CN110632113A - 一种原子分子水平的原位细胞分析方法 - Google Patents

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王申林
汉蓉
宋治军
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    • G01N24/088—Assessment or manipulation of a chemical or biochemical reaction, e.g. verification whether a chemical reaction occurred or whether a ligand binds to a receptor in drug screening or assessing reaction kinetics

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Abstract

本发明属于原位细胞分析技术领域，本发明提供了一种原子分子水平的原位细胞分析方法，包括：设计LHSQC脉冲序列；固体核磁检测细菌与抗菌肽反应产物。通过本发明的方法，使检测灵敏度提高三倍以上，可以在较短的时间内获取高质量的固体核磁共振谱图，避免了长时间实验所导致的细菌死亡和代谢物改变，保持了细菌的活性并获取一系列可以反映细菌表面结构信息的一维、二维核磁谱图。

Description

一种原子分子水平的原位细胞分析方法
技术领域
本发明属于固体核磁共振检测技术领域。
背景技术
2019年世界卫生组织(WHO)报导，细菌耐药性问题已成为“全球十大健康威胁”之一。其严重程度甚至超过了艾滋病(HIV)和埃博拉病毒(EBOLA)。根据欧洲疾病预防和控制中心在2011年的统计数据(the European Centre for Disease Prevention andControl，ECDC)，欧洲每年有近25,000人死于抗药性细菌感染，英国政府于2013年提供的数据表明全世界近五十万人因细菌感染而死亡。细菌耐药性产生的主要原因是抗生素的长期使用。如何找到一种原子分子水平的原位细胞分析方法，变得尤为紧迫。
发明内容
本发明提供了一种原子分子水平的原位细胞分析方法，包括：设计LHSQC 脉冲序列；固体核磁检测细菌与抗菌肽反应产物。
进一步地，所述的细菌为大肠杆菌BL21。
进一步地，所述的抗菌肽为抗菌肽LAH4。
进一步地，所述的设计LHSQC脉冲序列为通过调节相位φ0，使开始检测时水的磁化矢量方向为+z轴。
进一步地，所述的固体核磁检测细菌与抗菌肽反应产物的pH＝5.3。
更进一步地，所述的抗菌肽LAH4的浓度为2MIC。
通过本发明的方法，使检测灵敏度提高三倍以上，可以在较短的时间内获取高质量的固体核磁共振谱图，避免了长时间实验所导致的细菌死亡和代谢物改变，保持了细菌的活性并获取一系列可以反映细菌表面结构信息的一维、二维核磁谱图。
附图说明
图1是抗菌肽抑菌机理全细胞原位研究方法示意图。
图2是LHSQC实验的脉冲序列图。
图3是大肠杆菌BL21与抗菌肽LAH4不同反应时间及pH条件下的固体核磁二维。其中，A是pH 5.3条件下的BL21，其中矩形框内为加入抗菌肽以后发生变化的信号，该区域是大肠杆菌表面脂多糖区LPS的信号；B是pH 5.3BL21 与LAH4反应20min；C是pH 5.3BL21与LAH4反应40min；D是pH 7.0BL21与 LAH4反应20min；E是pH 7.0BL21与LAH4反应40min。
图4是为固体核磁一维31P谱图。其中，矩形框区为细菌细胞膜脂多糖LPS 区域上的P-P键的信号。A为固体核磁一维31P谱图；B为大肠杆菌不加抗菌肽信号图；C为加抗菌肽信号图。
图5是固体核磁一维13C CP谱图。其中，A为加LAH4的固体核磁共振二维13C-13CDARR图；B为不加LAH4的固体核磁共振二维13C-13C DARR图。
具体实施方式
实施例
1.大肠杆菌BL21的培养
在大肠杆菌的LB(Luria-Bertani)培养基、标准M9基础培养基(M9 minimalmedium)中分别测定不同pH值下大肠杆菌的活性，如下表1所示：
表1不同培养基，不同pH值条件下LAH4的杀菌活性
培养基类型 pH值 MIC(μg/mL)
LB培养基 5.3 5
LB培养基 7.0 40
M9培养基 5.3 20
M9培养基 7.0 >320
在上述实验中，获得了在M9培养基中酸性和中性条件下抗菌肽LAH4的 MIC值，后续实验将选择M9培养基，并以酸性条件下抗菌肽的MIC值作为浓度参考。
在LB培养基中接入大肠杆菌BL21，37℃，210rpm培养使OD600值达到 7-10，转入25mL M9培养基，控制起始OD600值为0.1，37℃，210rpm，无氧条件下培养过夜，OD600值达到1.2～1.6时，离心(3000g,3min)得离心菌。
2.大肠杆菌BL21与抗菌肽LAH4的反应
配制pH＝5.3的M9溶液，将1中离心菌重悬，用配制好的M9将抗菌肽 LAH4溶解并配成抗菌肽LAH4为2MIC，37℃孵育16小时，离心(3000g,3min)，超纯水洗涤一次，装样，得到反应产物。
3.设计LHSQC脉冲序列
设计如图1所示的LHSQC脉冲序列。
其中，白色条和黑色条分别代表π/2和π脉冲。τ为通过实验优化的脉冲间隔时间。
通过调节相位φ0，使开始检测时水的磁化矢量方向为+z轴，从而加速目标质子的纵向弛豫的恢复，提高单位时间的扫描次数，进而提高检测效率。
数据采集开始时，水磁化在+z方向上，0为+x，水磁化在-z方向，0为-x。相位周期分别为□1＝(y,y,y,y,-y,-y,-y,-y)，□2＝(x,x,x,x,-x,-x,-x,-x)和□rec ＝(x,-x,x,-x,-x,x,-x,x)。
4.固体核磁检测细菌与抗菌肽反应产物
如图2所示，在pH 5.3的M9培养基中使抗菌肽LAH4和大肠杆菌反应 20min,40min，并利用LHSQC快速检测方法测定反应前后大肠杆菌的固体核磁二维1H-13C相关谱。
在pH 5.3酸性条件下时，细菌与抗菌肽反应前后，细菌细胞膜上磷脂信号 (图2-A中)无明显变化,但脂多糖LPS(Lipopolysaccharide)的信号(图2-A 中矩形区域)明显减弱，并且反应时间越长，变化越显著(图2-B、C)。在pH 7.0 中性条件下时，两种信号均无明显变化(图2-D、E)。
由此可知，LAH4破坏了细菌细胞膜表面的多糖结构，进而杀死细菌。并且抑菌过程受pH的调控，在酸性条件下，LAH4的抑菌功能更强。
通过采集固体核磁共振2D1H-13CLHSQC相关谱，发现抗菌肽LAH4随着时间的延长逐步破坏细菌细胞壁。
通过1H-13CCP和1D-31P实验发现，加入LAH4后，大肠杆菌细胞表面磷脂膜的流动性降低。
在酸性条件下，随着抗菌肽LAH4浓度的增大，LAH4先吸附在大肠杆菌细胞膜表面，降低细菌膜流动性，增大膜通透性，进而以类似于表面活性剂的方式将膜裂解，导致细菌死亡。
如图3所示，加入抗菌肽后，在酸性条件下，细菌表面脂多糖LPS以及肽聚糖PG区域的信号受到明显影响(信号减弱)，且随着时间的延长，信号减弱的程度增大。磷脂的谱图信号随时间未发生明显变化。在中性条件下，LPS，PG 和磷脂的谱图信号均无明显变化。抗菌肽LAH4在酸性条件下会影响细菌表面 LPS和PG的结构。
如图4所示，酸性条件下细菌中加入LAH4后，LPS在一维31P谱-10ppm处的特征峰变宽，分辨率下降。LAH4在酸性条件下会扰乱LPS结构的均一性(峰变宽，分辨率下降表明结构的均一性下降)，即LAH4在酸性条件下会影响LPS 的结构。细菌表面多糖信号峰半峰宽变窄，强度变大，LPS区域信号增强，即刚性增强，细菌细胞膜的流动性减弱。
如图5所示，加LAH4和不加LAH4时，大肠杆菌在37℃条件下孵育 40min后的固体核磁共振二维13C-13C DARR(Dipolar-Assisted Rotational Resonance)谱(图5-A,B)。加LAH4后，二维DARR谱(图5-A)中，多糖区的大多数峰强度比不加LAH4时DARR谱(图5-B)中对应的交叉峰强度有了明显的增强。酸性条件下加入LAH4，谱图信号增强。酸性条件下，LAH4使细菌膜结构刚性变强，流动性减小。
抗菌肽LAH4在酸性条件下,吸附在细菌膜表面，破坏LPS区域的多糖结构均一性，细菌膜结构被扰乱破坏，膜的刚性增强，流动性减弱，细菌膜的通透性改变。

Claims (6)

1.一种原子分子水平的原位细胞分析方法，其特征在于，包括：
设计LHSQC脉冲序列；
固体核磁检测细菌与抗菌肽反应产物。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的细菌为大肠杆菌BL21。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的抗菌肽为抗菌肽LAH4。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的设计LHSQC脉冲序列为通过调节相位φ0，使开始检测时水的磁化矢量方向为+z轴。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的固体核磁检测细菌与抗菌肽反应产物的pH＝5.3。
6.如权利要求3所述的分析方法，其特征在于，所述的抗菌肽LAH4的浓度为2MIC。
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