KR102425034B1 - 표적 바이러스 검출을 위한 페이퍼 멤브레인 기반 현장용 rna 추출 플랫폼 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표적 바이러스 검출을 위한 페이퍼 멤브레인 기반 현장용 RNA 추출 플랫폼에 관한 것으로서, RNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용되는 샘플패드와, 상기 샘플패드에 수용된 상기 샘플로부터 유출된 RNA를 운반하는 세척버퍼가 수용되는 로딩 패드와, 상기 세척버퍼에 의해 운반된 RNA가 농축되는 바인딩 패드와, 상기 바인딩 패드로 전개된 상기 세척버퍼를 흡수하며, 상기 바인딩 패드의 다운스트림에 위치하는 위킹 패드를 구비한다.
본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스는 측방 유동 분리 기반으로 RNA를 추출하므로 다양한 종류의 샘플들로부터 RNA를 추출하는데 비교적 짧은 시간이 소요되며, 원심 분리, 다중 세척 과정 등의 추가 처리를 요구하지 않기 때문에, 특히 제한적인 환경에서의 RNA 추출 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스는 측방 유동 분리 기반으로 RNA를 추출하므로 다양한 종류의 샘플들로부터 RNA를 추출하는데 비교적 짧은 시간이 소요되며, 원심 분리, 다중 세척 과정 등의 추가 처리를 요구하지 않기 때문에, 특히 제한적인 환경에서의 RNA 추출 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
Description
본 발명은 표적 바이러스 검출을 위한 페이퍼 멤브레인 기반 현장용 RNA 추출 플랫폼에 관한 것이다. 보다 상세하게는 RNA 프로브(RNA probe)를 이용하여 RNA를 추출할 수 있는 RNA 추출 디바이스를 제공한다. 또한 이를 이용한 추출방법을 제공한다.
RNA는 유전정보의 흐름에서 DNA의 정보를 단백질로 발현시키는 중간 산물로 알려져 있는데 최근에 mRNA의 새로운 기능이 규명되기 시작하였고, 특히 mRNA의 암호화되지 않는 부분(untraslated region ; UTR)은 mRNA가 단백질로 발현되는 효율성과, mRNA 자체의 안정성, 그리고 mRNA의 위치를 결정하는 중요한 정보를 지니는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 mRNA의 UTR의 구조는 대부분 2차원적 또는 3차원적 구조를 가지고 있으며, 모양과 염기서열에서 특색을 보인다. 특히, 3차원적 구조는 생체 내의 여러 가지 RNA 결합 단백질과 특이적인 결합을 통하여 그 기능을 나타내기 때문에, 특이적 구조를 가진 RNA는 세포 내에서 중요한 표적 분자가 될 수 있다. 최근까지 알려진 바에 의하면, 박테리아의 16S rRNA A 부위(A site), HIV 바이러스의 TAR 결합 부위(binding site), RRE결합 부위(binding site), IRE mRNA, 티미딜레이트 합성효소(thymidilate synthetase) mRNA 등이 표적 분자로서 인정되고 있다. 최근에는 다양한 사이토카인(cytokine), 세포-세포간의 인식과 신호를 전달하는 물질들, 성장인자(growth factor)들과 여러 가지 구형 단백질 등의 mRNA의 UTR의 역할이 규명되기 시작하여 그 중요성이 인식되면서 mRNA의 특이적 염기서열 및 모양이 RNA 표적 분자로 대두될 가능성이 점점 커져가고 있다. 이 외에도 텔로머레이즈(telomerase) RNA, APP mRNA, HSP mRNA 등 질병과 직접 관련이 있는 여러 가지 mRNA의 UTR이 특이적인 모양과 염기서열을 가지고 있으므로 쉽게 표적화 되고 있다.
그러나, 이러한 종래의 RNA 추출 키트들은, RNA 추출 시간이 오래걸리고, 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.
[1] Niemz, A, TM Ferguson, and DS. Boyle, Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases Trends Biotechnol, 2011 29(5): p 240-50(비특허문헌 0002) [2] Thatcher, SA, DNA/RNA preparation for molecular detection Clin Chem, 2015 61(1): p 89-99
본 발명은 상기와 같은 문제점을 개선하기 위해 창안된 것으로서, 측방 유동 분리 방식을 기반으로, 짧은 시간 내에 효율적으로 다양한 종류의 샘플들로부터 RNA 추출이 가능한 RNA 추출 디바이스로서, 표적 바이러스 검출을 위한 페이퍼 멤브레인 기반 현장용 RNA 추출 플랫폼을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스는 RNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용되는 샘플패드와, 상기 샘플패드에 수용된 상기 샘플로부터 유출된 RNA를 운반하는 세척버퍼가 수용되는 로딩 패드와, 상기 세척버퍼에 의해 운반된 RNA가 농축되는 바인딩 패드와, 상기 바인딩 패드로 전개된 상기 세척버퍼를 흡수하며, 상기 바인딩 패드의 다운스트림에 위치하는 위킹 패드를 구비한다.
상기 바인딩 패드는 제1결합물질이 도포된 페이퍼 멤브레인 및 상기 제2결합물질을 구비한다.
상기 제1결합물질은 비오틴(Biotin) 및 스트렙트아비딘(Streptavidin)의 복합체이고, 상기 제2결합물질은 추출대상 RNA에 상보적인 서열을 갖는 RNA 프로브 및 비오틴의 복합체인 것이 바람직하다.
상기 로딩 패드, 샘플 패드, 바인딩 패드 및 위킹 패드가 순차적으로 상호 이격되게 나열된다.
상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드는 다공성 멤브레인(porous membrane)으로 이루지며, 상기 세척 버퍼에 대한 흡수성을 갖는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스는 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 표면 상에 놓이는 지지체를 더 포함할 수도 있다.
상기 지지체는 상기 세척버퍼 및 추출대상 RNA가 흡수되지 않는 물질로 이루어진다.
한편, 본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스는 상기 바인딩 패드에 농축된 RNA를 밀집시키기 RNA 결합영역을 더 포함할 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스는 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 수용되는 케이스를 더 포함할 수도 있다.
상기 케이스는 상기 로딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 로딩 패드에 상기 세척버퍼를 주입시키기 위한 버퍼 주입구와, 상기 샘플 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 샘플 패드에 상기 샘플을 주입시키기 위항 샘플 주입구와, 상기 바인딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 바인딩 패드에 농축된 RNA를 추출하기 위한 RNA 추출구를 포함한다.
상기 샘플 패드는, 상기 샘플로부터 RNA를 추출하는 세포 용해 조성물세포 용해 조성물)를 포함한다.
본 발명에 따른 표적 바이러스 검출을 위한 페이퍼 멤브레인 기반 현장용 RNA 추출 플랫폼은 RNA 추출 디바이스로서, 측방 유동 분리 기반으로 RNA를 추출하므로 다양한 종류의 샘플들로부터 RNA를 추출하는데 비교적 짧은 시간이 소요되며, 원심 분리, 다중 세척 과정 등의 추가 처리를 요구하지 않기 때문에, 특히 제한적인 환경에서의 RNA 추출 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분리 기반의 RNA 추출디바이스는 비교적 단순한 구조를 가지고 있어, 쉽고 빠르게 생산이 가능하므로, 쉽게 대량 생산 및 사업화 할 수 있는 효과가 있다.
도 1 내지 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스를 도시한 도면이고, 도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 RNA 추출 디바이스의 바인딩 패드에 대한 개념도이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스에 대해 상세히 설명한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
도 1 내지 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스를 도시한 도면이다.
도면을 참조하면, 본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스(1)는 샘플 패드(110), 로딩 패드(120), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140), 이송 패드(150), 지지체(160), 및 케이스(180)를 포함한다.
샘플 패드
샘플 패드(110)(sample pad)에는 RNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용된다. 샘플 패드(110)는 RNA 추출을 행할 샘플을 수용하여 함유할 수 있는 물질로 이루어진다. 여기서 샘플은, RNA 추출을 행할 생물학적 물질을 의미한다. 예를 들어, 샘플은 세포배양액, 타액, 혈액, 혈청, 인공 담액, 우유 등을 포함하며, 생리적 유체와 같은 어떠한 생물학적 공급원으로부터도 유래될 수 있다. 한편 샘플 패드(110)는 알칼리성을 갖도록 처리된다. 구체적으로, 샘플 패드(110)는 샘플 내의 타겟 세포를 파괴하여 타겟 세포로부터 RNA를 방출시키는 세포 용해 조성물(lysis buffer)을 포함한다. 이에, 샘플 패드(110)에 샘플이 주입되면, 샘플 내 세포 등이 용해되면서 그 속에 함유된 RNA가 유출된다. 이 과정에서 DNA도 유출 될 수 있으나 후술할 제2 세척 버퍼를 가함으로써 RNA만 수득할 수 있다.
상기 세포 용해 조성물은 Tris·아세트산(Tris·acetate), 염화나트륨, 비이온성 계면활성제, EDTA, 글리세롤, 및 RNase 저해제의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포 용해조성물은 80 mM 내지 120 mM Tris·아세트산, 120 mM 내지 180 mM 염화나트륨, 0.8 w/w% 내지 1.2 w/w% Tween20, 0.8 mM 내지 1.2 mM EDTA, 3 w/w% 내지 7 w/w% 글리세롤, 및 1.5 내지 2.5 ㎍/ml RNase 저해제를 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포 용해용 조성물은 RNase 활성을 증진시키기 위해, 0.1 mM 내지 0.5 mM의 시티딘 2',3'-cCMP (cytidine 2', 3'-cyclic monophosphate)를 더 포함할 수 있다. 상기 세포 용해 조성물의 pH는 6.0 내지 7.0, 보다 바람직하게는 6.2 내지 6.8인 것이 바람직하다. 세포 용해 조성물은 샘플 패드에서 건조된 상태로 안정하게 도포되어 있다가, 수분이 공급되면 빠르게 용해되면서 세포와 반응할 수 있어야 하고, RNase 저해제를 안정한 상태로 보존하면서 충분히 활성할 수 있도록 적절한 환경을 제공해야 한다. 상기 RNase 저해제는 재조합 단백질, 화학 물질, 또는 이들의 조합일 수 있고, 예를 들어 RNaseOUT™(ThermoFisher, #10777019)과 같은 시중에서 판매하는 것을 이용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
로딩 패드
로딩 패드(120)(loading pad)에는 샘플 패드(110)에 수용된 샘플로부터 유출된 RNA를 운반하는 세척 버퍼(washing buffer)가 수용된다. 후술할 샘플 패드(110), 로딩 패드(120), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140) 간의 액체 흡수성의 차이로 인하여, 로딩 패드(120)에 주입되어 로딩 패드(120)에 수용된 세척 버퍼는 RNA 추출 디바이스의 다운 스트림을 향하여 전개된다. 즉, 로딩 패드(120)로부터 전개된 세척 버퍼는 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)를 순차적으로 거치게 되어, 샘플 패드(110)에 수용된 샘플로부터 유출된 RNA를 바인딩 패드(130)로 운반한다. 또한 세척 버퍼에는 DNase가 함유되어 DNA를 제거하는 기능을 한다.
상기 세척 버퍼는 RNase가 없는 정제수, Tris·아세트산, 염화나트륨, 비이온성 계면활성제, 및 EDTA를 포함하는 제1 세척 버퍼와 DNase를 더 포함하는 제2 세척 버퍼를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 세척 버퍼는 먼저 RNase로 처리하고 여과 등의 방법으로 정제처리를 하여 RNase가 없는 정제수, 40 mM 내지 60 mM Tris·아세트산, 40 mM 내지 60 mM 염화나트륨, 0.3 w/w% 내지 0.8 w/w% Tween20, 및 0.8 mM 내지 1.2 mM EDTA를 포함하는 것일 수 있고, 상기 제2 세척 버퍼는 상기 제1 세척 버퍼에 0.8 U/㎕ 내지 1.2 U/㎕ DNase I 및 3 mM 내지 7 mM MgSO4를 더 함유하는 것일 수 있다. 세척 버퍼는 세포 용해물을 더욱 희석하면서 침전물을 형성시키지 않아야 하고, RNase 저해제가 안정한 상태로 보존하면서 충분히 활성할 수 있도록 적절한 환경을 제공해야 한다. 상기 세척 버퍼의 조성과 함량은 세포 용해 조성물에 최적화된 조합으로서, 가장 높은 RNA 추출 수율을 달성할 수 있다. 또한 제1 세척 버퍼는 세포 용해물 중 핵산을 제외한 물질들 제거하기 위함이고, 제2 세척 버퍼는 핵산 중 DNA를 제거하기 위한 것이다. 제2 세척 버퍼는 DNase가 빠른 시간 내에 충분히 활성하기 위해서 Mg2+을 MgSO4로서 함유한다.
다른 구체예에서, 제2 세척 버퍼의 추가 구성성분인 0.8 U/㎕ 내지 1.2 U/㎕ DNase I 및 3 mM 내지 7 mM MgSO4는 바인딩 패드의 페이퍼 멤브레인 안정화 증가를 위해 소르비톨, 비이온성 계면활성제, 및 글리세롤을 포함하는 용액에도 첨가할 수 있다.
바인딩 패드
바인딩 패드(130)(binding pad)에는 세척 버퍼에 의하여 운반된 RNA가 농축된다. 바인딩 패드(130)는 RNA가 농축될 수 있도록 생체적합성을 갖는 물질로 이루어진다.
한편, 상기 바인딩 패드(130)는 도 5에 도시된 바와 같이 페이퍼 멤브레인을 구비한다. 페이퍼 멤브레인은 다공성 멤브레인으로 이루어진다. 다공성 멤브레인을 이루는 다공성 물질의 비제한적인 예시로는, 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 카툰(cotton), 나일론과 같은 다공성 겔 등이 있다. 이때, 페이퍼 멤브레인은 제1결합물질이 결합되어 있는데, 페이퍼 멤브레인의 표면에 상기 제1결합물질이 도포되어 소정의 결합층을 이룬다. 여기서, 제1결합물질은 비오틴(Biotin) 및 스트렙트아비딘(Streptavidin)의 복합체가 적용된다.
상기 제1결합물질에는 스트렙트아비딘을 매개로 제2결합물질이 결합할 수 있다. 상기 제2결합물질은 추출대상 RNA에 상보적인 서열을 갖는 RNA 프로브 및 비오틴의 복합체, 구체적으로 비오틴화된 RNA 프로브인 것이 바람직하다. 페이퍼 멤브레인은 표적대상 RNA 프로브의 종류에 따라 두 개 이상으로 바인드 패드 상에 배치될 수 있다.
프로브는 추출대상 RNA를 검출하기 위한 것으로서, 제2결합물질에 표지되어 있다. 상기 프로브는 상기 추출대상 RNA에 상보적인 서열을 갖는 RNA 프로브(RNA probe)가 적용된다.
페이퍼 멤브레인은 소르비톨, 비이온성 계면활성제, 및 글리세롤을 포함하는 용액에 담근 후 건조시킨 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 페이퍼 멤브레인은 40 mM 내지 60 mM 소르비톨, 0.2 w/w% 내지 0.8 w/w% TritonX-20, 및 0.1 w/w% 내지 0.3 w/w% 글리세롤을 함유할 수 있다. 페이퍼 멤브레인에 상기와 같은 물질을 도포하는 것은 페이퍼 멤브레인에 도포된 제1 및 제2 결합물질은 화학물질이 아니라 단백질 및 핵산이므로 가혹 조건에서 보존성이 감소할 수 있다. 따라서 페이퍼 멤브레인을 상기와 같은 성분을 함유하도록 전처리한 후 제1 및 제2 결합물질을 도포함으로써, RNA 추출 디바이스의 장기 보존성을 증가시킬 수 있다.
작업자는 페이퍼 멤브레인 표면에 비오틴을 도포하여 결합층을 형성하고, 결합층에 스트렙트아비딘을 도포하여 페이퍼 멤브레인에 제1결합물질을 도포할 수 있다. 그런 다음, 제2결합물질로서 비오틴화된 RNA 프로브를 처리하면 스트렙트아비딘에 제2결합물질의 비오틴 부분이 결합하여 바인딩 패드를 제조할 수 있다. 스트렙트아비딘은 비오틴에 견고하게 붙는 성질을 가지고 있으므로 RNA 프로브를 페이퍼 멤브레인에 견고하게 부착시킨다.
한편, 본 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스는, 바인딩 패드(130)에 농축된 RNA를 밀집시키기 위한 RNA 결합 영역이 형성되어 있다. 바인딩 패드(130)에 농축된 RNA는 페이퍼 멤브레인 상에 형성된 RNA 결합영역으로 밀집되게 된다. 본 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스는, RNA를 밀집시키는 RNA 결합영역을 포함함으로써, RNA 추출 효율을 극대화시켰다. RNA 결합영역은 페이퍼 멤브레인 상에 홀(hole)으로 기능할 수 있는 오목한 영역을 형성하고 그 바닥 표면에만 폴리에틸렌프탈레이트와 같은 단백질에 결합력을 갖는 고분자를 처리한 후, 그 위에 제1결합물질 및 제2결합물질을 처리함으로써 RNA 프로브를 결합시킬 수 있다.
위킹 패드
위킹 패드(140)(wicking pad)는 바인딩 패드(130)로 전개된 세척 버퍼를 흡수한다. 위킹 패드(140)는 바인딩 패드(130)의 다운 스트림에 위치한다. 그리고, 세척 버퍼는 샘플 패드(110)에서 바인딩 패드(130)를 거쳐, 위킹 패드(140)로 흡수된다.
로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 및 위킹 패드(140) 각각은 다공성 멤브레인으로 이루어진다. 다공성 멤브레인을 이루는 다공성 물질의 비제한적인 예시로는, 섬유성 종이, 셀룰로오스 물질로 된 미세기공 멤브레인, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 유도체, 니트로셀룰로오스, 유리섬유, 카툰(cotton), 나일론과 같은 다공성 겔 등이 있다.
다공성 멤브레인으로 이루어져 있기 때문에, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140) 각각은 액체 흡수성을 갖는다. 구체적으로, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140) 각각은, 전술한 로딩 패드(120)에 주입되는 세척 버퍼에 대한 흡수성을 갖는다. 그리고, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)의 액체 흡수력은 서로 상이하다. 보다 구체적으로, 로딩 패드(120)의 액체 흡수력이 가장 낮으며, 위킹 패드(140)의 액체 흡수력이 가장 크다. 즉, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140)로 갈수록 액체 흡수력이 커진다.
본 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스는, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)가 순차적으로 상호 이격되어 나열된 구조를 포함한다. 즉, 본 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스는 복수의 패드들이 액체 흡수력의 순서대로 배열된 구조를 포함한다. 즉, 본 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스는 업 스트림 쪽에 액체 흡수력이 가장 낮은 로딩 패드(120)가 마련되고, 다운 스트림으로 갈수록 액체 흡수력이 큰 패드가 마련되어, 다운 스트림의 가장 끝부분에는 위킹 패드(140)가 마련된 구조를 포함한다. 이러한 구조 때문에, 로딩 패드(120)에 주입된 세척 버퍼는 자연스럽게 위킹 패드(140)를 향하여 전개될 수 있다.
한편, 이송 패드(150)(transfer pad)는, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)를 연결하여, 세척 버퍼가 이동할 수 있도록 한다. 즉, 이송 패드(150)는 로딩 패드(120)와 샘플 패드(110) 사이, 샘플 패드(110)와 바인딩 패드(130) 사이 및 바인딩 패드(130)와 위킹 패드(140) 사이에 각각 마련된다.
지지체(160)는, 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140) 및 이송 패드(150)를 지지한다. 지지체(160)는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140) 및 이송 패드(150)를 지지할 수 있는 물질로써, 확산되는 RNA 및 세척 버퍼가 유출되지 않도록 액체 불투과성(액체 불흡수성)을 갖는 물질이라면 어떠한 물질로도 형성될 수 있다. 지지체(160) 상에는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)가 순차적으로 마련된다. 그리고, 로딩 패드(120)와 샘플 패드(110) 사이, 샘플 패드(110)와 바인딩 패드(130) 사이 및 바인딩 패드(130)와 위킹 패드(140) 사이에는 각각 이송 패드(150)가 마련된다.
케이스(180)는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140), 이송 패드(150) 및 지지체(160)를 수용한다. 케이스(180)는 상부 케이스(180')와 하부 케이스(180")로 이루어진다. 하부 케이스(180")의 표면 상에는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130), 위킹 패드(140), 이송 패드(150) 및 지지체(160)가 놓인다. 하부 케이스(180")와 결합되는 상부 케이스(180')에는 버퍼 주입구, 샘플 주입구 및 RNA 추출구가 형성된다.
버퍼 주입구는 로딩 패드(120)와 대응되는 위치에 형성된다. 사용자는 버퍼 주입구를 통하여 로딩 패드(120)에 세척 버퍼를 주입할 수 있다.
샘플 주입구는 샘플 패드(110)와 대응되는 위치에 형성된다. 사용자는 샘플 주입구를 통하여 샘플 패드(110)에 샘플을 주입할 수 있다.
RNA 추출구는 바인딩 패드(130)와 대응되는 위치에 형성된다. 사용자는 RNA 추출구를 통하여 바인딩 패드(130)에 농축된 RNA를 추출할 수 있다. 복수 개의 RNA를 추출하고자 하는 경우, 추출구는 바인딩 패드의 페이퍼 상에 RNA 결합영역 마다 대응되는 위치에 추출구를 배치할 수 있다.
RNA 추출 디바이스의 구조 및 디자인된 케이스(180)는 도 2에 도시되었다. 디자인된 케이스(180) 상의 세 개의 구멍의 위치는 로딩 패드(120), 샘플 패드(110) 및 바인딩 패드(130)의 위치에 대응된다. 구멍의 모양, 스트립 윤곽 및 케이스(180)의 압력은 오버플로우를 방지함과 동시에 RNA 추출 효율을 증대시키며, 다공성 구조 내의 유체 흐름 재현성을 향상시킨다.
완전히 조립된 RNA 추출 디바이스는 도 3에 도시되었다. 실제 RNA 추출 디바이스의 크기는 동전과 비교되었다. RNA 추출 디바이스는 컴팩트한 디자인을 가지며 손에 들고 사용 가능한 크기를 가져, 제한된 환경에서의 핵산 테스트에 매우 적합하다.
RNA 추출 디바이스는 다양한 다공성 물질들이 적절하게 배치되어, RNA 분자들의 상대적 친화도 차이에 따라 바인딩 패드(130) 상에 RNA 농도가 유도되도록 설계되었다.
로딩 패드(120), 샘플 패드(110), 바인딩 패드(130) 및 위킹 패드(140)는 도 4에 도시된 바와 같이, 각각의 특성에 따라 배치되었다. 다양한 다공성 물질들의 결합친화도는 형광 표시된 RNA에 의하여 추정될 수 있었다.
상술된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스는 이송 패드(150)(transfer pad), 로딩 패드(120)(loading pad), 샘플 패드(110)(sample pad), 바인딩 패드(130)(binding) 및 위킹 패드(140)(wicking pad)를 포함한다. 이송 패드(150)는 비대칭 PES 멤브레인의 종류 중 하나인 vivid plasma separation-GF (Pall)이다. 로딩 패드(120)로는 Glass pad GF/C grade (Whatman) 이 사용되었고, 샘플 패드(110)로는 conjugate pad (Pall)가 사용되었다. 위킹 패드(140)는 RNA 추출 디바이스에서 유체의 흐름을 유도할 수 있도록 다운 스트림에 마련되었다.
우선, 적절한 길이로 절단된 이송 패드(150)가 지지체(160)(backing card) 상에 부착되었다. 균일한 길이로 절단된 로딩 패드(120)(10mm), 샘플 패드(110)(5mm) 및 위킹 패드(140)(15mm)는 지지체(160)의 나머지 부분들에 부착되었다. RNA 추출 디바이스의 모든 구성들이 부착된 이후, 받침 카드는 균일한 5mm 길이의 스트립 형태로 절단되었다.
케이스(180)는 Solidwork software에 의하여 디자인 되었고, 3D 프린팅에 의하여 제조되었다. 프린트된 케이스(180)는 상부 케이스(180')와 하부 케이스(180")를 포함한다. 상부 커버에 포함된 세개의 구멍들은 각각 버퍼 주입구, 샘플 주입구, 그리고 RNA 추출구로써, 각각 로딩 패드(120), 샘플 패드(110) 및 바인딩 패드(130)와 피팅되었다. RNA 추출 디바이스 내의 RNA 추출을 위한 모든 용액들은 주입구들을 통하여 주입되었고, 최종 RNA 용액은 피펫에 의하여 RNA 추출구 통하여 추출된다.
상술된 바와 같이 구성된 본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스는 측방 유동 분리 기반으로 RNA를 추출하므로 다양한 종류의 샘플들로부터 RNA를 추출하는데 비교적 짧은 시간이 소요되며, 원심 분리, 다중 세척 과정 등의 추가 처리를 요구하지 않기 때문에, 특히 제한적인 환경에서의 RNA 추출 분야에 유용하게 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 측방 유동 분리 기반의 RNA 추출디바이스는 비교적 단순한 구조를 가지고 있어, 쉽고 빠르게 생산이 가능하므로, 쉽게 대량 생산 및 사업화 할 수 있는 효과가 있다.
DNA와 달리 RNA는 매우 불안정한 특성을 갖고, 인체로부터 분리된 시료들은 대부분 RNase를 함유하기 때문에 시료로부터 추출된 RNA가 다량 분해될 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 RNA 추출 디바이스에서 각 패드에 함유된 물질이나 사용되는 물은 RNase free 여야 하고, RNase 저해제가 시료에 존재하는 RNase의 활성을 억제하기 적합한 환경을 제공할 수 있어야 한다.
본 발명의 일 실시예는 RNA 추출 디바이스에서, 샘플 패드에 개체로부터 분리된 시료를 적용하는 단계; 상기 샘플패드에 세척버퍼를 적가하여 RNA를 바인딩 패드로 운반하는 단계; 및 상기 바인딩 패드로 부터 RNA를 수득하는 단계를 포함하는, RNA 추출하는 방법을 제공한다.
여기서 세척버퍼를 적가하는 단계는, 제1세척버퍼를 적가한 후, 제2세척버퍼를 적가하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 또한 상기 RNA를 수득하는 단계에서 바인딩 패드의 RNA 프로브에 형광 표지자를 달아서 시각적으로 표적대상 RNA를 검출할 수 있고, 바인딩 패드만 절단하여 RNA free 정제수에 담근 후 vortex, 초음파 등의 알려진 방식으로 RNA를 해리하여 통상적으로 알려진 방법으로 침전시킨 후 RNA만을 수득할 수 있다.
이하, 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이하의 실험예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이하의 실험예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
제조예 1. 세포 용해 조성물(Lysis buffer)의 준비
세포 용해 조성물은, 구성 성분, pH 및 각 성분 비 등을 달리하여 하기의 표 1과 같이 혼합하여 준비하였다. RNase 저해제는 RNaseOUT™(Thermo Fisher, #10777019)로 2 ㎍/ml의 농도를 1 ml 만큼 사용하였고, 모든 조성에는 0.2 mM cCMP가 첨가되었다.
| 조성 | RNase 저해제 | pH | |
| 실시예 1 | 100mM Tris·acetate 150mM NaCl 1 w/w% Tween20 1 mM EDTA 5 w/w% 글리세롤 |
2 ㎍/ml | 6.5 |
| 비교예 1 | 50mM Tris-HCl 150mM NaCl1 w/w% Tween20 1mM DTT |
2 ㎍/ml | 7.5 |
| 비교예 2 | 50mM Tris-HCl 150mM NaCl 5mM EDTA 1 w/w% NP-40 |
2 ㎍/ml | 8.5 |
| 비교예 3 | 50mM Tris-HCl 1 w/w% Triton X-100 0.5 w/w% SDC 0.1 w/w% SDS |
2 ㎍/ml | 8.5 |
제조예 2. RNA 추출 디바이스의 제조
본 발명의 일 실시예에 따른 RNA 추출 디바이스는 이송 패드(150)(transfer pad), 로딩 패드 (120)(loading pad), 샘플 패드(110)(sample pad), 바인딩 패드(130)(binding) 및 위킹 패드(140)(wicking pad)를 포함한다. 이송 패드(150)는 비대칭 PES 멤브레인의 종류 중 하나인 vivid plasma separation-GF (Pall)이다. 로딩 패드(120)로는 Glass pad GF/C grade (Whatman) 이 사용되었고, 샘플 패드(110)로는 conjugate pad (Pall)가 사용되었고, 바인딩 패드(130)로는 glass pad GF/F grade (Whatman) 가 사용되었다. 위킹 패드(140)는 RNA 추출 디바이스에서 유체의 흐름을 유도할 수 있도록 다운 스트림에 마련되었다.
우선, 적절한 길이로 절단된 이송 패드(150)가 지지체(160)(backing card) 상에 부착되었다. 균일한 길이로 절단된 로딩 패드(120)(10mm), 샘플 패드(110)(5mm), 바인딩 패드 (130)(5mm×5mm) 및 위킹 패드(140)(15mm)를 지지체(160)의 나머지 부분들에 부착하고, 페이퍼 멤브레인(131)(검출하려는 표적대상 RNA의 개수에 따라 1~5m×1~5mm 크기 조절)을 바인딩 패드 위에 부착하였다. RNA 추출 디바이스의 모든 구성들이 부착된 이후, 받침 카드는 균일한 5mm 길이의 스트립 형태로 절단되었다. 그리고, 각 스트립은 RNA 추출 테스트를 위하여 프린트된 케이스(180) 안에 놓여졌다. 마지막으로, 20㎕의 제조예 1의 세포 용해 조성물이 샘플 패드(110)에 피펫되었고, 이 후 37℃ 오븐에서 건조되었다.
바인딩 패드 (130)에 배치되는 페이퍼 멤브레인(131)은 표면에 오목한 구역을 형성하고 그 바닥에만 폴리에틸렌프탈레이트 잉크로 인쇄 처리하고 건조시킨 후, 그 위에 비오틴 용액을 처리하고 4℃에서 밤새 반응시킨 후 PBS 완충액으로 세척하고 NHS(N-hydroxysulfosuccinimide) 용액을 적용하여 고정시켰다. 그런 다음 스트렙트아비딘 용액을 처리하고 상온에서 반응시켜 페이퍼 멤버레인의 비오틴에 결합시킨 후 세척하고, 비오틴화된 RNA 프로브를 처리하고 다시 4℃에서 밤새 반응시켜 페이퍼 멤브레인에 RNA 프로브까지 고정시켰다. 하기의 시험예 1 및 2에서 사용된 RNA 프로브는 18S rRNA에 상보적인 올리고 RNA로 Trilink (USA)에서 구입하였다.
케이스(180)는 Solidwork software에 의하여 디자인되었고, 3D 프린팅에 의하여 제조되었다. 프린트된 케이스 (180)는 상부 케이스(180')와 하부 케이스(180")를 포함한다. 상부 커버에 포함된 세개의 구멍들은 각각 버퍼 주입구, 샘플 주입구, 그리고 RNA 추출구로써, 각각 로딩 패드(120), 샘플 패드(110) 및 바인딩 패드(130)와 피팅되었다. RNA 추출 디바이스 내의 RNA 추출을 위한 모든 용액들은 주입구들을 통하여 주입되었고, 최종 RNA 용액은 피펫에 의하여 RNA 추출구 통하여 추출되었다
시험예 1. 핵산 수율 측정
본 발명의 RNA 추출 디바이스를 이용하여 높은 RNA 추출 수율을 달성할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, DMEM 배지(Gibco)에 2.5*102 cell/ml로 HeLa 세포를 현탁하고, 이를 50㎕ 덜어 튜브에 옮기고 실시예 1 및 비교예 1 내지 3의 Lysis buffer가 적용된 RNA 추출 디바이스 각각에 첨가하고, RNase free 정제수(UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water, Invitrogen)를 사용하여 제조한 제1 세척 버퍼 (50mM Tris-아세트산, 50mM NaCl, 0.5 w/w% Tween20, 1 mM EDTA, pH7.0) 200㎕를 로딩 패드에 1분 내지 3분 동안 천천히 적가하고, 이어서 제2 세척 버퍼 (제1 세척 버퍼에 1 U/㎕ DNase I(Thermo Fisher #EN0521) 및 5mM MgSO4 첨가) 200㎕를 적가한 후, 바인딩 패드 부분만을 절단하였다. 이를 증류수 100㎕에 담궈 볼텍싱하고 원심분리한 후 용액에서 바인딩 패드를 건져 내어 제거하고 여기에 침전 용액 (35% 이소프로판올, 0.5M NaCl)을 100㎕ 가하여 침전물을 발생시키고, 원심분리한 후 상등액을 버리고, 침전물에 증류수 30㎕을 가하여 핵산 물질을 다시 수용액으로 용해시켰다. 그런 다음 나노드롭 분광광도계 (Nano-300, LUCAS)로 핵산 농도를 측정하였다. 이를 세 번 반복하여 그 평균을 구하였다.
그 결과, 실시예 1은 바인딩 패드까지 도달한 핵산의 수율이 2.7 ㎍/ml로 측정된 반면, 비교예 1은 852.6 ng/ml, 비교예 2는 531.8 ng/ml, 및 비교예 3은 652.9 ng/ml 으로 실시예 1에 비해 수율이 현저히 낮았다.
시험예 2: 페이퍼 멤브레인의 제조
바인딩 패드는 표적 대상 RNA와 결합할 수 있는 비오틴화된 RNA 프로브를 포함하는데, 비오틴과 스트렙트아비딘 간의 결합이 견고함에도 불구하고, 장기보존시 RNA 프로브가 페이퍼 멤브레인에서 해리되어 RNA 추출 수율이 낮아질 수 있다. 이에 본 발명의 RNA 추출 디바이스의 장기보존성을 향상시키기 위해 페이퍼 멤브레인의 제조시 안정화제를 첨가한 후 장기 보존성을 시험하였다.
구체적으로, 제조예 2와 같이 제조하되, 페이퍼 멤브레인은 제조 시 하기의 표 2와 같은 조성의 용액에 담근 후 건조시킨 것을 사용하였다. 표 2의 조성에 1 U/㎕ DNase I 및 5 mM MgSO4을 첨가할 수도 있다. 그런 다음 완성된 RNA 추출 디바이스를 45℃, 75% 상대습도 상에 30일 간 노출시킨 후 RNA 추출 디바이스를 준비하고, 이를 이용하여 RNA를 추출하였다. RNA 추출시험은 시험예 1과 동일한 방식으로 수행하였고, 세포 용해 조성물로 실시예 1을 사용하여 제작한 것이었다.
| 조성 | |
| 실시예 2 | 50 mM 소르비톨 0.5 w/w% TritonX-20 0.2 w/w% 글리세롤 |
| 비교예 4 | 50 mM 만니톨0.5 w/w% TritonX-20 0.2 w/w% 글리세롤 |
| 비교예 5 | 50 mM 소르비톨 0.5 w/w% TritonX-20 |
| 비교예 6 | 50 mM 소르비톨 0.2 w/w% 글리세롤 |
그 결과, 실시예 2는 바인딩 패드까지 도달한 핵산의 수율이 3.5 ㎍/ml로 측정된 반면, 비교예 4는 1.12 ㎍/ml, 비교예 5는 839.5 ng/ml, 및 비교예 6은 755.5 ng/ml 으로 실시예 1에 비해 수율이 현저히 낮았다.
제시된 실시 예들에 대한 설명은 임의의 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 이용하거나 또는 실시할 수 있도록 제공된다. 이러한 실시예들에 대한 다양한 변형들은 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 여기에 정의된 일반적인 원리들은 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 다른 실시예들에 적용될 수 있다. 그리하여, 본 발명은 여기에 제시된 실시예들로 한정되는 것이 아니라, 여기에 제시된 원리들 및 신규한 특징들과 일관되는 최광의의 범위에서 해석되어야 할 것이다.
1: RNA 추출 디바이스
110: 샘플 패드
120: 로딩 패드
130: 바인딩 패드
131: 페이퍼 멤브레인
140: 위킹 패드
150: 이송 패드
160: 지지체
180: 케이스
110: 샘플 패드
120: 로딩 패드
130: 바인딩 패드
131: 페이퍼 멤브레인
140: 위킹 패드
150: 이송 패드
160: 지지체
180: 케이스
Claims (12)
- RNA를 추출하고자 하는 샘플이 수용되는 샘플 패드;
상기 샘플 패드에 수용된 상기 샘플로부터 유출된 RNA를 운반하는 세척 버퍼가 수용되는 로딩 패드;
상기 세척 버퍼에 의해 운반된 RNA가 농축되는 바인딩 패드; 및
상기 바인딩 패드로 전개된 상기 세척 버퍼를 흡수하며, 상기 바인딩 패드의 다운스트림에 위치하는 위킹 패드;를 구비하는, RNA 추출 디바이스로,
상기 샘플 패드는 80 mM 내지 120 mM Tris·아세트산, 120 mM 내지 180 mM 염화나트륨, 0.8 w/w% 내지 1.2 w/w% Tween20, 0.8 mM 내지 1.2 mM EDTA, 3 w/w% 내지 7 w/w% 글리세롤, 및 1.5 내지 2.5 ㎍/ml RNase 저해제를 포함하는 세포 용해 조성물(lysis buffer)을 포함하고,
상기 세척 버퍼는 40 mM 내지 60 mM Tris·아세트산, 40 mM 내지 60 mM 염화나트륨, 0.3 w/w% 내지 0.8 w/w% Tween20, 및 0.8 mM 내지 1.2 mM EDTA를 포함하는 제1 세척 버퍼, 및 상기 제1 세척 버퍼에 0.8 U/㎕ 내지 1.2 U/㎕ DNase I 및 3 mM 내지 7 mM MgSO4를 더 포함하는 제2 세척 버퍼를 포함하고,
상기 바인딩 패드는 제1 결합물질이 결합된 페이퍼 멤브레인을 구비하고, 상기 페이퍼 멤브레인은 40 mM 내지 60 mM 소르비톨, 0.2 w/w% 내지 0.8 w/w% TritonX-20, 및 0.1 w/w% 내지 0.3 w/w% 글리세롤을 포함하는 것인, RNA 추출 디바이스. - 제1항에 있어서, 상기 바인딩 패드는 추출대상 RNA를 검출하기 위한 것으로서 제2 결합물질을 더 구비하고,
상기 제1 결합물질은 비오틴(Biotin) 및 스트렙트아비딘(Streptavidin)의 복합체이고, 상기 제2 결합물질은 비오틴 및 상기 추출대상 RNA에 상보적인 서열을 갖는 RNA 프로브(RNA probe)의 복합체인, RNA 추출 디바이스. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 로딩 패드, 샘플 패드, 바인딩 패드 및 위킹 패드가 순차적으로 상호 이격되게 나열된, RNA 추출 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드는 다공성 멤브레인(porous membrane)으로 이루어지며, 상기 세척 버퍼에 대한 흡수성을 갖는, RNA 추출 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 표면 상에 놓이는 지지체를 더 포함하는, RNA 추출 디바이스.
- 제7항에 있어서, 상기 지지체는 상기 세척 버퍼 및 추출대상 RNA가 흡수되지 않는 물질로 이루어진, RNA 추출 디바이스.
- 제1항에 있어서, 상기 로딩 패드, 상기 샘플 패드, 상기 바인딩 패드 및 상기 위킹 패드가 수용되는 케이스를 더 포함하는, RNA 추출 디바이스.
- 삭제
- 제9항에 있어서, 상기 케이스는, 상기 로딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 로딩 패드에 상기 세척 버퍼를 주입시키기 위한 버퍼 주입구;
상기 샘플 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 샘플 패드에 상기 샘플을 주입시키기 위한 샘플 주입구; 및
상기 바인딩 패드와 대응되는 위치에 형성되어, 상기 바인딩 패드에 농축된 RNA를 추출하기 위한 RNA 추출구를 포함하는, RNA 추출 디바이스. - 제1항의 RNA 추출 디바이스에서, 샘플 패드에 개체로부터 분리된 시료를 적용하는 단계;
상기 샘플 패드에 세척 버퍼를 적가하여 RNA를 바인딩 패드로 운반하는 단계; 및
상기 바인딩 패드로 부터 RNA를 수득하는 단계를 포함하는, RNA 추출 방법.
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