CN105223222B - 一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法 - Google Patents
一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105223222B CN105223222B CN201510746056.6A CN201510746056A CN105223222B CN 105223222 B CN105223222 B CN 105223222B CN 201510746056 A CN201510746056 A CN 201510746056A CN 105223222 B CN105223222 B CN 105223222B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nmr
- data
- acid
- sample
- analysis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 241000206607 Porphyra umbilicalis Species 0.000 title description 49
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 claims abstract description 45
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 claims abstract description 18
- 241001480978 Pyropia haitanensis Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000005311 nuclear magnetism Effects 0.000 claims abstract 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 claims description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 14
- XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N taurine Chemical compound NCCS(O)(=O)=O XOAAWQZATWQOTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N glycine betaine Chemical compound C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N isethionic acid Chemical compound OCCS(O)(=O)=O SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 9
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960003080 taurine Drugs 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 6
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 6
- 238000002790 cross-validation Methods 0.000 claims description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 claims description 6
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 6
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 241001474374 Blennius Species 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 5
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 5
- 229940045996 isethionic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 3
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 3
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 claims description 3
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 claims description 3
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 claims description 3
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000001551 total correlation spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 3
- IWBTVBUNSFJIIE-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-hydroxypentanoic acid Chemical class NCCCC(O)C(O)=O IWBTVBUNSFJIIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 2
- 229940032330 sulfuric acid Drugs 0.000 claims description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 claims 2
- BWHGMFYTDQEALD-UHFFFAOYSA-N 5-amino-2-oxopentanoic acid Chemical class [NH3+]CCCC(=O)C([O-])=O BWHGMFYTDQEALD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- FSKVGWXINKZUKS-UHFFFAOYSA-M Betaine Aldehyde Chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CC=O FSKVGWXINKZUKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 claims 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 claims 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 claims 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 claims 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 claims 1
- 150000008131 glucosides Chemical class 0.000 claims 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims 1
- QMPSBIWJVUCDKV-UHFFFAOYSA-N methyl 2-methylsulfanylpropanoate Chemical compound COC(=O)C(C)SC QMPSBIWJVUCDKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229960005137 succinic acid Drugs 0.000 claims 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 claims 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 claims 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 claims 1
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 abstract description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010239 partial least squares discriminant analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 abstract description 3
- 241000206609 Porphyra Species 0.000 description 15
- 150000004682 monohydrates Chemical class 0.000 description 10
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 9
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 7
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 6
- 150000004684 trihydrates Chemical class 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 5
- LGBPWIAXPVUTMY-JLAZNSOCSA-N (2r)-3,4-dihydroxy-2-[(1s)-1-hydroxyethyl]-2h-furan-5-one Chemical compound C[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O LGBPWIAXPVUTMY-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-fucose Chemical compound C[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 4
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 3
- WXCQAWGXWVRCGP-UHFFFAOYSA-N choline sulfate Chemical compound C[N+](C)(C)CCOS([O-])(=O)=O WXCQAWGXWVRCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 3
- NHGQBOQYUPIPCD-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-sulfanylbutanoic acid Chemical compound CCC(C)(S)C(O)=O NHGQBOQYUPIPCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- SXKNCCSPZDCRFD-UHFFFAOYSA-N betaine aldehyde Chemical compound C[N+](C)(C)CC=O SXKNCCSPZDCRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 description 2
- GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N methanol;hydrate Chemical compound O.OC GBMDVOWEEQVZKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CEOQIIPQXIIEQT-PQYRJTSOSA-N (2r)-2-[(1s)-1,2-dihydroxyethyl]-3,4-dihydroxy-2h-furan-5-one;dihydrate Chemical compound O.O.OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CEOQIIPQXIIEQT-PQYRJTSOSA-N 0.000 description 1
- 230000005791 algae growth Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N monobenzone Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1OCC1=CC=CC=C1 VYQNWZOUAUKGHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001208 nuclear magnetic resonance pulse sequence Methods 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- FUHPCDQQVWLRRY-UHFFFAOYSA-N valerenic acid Natural products CC1CCC(C=C(/C)C(=O)O)C2C1CC=C2C FUHPCDQQVWLRRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种鉴别不同收获期坛紫菜的方法，依次包括预处理、破碎、离心、抽滤、真空冷冻干燥、核磁谱采集、数据分析和鉴别。对待鉴定的样品所有一维1H‑NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并经过信号归属、调整相位、基线校正、定标以及积分等处理后，采用SIMCA‑P+软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析。然后对NMR数据进行主成分分析对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量。不同收获期坛紫菜的提取物的NMR数据的PCA分析结果中则区分明显，前期采割的紫菜与中期采割的紫菜主要体现在PC2上的区分，而后期采割的紫菜与前期和中期采割的紫菜主要体现在PC1上的区分。
Description
技术领域
本发明属于藻类生长期检测技术领域，具体涉及一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法。
背景技术
坛紫菜(Pyropia haitanensis)属红藻类，为我国人工养殖的主要海藻品种之一，是一种理想的高蛋白、低脂肪的食品，富含多种氨基酸及无机盐，为广大消费者喜爱。但紫菜的收割期持续时间较长，不同收割期紫菜的品质不同，市场价格相差较大。一般来说，第一次采割(时间大约在11月中旬)的紫菜叫一水紫菜，第二次采割(时间大约在12月下旬)的紫菜叫二水紫菜，而第三次采割(时间大约在翌年的1月下旬)的紫菜叫三水紫菜。但消费者很难从形态上分辨不同收获期的紫菜，因此，有必要提供一种有效的检测不同收获期坛紫菜的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明通过核磁共振技术分析未知收获期的紫菜样品所含的代谢物，再借助多变量统计方法分析未知样品与已知收获期的紫菜样品的聚类情况，来判别未知样品所属的收获期。
本发明的方法，包括如下的步骤：
1)待检测坛紫菜的预处理
将待检测的坛紫菜样品清洗后，沥水后置于阴凉处去除表面水分；
2)细胞破壁：
将待检测的坛紫菜样品加入甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为2：1)中进行细胞破碎，使坛紫菜叶片破碎后的粒径达到20μm以下来实现细胞的破壁；
3)离心：
将步骤2)破碎后的样品在10000r/min-15000r/min、0℃-4℃下离心，抽取上清液，残渣中加入甲醇水溶液(甲醇水体积比为2：1)，振荡混匀，重复上述操作3-4次，合并上清液；
4)抽滤：
将制备的上清液常温下于0.09MPa以上真空度下去除甲醇；
5)真空冷冻干燥：
将上述真空抽滤后的样品在-20℃进行冻结后，进行真空冷冻干燥至水分含量达到2％以下得到样品；
6)核磁谱采集：
取上述真空冷冻干燥的样品加入磷酸缓冲溶液进行离心(离心条件如下：10000r/min-15000r/min，0℃-4℃，5min-20min)得到上清液，上清液在核磁核磁共振仪为400MHz以上的核磁共振波谱仪进行小分子代谢物的检测，得到一维1H NMR谱数据；
上述磷酸缓冲液(pH 7.4)的组成如下：0.2964％NaH2PO4·2H2O，1.8486％K2HPO4·3H2O，0.1％NaN3、0.005％TSP和90％D2O；余量为水。
所述核磁共振技术鉴定参数如下：使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一维1H NMR谱，在该序列中的等待时间(RD，2s)和混合时间(tm，100ms)施加强度约50Hz的低功率连续波进行水峰抑制，每一个样品的90°脉冲宽度均设置约10s，谱宽设置为20ppm，采样点数32K，FID累加64次；
所述的坛紫菜特征小分子代谢物是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、海带醇、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、苏氨酸、丙氨酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、2-氧代-5-氨基缬草酸、乙酸、谷氨酸、苹果酸、苹果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、柠檬酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲基巯基丙酸、天冬酰胺、γ-氨基丁酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、甜菜碱醛、甘氨酸、异红藻糖苷和红藻糖苷。
7)数据分析：
为对待鉴定的样品的所有一维1H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对检测到的物质进行了归属；以内标物(TSP，0ppm)对所有一维1H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱(0.8-5.3)进行分段积分，积分区间为2.4Hz；去除残存的水信号(4.6-4.9)和甲醇信号(3.3-3.4)所在的积分区间之后，设置整个谱的积分面积总和为1，对每个积分区间的数据进行归一化处理；采用SIMCA-P+软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析；为获得各组样品的聚类情况和检测离群点，首先对NMR数据进行主成分分析(PCA)，在PCA处理中选用标准化的数据处理模式；为了进一步得到对组间区分具有显著性贡献的化合物，对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量。采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性；在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用MATLAB软件可获得OPLS-DA模型的载荷图；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量(X)和分组变量(Y)之间的皮尔森积差相关系数(r)；
8)样品收获期的鉴别：
根据步骤7)得到的坛紫菜提取物的NMR数据的PCA模型的结果分析，其中PCA模型的PC1解释80％-85％的变量，而PC2解释10％-15％的变量；其中，前期采割的紫菜与中期采割的紫菜体现在PC2上的区分，而后期采割的紫菜要体现在PC1上的区分。
本发明通过核磁共振氢谱法测定不同收获期坛紫菜总提取物中小分子物质的变化，前处理方法简单，检测速度快，不同海域不同时期的坛紫菜具有很好的重现性和高度的特征性。
附图说明
图1：基于核磁共振方法鉴别不同收获期坛紫菜的方法流程图。
图2：实施例1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜提取物的1HNMR谱。
图3：为实施例:1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜提取物的PCA得分图。
图4：实施例1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜提取物的OPLS-DA得分图(左)和相关系数图(右)。
具体实施方式
本发明使用的核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，简称NMR)是指具有固定磁矩的原子核，如1H、13C、31P、19F、15N、129Xe等，在恒定磁场与交变磁场的作用下，与交变磁场发生能量交换的现象。
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
如图1所示，本实施例中通过核磁共振技术对采割于11月的第一批(下文简称一水)、采割于12月的第二批(下文简称二水)、采割于翌年1月的第三批(下文简称三水)坛紫菜进行鉴别的方法，依次包括预处理、破碎、离心、抽滤、真空冷冻干燥、核磁谱采集、数据分析和鉴别，其具体步骤如下：
1)预处理步骤为：分别将一水、二水和三水坛紫菜经二级沙滤海水清洗后，沥水后置于阴凉处吹去表面水分。
2)破碎步骤为：分别取经预处理的一水、二水、三水坛紫菜，称量0.1g至2mL的离心管中，加入甲醇水溶液(甲醇水的体积比＝2：1)1mL，选取破碎转速5000r/min，每次45s，循环15次，进行细胞破碎，使破碎后紫菜粒径达到20μm以下，每个样品平行数目为10。
3)离心步骤为：将上述破碎后样品进行离心，转速12000r/min，4℃，10min，抽取上清液，残渣中加入甲醇水溶液(甲醇水体积比为2：1)1mL，振荡混匀，重复上述操作3-4次，合并上清液。
4)抽滤步骤为：合并离心过程中所取上清液，放入真空干燥箱进行抽滤，真空度0.095MPa，室温条件，以去除甲醇。
5)真空冷冻干燥步骤为：将抽滤结束的上清液放入-20℃的冰箱冻结12h，然后取出进行真空冷冻干燥48h，至水分含量达到2％以下，结束后密封放入-20℃冰箱冻藏备用。
6)核磁谱采集步骤为：取经真空冷冻干燥的样品至2毫升的离心管中，加入600uL磷酸缓冲溶液(K2HPO4/NaH2PO4，0.1M，pH 7.4)，于4℃，10000r/min，10min条件下进行离心后，取上清液550uL于2mL的核磁管内，使用600MHz核磁共振波谱仪进行采集。
数据分析步骤为：对待鉴定的样品的所有一维1H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对检测到的物质进行了归属。有代表性的一水、二水和三水的紫菜核磁谱见图2。本发明共检测到31种代谢物，包括亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、海带醇、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、苏氨酸、丙氨酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、2-氧代-5-氨基缬草酸、乙酸、谷氨酸、苹果酸、苹果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、柠檬酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲基巯基丙酸、天冬酰胺、γ-氨基丁酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、甜菜碱醛、甘氨酸、异红藻糖苷和红藻糖苷。这些代谢物的详细NMR信息见表1。
以内标物(TSP，0ppm)对所有一维1H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱(0.8-5.3)进行分段积分，积分区间为2.4Hz。去除残存的水信号(4.6-4.9)和甲醇信号(3.3-3.4)所在的积分区间之后，设置整个谱的积分面积总和为1，对每个积分区间的数据进行归一化处理。采用SIMCA-P+软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析。为获得各组样品的聚类情况和检测离群点，首先对NMR数据进行主成分分析(PCA)，在PCA处理中选用标准化的数据处理模式。本发明得到的PCA图见图3，图中星号代表一水紫菜(H1)，圆圈代表二水紫菜(H2)，菱形代表三水紫菜(H3)。每一个符号(即星号、圆圈或菱形)代表一个紫菜样品的一个一维1H核磁谱。PC1表示主成分1，PC2表示主成分2。在这个PCA模型中，PC1解释了81.1％的变量，而PC2解释了10.7％的变量。从这个PCA图可以看出，三水紫菜(H3组)和前面两次收割的紫菜(H1组和H2组)在PC1上有明显区分，说明三水紫菜的代谢物与前两组相差较大。但一水紫菜(H1组)与二水紫菜(H2组)在PC2上有明显区分，说明这两组紫菜所含的代谢物也存在差异，只是这种差异没有与三水紫菜大。
为了进一步得到对组间区分具有显著性贡献的代谢物，对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，结果见图4。该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量。采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性。R2和Q2值可分别指示模型的可预测能力和质量，而CV-ANOVA的分析结果也同时符合p<0.05时，模型才可靠。在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用MATLAB软件可获得OPLS-DA模型的载荷图。载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量(X)和分组变量(Y)之间的皮尔森积差相关系数(r)。本研究采用的是相关系数的绝对值(|r|)，只有当|r|大于0.602时，其相应的代谢物才对组间区分具有显著性贡献(n＝10，p<0.05)。本发明得到3个OPLS-DA模型，分别是一水、二水和三水紫菜之间的两两比较模型，图中A、B和C表示OPLS-DA的得分图，而D、E和F分别表示A、B和C的载荷图。这A、B和C模型的Q2值分别是0.94、0.97和0.98，p值分别是4.2×10-9、3.9×10-11和8.7×10-12，表示这3个模型是可靠的。D、E和F图中列出的数字代表对区分不同收获期的紫菜具有显著意义的代谢物。这些代谢物包括亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、羟乙基磺酸、海带醇、甜菜碱、胆碱-O-硫酸、异红藻糖苷和红藻糖苷(图4)。2-羟基-5-氨基缬草酸、羟乙基磺酸、海带醇、甜菜碱、胆碱-O-硫酸、亮氨酸以及乳酸的含量随着采割时间的推迟呈显著降低，而丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、红藻糖苷以及6-脱氧-抗坏血酸的含量随着采割时间的推迟呈显著升高。这些物质的含量变化是鉴别一水、二水和三水坛紫菜的物质依据。这些代谢物的具体相关系数值列于表2。
7)鉴别，即基于上述数据分析得出一水、二水、三水坛紫菜的鉴别方法，即根据一水、二水和三水坛紫菜的PCA图中各组的聚类情况进行判别，聚为一组的样品都来自同一个采割期。本发明中的PCA结果表明，三组坛紫菜根据采割期分别聚成一组，而且一水坛紫菜(H1组)和二水坛紫菜(H2组)的代谢物组成差异较小，而与三水紫菜(H3组)的代谢物组成差异较大。这种组间的代谢物差异主要体现在以下几个方面。1、与一水坛紫菜相比，二水坛紫菜具有较高水平的天冬氨酸、牛磺酸、异红藻糖苷和红藻糖苷，而较低水平的亮氨酸、海带醇、2-羟基-5-氨基缬草酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸和甜菜碱；2、与一水和二水坛紫菜相比，三水坛紫菜具有较高水平的6-脱氧-抗坏血酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和牛磺酸，而较低水平的乳酸、2-羟基-5-氨基缬草酸和异红藻糖苷。
表1：新鲜坛紫菜小分子物质的NMR信号归属。
注：a：多重性；s：单峰；d：双峰；t：三重峰；q：四重峰；dd：双重二重峰；m：多重峰；#：未能确定的信号或多重性。
表2：实施例1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜中显著相关的物质。
注：a相关系数，正值和负值分别表示正相关和负相关。0.602作为相关系数是否具有显著性差异的临界值。“-”表示相关系数的绝对值小于临界值。
对于未知收获期的坛紫菜，可以通过本发明所述的方法进行辨别。具体来说，对未知样品和已知的不同收获期的样品进行NMR分析，对采集到的所有一维1H-NMR谱进行PCA分析，看未知样品与哪个收获期的样品聚类在一起，从而判断该未知样品的收获时间。
Claims (4)
1.一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)待检测坛紫菜的预处理
将待检测的坛紫菜样品清洗后，沥水后置于阴凉处去除表面水分；
2)细胞破壁：
将待检测的坛紫菜样品加入甲醇水溶液中进行细胞破碎，使坛紫菜叶片破碎后的粒径达到20μm以下来实现细胞的破壁；
3)离心：
将步骤2)破碎后的样品在10000r/min-15000r/min、0℃-4℃下离心，抽取上清液，残渣中加入甲醇水溶液，振荡混匀，重复上述操作3-4次，合并上清液；
4)抽滤：
将制备的上清液常温下于0.09MPa以上真空度下去除甲醇；
5)真空冷冻干燥：
将上述抽滤后的样品在-20℃进行冻结后，进行真空冷冻干燥至水分含量达到2％以下得到样品；
6)核磁谱采集：
取上述真空冷冻干燥的样品加入磷酸缓冲溶液进行离心得到上清液，上清液在核磁核磁共振仪为400MHz以上的核磁共振波谱仪进行坛紫菜特征小分子代谢物的检测，得到一维1H NMR谱数据；
所述核磁共振技术鉴定参数如下：使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一维1H NMR谱，在该序列中的等待时间RD为2s，混合时间tm为100ms，施加强度50Hz的低功率连续波进行水峰抑制，每一个样品的90°脉冲宽度均设置10s，谱宽设置为20ppm，采样点数32K，FID累加64次；
所述的坛紫菜特征小分子代谢物是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、海带醇、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、苏氨酸、丙氨酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、2-氧代-5-氨基缬草酸、乙酸、谷氨酸、苹果酸、苹果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、柠檬酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲基巯基丙酸、天冬酰胺、γ-氨基丁酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、甜菜碱醛、甘氨酸、异红藻糖苷和红藻糖苷；
7)数据分析：
为对待鉴定的样品的所有一维1H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对检测到的物质进行了归属；以内标物TSP对所有一维1H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱0.8-5.3进行分段积分，积分区间为2.4Hz；去除残存的水信号4.6-4.9和甲醇信号3.3-3.4所在的积分区间之后，设置整个谱的积分面积总和为1，对每个积分区间的数据进行归一化处理；采用SIMCA-P+软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析；为获得各组样品的聚类情况和检测离群点，首先对NMR数据进行主成分分析，在主成分分析处理中选用标准化的数据处理模式；为了进一步得到对组间区分具有显著性贡献的化合物，对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量；采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性；在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用MATLAB软件获得OPLS-DA模型的载荷图；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量X和分组变量Y之间的皮尔森积差相关系数r；
8)样品收获期的鉴别：
根据步骤7)得到的坛紫菜提取物的NMR数据的PCA模型的结果分析，其中PCA模型的PC1解释80％-85％的变量，而PC2解释10％-15％的变量；其中，前期采割的紫菜与中期采割的紫菜体现在PC2上的区分，而后期采割的紫菜要体现在PC1上的区分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)和步骤3)中所使用的甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为2：1。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤6)中的离心条件如下：10000r/min-15000r/min，0℃-4℃，5min-20min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤6)中的磷酸缓冲液的组成如下：0.2964％NaH2PO4·2H2O，1.8486％K2HPO4·3H2O、0.1％NaN3、0.005％TSP和90％D2O，pH 7.4。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510746056.6A CN105223222B (zh) | 2015-11-04 | 2015-11-04 | 一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510746056.6A CN105223222B (zh) | 2015-11-04 | 2015-11-04 | 一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105223222A CN105223222A (zh) | 2016-01-06 |
| CN105223222B true CN105223222B (zh) | 2017-05-10 |
Family
ID=54992295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510746056.6A Expired - Fee Related CN105223222B (zh) | 2015-11-04 | 2015-11-04 | 一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105223222B (zh) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106950241B (zh) * | 2017-02-27 | 2019-10-01 | 南昌大学 | 一种预测茶油中其他掺杂油种类及含量的方法 |
| CN106770875A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-05-31 | 江南大学 | 基于代谢组学研究手段进行葡萄酒产地识别的方法 |
| CN107727680A (zh) * | 2017-11-22 | 2018-02-23 | 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于nmr代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法 |
| CN107941839A (zh) * | 2017-11-22 | 2018-04-20 | 河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 一种基于nmr代谢组学技术鉴别草莓品种的方法 |
| CN108490016A (zh) * | 2018-02-07 | 2018-09-04 | 山西大学 | 一种酸枣仁和滇枣仁的鉴别方法 |
| CN108426910B (zh) * | 2018-03-08 | 2020-09-01 | 宁波大学 | 一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法 |
| CN109596660A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-04-09 | 山西大学 | 一种沁州黄小米的鉴别方法 |
| EP4003045A4 (en) * | 2019-07-30 | 2023-06-21 | Umaro Foods, Inc. | PLANT-BASED FOOD PRODUCTS |
| CN110724502A (zh) * | 2019-11-01 | 2020-01-24 | 界首市金一龙粮食机械购销有限公司 | 一种防冻冷却液的防腐耐磨改性方法 |
| CN114216875A (zh) * | 2021-11-06 | 2022-03-22 | 浙江工商大学 | 一种鉴别不同产地及不同收获期坛紫菜方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0634583A (ja) * | 1992-07-16 | 1994-02-08 | Asahi Chem Ind Co Ltd | オキシメチレン重合体の末端基またはコモノマーの定性および定量方法 |
| CN102175707A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-09-07 | 四川大学 | 一种鉴别和评价川贝母的新方法 |
| CN104304427A (zh) * | 2014-10-16 | 2015-01-28 | 宁波大学 | 一种坛紫菜的保鲜方法 |
-
2015
- 2015-11-04 CN CN201510746056.6A patent/CN105223222B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0634583A (ja) * | 1992-07-16 | 1994-02-08 | Asahi Chem Ind Co Ltd | オキシメチレン重合体の末端基またはコモノマーの定性および定量方法 |
| CN102175707A (zh) * | 2011-03-01 | 2011-09-07 | 四川大学 | 一种鉴别和评价川贝母的新方法 |
| CN104304427A (zh) * | 2014-10-16 | 2015-01-28 | 宁波大学 | 一种坛紫菜的保鲜方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 夏梦洁 等;海苔营养物质的核磁共振分析;《食品科技》;20141231;第39卷(第10期);第1节，第2节，表1-2 * |
| 孙雨航 等;代谢组学中核磁共振技术的数据分析方法;《中国兽医杂志》;20101231;第50卷(第12期);第3-4节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105223222A (zh) | 2016-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105223222B (zh) | 一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法 | |
| JP6339244B2 (ja) | Ｆｔ−ｉｒスペクトルデータの多変量統計分析を用いた果実の糖度及び酸度の予測方法 | |
| CN106950241B (zh) | 一种预测茶油中其他掺杂油种类及含量的方法 | |
| CN103245685B (zh) | 一种菜用大豆鲜籽粒品质1h nmr评价方法 | |
| WO2020177423A1 (zh) | 一种基于低场核磁的微波干燥香辛蔬菜风味智能检测的装置及方法 | |
| CN104849323B (zh) | 一种基于电子鼻快速检测果汁中澄清剂的方法 | |
| CN111413316A (zh) | 基于拉曼光谱的乳粉真实性筛查方法 | |
| CN109633012B (zh) | 一种浙麦冬的鉴别方法 | |
| CN117874480A (zh) | 基于ico-boss算法的土壤重金属光谱特征提取方法 | |
| CN108982570A (zh) | 一种基于核磁共振技术的食用油品质鉴别方法 | |
| WO2013002455A1 (ko) | 가공인삼의 원산지 또는 연령 판별용 표준 마커, 이의 확립방법 또는 이를 이용한 원산지 또는 연령 판별방법 | |
| CN104698193A (zh) | 一种鉴定恒河猴血型的方法 | |
| CN106404711A (zh) | 一种鉴别山药破壁饮片掺假的方法 | |
| CN110057641A (zh) | 抗干扰能力强的含有6项指标的复合校准品及其制备方法 | |
| CN106680390A (zh) | 一种茶树氮素营养的诊断方法 | |
| CN104502307A (zh) | 一种快速检测长牡蛎糖原和蛋白质含量的方法 | |
| CN113654864A (zh) | 一种食品中油脂的提取方法及其应用 | |
| CN108426910B (zh) | 一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法 | |
| CN107450085B (zh) | 一种基于itd模糊熵的微小周跳探测方法 | |
| CN110702483A (zh) | 一种超快速鉴别海鲜或肉类的预处理方法 | |
| CN107884431B (zh) | 基于1h-nmr的代谢组学鉴别鲜鹿茸与热炸茸的方法 | |
| CN107462564B (zh) | 一种基于银超晶体的黄曲霉毒素b1快速免标记检测方法 | |
| CN116124680A (zh) | 一种鉴定青钱柳倍性的方法 | |
| CN104297364A (zh) | 一种评价杏鲍菇鲜味程度的方法 | |
| CN108614000A (zh) | 基于simca模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170510 Termination date: 20191104 |