단계(S110) 및 세포 용해물에서 핵산을 분리 및 수집하는 단계(S120)를 포함할 수 있다.
세포벽이 용해된 세포 용해물을 준비하는 단계(S110)는 세포 용해 조성물에 의해 세포벽이 파괴된 세포를 포함하는 세포 수집물(예컨대, 검체)을 제공받는 단계일 수 있다. 예시적인 실시예에서, 세포 용해물을 준비하는 단계(S110)는 세포 수집물 및 세포 용해 조성물이 혼합된 세포 용해물이 수용되어 밀폐된 검체 용기를 준비하는 단계(S111) 및 검체 용기를 개방하여 세포 용해물을 공기 중에 노출시키는 단계(S112)를 포함할 수 있다.
세포 수집물은 피검자의 타액 등을 포함할 수 있다. 피검자의 타액에는 피검자의 구강 세포 및/또는 구강 내 세균 등이 포함되어 있을 수 있다. 앞서 설명한 것과 같이, 세포 용해 조성물은 세포 수집물의 세포벽을 용해시키고 세포벽이 용해된 핵산을 보존할 수 있다. 즉, 세포 수집물 및 세포 용해 조성물이 혼합된 세포 용해물이 수용되어 밀폐된 검체 용기를 준비하는 단계(S111)에서 세포는 이미 세포벽이 용해된 상태일 수 있다. 따라서 후술할 핵산을 추출하는 단계(S120)에서 별도의 세포벽 용해 과정 없이 세포 용해물을 그대로 사용할 수 있고, 핵산의 분리, 정제 및/또는 추출 과정을 효율적으로 수행할 수 있다.
이하, 도 2를 더 참조하여 본 실시예에 따른 핵산의 추출 방법에 사용되는 검체 용기에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 도 2는 세포 용해물을 준비하는 단계에서 사용되는 검체용기의 단면사시도이다.
도 2를 더 참조하면, 검체 용기(1)는 용기 본체(10) 및 용기 본체(10)의 상단에 가역적으로 결합 가능하게 구성된 용기 캡(20)을 포함하고, 용기 캡(20)의 하단에 배치된 절개된 시트(30)를 포함할 수 있다.
용기 본체(10)는 상부가 개방된 대략 원통형 용기일 수 있다. 용기 본체(10)에는 세포 수집물과 세포 용해 조성물이 혼합된 세포 용해물(40)이 수용된 상태일 수 있다. 용기 본체(10)의 상단 외주면에는 제1 나사산(11)이 배치될 수 있다. 제1 나사산(11)은 후술할 용기 캡(20)의 제2 나사산(21)과 나사 조임 결합을 형성할 수 있고, 이를 통해 검체 용기(1) 내의 세포 수집물과 세포 용해 조성물이 혼합된 세포 용해물(40)은 외부로부터 완전히 밀폐되어 수용될 수 있다.
용기 캡(20)은 적어도 부분적으로 용기 본체(10) 내에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 용기 캡(20)은 체결 바디부(22), 절개 유닛부(24) 및 용해액 수용부(26)를 포함하고, 평면 시점에서, 체결 바디부(22)는 용기 본체(10)를 부분적으로 둘러싸며, 절개 유닛부(24), 용해액 수용부(26) 및 시트(30)는 각각 적어도 부분적으로 용기 본체(10)의 내부 공간에 삽입 배치될 수 있다.
체결 바디부(22)의 내주면에서는 제2 나사산(21)이 배치될 수 있다. 앞서 설명한 것과 같이, 제2 나사산(21)은 제1 나사산(11)과 나사 조임 결합을 형성하여 가역적으로 결합될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 '가역적 결합'은 체결과 해제가 반복적으로 가능한 결합을 의미한다.
용해액 수용부(26)는 그 내부에 공간을 갖는 원통형 용기일 수 있다. 용해액 수용부(26)는 체결 바디부(22)와 물리적 경계 없이 일체로 형성될 수 있다. 용해액 수용부(26)의 내측에는 절개 유닛부(24)가 배치될 수 있다. 절개 유닛부(24)는 용해액 수용부(26)를 가로지르도록 연장된 형상일 수 있다. 절개 유닛부(24)는 상하 방향의 이동이 가능하게 구성될 수 있다.
시트(30)는 용해액 수용부(26)의 하측 단부 상에 배치될 수 있다. 시트(30)는 체결 바디부(22) 및 용해액 수용부(26)에 비해 강도가 약한 재료로 이루어질 수 있다. 또, 시트(30)는 액상의 물질이 투과하지 않는 재료로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 시트(30)는 은박지 또는 합성 수지 박막 등으로 이루어질 수 있다. 시트(30)는 적어도 부분적으로 절개된 상태일 수 있다.
본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나, 본 실시예에 따른 검체 용기(1)는 최초 상태에서 용해액 수용부(26) 내에 세포 용해 조성물이 수용되고 시트가 절개되지 않은 상태로 용해액 수용부(26)의 하단을 밀봉할 수 있다. 즉, 용해액 수용부(26)와 절개되지 않은 시트는 함께 세포 용해 조성물을 밀봉 수용할 수 있다. 또, 용기 본체(10) 내에 세포 수집물(피검자의 타액 등)이 수용될 수 있다. 용기 캡(20) 상부에 압력을 가하면 절개 유닛부(24)가 하방 이동하며 시트(30)를 부분적으로 절개하고, 용해액 수용부(26) 내에 수용되어 있던 세포 용해 조성물이 용기 본체(10) 측으로 쏟아지며 세포 용해 조성물과 세포 수집물이 혼합될 수 있다. 이러한 과정을 통해 도 2 등에 도시된 것과 같은 상태가 될 수 있다.
본 실시예에 따른 핵산의 추출 방법에 사용되는 검체 용기(1)에 따르면, 채취된 세포 수집물은 세포 용해 조성물과 혼합되어 세포벽이 파괴된 세포 용해물(40)을 생성할 수 있다. 세포 용해물(40)은 검체 용기(1) 내에 완전히 밀봉되되, 검체 용기(1)가 흔들릴 경우 절개된 시트(30)와 맞닿도록 구성될 수 있다.
세포벽이 용해된 세포 용해물(40)이 검체 용기(1) 내에 완전히 밀봉되기 때문에 그 상태로 장시간, 예컨대 약 30일 이상 보존이 가능할 수 있다. 앞서 설명한 것과 같이 구아니딘염산, 아세트산 나트륨, 에틸렌다이아민테트라아세트산, 비이온성 계면활성제 및 아지드화나트륨을 포함하는 세포 용해 조성물은 세포벽의 용해 뿐만 아니라 세포벽이 용해된 세포 용해물(40)의 보존 안정성을 향상시킬 수 있다.
또, 그 내부에 한번 수용된 세포 수집물과 세포 용해 조성물은 사용자가 검체 용기(1)를 개방하기 전까지 외부에 노출되지 않은 상태로 세포벽의 용해가 진행되기 때문에 각각의 보존 안정성이 증가함은 물론, 사용자(예컨대 검사자)의 조작이 간편 및 용이해질 수 있다. 또한, 검사자에게 특별하고 신중한 조작을 요구하지 않기 때문에 검사자 별로 동일한 결과를 합리적으로 기대할 수 있고, 나아가 그 시험 결과의 신뢰성을 향상시킬 수 있다.
나아가, 기존의 핵산 추출 방법들은 여러가지 용액을 사용하여 세포를 용해하고, 용해 후 단백질을 제거한 후에 비로소 핵산 추출이 시작되는 등 절차가 번거롭고 시간이 오래 소요되는 문제가 있었다. 뿐만 아니라 여러 단계를 거치는 과정에서 불순물 오염 가능성이 발생하고, 검사자 별로 재현성 있는 결과를 얻기가 쉽지 않은 한계가 있었다.
본 발명이 이에 제한되는 것은 아니나, 본 실시예에 따를 경우, 예를 들어 피검자로부터 검체를 채취한 직후에 곧바로 세포 수집물과 세포 용해 조성물을 혼합할 경우, 세포벽이 용해된 세포 수집물이 형성되고 그 상태로 장시간의 보존 내지는 이동이 가능하며, 세포벽이 용해된 상태로 검사자가 핵산 추출을 진행함으로써 별도의 세포벽 용해 절차를 생략할 수 있는 효과가 있다. 즉, 검체 용기(1)를 이용하여 검체의 수송, 세포벽의 용해 및 단백질 제거가 동시에 가능하여 핵산을 추출하는데 소요되는 노력과 비용, 시간을 절감할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 검체 용기(1) 내에 수용된 세포 용해물(40)은 염화세틸피리디늄, 살리실산메틸 및 글리세린 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 염화세틸피리디늄, 살리실산메틸 및/또는 글리세린은 각각 세포벽 용해 및 후술할 핵산 추출 특성을 저하시키지 않으면서, 세포벽이 용해된 세포 용해물의 보존 특성 향상에 기여할 수 있다.
세포 용해물이 수용되어 밀폐된 검체 용기(1)를 제공받은 검사자는 검체 용기(1)를 개방하여 세포 용해물(40)을 공기 중에 노출시킬 수 있다(S112). 예를 들어, 용기 본체(10)의 제1 나사산(11)과 용기 캡(20)의 제2 나사산(21)의 나사 조임을 해제하여 용기 본체(10)의 내부 공간을 개방할 수 있다. 앞서 설명한 것과 같이, 본 단계(S112)에서 검체 용기(1) 내부의 세포 용해물(40)은 이미 검체의 세포벽이 용해된 상태일 수 있다.
세포 용해물에서 핵산을 분리 및 수집하는 단계(S120)의 구체적인 방법은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어, 에탄올 침전법, 핵산 침전법, 컬럼을 이용한 원심분리법, 또는 컬럼을 이용한 여과법 등이 이용될 수 있다. 이하, 컬럼을 이용한 방법을 예로 하여 설명한다.
세포 용해물을 컬럼에 로딩하는 단계(S121)에서, 세포 용해물의 로딩에 사용되는 컬럼은 고체상 컬럼일 수 있다. 상기 컬럼은 종래 핵산(DNA 또는 RNA) 추출에 이용되는 컬럼을 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 컬럼은 양이온 금속 비드 또는 양이온 흡착 섬유로 패킹된 DNA 부착성 컬럼일 수 있다.
세포 용해물을 컬럼에 로딩하는 단계(S121)에서 컬럼에 부착되는 액상은 검체 용기(1)에 밀봉 수용되어 있던 세포 용해물을 그대로 사용할 수 있다. 즉, 검체 용기(1)를 개방(S112)한 후, 세포 용해물을 컬럼에 로딩하는 단계(S121) 사이에 별도의 처리 과정 없이, 검체 용기(1) 내의 세포 용해 조성물을 핵산 추출의 전처리 액으로 사용할 수 있다.
그 다음 컬럼을 세척하고(S122), 세척된 컬럼으로부터 핵산을 용리한다(S123). 컬럼으로부터 핵산을 용리하는 단계(S123)에서 사용되는 용리 조성물은 Tris-HCL 완충액, TE 완충액, 아쿠아 비데스트(aqua bidest) 및 PCR 완충액 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
이하, 제조예, 비교예 및 실험예를 참조하여 본 발명의 세포 용해 조성물에 대해 더욱 상세하게 설명한다.
제조예 1: 세포 용해 조성물의 제조
구아니딘염산(시그마알드리치 Cat.No. 50950, 2.5kg) 5M, 아세트산나트륨(시그마알드리치 Cat.No. S8750, 250g) 0.3M, 에틸렌다이아민테트라아세트산(시그마알드리치 Cat.No. E7889, 100ml) 5mM, 트윈 20(시그마알드리치 Cat.No. P9416, 100ml) 0.5 중량%, 및 아지드화나트륨(시그마알드리치 Cat.No. S8032, 100g) 0.2 중량%를 혼합하여 세포 용해 조성물을 제조하였다.
제조예 2: 세포 용해 조성물의 제조
에틸렌다이아민테트라아세트산 5mM 대신에 3mM을 혼합한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 세포 용해 조성물을 제조하였다.
제조예 3: 세포 용해 조성물의 제조
아세트산나트륨 0.3M 대신에 0.2M을 혼합한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 세포 용해 조성물을 제조하였다.
제조예 4: 세포 용해 조성물의 제조
아지드화나트륨 0.2 중량% 대신에 0.05 중량%를 혼합한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 세포 용해 조성물을 제조하였다.
비교예 1: 비교 조성물의 제조
구아니딘염산(시그마알드리치 Cat.No. 50950, 2.5kg) 6M, 에틸렌다이아민테트라아세트산(시그마알드리치 Cat.No. E7889, 100ml) 5mM, 트윈 20(시그마알드리치 Cat.No. P9416, 100ml) 0.5 중량% 및 PIPES 0.1M을 혼합하여 비교 조성물을 제조하였다.
비교예 2: 비교 조성물의 제조
아지드화나트륨을 혼합하지 않은 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 비교 조성물을 제조하였다.
비교예 3: 비교 조성물의 제조
아지드화나트륨 및 아세트산나트륨을 혼합하지 않은 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 비교 조성물을 제조하였다.
비교예 4: 비교 조성물의 제조
구아니딘염산의 농도를 0.3M으로 하고, 아세트산나트륨의 농도를 5M로 한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 방법으로 비교 조성물을 제조하였다.
비교예 5: 시중 구강 청결제
시중에서 구입한 구강 청결제 조성물을 비교 조성물로 준비하였다.
실험예 1: 핵산 추출
제조예 1 내지 제조예 4 및 비교예 1 내지 비교예 5에 따른 조성물과 건강한 성인 남자의 타액의 혼합액 샘플을 각각 준비하였다. 그리고 상기 샘플들을 30일 동안 상온에서 보관하였다. 이하 과정은 30일 동안 보관된 후의 샘플 각각을 이용하여 수행하였다.
1.5ml 튜브를 준비하고 세포 용해 조성물과 타액의 혼합물 샘플 0.5ml를 넣어 볼텍싱(vortex)한 후 65℃에서 10분간 유지한 후 스핀 다운하였다. 그 다음 이산화규소(silicon dioxide) 용액 0.5g/ml(시그마알드리치 Cat.No. S5631)을 첨가하고 다시 볼텍싱한 후 상온에서 5분간 유지하였다. 그리고 5,000rpm에서 30초 간 원심분리하고 상등액을 제거하였다.
이어서 1.0M 염화나트륨(시그마알드리치 Cat.No. S7653), 50mM MOPS pH 7.0(시그마알드리치 Cat.No. M1254), 30% 에탄올(덕산화학, ethyl alcohol 99.9% GR grade 1L) 버퍼 1,000㎕를 더 첨가하고 볼텍싱한 후 5,000rpm에서 30초간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 나서 70% 에탄올 1000㎕를 더 첨가하고 다시 복텍싱한 후 5,000rpm에서 30초간 원심분리하였다. 그리고 상등액을 제거하였다.
스핀 다운 한 후에 피펫을 이용하여 용액을 완전히 제거하였다. 그리고 100mM Tris-HCL pH 7.5(시그마알드리치 Cat.No. 93363), 10mM EDTA(시그마알드리치 Cat.No. E7889) 버퍼 200㎕를 더 첨가하고 볼텍싱한 후 65℃에서 10분간 유지하고, 이어서 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 핵산을 추출하였다.
이어서 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3을 참조하면, 제조예들의 경우 비교예들에 비해 겔 밴드가 뚜렷한 것을 확인할 수 있다.
실험예 2: 검체 보존 안정성
제조예 1 및 비교예 5에 따른 조성물과 건강한 성인 남자의 타액의 혼합액 샘플을 각각 8개씩 준비하였다. 그리고 상기 샘플들 상온에서 보관 후 보관 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 5일차, 7일차, 15일차 및 30일차에 개봉하여 보관일차에 따른 보존 안정성을 시험하였다.
구체적으로, 실험예 1과 동일한 방법으로 핵산을 추출하고 전기영동을 진행한 후 real-time PCR을 수행하여 검체 내 세균이 확인되는 Ct 값을 측정하고 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다. 표 1 및 표 2에서, Ct 값이 작을수록 민감도가 높고 보존 안정성이 높은 것을 의미한다. 또, 하기 표 1 및 표 2에서, Aa, Pg, Tf, Sm, Td, Pi, Fn, Lc, Pn, Smi, Ss는 각각 분석의 대상이 되는 균주를 의미한다.
Ct Aa Pg Tf Sm Td Pi Fn Lc Pn Smi Ss
1일차 0 26.09 29.15 25.75 30.15 24.34 23.89 0 31.39 24.47 0
2일차 0 26.2 29.04 24.81 31.27 24.63 24.01 0 31.64 24.06 0
3일차 0 26.28 29.14 25.29 30.52 24.84 23.11 0 31.66 24.04 0
4일차 0 26.53 29.27 24.54 29.87 25.43 22.64 0 31.65 23.75 0
5일차 0 26.24 28.95 24.58 29.86 25.56 22.66 0 31.88 23.69 0
7일차 0 26.5 29.39 24.65 29.71 25.5 22.69 0 32.08 23.63 0
15일차 0 25.12 27.46 24.25 29.63 25.41 22.78 0 32.14 23.61 0
30일차 0 26.98 29.16 24.55 29.66 26.23 22.48 0 32.53 24.04 0
Ct Aa Pg Tf Sm Td Pi Fn Lc Pn Smi Ss
1일차 0 27.14 30.5 27.12 30.91 24.91 24.3 0 31.58 25.08 0
2일차 0 26.33 29.9 26.16 31.45 24.79 24.32 0 31.86 24.41 0
3일차 0 27.37 30.43 26.22 30.93 24.41 24.17 0 31.36 24.48 0
4일차 0 27.18 30 26.01 31.04 24.72 24.01 0 31.54 24.27 0
5일차 0 25.81 28.4 24.47 30.33 24.19 24.07 0 31.71 24.15 0
7일차 0 25 27.43 24.01 29.85 23.69 22.98 0 31.26 23.56 0
15일차 0 27.08 30.18 25.63 30.5 24.41 23.87 0 31.75 24.23 0
30일차 0 27.04 29.76 25.75 31.32 24.87 23.87 0 31.97 24.46 0
이상에서 본 발명의 실시예를 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에 구체적으로 나타난 각 구성 요소는 변형하여 실시할 수 있다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부된 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

  1. (a) 피검자로부터 채취된 세포 수집물 및 세포 용해 조성물을 포함하는 세포 용해물을 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 용해물에서 핵산을 분리 및 수집하는 단계를 포함하되,
    상기 세포 용해 조성물은,
    구아니딘염산 4.0M 내지 6.0M;
    아세트산나트륨 0.2M 내지 0.5M;
    에틸렌다이아민테트라아세트산 3mM 내지 6mM;
    아지드화나트륨 0.05 중량% 내지 0.3 중량%; 및
    트윈 20 0.3 중량% 내지 0.5 중량%를 포함하는, 구강 내 세포의 핵산의 추출 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 세포 용해물은 염화세틸피리디늄, 살리실산메틸 및 글리세린 중 하나 이상을 더 포함하는, 핵산의 추출 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 세포 용해물을 준비하는 단계는,
    채취된 세포 수집물 및 상기 세포 용해 조성물이 혼합된 상기 세포 용해물이 수용되어 밀폐된 검체 용기를 준비하는 단계, 및
    상기 검체 용기를 개방하여 상기 세포 용해물을 공기 중에 노출시키는 단계를 포함하되,
    상기 검체 용기는 절개된 시트 부분을 포함하고,
    상기 세포 용해물은 상기 절개된 시트 부분과 맞닿는, 핵산의 추출 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 세포 용해물에서 핵산을 분리 및 수집하는 단계는,
    컬럼에 상기 세포 용해물을 로딩하는 단계,
    상기 컬럼을 세척하는 단계, 및
    상기 세척된 컬럼으로부터 핵산을 용리하는 단계를 포함하고,
    상기 컬럼에 로딩하는 단계에서 컬럼에 부착되는 세포 용해물은, 상기 검체 용기에 수용되어 있던 세포 용해물을 그대로 사용하고,
    상기 용리하는 단계에서 사용되는 용리 조성물은, Tris-HCL 완충액, TE 완충액, 아쿠아 비데스트(aqua bidest) 및 PCR 완충액 중 하나 이상을 포함하는, 핵산의 추출 방법.
  6. 구아니딘염산 4.0M 내지 6.0M;
    아세트산나트륨 0.2M 내지 0.5M;
    에틸렌다이아민테트라아세트산 3mM 내지 6mM;
    아지드화나트륨 0.05 중량% 내지 0.3 중량%; 및
    트윈 20 0.3 중량% 내지 0.5 중량%를 포함하는 구강 세포 용해 조성물.
  7. 삭제
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