CN107727680A - 一种基于nmr代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法 - Google Patents

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安莉
马婧玮
汪红
吴家锴
张军锋
李通
李萌
马欢
周娟
杨国华
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Abstract

本发明提出了一种基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，采用核磁共振技术获得有机苹果和普通苹果的NMR指纹图谱，并对指纹图谱进行分析，鉴别有机苹果和普通苹果中的化学成分，采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS‑DA）对有机苹果和普通苹果进行化学成分分析，在OPLS‑DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV‑ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，最终通过OPLS‑DA模型中的Score图解决鉴定有机苹果和普通苹果的技术问题。

Description

一种基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法
技术领域
本发明涉及涉及植物代谢组学领域，具体涉及一种基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法。
背景技术
代谢组学(metabonomics或metabolomics)是效仿基因组学和蛋白质组学的研究思想，对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系的研究方式，是系统生物学的组成部分。其研究对象大都是相对分子质量1000以内的小分子物质。先进分析检测技术结合模式识别和专家系统等计算分析方法是代谢组学研究的基本方法。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学之后新近发展起来的一门学科，是系统生物学的重要组成部分。之后得到迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与人类健康护理密切相关的领域。其样品主要是动植物的细胞和组织的提取液。主要技术手段是核磁共振（NMR），质谱（MS），色谱（HPLC，GC）及色谱质谱联用技术。核磁共振（NMR）由于其灵敏性、无损性以及能够根据特征峰定性的探测代谢物成分等优点，已发展为代谢组学中最常用的化学分析检测技术。核磁测定样品是非破坏性的，且只要很少的样品预处理，就可以获得提取物的结构信息，具有较好的重现性。
苹果(Malus domestica)属于蔷薇科落叶乔木，果实呈球形，苹果中富含VC、类黄酮类化合物、多酚、膳食纤维、有机酸、可溶性糖、果胶、矿物质和微量元素等。因此，苹果具有生津止渴、健脾益胃、养心益气、润肺、预防心血管疾病和降血压等作用。此外，苹果产量在我国水果中位居首例，在全世界中种植量也最大，产量最多的水果。有机苹果近年来受到国内外消费者的追捧，销售价格往往是普通苹果的数倍，因此，一些不法商贩为牟取利润，往往以次充好，欺骗消费者，使消费者的权益受损。目前，有机苹果与普通苹果区别往往是通过比较颜色和口感，查询外包装上的认证标志或防伪码。
发明内容
本发明提出一种基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，采用核磁共振技术获得有机苹果和普通苹果的NMR指纹图谱,并对指纹图谱进行分析，鉴别有机苹果和普通苹果中的化学成分，采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对有机苹果和普通苹果进行化学成分分析，在OPLS-DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV-ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，最终通过OPLS-DA模型中的Score图解决鉴定有机苹果和普通苹果的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，步骤为：
S1苹果样本的制备：选用待测苹果样本，将苹果样本切成薄片，然后于液氮中研磨成粉末，将苹果粉末置于-80℃条件下保存；
S2苹果样本的前处理：称取一定量的苹果粉末，加入0.2M的磷酸缓冲溶液，振荡混匀后，取上清液至核磁管中待测定；
S3苹果样本测定的仪器条件：在核磁共振光谱仪上记录1H NMR谱，条件为5 mm多核宽带观测探头，观测频率为600.13MHz，采用标准NOESYPR1D脉冲序列采集[RD-90◦-t1-90◦-tm-90◦-ACQ]；
S4数据处理过程：利用AMIX软件对所有1H NMR谱图0.50-4.68 ppm以及5.0-9.5 ppm范围内的谱峰，以0.04 ppm的宽度进行分段积分。
所述步骤S1中薄片的厚度为1-2 mm。
所述步骤S2中磷酸缓冲溶液pH为7.4，含0.1%TSP内标，由纯重水配置。
所述步骤S3中核磁共振实验中预饱和法压制水峰，实验温度为300 K，等待时间RD为2 s，混合时间tm为100 ms，t1为4 μs，累加次数48次。
所述步骤S4中利用AMIX软件(德国Bruker-Biospin公司研发)处理前，先对每个NMR谱分别采用线宽为0.25的指数窗函数进行傅立叶变换，进行相位调整和基线校正后，以TSP信号峰中心位置δ 0.00进行化学位移定标。
本技术方案能产生的有益效果：
1．本发明采用核磁共振技术获得有机苹果和普通苹果的NMR指纹图谱,并对指纹图谱进行分析，鉴别有机苹果和普通苹果中的化学成分，采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对有机苹果和普通苹果进行化学成分分析，在OPLS-DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV-ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，最终通过OPLS-DA模型中的Score图分析有机苹果和普通苹果。
2．本发明与传统的仅靠颜色、口感等感官鉴别相比较，灵敏度高，结果准确可靠。
3.本发明采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对普通苹果组和有机苹果组进行分析。首先在OPLS-DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV-ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，如表1，结果发现所建立的普通苹果组和有机苹果组模型具有统计意义，表明了所建模型有效且可靠，能够进行数据分析；
表1 有机苹果组和普通苹果组OPLS-DA模型的内部交叉验证和CV-ANOVA验证参数
Group R2X Q2 p (CV) Significance
有机组vs普通组 0.985 0.974 0.002 s.
4.本发明还通过OPLS-DA模型中的Score图（见图2）和3D图（见图3）进行分析验证，发现有机苹果组和普通苹果组显示这两组有着良好的分离度，有机苹果和普通苹果能够被很好的区分开，该方法能够用于区分普通苹果组和有机苹果组。
附图说明
图1为普通苹果组和有机苹果组600 M NMR图谱。
图2为普通苹果组和有机苹果组OPLS-DA模型的得分图。
图3普通苹果组和有机苹果组OPLS-DA模型的3D图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，包括如下步骤：
S1苹果样本的制备：选用从三门峡二仙坡绿色果业有限公司的无任何损伤的有机苹果1个、购自三门峡湖滨区普通苹果1个及随机从市场上购买的5个有机苹果和5无机苹果，将每个苹果切成1.5 mm的薄片，将每个苹果切好的苹果片置于液氮中研磨成粉末状，苹果粉末置于-80℃环境保存。
苹果样本前处理：分别称取40 mg苹果样本粉末，加入800 μL0.2M的磷酸缓冲溶液（pH=7.4，含0.1%TSP内标，由纯重水配置），其中重水溶液用以锁场，TSP用于对化学位移进行定标。涡旋振荡10 min，超声30 min后，于12000 rp/m离心15 min，移取550 μL上清液至5 mm核磁管中以待测定。有机苹果和普通苹果各制备6份。
苹果样本测定的仪器条件：苹果样本在布鲁克AV-600 MHz核磁共振光谱仪上记录1H NMR谱，5 mm多核宽带观测（BBO）探头，观测频率为600.13 MHz，采用标准NOESYPR1D脉冲序列采集[RD-90◦-t1-90◦-tm-90◦-ACQ]，预饱和法压制水峰，实验温度为300 K，等待时间RD为2 s，混合时间tm为100 ms，t1为4 μs，累加次数48次。
数据处理过程：对每个NMR谱，分别采用线宽为0.25的指数窗函数进行傅立叶变换，进行相位调整和基线校正后，以TSP信号峰中心位置δ 0.00进行化学位移定标。利用AMIX软件对所有1H NMR谱图0.50-4.68 ppm以及5.0-9.5 ppm范围内的谱峰以0.04 ppm的宽度进行分段积分，其中0.50 ppm以下和9.50 ppm以上为噪声区，4.68-5.00 ppm则考虑到受水峰压制的影响，故上述谱峰段不进行积分。
数据分析：图1是所获得的普通苹果和有机苹果NMR指纹图谱，由图1可知利用肉眼并不能有效的区别出普通和有机苹果。
故采用有监督的多维统计分析方法即正交偏最小二乘法（OPLS-DA）对普通苹果组和有机苹果组进行分析。首先在OPLS-DA模型中利用内部交叉验证和外部验证中的CV-ANOVA两种验证方法对所建立模型的可靠性进行验证，如表1。结果发现所建立的普通苹果组和有机苹果组模型具有统计意义，表明了所建模型有效且可靠，能够进行数据分析。
表1 有机苹果组和普通苹果组OPLS-DA模型的内部交叉验证和CV-ANOVA验证参数
Group R2X Q2 p (CV) Significance
有机组vs普通组 0.985 0.974 0.002 s.
下面通过OPLS-DA模型中的Score图（见图2）和3D图（见图3）进行分析，发现6个有机苹果组和6个普通苹果组，显示有着良好的分离度，有机苹果和普通苹果能够被很好的区分开，该方法能够用于区分普通苹果组和有机苹果组，也说明了申请人此次在市场上购买的有机苹果的质量相对来说合格。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，其特征在于，步骤为：
S1苹果样本的制备：选用待测苹果样本，将苹果样本切成薄片，然后于液氮中研磨成粉末，将苹果粉末置于-80℃条件下保存；
S2苹果样本的前处理：称取一定量的苹果粉末，加入0.2M的磷酸缓冲溶液，振荡混匀后，取上清液至核磁管中待测定；
S3苹果样本测定的仪器条件：在核磁共振光谱仪上记录1H NMR谱，条件为5 mm多核宽带观测探头，观测频率为600.13MHz，采用标准NOESYPR1D脉冲序列采集；
S4数据处理过程：利用AMIX软件对所有1H NMR谱图0.50-4.68 ppm以及5.0-9.5 ppm范围内的谱峰，以0.04 ppm的宽度进行分段积分。
2.如权利要求1所述的基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，其特征在于：所述步骤S1中薄片的厚度为1-2 mm。
3.如权利要求1所述的基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，其特征在于：所述步骤S2中磷酸缓冲溶液pH为7.4，含0.1%TSP内标，由纯重水配置。
4.如权利要求1所述的基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，其特征在于：所述步骤S3中脉冲序列为RD-90◦-t1-90◦-tm-90◦-ACQ；核磁共振实验中预饱和法压制水峰，实验温度为300 K，等待时间RD为2 s，混合时间tm为100 ms，t1为4 μs，累加次数48次。
5.如权利要求1所述的基于NMR代谢组学技术鉴别有机苹果与普通苹果的方法，其特征在于：所述步骤S4中利用AMIX软件处理前，先对每个NMR谱分别采用线宽为0.25的指数窗函数进行傅立叶变换，进行相位调整和基线校正后，以TSP信号峰中心位置δ 0.00进行化学位移定标。
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