CN115078606B - 一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，包括以下步骤：S1.对虾糜样品进行粗脂提取，制得虾糜粗脂；S2.从虾糜粗脂中进行虾糜磷脂的分离纯化，制得虾糜磷脂；S3.对虾糜磷脂通过液相色谱‑质谱联用法进行液相色谱‑质谱分析，并结合化学计量学的方法对虾糜磷脂进行鉴别和定量分析，实现对虾糜样品的品种鉴别。它可以快速且准确地对虾糜品种进行鉴定，防止虾糜制品品种造假现象的发生。

Description

一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法

技术领域

本发明涉及一种鉴别虾糜制品品种的方法，特别是一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法。

背景技术

水产品是一类含有高蛋白低脂肪的食物，在我国动物产品消费中占有重要位置，其市场在逐步扩大，需求量也不断上升。目前，市面上销售的水产品主要分为鲜活类、冰冻类、熟制品类和干制品类。然而，随着水产品贸易全球化，食品供应链的多样化，水产品的掺假情况日益加剧，其品种和安全问题广泛受到关注。水产品的欺诈不仅破坏了其供应链的可信度，损害了消费者的利益，甚至可能引起食品种量安全问题。同时，含有天然毒素的物种以及含有不同潜在过敏原的物种会对部分消费群体的健康安全产生严重威胁。

水产品的种类繁多，近缘品种间可能存在营养价值和口感上的差异，且品种间经济价值有巨大的差别。水产品的欺诈形式多样，可能发生在从水产品捕捞、包装、运输、加工、到销售以及餐馆烹饪整个供应链中的任何阶段。有些欺诈情况的发生可能是无意的，如目前缺乏世界范围内的水产品命名统一标准，同一物种在不同地域可能存在不同的名称，加之大部分从业者缺乏区分外观形态相似的水产品品种的专业能力，从而使得近缘性物种极易被混淆。然而，另有一些不法商贩有意利用这一漏洞，通过掺假掺杂等方式来获得高额的收益。目前主要的欺诈手段有以下几种：贴错标签，写错产地来源，以养殖的冒充海捕野生的，在加工过程中以次充好等。其中虾糜制品营养丰富，口感风味俱佳，近年来受到消费者的广泛喜爱。但虾糜制品在加工后失去了虾品种原有的形态学特征，无法通过肉眼直接进行品种鉴别，这导致了品种造假情况的发生，而虾糜制品品种鉴别国家统一标准的缺乏则加剧了这一社会性问题的发生。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法。它可以快速且准确地对虾糜品种进行鉴定，防止虾糜制品品种造假现象的发生。

本发明的技术方案：一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法,其特征在于，包括以下步骤：

S1.对虾糜样品进行粗脂提取，制得虾糜粗脂；

S2.从虾糜粗脂中进行虾糜磷脂的分离纯化，制得虾糜磷脂；

S3.对虾糜磷脂通过液相色谱-质谱联用法进行液相色谱-质谱分析，并结合化学计量学的方法对虾糜磷脂进行鉴别和定量分析，实现对虾糜样品的品种鉴别。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法中，所述的S1为将虾糜样品放入粗脂提取瓶，并通过离心机实现粗脂提取，粗脂提取瓶包括带瓶盖的瓶体，瓶体中部设有反应腔，反应腔一侧自上而下依次设有带提取剂的提取腔、带分离剂的分离腔，反应腔另一侧自上而下依次设有带第一萃取剂的第一萃取腔、带第二萃取剂的第二萃取腔、带第三萃取剂的第三萃取腔，提取腔、分离腔、第一萃取腔、第二萃取腔和第三萃取腔内设有与垂直于反应腔的推杆，推杆一侧设有用于实现与反应腔隔绝的密封圈，推杆另一侧设有按钮，反应腔下侧设有排液口，排液口下侧设有排液机构。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法中，所述的瓶体两侧设有与按钮相对应的安装孔，安装孔内设有复位弹簧，复位弹簧一端连接安装孔，复位弹簧另一端连接按钮。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法中，所述的排液机构包括排液块，排液块上设有与排液口相对应的流道，排液块两侧设有拨杆，瓶体内设有与拨杆相对应的导向槽。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法中，所述的提取剂为以质量比计48份的氯仿-甲醇混合液，分离剂为以质量比计24份的超纯水，第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂为以质量比计35份的氯仿。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法中，所述的虾糜样品加入量为以质量比计6份的虾糜样品，加入后盖上瓶盖，向推动提取腔中的推杆，使提取剂进入反应腔，推杆会在复位弹簧的作用下实现复位，接着通过超声辅助对虾糜样品进行提取，提取时间为30分钟，然后通过推杆将分离剂添加到反应腔，并用8000r/min高速冷冻离心15min，接着通过转动拨杆将排液块上的流道与排液口对齐，使下层有机相能转移出来，接着通过推杆将第一萃取剂加入到反应腔中，实现对反应腔中余下上清液和固形物的萃取，将下层有机相通过排液块排出，接着通过推杆将第二萃取剂加入到反应腔，再次萃取，将下层有机相再次通过排液块排出，最后通过推杆将第三萃取剂加入到反应腔，完成最终萃取，将下层有机相通过排液块排出，将合并后的下层有机相转移至提取容器中，使用旋转蒸发仪在55℃下使氯仿蒸发，提取容器中的残留物即为虾糜粗脂。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法中，所述的S2中虾糜磷脂制备的具体过程为：虾糜粗脂中加入丙酮，充分振荡，萃取，然后以8000r/min冷冻离心10min，取出上清液，将离心管中剩余的沉淀用氮吹仪吹干，分离纯化得到虾糜磷脂。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，所述的S3中对虾糜磷脂通过液相色谱-质谱联用法进行液相色谱-质谱分析中，液相色谱分析中采用乙腈-水溶液体系作为流动相，并在流动相中加入了甲酸，且流动相的流速为600μL·min^-1，色谱柱的柱温为30℃。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，所述的S3中对虾糜磷脂通过液相色谱-质谱联用法进行色谱-质谱分析中，质谱分析中采用负离子模式进行检测，检测的范围设置为600-1000Da，喷雾电压(IS)设置为-4500V，去簇电压(DP)为-70V，射入电压(EP)为20V，碰撞电压(CE)为-20V。

前述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，所述的S3中化学计量学分析的具体过程如下：基于化学计量学对液相色谱-质谱联用法得到的虾糜磷脂数据进行统计分析，对虾糜磷脂进行鉴别和定量分析，构建了PCA，OPLS-DA和聚类热图模型。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明使用液相色谱-质谱联用法与化学计量学相结合的方法，首次用于虾糜制品品种的鉴别，通过对虾糜样品中磷脂分子的鉴别和分析，实现品种的区分，液相色谱-质谱联用法检测准确灵敏，可以实现定性定量分析，对虾糜产品检测准确；

2、本发明使用粗脂提取瓶用于粗脂提取，粗脂提取过程中所需原料可以直接储存于粗脂提取瓶中，控制检测中的变量，减小检测中的误差；

3、本发明粗脂制备的过程中，离心后的下层液体可以通过排液口与反应腔的排液口对齐，实现下层液体的排出，避免分层液体多次取出的过程中，产生较大的检测误差。

附图说明

图1为相色谱-质谱联用法测得数据制得的PCA，OPLS-DA模型；

图2为相色谱-质谱联用法测得数据制得的聚类热图模型；

图3为不同流动相流速下磷脂响应值液相图；

图4为不同色谱柱柱温下磷脂响应值液相图；

图5为粗脂提取瓶的剖视图；

图6为粗脂提取瓶的结构示意图。

附图中的标记为：1-瓶盖，2-瓶体，3-反应腔，4-提取腔，5-分离腔，6-第一萃取腔，7-第二萃取腔，8-第三萃取腔，9-推杆，10-密封圈，12-按钮，13-安装孔，14-复位弹簧，15-排液口，16-排液块，17-流道，18-拨杆，19-导向槽。

本申请人作了一系列实验,可以证实本发明提供的方法有效可控，可以准确检测虾糜品种。

实验例1，

对液相色谱条件优化因素实验。

实验方法1，液相色谱分析中分别采用不同流速的流动相，其余条件保持一致，流动相流速分别为150μL·min^-1、300μL·min^-1、450μL·min^-1、600μL·min^-1、750μL·min^-1，检测虾糜磷脂响应值。

不同流动相流速下磷脂响应值液相图如图3所示,其中PC 14:0/14:0、PE 15:0/15:0、PS 14:0/14:0以及PI 16:0/16:0为四种磷脂标准品，图3数据表明在流动相的流速为600μL·min^-1时磷脂响应值最好。

实验方法2，液相色谱分析中调节色谱柱柱温，使色谱柱柱温不同，其余条件保持一致，色谱柱柱温分别为20℃、30℃、40℃，检测虾糜磷脂响应值。

不同色谱柱柱温下磷脂响应值液相图如图4所示,其中PC 14:0/14:0、PE 15:0/15:0、PS 14:0/14:0以及PI 16:0/16:0为四种磷脂标准品，图4数据表明在色谱柱柱温分别为30℃时磷脂响应值最好。

具体实施方式

实施例1，从超市购买常见的虾，包括以下品种：斑节对虾、哈氏仿对虾、凡纳滨对虾、刀额新对虾、中国明对虾、日本对虾和中华管鞭虾，将上述虾制备成虾糜样品，虾糜样品的制备流程如下，将虾去头去壳，去除虾线(内脏)，保留虾肉。用纯水将虾肉洗净，用吸水纸去除表面残留的水分，待用。该过程于1h内完成，取上述处理后的虾肉，切小块，在4-10℃的温度下空擂30s后，加入2％食用盐擂溃60s，直至虾糜呈灰色粘稠，制成虾糜，置于-20℃冰箱中贮藏待用。虾糜样品的制备：将上述虾糜样品放置于50mL离心管中，以6,000r/min高速冷冻离心3min，去除气泡。先在40℃下水浴加热30min后，在90℃下水浴加热10min，用吸水纸去除表面残余水分，待用。对虾糜样品进行粗脂提取，制得虾糜粗脂，从虾糜粗脂中进行虾糜磷脂的分离纯化，制得虾糜磷脂对虾糜磷脂通过液相色谱-质谱联用法进行液相色谱-质谱分析，其中液相色谱分析为采用1100型高效液相色谱仪进行液相分析，该设备配有真空脱气机、自动进样器、柱室以及四元泵。色谱柱采用Cosmosil亲水作用色谱柱(4.6×150mm,5μm)进行磷脂的分离，柱温保持在30℃。流动相A(水相)为含有0.1％甲酸和20mmol·L^-1的甲酸铵的水溶液(pH 4.0左右)，流动相B(有机相)为含有0.1％甲酸的乙腈溶液(pH 4.0-4.5)，采用梯度洗脱程序：0-3min，保持5％流动相A；3-13min，将流动相A从5％增加到30％；13-18min，将流动相A从30％增加到50％；18-21min，保持50％流动相A；21-25min，将流动相A从50％增加到95％，然后保持5min。流动相流速设置为600μL·min^-1，每次的进样量设置为2μL。在每次进样之前，用50％流动相A对色谱柱进行清洗，并重新调节至初始条件，平衡5min后再进样。在实验结束后，清洗色谱柱和仪器管路，平衡30min后再关机，并结合化学计量学的方法对虾糜磷脂进行鉴别和定量分析，实现对虾糜样品的品种鉴别，建立如图1-2所示的主成分分析(PCA)模型、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型以及聚类热图模型，图2中a组由凡纳滨对虾虾糜、中国明对虾虾糜、斑节对虾虾糜组成，而另b组则由日本对虾虾糜、中华管鞭虾虾糜、哈氏仿对虾虾糜和刀额新对虾虾糜组成，其中A为斑节对虾虾糜；B为哈氏仿对虾虾糜；C为凡纳滨对虾虾糜；D为刀额新对虾虾糜；E为中国明对虾虾糜；F为日本对虾虾糜；G为中华管鞭虾虾糜，对虾糜样品的磷脂分子差异进一步分析以实现对虾糜品种的鉴别,从图1中可以得知，虾糜样品在图中很好地分成了七个特征簇，这意味着样本在空间上分布良好，并且构建的PCA模型非常可靠，在PCA分析的基础上，建立OPLS-DA模型进一步揭示了有助于鉴别这七种虾糜样品的潜在磷脂的分子种类，图1d中VIP>1的变量被认为是分类的有效指标；接着用方法学验证，以凡纳滨对虾虾糜样品作为代表，脂肪酸离子(m/z 255.2、279.2、301.2和327.2)和磷脂离子(m/z 699.5和742.5)被选为代表离子。通过同一天内对同一虾糜样品重复电离测试5次来计算日内相对标准偏差，日间相对标准偏差则通过连续5天每天各检测一次的方式来计算，结果如下表所示。代表离子日内差异的RSD小于8.05％，日间差异的RSD在5.93％-8.03％范围内，证明该方法的精密度高，能够得到稳定、准确的数据结果，且具有良好的重复性。

其中，虾糜粗脂的提取过程中，使用了粗脂提取瓶，粗脂提取瓶可以控制检测中的变量，减少检测中的人工误差，在使用的过程中，虾糜样品可以通过打开瓶盖1从加入到瓶体2内的反应腔3中，然后按下按钮12，按钮12通过推杆9带动密封圈10向反应腔3轴心方向运动，从而提取腔4内的提取液可以从提取腔4流入到反应腔3中，推杆9推动的过程中，安装孔13与提取腔4、分离腔5、第一萃取腔6、第二萃取腔7和第三萃取腔8间的瓶壁上设有推杆9运动的导向孔，导向孔上设有密封层，并在超声辅助下提取30分钟，接着推动分离腔5中的推杆9，使分离剂进入到反应腔3中，并用8000r/min高速冷冻离心15min，下层有机相可以通过排液机构排出，通过转动拨杆18使排液块16中的流道17与排液口15对齐，使反应腔3内的下层液体能方便有序的取出，避免倒出取液时不同分层的液体再次混合，影响测试结果，接着按下第一萃取腔6对应的按钮12，使第一萃取腔6内的第一萃取剂流入到反应腔3中，通过第一萃取剂对反应腔3残留的上清液和固形物进行萃取，萃取完成后通过排液机构将下层有机相取出，第二萃取腔7内的第二萃取剂和第三萃取腔8内的第三萃取剂可以实现多次萃取，步骤与第一萃取腔6中第一萃取剂萃取步骤一致，最后将合并后的下层有机相转移至提取容器中，使用旋转蒸发仪在55℃下使氯仿蒸发，提取容器中的残留物即为虾糜粗脂。这样的粗脂提取瓶可以避免实验过程中人工添加各试剂时产生的误差，并且提高工作人员的效率，使粗脂提取速度增加，可以控制测试中的变量，检测标准化，对于测定结果更为准确，结果更专业。

Claims (7)

1.一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法,其特征在于：包括以下步骤：

S1.对虾糜样品进行粗脂提取，制得虾糜粗脂，粗脂提取过程包括将虾糜样品放入粗脂提取瓶，并通过离心机实现粗脂提取，粗脂提取瓶包括带瓶盖(1)的瓶体(2)，瓶体(2)中部设有反应腔(3)，反应腔(3)一侧自上而下依次设有带提取剂的提取腔(4)、带分离剂的分离腔(5)，反应腔另一侧自上而下依次设有带第一萃取剂的第一萃取腔(6)、带第二萃取剂的第二萃取腔(7)、带第三萃取剂的第三萃取腔(8)，提取腔(4)、分离腔(5)、第一萃取腔(6)、第二萃取腔(7)和第三萃取腔(8)内设有与垂直于反应腔(3)的推杆(9)，推杆(9)一侧设有用于实现与反应腔(3)隔绝的密封圈(10)，推杆(9)另一侧设有按钮(12)，反应腔(3)下侧设有排液口(15)，排液口(15)下侧设有排液机构；

所述的瓶体(2)两侧设有与按钮(12)相对应的安装孔(13)，安装孔(13)内设有复位弹簧(14)，复位弹簧(14)一端连接安装孔(13)，复位弹簧(14)另一端连接按钮(12)；

所述的排液机构包括排液块(16)，排液块(16)上设有与排液口(15)相对应的流道(17)，排液块(16)两侧设有拨杆(18)，瓶体(2)内设有与拨杆(18)相对应的导向槽(19)；

S2.从虾糜粗脂中进行虾糜磷脂的分离纯化，制得虾糜磷脂；

S3.对虾糜磷脂通过液相色谱-质谱联用法进行液相色谱-质谱分析，并结合化学计量学的方法对虾糜磷脂进行鉴别和定量分析，实现对虾糜样品的品种鉴别。

2.根据权利要求1所述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，其特征在于，所述的提取剂为以质量比计48份的氯仿-甲醇混合液，分离剂为以质量比计24份的超纯水，第一萃取剂、第二萃取剂和第三萃取剂为以质量比计35份的氯仿。

3.根据权利要求1所述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，其特征在于，所述的虾糜样品加入量为以质量比计6份的虾糜样品，加入后盖上瓶盖(1)，向推动提取腔(4)中的推杆(9)，使提取剂进入反应腔(3)，推杆(9)会在复位弹簧(14)的作用下实现复位，接着通过超声辅助对虾糜样品进行提取，提取时间为30分钟，然后通过推杆(9)将分离剂添加到反应腔(3)，并用8000r/min高速冷冻离心15min，接着通过转动拨杆(18)将排液块(16)上的流道(17)与排液口(15)对齐，使下层有机相能转移出来，接着通过推杆(9)将第一萃取剂加入到反应腔(3)中，实现对反应腔中余下上清液和固形物的萃取，将下层有机相通过排液块(16)排出，接着通过推杆(9)将第二萃取剂加入到反应腔(3)，再次萃取，将下层有机相再次通过排液块(16)排出，最后通过推杆(9)将第三萃取剂加入到反应腔(3)，完成最终萃取，将下层有机相通过排液块(16)排出，将合并后的下层有机相转移至提取容器中，使用旋转蒸发仪在55℃下使氯仿蒸发，提取容器中的残留物即为虾糜粗脂。

4.根据权利要求1所述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，其特征在于，所述的S2中虾糜磷脂制备的具体过程为：虾糜粗脂中加入丙酮，充分振荡，萃取，然后以8000r/min冷冻离心10min，取出上清液，将离心管中剩余的沉淀用氮吹仪吹干，分离纯化得到虾糜磷脂。

5.根据权利要求1所述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，其特征在于，所述的S3中对虾糜磷脂通过液相色谱-质谱联用法进行液相色谱-质谱分析中，液相色谱分析中采用乙腈-水溶液体系作为流动相，并在流动相中加入了甲酸，且流动相的流速为600μL·min^-1，色谱柱的柱温为30℃。

6.根据权利要求1所述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，其特征在于，所述的S3中对虾糜磷脂通过液相色谱-质谱联用法进行色谱-质谱分析中，质谱分析中采用负离子模式进行检测，检测的范围设置为600-1000Da，喷雾电压(IS)设置为-4500V，去簇电压(DP)为-70V，射入电压(EP)为20V，碰撞电压(CE)为-20V。

7.根据权利要求1所述的一种基于脂质组学鉴定虾糜制品品种的方法，其特征在于，所述的S3中化学计量学分析的具体过程如下：基于化学计量学对液相色谱-质谱联用法得到的虾糜磷脂数据进行统计分析，对虾糜磷脂进行鉴别和定量分析，构建了PCA，OPLS-DA和聚类热图模型。

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