CN105223222B - 一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种鉴别不同收获期坛紫菜的方法，依次包括预处理、破碎、离心、抽滤、真空冷冻干燥、核磁谱采集、数据分析和鉴别。对待鉴定的样品所有一维1H‑NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并经过信号归属、调整相位、基线校正、定标以及积分等处理后，采用SIMCA‑P+软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析。然后对NMR数据进行主成分分析对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量。不同收获期坛紫菜的提取物的NMR数据的PCA分析结果中则区分明显，前期采割的紫菜与中期采割的紫菜主要体现在PC2上的区分，而后期采割的紫菜与前期和中期采割的紫菜主要体现在PC1上的区分。

Description

一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法

技术领域

本发明属于藻类生长期检测技术领域，具体涉及一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法。

背景技术

坛紫菜(Pyropia haitanensis)属红藻类，为我国人工养殖的主要海藻品种之一，是一种理想的高蛋白、低脂肪的食品，富含多种氨基酸及无机盐，为广大消费者喜爱。但紫菜的收割期持续时间较长，不同收割期紫菜的品质不同，市场价格相差较大。一般来说，第一次采割(时间大约在11月中旬)的紫菜叫一水紫菜，第二次采割(时间大约在12月下旬)的紫菜叫二水紫菜，而第三次采割(时间大约在翌年的1月下旬)的紫菜叫三水紫菜。但消费者很难从形态上分辨不同收获期的紫菜，因此，有必要提供一种有效的检测不同收获期坛紫菜的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明通过核磁共振技术分析未知收获期的紫菜样品所含的代谢物，再借助多变量统计方法分析未知样品与已知收获期的紫菜样品的聚类情况，来判别未知样品所属的收获期。

本发明的方法，包括如下的步骤：

1)待检测坛紫菜的预处理

将待检测的坛紫菜样品清洗后，沥水后置于阴凉处去除表面水分；

2)细胞破壁：

将待检测的坛紫菜样品加入甲醇水溶液(甲醇与水的体积比为2：1)中进行细胞破碎，使坛紫菜叶片破碎后的粒径达到20μm以下来实现细胞的破壁；

3)离心：

将步骤2)破碎后的样品在10000r/min-15000r/min、0℃-4℃下离心，抽取上清液，残渣中加入甲醇水溶液(甲醇水体积比为2：1)，振荡混匀，重复上述操作3-4次，合并上清液；

4)抽滤：

将制备的上清液常温下于0.09MPa以上真空度下去除甲醇；

5)真空冷冻干燥：

将上述真空抽滤后的样品在-20℃进行冻结后，进行真空冷冻干燥至水分含量达到2％以下得到样品；

6)核磁谱采集：

取上述真空冷冻干燥的样品加入磷酸缓冲溶液进行离心(离心条件如下：10000r/min-15000r/min，0℃-4℃，5min-20min)得到上清液，上清液在核磁核磁共振仪为400MHz以上的核磁共振波谱仪进行小分子代谢物的检测，得到一维¹H NMR谱数据；

上述磷酸缓冲液(pH 7.4)的组成如下：0.2964％NaH₂PO₄·2H₂O，1.8486％K₂HPO₄·3H₂O，0.1％NaN₃、0.005％TSP和90％D₂O；余量为水。

所述核磁共振技术鉴定参数如下：使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一维¹H NMR谱，在该序列中的等待时间(RD，2s)和混合时间(tm，100ms)施加强度约50Hz的低功率连续波进行水峰抑制，每一个样品的90°脉冲宽度均设置约10s，谱宽设置为20ppm，采样点数32K，FID累加64次；

所述的坛紫菜特征小分子代谢物是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、海带醇、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、苏氨酸、丙氨酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、2-氧代-5-氨基缬草酸、乙酸、谷氨酸、苹果酸、苹果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、柠檬酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲基巯基丙酸、天冬酰胺、γ-氨基丁酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、甜菜碱醛、甘氨酸、异红藻糖苷和红藻糖苷。

7)数据分析：

为对待鉴定的样品的所有一维¹H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对检测到的物质进行了归属；以内标物(TSP，0ppm)对所有一维¹H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱(0.8-5.3)进行分段积分，积分区间为2.4Hz；去除残存的水信号(4.6-4.9)和甲醇信号(3.3-3.4)所在的积分区间之后，设置整个谱的积分面积总和为1，对每个积分区间的数据进行归一化处理；采用SIMCA-P⁺软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析；为获得各组样品的聚类情况和检测离群点，首先对NMR数据进行主成分分析(PCA)，在PCA处理中选用标准化的数据处理模式；为了进一步得到对组间区分具有显著性贡献的化合物，对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量。采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性；在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用MATLAB软件可获得OPLS-DA模型的载荷图；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量(X)和分组变量(Y)之间的皮尔森积差相关系数(r)；

8)样品收获期的鉴别：

根据步骤7)得到的坛紫菜提取物的NMR数据的PCA模型的结果分析，其中PCA模型的PC1解释80％-85％的变量，而PC2解释10％-15％的变量；其中，前期采割的紫菜与中期采割的紫菜体现在PC2上的区分，而后期采割的紫菜要体现在PC1上的区分。

本发明通过核磁共振氢谱法测定不同收获期坛紫菜总提取物中小分子物质的变化，前处理方法简单，检测速度快，不同海域不同时期的坛紫菜具有很好的重现性和高度的特征性。

附图说明

图1：基于核磁共振方法鉴别不同收获期坛紫菜的方法流程图。

图2：实施例1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜提取物的¹HNMR谱。

图3：为实施例:1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜提取物的PCA得分图。

图4：实施例1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜提取物的OPLS-DA得分图(左)和相关系数图(右)。

具体实施方式

本发明使用的核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，简称NMR)是指具有固定磁矩的原子核，如1H、13C、31P、19F、15N、129Xe等，在恒定磁场与交变磁场的作用下，与交变磁场发生能量交换的现象。

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

如图1所示，本实施例中通过核磁共振技术对采割于11月的第一批(下文简称一水)、采割于12月的第二批(下文简称二水)、采割于翌年1月的第三批(下文简称三水)坛紫菜进行鉴别的方法，依次包括预处理、破碎、离心、抽滤、真空冷冻干燥、核磁谱采集、数据分析和鉴别，其具体步骤如下：

1)预处理步骤为：分别将一水、二水和三水坛紫菜经二级沙滤海水清洗后，沥水后置于阴凉处吹去表面水分。

2)破碎步骤为：分别取经预处理的一水、二水、三水坛紫菜，称量0.1g至2mL的离心管中，加入甲醇水溶液(甲醇水的体积比＝2：1)1mL，选取破碎转速5000r/min，每次45s，循环15次，进行细胞破碎，使破碎后紫菜粒径达到20μm以下，每个样品平行数目为10。

3)离心步骤为：将上述破碎后样品进行离心，转速12000r/min，4℃，10min，抽取上清液，残渣中加入甲醇水溶液(甲醇水体积比为2：1)1mL，振荡混匀，重复上述操作3-4次，合并上清液。

4)抽滤步骤为：合并离心过程中所取上清液，放入真空干燥箱进行抽滤，真空度0.095MPa，室温条件，以去除甲醇。

5)真空冷冻干燥步骤为：将抽滤结束的上清液放入-20℃的冰箱冻结12h，然后取出进行真空冷冻干燥48h，至水分含量达到2％以下，结束后密封放入-20℃冰箱冻藏备用。

6)核磁谱采集步骤为：取经真空冷冻干燥的样品至2毫升的离心管中，加入600uL磷酸缓冲溶液(K₂HPO₄/NaH₂PO₄，0.1M，pH 7.4)，于4℃，10000r/min，10min条件下进行离心后，取上清液550uL于2mL的核磁管内，使用600MHz核磁共振波谱仪进行采集。

数据分析步骤为：对待鉴定的样品的所有一维¹H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对检测到的物质进行了归属。有代表性的一水、二水和三水的紫菜核磁谱见图2。本发明共检测到31种代谢物，包括亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、海带醇、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、苏氨酸、丙氨酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、2-氧代-5-氨基缬草酸、乙酸、谷氨酸、苹果酸、苹果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、柠檬酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲基巯基丙酸、天冬酰胺、γ-氨基丁酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、甜菜碱醛、甘氨酸、异红藻糖苷和红藻糖苷。这些代谢物的详细NMR信息见表1。

以内标物(TSP，0ppm)对所有一维¹H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱(0.8-5.3)进行分段积分，积分区间为2.4Hz。去除残存的水信号(4.6-4.9)和甲醇信号(3.3-3.4)所在的积分区间之后，设置整个谱的积分面积总和为1，对每个积分区间的数据进行归一化处理。采用SIMCA-P⁺软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析。为获得各组样品的聚类情况和检测离群点，首先对NMR数据进行主成分分析(PCA)，在PCA处理中选用标准化的数据处理模式。本发明得到的PCA图见图3，图中星号代表一水紫菜(H1)，圆圈代表二水紫菜(H2)，菱形代表三水紫菜(H3)。每一个符号(即星号、圆圈或菱形)代表一个紫菜样品的一个一维¹H核磁谱。PC1表示主成分1，PC2表示主成分2。在这个PCA模型中，PC1解释了81.1％的变量，而PC2解释了10.7％的变量。从这个PCA图可以看出，三水紫菜(H3组)和前面两次收割的紫菜(H1组和H2组)在PC1上有明显区分，说明三水紫菜的代谢物与前两组相差较大。但一水紫菜(H1组)与二水紫菜(H2组)在PC2上有明显区分，说明这两组紫菜所含的代谢物也存在差异，只是这种差异没有与三水紫菜大。

为了进一步得到对组间区分具有显著性贡献的代谢物，对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，结果见图4。该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量。采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性。R²和Q²值可分别指示模型的可预测能力和质量，而CV-ANOVA的分析结果也同时符合p<0.05时，模型才可靠。在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用MATLAB软件可获得OPLS-DA模型的载荷图。载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量(X)和分组变量(Y)之间的皮尔森积差相关系数(r)。本研究采用的是相关系数的绝对值(|r|)，只有当|r|大于0.602时，其相应的代谢物才对组间区分具有显著性贡献(n＝10，p<0.05)。本发明得到3个OPLS-DA模型，分别是一水、二水和三水紫菜之间的两两比较模型，图中A、B和C表示OPLS-DA的得分图，而D、E和F分别表示A、B和C的载荷图。这A、B和C模型的Q²值分别是0.94、0.97和0.98，p值分别是4.2×10^-9、3.9×10^-11和8.7×10^-12，表示这3个模型是可靠的。D、E和F图中列出的数字代表对区分不同收获期的紫菜具有显著意义的代谢物。这些代谢物包括亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、羟乙基磺酸、海带醇、甜菜碱、胆碱-O-硫酸、异红藻糖苷和红藻糖苷(图4)。2-羟基-5-氨基缬草酸、羟乙基磺酸、海带醇、甜菜碱、胆碱-O-硫酸、亮氨酸以及乳酸的含量随着采割时间的推迟呈显著降低，而丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、红藻糖苷以及6-脱氧-抗坏血酸的含量随着采割时间的推迟呈显著升高。这些物质的含量变化是鉴别一水、二水和三水坛紫菜的物质依据。这些代谢物的具体相关系数值列于表2。

7)鉴别，即基于上述数据分析得出一水、二水、三水坛紫菜的鉴别方法，即根据一水、二水和三水坛紫菜的PCA图中各组的聚类情况进行判别，聚为一组的样品都来自同一个采割期。本发明中的PCA结果表明，三组坛紫菜根据采割期分别聚成一组，而且一水坛紫菜(H1组)和二水坛紫菜(H2组)的代谢物组成差异较小，而与三水紫菜(H3组)的代谢物组成差异较大。这种组间的代谢物差异主要体现在以下几个方面。1、与一水坛紫菜相比，二水坛紫菜具有较高水平的天冬氨酸、牛磺酸、异红藻糖苷和红藻糖苷，而较低水平的亮氨酸、海带醇、2-羟基-5-氨基缬草酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸和甜菜碱；2、与一水和二水坛紫菜相比，三水坛紫菜具有较高水平的6-脱氧-抗坏血酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和牛磺酸，而较低水平的乳酸、2-羟基-5-氨基缬草酸和异红藻糖苷。

表1：新鲜坛紫菜小分子物质的NMR信号归属。

注：a：多重性；s：单峰；d：双峰；t：三重峰；q：四重峰；dd：双重二重峰；m：多重峰；#：未能确定的信号或多重性。

表2：实施例1中一水(H1)、二水(H2)、三水(H3)坛紫菜中显著相关的物质。

注：^a相关系数，正值和负值分别表示正相关和负相关。0.602作为相关系数是否具有显著性差异的临界值。“-”表示相关系数的绝对值小于临界值。

对于未知收获期的坛紫菜，可以通过本发明所述的方法进行辨别。具体来说，对未知样品和已知的不同收获期的样品进行NMR分析，对采集到的所有一维¹H-NMR谱进行PCA分析，看未知样品与哪个收获期的样品聚类在一起，从而判断该未知样品的收获时间。

Claims (4)

1.一种不同收获期坛紫菜的鉴别方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)待检测坛紫菜的预处理

将待检测的坛紫菜样品清洗后，沥水后置于阴凉处去除表面水分；

2)细胞破壁：

将待检测的坛紫菜样品加入甲醇水溶液中进行细胞破碎，使坛紫菜叶片破碎后的粒径达到20μm以下来实现细胞的破壁；

3)离心：

将步骤2)破碎后的样品在10000r/min-15000r/min、0℃-4℃下离心，抽取上清液，残渣中加入甲醇水溶液，振荡混匀，重复上述操作3-4次，合并上清液；

4)抽滤：

将制备的上清液常温下于0.09MPa以上真空度下去除甲醇；

5)真空冷冻干燥：

将上述抽滤后的样品在-20℃进行冻结后，进行真空冷冻干燥至水分含量达到2％以下得到样品；

6)核磁谱采集：

取上述真空冷冻干燥的样品加入磷酸缓冲溶液进行离心得到上清液，上清液在核磁核磁共振仪为400MHz以上的核磁共振波谱仪进行坛紫菜特征小分子代谢物的检测，得到一维¹H NMR谱数据；

所述核磁共振技术鉴定参数如下：使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一维¹H NMR谱，在该序列中的等待时间RD为2s，混合时间tm为100ms，施加强度50Hz的低功率连续波进行水峰抑制，每一个样品的90°脉冲宽度均设置10s，谱宽设置为20ppm，采样点数32K，FID累加64次；

所述的坛紫菜特征小分子代谢物是异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、海带醇、6-脱氧-抗坏血酸、乳酸、苏氨酸、丙氨酸、2-羟基-5-氨基缬草酸、2-氧代-5-氨基缬草酸、乙酸、谷氨酸、苹果酸、苹果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、柠檬酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲基巯基丙酸、天冬酰胺、γ-氨基丁酸、胆碱-O-硫酸、羟乙基磺酸、胆碱、甜菜碱、牛磺酸、甜菜碱醛、甘氨酸、异红藻糖苷和红藻糖苷；

7)数据分析：

为对待鉴定的样品的所有一维¹H-NMR谱数据经傅立叶变换得到谱图，并依照COSY、TOCSY、HSQC和HMBC二维NMR谱对检测到的物质进行了归属；以内标物TSP对所有一维¹H NMR进行化学位移定标，调整相位并校正基线之后，对NMR谱0.8-5.3进行分段积分，积分区间为2.4Hz；去除残存的水信号4.6-4.9和甲醇信号3.3-3.4所在的积分区间之后，设置整个谱的积分面积总和为1，对每个积分区间的数据进行归一化处理；采用SIMCA-P⁺软件对归一化的NMR数据进行多变量数据分析；为获得各组样品的聚类情况和检测离群点，首先对NMR数据进行主成分分析，在主成分分析处理中选用标准化的数据处理模式；为了进一步得到对组间区分具有显著性贡献的化合物，对NMR数据进行了正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，该分析中选用了自动规格化的数据处理模式，并以该自动规格化的NMR数据作为X变量，而分组信息作为Y变量；采用7倍交叉验证和进一步的交叉验证的方差分析来确保OPLS-DA模型的可靠性；在对自动规格化的NMR数据作进一步的回溯转换处理后，再利用MATLAB软件获得OPLS-DA模型的载荷图；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示回溯转换处理后的变量X和分组变量Y之间的皮尔森积差相关系数r；

8)样品收获期的鉴别：

根据步骤7)得到的坛紫菜提取物的NMR数据的PCA模型的结果分析，其中PCA模型的PC1解释80％-85％的变量，而PC2解释10％-15％的变量；其中，前期采割的紫菜与中期采割的紫菜体现在PC2上的区分，而后期采割的紫菜要体现在PC1上的区分。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)和步骤3)中所使用的甲醇水溶液，其中甲醇与水的体积比为2：1。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤6)中的离心条件如下：10000r/min-15000r/min，0℃-4℃，5min-20min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤6)中的磷酸缓冲液的组成如下：0.2964％NaH₂PO₄·2H₂O，1.8486％K₂HPO₄·3H₂O、0.1％NaN₃、0.005％TSP和90％D₂O，pH 7.4。