CN108426910A - 一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法 - Google Patents

一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法，通过对致病性哈维氏弧菌和非致病性哈维氏弧菌的代谢产物进行分析后，确定了用于检测哈维氏弧菌是否具有致病性的标准。从而在基于NMR技术检测分析致病性哈维氏弧菌特征性代谢产物的基础上建立了本发明；解决鉴定未知哈维氏弧菌致病性与否属性。本发明缩短了实验周期，避免实验动物个体敏感性差异，以及实验动物在暂养过程中对环境的敏感，使致病性检测更加方便、快捷。

Description

一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法
技术领域
本发明属于病原菌致病性鉴定技术领域，具体涉及一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法。
背景技术
哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是一种革兰氏阴性菌、发光的海洋细菌，广泛分布于海洋环境中，可分为致病性和非致病性两种类型。致病性哈维氏弧菌在全世界范围水产养殖业造成了巨大的经济损失，在南美洲和亚洲地区尤为严重，它不但能引起海水鱼、虾、贝如大黄鱼、石斑鱼、鲷、鲈鱼、文蛤、对虾等多种水产动物的疾病，而且还能通过食物链引起食物中毒，是人畜共患致病菌。目前，哈维氏弧菌的检测方法主要有生理生化方法、分子生物学及免疫诊断技术，如多重PCR检测、基因芯片检测等。在已报道的哈维氏弧菌检测方法中，都集中在哈维氏弧菌的定性方面，但对哈维氏弧菌的致病性及其致病能力的强弱检测方法则无报道。而哈维氏弧菌致病能力强弱往往是水产动物疾病是否爆发的关键因素，因此，急需开发哈维氏弧菌是否具有致病性的鉴定技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的标准，所述的标准的建立方法如下：利用高分辨核磁共振谱仪采集待检测的哈维氏弧菌的NMR代谢产物谱，采集用于代谢物的归属的1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H J分解谱、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC 2D NMR谱，将所得数据建立分析数据矩阵，用SIMCA-P进行主成分分析，获得直观的聚类图和载荷图，当采集到的数据处于OPLS-DA值和和荷载图A区间，则为非致病性弧菌；当样品处于OPLS-DA值和和荷载图B区间，则确定为致病性哈维氏弧菌。
本发明再一个方法提供一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法，该方法包括如下的步骤：
1)将待测哈维氏弧菌接至固体培养基上进行划线培养，
所述的固体培养基，为海水牛肉膏蛋白胨固体培养基，其配方如下：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、2％琼脂；
所述的培养，优选是在28℃培养24小时；
2)哈维氏弧菌代谢产物提取：
取培养好的哈维氏弧菌加入40％的乙腈水进行破碎提取，提取液离心取上清液后，在真空条件下除去上清液中的有机溶剂；经再次离心(4℃，12000r/min，10min)后，移取上清液进行抽滤至凝胶状；再进行干冻后移至NMR核磁管中进行核磁分析；
3)采集NMR数据：
所有的NMR的谱都在298K下用配置有反相检测低温探头Bruker Avance III800MHz谱仪下进行采集，对应的质子共振频率为800.20MHz，使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一维1H NMR谱；施加50Hz强度的连续波在等待时间(RD，2s)和混合时间(tm，100ms)时进行水峰抑制。90°脉冲长度调至10s，t1设为6μs；
4)核磁共振数据处理和多元数据分析：
对一维氢谱进行手动相位和基线校正以及根据内标TSP定标后，用AMIX软件对5.55-0.80区间的1H NMR谱进行分割并积分；为去除水和残留的乙腈信号对谱峰的影响，与其相关的信号区间4.96-4.67和2.09-2.07被去除；每一个分割区间积分被归一化到整个谱峰的积分面积以弥补样品间体积或浓度的差异；
经归一化后的NMR数据被导入SIMCA-P+软件进行多变量统计分析：首先，利用主成分分析PCA，采用中心化数据处理方式，以观测样品的聚类情况和识别离群点；然后，采用正交化偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)对NMR数据做进一步分析；模型的载荷图采用MATLAB软件绘制，在绘制载荷图之前，先对自动规格化NMR数据进行back-transformation处理；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值。颜色标尺范围为自动规格化权重的最小值和最大值；
当样品处于OPLS-DA值和和荷载图A区间，则为非致病性的弧菌；当样品处于OPLS-DA值和和荷载图B区间，则确定为具有致病性哈维氏弧菌。
所述的代谢产物，为异戊酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、乙酸、苏氨酸、乳酸、丙氨酸、腐胺、醋酸盐、乙酰胺、N-乙酰基丙氨酸、蛋氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、琥珀酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲胺、赖氨酸、肌酸、Δ-羟赖氨酸、肉碱、甜菜碱、甘氨酸、核糖-5-磷酸、尿嘧啶、富马酸盐、酪氨酸、苯丙氨酸、胸腺嘧啶、胞苷、胸苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、甲酸、烟酸盐、残留的甲醇、氨基酸。
本发明的优点在于缩短了实验周期，避免实验动物个体敏感性差异，以及实验动物在暂养过程中对环境的敏感，使致病性检测更加方便、快捷。
附图说明
图1：哈维氏弧菌非致病性(A)和致病性(B)两个典型的800MHz的1H NMR谱。相比于0.9‐4.7的化学位移范围内，在4.9‐5.55区域显示的是16倍倍率的谱；
图2：(线上颜色)哈维氏弧菌提取物的PCA分数图，非致病性(A，星星)，致病性(B，圆圈)；
图3：(线的颜色)OPLS-DA值(左)和编码系数荷载图(右)，用以区分的模型，哈维氏弧菌非致病性(A，星形)、致病性(B，圆圈)提取物；
图4：待测哈维氏弧菌提取物与致病性和非致病提取物NMR的PCA分数图。
图5：待测样品与致病性和非致病性哈维氏弧菌的OPLS‐DA值和编码系数荷载图。
具体实施方式
申请人通过对致病性哈维氏弧菌和非致病性哈维氏弧菌的代谢产物进行分析后，确定了用于检测哈维氏弧菌是否具有致病性的标准。从而在基于NMR技术检测分析致病性哈维氏弧菌特征性代谢产物的基础上建立了本发明；解决鉴定未知哈维氏弧菌致病性的难题。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1：检检测标准的确定和方法的建立
采用分光光度计法和平板计数法，将来源不同的哈维氏弧菌菌株扩大培养后用PBS溶液稀释成浓度8×108CFU/mL的菌液。每株菌选取150-200g健康大黄鱼随机分成三个试验组和一个对照组，每组十条鱼。分别肌肉注射100微升、200微升、300微升，对照组注射相同剂量的PBS溶液。七天内全致死率为100％的则为致病性哈维氏弧菌，致死率小于20％则为非致病性哈维氏弧菌。
2、致病性和非致病性哈维氏弧菌的培养
将致病性和非致病性哈维氏弧菌接至海水牛肉膏蛋白胨固体培养，划线培养。28℃培养24小时。培养基配方如下：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、2％琼脂，加海水至一定值。
3、致病性和非致病性哈维氏弧菌代谢物的提取
取培养好的哈维氏弧菌0.3g于管中，并放入适量破碎珠。分别加入600μL40％的乙腈水，用组织破碎仪(20Hz，30s)破碎12次，每次间隔10s，每次间隔都要放入冰块中进行降温，以免热度影响结果。待弧菌完全破碎后，经离心(4℃，12000r/min，10min)取上清液，残渣使用上述方法再重复提取1次。合并2次上清液，在真空下除去上清液中的有机溶剂。经再次离心(4℃，12000r/min，10min)后，移取上清液于PE管中并用封口膜封好，并且在上面扎洞。用抽滤泵进行抽滤至凝胶状。再进行干冻后移至5mm NMR核磁管中进行核磁分析。
4、NMR数据采集方法
所有的NMR的谱都在298K下用配置有反相检测低温探头Bruker Avance III800MHz谱仪下进行采集，对应的质子共振频率为800.20MHz。使用标准的Noesypr1D脉冲序列(RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)采集一维1H NMR谱。施加约50Hz强度的连续波在等待时间(RD，2s)和混合时间(tm，100ms)时进行水峰抑制。90°脉冲长度调至约10s，t1设为6μs。谱宽设置为20ppm，采样点数为32K，FID累加次数是64。所有一维1H NMR谱在傅立叶变换前给FID乘以增宽因子为0.5Hz的指数窗函数进行处理。为了NMR信号归属，对选定样品采集了包括1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC在内的2D NMR谱。在COSY和TOCSY实验中，采样点数分别为200(F1)和1024(F2)，间接采样维F1和直接采样维F2的谱宽设置为10.5ppm，每一条FID累加256次。在TOCSY实验中，选用MLEV-17组合脉冲进行自旋锁定，混合时间为80ms。1H-13C相关谱实验选用带脉冲梯度场的HSQC和HMBC序列，采样点数均设为400(F1)和1024(F2)，谱宽分别为220ppm(F1)和10.5ppm(F2)，每一条FID累加256次。采用组合脉冲(GARP)对HSQC实验中的13C信号去偶。
5、核磁共振数据处理和多元数据分析
对一维氢谱进行手动相位和基线校正以及根据内标TSP定标后，用AMIX软件(V3.8,Bruker-Biospin,Germany)对5.55-0.80区间的1H NMR谱进行分割并积分。为去除水和残留的乙腈信号对谱峰的影响，与其相关的信号区间4.96-4.67和2.09-2.07被去除。每一个分割区间积分被归一化到整个谱峰的积分面积以弥补样品间体积或浓度的差异。
经归一化后的NMR数据被导入SIMCA-P+软件(V.12,Umetrics,Sweden)进行多变量统计分析。首先，利用主成分分析(PCA)以观测样品的聚类情况和识别离群点。在PCA中，采用中心化数据处理方式。接着，采用正交化偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)对NMR数据做进一步分析。该分析中，对NMR数据进行了自动规格化的数据处理模式，并以自动规格化的NMR数据作为X-矩阵，分组信息作为Y-矩阵。R2和Q2值指示OPLS-DA模型的质量，并用7-倍交叉验证和CV-ANOVA方法(p<0.05)进一步验证模型的可靠性。模型的载荷图采用MATLAB软件绘制，但在绘制载荷图之前，先对自动规格化NMR数据进行back-transformation处理，即首先给每一个变量的loadings乘以各自的标准偏差得到一个新的loadings。载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值，权重即表示变量(X)和分组变量(Y)之间的相关系数(r)。颜色标尺范围为自动规格化权重的最小值和最大值。采用该载荷图可直观地表示对组间区分贡献显著的物质。本研究中，|r|大于0.602，被认为在统计上具有显著性(n＝10，p<0.05)。
6、致病性和非致病性哈维氏弧菌代谢产物分析
6.1、哈维氏弧菌40种代谢产物确定
根据一系列的二维NMR实验及以往实验数据，先确定哈维氏弧菌中40种代谢产物。如表1.
表1：哈维氏弧菌的代谢产物
a多重性：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重峰；dd，双重二重峰；m，多重峰。
6.2致病与非致病性哈维氏弧菌代谢物模型比对
用已知致病和非致病性哈维氏弧菌菌株代谢产物来制作模型。如图1所示，根据一系列的二维NMR实验及文献数据，确定了哈维氏弧菌中40种代谢产物。
NMR数据进行多元数据分析。从提取物中得到的归一化的NMR数据进行PCA分析，得到数据集的一个概述，A、B两个样品根据前两个主成分(PC1和PC2)清楚地聚成两组，可观察到A、B代谢组成的显著差异。
为了进一步研究不同生理形态的弧菌代谢产物的差异，以成分分布数据为X轴，组信息为Y轴构建一个OPLS‐DA模型。由OPLS‐DA的交叉验证的分数图(图3)表明A、B组分中含量的差异。
两个OPLS‐DA模型的有效性由CV‐方差分析方法(P<0.05)进一步评估，这两种模型都以极低的r值通过了CV‐ANOVA的严格测试。具有极高的可信度。这些基础数据构成了致病性和非致病性代谢产物库。
实施例2：未知哈维氏弧菌致病性的检测
1、未知哈维氏弧菌菌种的培养
将待测哈维氏弧菌接至海水牛肉膏蛋白胨固体培养，划线培养。28℃培养24小时。培养基配方如下：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、2％琼脂，加海水至一定值。
2、哈维氏弧菌感染大黄鱼实验
采用分光光度计法和平板计数法，将扩大培养后待测哈维氏弧菌用PBS溶液稀释成浓度8×108CFU/mL的菌液。每株菌选取150-200g健康大黄鱼随机分成三个试验组和一个对照组，每组十条鱼。分别肌肉注射100微升、200微升、300微升，对照组注射相同剂量的PBS溶液。六天后，鱼全部死亡。判断该致病性哈维氏弧菌，
3、哈维氏弧菌代谢产物提取
取感染大黄鱼同一批培养的哈维氏弧菌0.3g于管中，并放入适量破碎珠。分别加入600μL40％的乙腈水，用组织破碎仪(20Hz，30s)破碎12次，每次间隔10s，每次间隔都要放入冰块中进行降温，以免热度影响结果。待弧菌完全破碎后，经离心(4℃，12000r/min，10min)取上清液，残渣使用上述方法再重复提取1次。合并2次上清液，在真空下除去上清液中的有机溶剂。经再次离心(4℃，12000r/min，10min)后，移取上清液于PE管中并用封口膜封好，并且在上面扎洞。用抽滤泵进行抽滤至凝胶状。再进行干冻后移至5mm NMR核磁管中进行核磁分析。
4、NMR数据采集方法
所有的NMR的谱都在298K下用配置有反相检测低温探头Bruker Avance III800MHz谱仪下进行采集，对应的质子共振频率为800.20MHz。使用标准的Noesypr1D脉冲序列(RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ)采集一维1H NMR谱。施加约50Hz强度的连续波在等待时间(RD，2s)和混合时间(tm，100ms)时进行水峰抑制。90°脉冲长度调至约10s，t1设为6μs。谱宽设置为20ppm，采样点数为32K，FID累加次数是64。所有一维1H NMR谱在傅立叶变换前给FID乘以增宽因子为0.5Hz的指数窗函数进行处理。为了NMR信号归属，对选定样品采集了包括1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC在内的2D NMR谱。在COSY和TOCSY实验中，采样点数分别为200(F1)和1024(F2)，间接采样维F1和直接采样维F2的谱宽设置为10.5ppm，每一条FID累加256次。在TOCSY实验中，选用MLEV-17组合脉冲进行自旋锁定，混合时间为80ms。1H-13C相关谱实验选用带脉冲梯度场的HSQC和HMBC序列，采样点数均设为400(F1)和1024(F2)，谱宽分别为220ppm(F1)和10.5ppm(F2)，每一条FID累加256次。采用组合脉冲(GARP)对HSQC实验中的13C信号去偶。
5、核磁共振数据处理和多元数据分析
对一维氢谱进行手动相位和基线校正以及根据内标TSP定标后，用AMIX软件(V3.8,Bruker-Biospin,Germany)对5.55-0.80区间的1H NMR谱进行分割并积分。为去除水和残留的乙腈信号对谱峰的影响，与其相关的信号区间4.96-4.67和2.09-2.07被去除。每一个分割区间积分被归一化到整个谱峰的积分面积以弥补样品间体积或浓度的差异。
6、致病性哈维氏弧菌代谢产物分析
根据一系列的二维NMR实验及以往实验数据，找到并确定待测哈维氏弧菌中与数据库中一致的40种代谢产物。如表1.
7、待测哈维氏弧菌代谢产物带入模型比对
从待测哈维氏弧菌提取物中得到的归一化的NMR数据与之前得到的致病性和非致病性哈维氏弧菌代谢物的NMR数据一起进行PCA分析，得到数据集的一个概述，见图5。两个OPLS‐DA模型的有效性由CV‐方差分析方法(P<0.05)进一步评估，这两种模型都以极低的r值通过了CV‐ANOVA的严格测试。具有极高的可信度。
与图3相比，当待测哈维氏弧菌的代谢产物符合B相，判定是致病性哈维氏弧菌。这与大黄鱼感染实验结果菌的检测一致。

Claims (6)

1.一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的标准，其特征在于，所述的标准的建立方法如下：利用高分辨核磁共振谱仪采集待检测的哈维氏弧菌的NMR代谢产物谱，采集用于代谢物的归属的1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H J分解谱、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC 2D NMR谱，将所得数据建立分析数据矩阵，用SIMCA-P进行主成分分析，获得直观的聚类图和载荷图，当采集到的数据处于OPLS-DA值和和荷载图A区间，则为非致病性弧菌；当样品处于OPLS-DA值和和荷载图B区间，则确定为致病性哈维氏弧菌。
2.一种鉴定哈维氏弧菌是否具有致病性的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)将待测哈维氏弧菌接至固体培养基上进行划线培养，
2)哈维氏弧菌代谢产物提取：
取培养好的哈维氏弧菌加入乙腈水溶液进行破碎提取，提取液离心取上清液后，在真空条件下除去上清液中的有机溶剂；经再次离心后，移取上清液进行抽滤至凝胶状；再进行干冻后移至NMR核磁管中进行核磁分析；
3)采集NMR数据：
所有的NMR的谱都在298K下用配置有反相检测低温探头Bruker Avance III 800MHz谱仪下进行采集，对应的质子共振频率为800.20MHz，使用标准的Noesypr1D脉冲序列RD-90°-t1-90°-tm-90°-ACQ采集一维1H NMR谱；施加50Hz强度的连续波在等待时间(RD，2s)和混合时间(tm，100ms)时进行水峰抑制，90°脉冲长度调至10s，t1设为6μs；
4)核磁共振数据处理和多元数据分析：
对一维氢谱进行手动相位和基线校正以及根据内标TSP定标后，用AMIX软件对5.55-0.80区间的1H NMR谱进行分割并积分；为去除水和残留的乙腈信号对谱峰的影响，与其相关的信号区间4.96-4.67和2.09-2.07被去除；每一个分割区间积分被归一化到整个谱峰的积分面积以弥补样品间体积或浓度的差异；
经归一化后的NMR数据被导入SIMCA-P+软件进行多变量统计分析：首先，利用主成分分析PCA，采用中心化数据处理方式，以观测样品的聚类情况和识别离群点；然后，采用正交化偏最小二乘法判别分析对NMR数据做进一步分析；模型的载荷图采用MATLAB软件绘制，在绘制载荷图之前，先对自动规格化NMR数据进行back-transformation处理；载荷图上的每一个点用颜色来表征，不同颜色对应于自动规格化的权重值；颜色标尺范围为自动规格化权重的最小值和最大值；
当样品处于OPLS-DA值和和荷载图A区间，则为非致病性的弧菌；当样品处于OPLS-DA值和和荷载图B区间，则确定为具有致病性哈维氏弧菌。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的固体培养基为海水牛肉膏蛋白胨固体培养基，其配方如下：1％蛋白胨、0.3％牛肉膏、2％琼脂。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中离心的条件是在4℃，12000r/min离心10min。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中乙腈水溶液的浓度为40％。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中的代谢产物为异戊酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、乙酸、苏氨酸、乳酸、丙氨酸、腐胺、醋酸盐、乙酰胺、N-乙酰基丙氨酸、蛋氨酸、γ-氨基丁酸、谷氨酸、琥珀酸、β-丙氨酸、天冬氨酸、二甲胺、赖氨酸、肌酸、Δ-羟赖氨酸、肉碱、甜菜碱、甘氨酸、核糖-5-磷酸、尿嘧啶、富马酸盐、酪氨酸、苯丙氨酸、胸腺嘧啶、胞苷、胸苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、甲酸、烟酸盐、残留的甲醇、氨基酸。
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