CN108614000A - 基于simca模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品安全领域，特别是麦卢卡蜂蜜鉴别领域，更为具体的说是涉及基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，利用请核磁共振波谱数据建立SIMCA模型，该模型稳定可靠。与其他麦卢卡蜂蜜的鉴别方法相比较，本发明通过运用模型方法对未知样本进行判别，避免主观因素和人为干扰，检测的准确性显著提高；运用H‑NMR对蜂蜜样本进行检测，没有复杂的样本前处理，操作相对简单，可实现高通量处理样本；可通过扩大数据库容量，提高准确率。
Description
技术领域
本发明属于食品安全领域，特别是麦卢卡蜂蜜鉴别领域，更为具体的说是涉及基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法。
背景技术
麦卢卡(Manuka)蜂蜜是新西兰特有的一种珍贵蜜种，是蜜蜂采集新西兰特有的一种灌木植物——Manuka(Leptospermum scoparium)的花蜜酿造而成的。由于麦卢卡蜂蜜具有独特的抗菌活性，可用于预防伤口感染，帮助伤口愈合，具有较高的药用价值，因此越来越受到我国消费者的青睐。
目前，新西兰的麦卢卡蜂蜜出口近10年来每年增长10％左右，2013年，从新西兰出口的蜂蜜价值1.28亿新西兰元。根据新西兰一家蜂农协会的统计，新西兰每年大约只出产1700-2000吨的麦卢卡蜂蜜，而在全球范围内，每年以麦卢卡名义出售的蜂蜜高达1万吨以上。同样地，进口至我国的麦卢卡蜂蜜所占的比重也在逐年增加。
一方面，有少数不法商人为了牟取暴利，在纯正的麦卢卡蜂蜜中掺入相对便宜的糖浆，这对进出口蜂产品市场造成了极大负面影响，欺骗了广大消费者，除了糖浆掺假外，其它种类的蜂蜜用于麦卢卡蜂蜜掺假也经常存在，而且后者往往更难鉴别。另一方面，由于麦卢卡蜂蜜是根据其抗菌活性高低进行质量评价和分级的，不同级别的麦卢卡蜂蜜价格差异巨大。麦卢卡蜂蜜中非法添加人工合成甲基乙二醛（methylglyoxal, MGO）或二羟基丙酮（DHA）以提高活性谋取暴利。
麦卢卡的鉴别方法主要由新西兰麦卢卡蜂蜜政府有关部门发布，常用丙醛酮（MGO）或二羟基丙酮（DHA）含量评价麦卢卡蜜的级别，但两者均可人为掺假。新西兰麦卢卡协会（UMFHA）发现leoptosperin和丁香酸甲酯作为麦卢卡蜂蜜的特征化合物且其含量与抗菌活性相关。新西兰官方为了建立一种基于科学、准确可靠麦卢卡蜂蜜鉴定标准，新西兰初级产业部（Ministry for Primary Industries，MPI）经过三年科学计划项目，在2017年4月公布了同时能区分出单花种麦卢卡蜜、多花种麦卢卡蜜和非麦卢卡蜂蜜鉴定标准，最终确定2'-甲氧基苯乙酮（2'-MAP）、2-甲氧基苯甲酸（2-MBA）、3-苯基乳酸（3-PA）和4-羟基苯基乳酸（4-HPA）这四种化合物可以作为判定麦卢卡蜂蜜的指标。但麦卢卡蜂蜜判定标准缺乏统一，导致蜂蜜市场鱼龙混杂。
我国在2011年出台了关于蜂蜜的强制性国家标准GB 14963-2011，主要从水分、果糖和葡萄糖总量及蔗糖含量三个强制性指标来判断蜂蜜的质量，该标准可用于评判麦卢卡蜂蜜的品质。但是由于新国标的检测参数相对简单，很难有效鉴别麦卢卡蜂蜜的掺假。针对新国标的掺杂造假的方法不断出现，掺杂后的麦卢卡蜂蜜其各项指标都能符合国标的要求。同时，目前国内对于麦卢卡蜂蜜的研究基本处于空白，这对于进口麦卢卡蜂蜜的监督监管, 以及保障我国消费者的合法权益都会造成很大影响。因此，开发有效、灵敏的蜂蜜掺假检测方法变得极为迫切，急需国内进行相关研究并制订标准以进行监管。
发明内容
本发明的目的是针对麦卢卡蜂蜜监督监管空白，提供一种基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法。
为了实现上述发明目的，本发明公开了一种基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，包括如下步骤：
A1.收集不同产地的麦卢卡蜂蜜巢蜜样本和不同品牌的麦卢卡商品化样本作为麦卢卡蜂蜜样本集S1；
A2.收集不同产地的卡努卡蜂蜜巢蜜样本、瑞瓦瑞瓦蜂蜜巢蜜样本、卡玛西蜂蜜巢蜜样本、圣诞花蜂蜜巢蜜样本、瑞塔蜂蜜巢蜜样本、塔瓦瑞蜂蜜巢蜜样本作为非麦卢卡蜂蜜样本集S2；
A3.分别测定麦卢卡蜂蜜样本集S1中的样本和非麦卢卡蜂蜜样本集S2中的样本的氢核磁共振数据；
A4.将A3获得的数据进行校正、提取、剔除，然后以筛选后的数据进行分段强度积分，并以这些强度积分数据矩阵进行标准化处理，选取前4个主成分建立SIMCA模型；将经过标准化处理的纯麦卢卡蜂蜜样本的强度积分相对数据矩阵与类别变量进行自动回归建模，得到鉴别模型；
A5.测定未知样本的氢核磁共振数据，并将该数据代入已建立的鉴别模型，判定未知样本是否为麦卢卡蜂蜜。
其中，本发明所说的不同产地的麦卢卡蜂蜜巢蜜样本是指分别采集自新西兰南岛和北岛的麦卢卡蜂蜜巢蜜样本。不同产地的卡努卡蜂蜜巢蜜样本、瑞瓦瑞瓦蜂蜜巢蜜样本、卡玛西蜂蜜巢蜜样本、圣诞花蜂蜜巢蜜样本、瑞塔蜂蜜巢蜜样本、塔瓦瑞蜂蜜巢蜜样本是指分别采集自新西兰南岛和北岛的巢蜜样本。
同样地，为了更加清楚，我们还需要指出的是，在本发明中所说的不同品牌的麦卢卡商品化样本是指市售的确认为麦卢卡蜂蜜的商品化样本。
优选地，测定麦卢卡蜂蜜样本集S1中的样本和非麦卢卡蜂蜜样本集S2中的样本的氢核磁共振数据中核磁共振波谱的分析条件为：采用BBI探头；测定温度: 室温20-35 ℃；环境湿度: 20-35%；观察频率400 MHz；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d或者为zg30或者zgpr；谱宽: 6410 Hz；90°脉冲宽度: pl= 6. 45μs；脉冲延迟时间: dl= 15 s；发射中心: O1=4.7；累加次数: 16或者为64。
进一步优选地，步骤A4中SIMCA模型的建立方法详细描述为：
A4.1数据获取：以核磁共振谱仪自带的数据处理软件对所得的核磁共振信号进行傅立叶变得换，得到样本的核磁图谱数据；
A4.2谱图预处理：将3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠做内标物，化学位移设为0.00进行谱峰对齐；基线校正选择polynomial fit拟合方式；相校正选择global和metabonomics算法先自动优化；
A4.3数据提取：将1H 化学位移δ 为4．69 ～ 5．20 区间的谱峰强度置为零，并从数据矩阵中剔除，同时将内标的化学位移δ0.00-0.10之间的谱峰也从数据矩阵中剔除，采用分段积分的方法，积分范围为化学位移δ0.10-10.0之间，按每段宽度△δ为0.03ppm进行分段积分；
A4.4模型的建立：对麦卢卡蜂蜜的强度积分相对数据矩阵进行标准化， pareto作为数据的标准化方法；选取前4个主成分建立SIMCA模型。
优选地，在本发明中我们还进一步公开蜂蜜样本的前处理方法：A0.包括样本溶解、除杂、以及检测样本制备。
所述的样本溶解优选的技术方案是，对无结晶的蜂蜜样本，直接将其搅拌均匀；对有结晶的蜂蜜样本，在密闭情况下，置于不超过40-60℃的水浴中温热，振荡，待样本全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。
其中优选的技术方案是置于不超过60℃的水浴中温热。
所述的除杂优选通过滤布过滤。其中进一步优选为利用0.10mm-0.14mm孔径尼龙滤布过滤除杂。
所述的检测样本制备包括以下步骤：
A0.1准确称取一定量的样本于离心管中，加入1mL 重水，溶解完全；
A0.2取A0.1中的溶液，并向其中加入浓度为0.5-2.0 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，其中，磷酸盐缓冲溶液中含体积分数为0.05-0.3%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液和0.1-3.0 mM的叠氮化钠，涡旋振荡至均匀混合，调整最终溶液的pH值为2.5-4.0，取其中600μl于核磁管中。
优选地，A0.1溶液与磷酸盐缓冲溶液两者的体积比为 800-1500：100-300。
优选地，本发明公开调整最终溶液pH选用盐酸或强氧化钠。更为优选的技术方案是，盐酸或强氧化钠的浓度为1.0 mol/L。
还需要说明的是，在本发明中我们运用建立好的鉴别模型对未知样本是否为麦卢卡蜂蜜进行判定，该判定方式是根据未知样本距离模型的位置和距离模型中心的远近来综合评估，最终判断未知样本是否属于模型内类别。
本发明所选用的四个主成分能够解释所有变量的97.7%，通过本发明所公开的方法所建立的鉴别模型稳定可靠。与其他麦卢卡蜂蜜的鉴别方法相比较，本发明通过运用模型方法对未知样本进行判别，避免主观因素和人为干扰，检测的准确性显著提高；运用H-NMR对蜂蜜样本进行检测，没有复杂的样本前处理，操作相对简单，可实现高通量处理样本；可通过扩大数据库容量，提高准确率。
附图说明
图1 为纯麦卢卡蜂蜜的SIMCA模型图。
图2 为所建模型的R2和Q2分布图。
图3 为未知样本1的SIMCA分布图。
图4为未知样本2的SIMCA分布图。
图5为未知样本3的SIMCA分布图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
实施例1 模型建立
1.仪器和设备
实验设备包括： Advance 400型核磁共振仪（瑞士布鲁克公司），14.1 T超导磁体，5 mm双核z-梯度探头及Topspin 2.3 试验控制及数据处理软件；5mm核磁共振样本管；高速离心机（Sigma，德国公司）；涡旋混合器（XW-80A型，上海医科大学仪器厂）；LP403分析天平（赛多利斯，德国公司）；
实验溶剂包括：氘代水（氘带度为99.8%）购于Cambrideg Isotope Laboratories公司；3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠（TSPSA）购于Aldich-Sigma公司；磷酸氢二钾和磷酸二氢钠（优级纯）购于Aldich-Sigma公司。
2.蜂蜜样本收集
共收集于新西兰不同产地的麦卢卡蜂蜜、卡奴卡蜂蜜、瑞瓦瑞瓦蜂蜜、卡玛希蜂蜜、圣诞花蜂蜜、瑞塔蜂蜜、塔瓦瑞蜂蜜7个品种，共计114个巢蜜样本，其中麦卢卡蜂蜜的巢蜜样本不低于80个；以及来自新西兰国家的50个商品化麦卢卡蜂蜜进行了分析。
3.样本制备
对无结晶的实验室样本，将其搅拌均匀，对有结晶的样本，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样本全部融化后搅匀，迅速冷却至室温；将融化后的蜂蜜样本，经0.10mm-0.14mm孔径尼龙滤布过滤，除去蜂蜜中固体杂质后，准确称取0.25 g样本于离心管中，加入1mL 重水，溶解完全；加入200μl浓度为1.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH=4.0）和100μl含体积分数为0.05%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液，涡旋振荡3min至均匀混合，离心10 min，取上清液于核磁管中。
4. 核磁指纹图谱数据库的建立
在400 MHz核磁共振波谱仪上进行1HNMR测试，实验温度为298K，利用D2O进行锁场，采用预饱和方法压制水峰； 其中在Topspin软件中各参数设置如下：PULPROG= Jresgpprqf,AQ_mod=DQD, TD=32K, NS=8*N, DS=4, TD0=1, SW=6000 Hz, D1=3 s, DE=4 μs, D8=0.1s, 信号累加240次，分别得到蜂蜜、掺假蜂蜜和糖浆样本的核磁共振信号，具体如图1所示；
5. 麦卢卡蜂蜜SIMCA模型的建立
用核磁共振谱仪自带的数据处理软件对所得的核磁共振信号进行傅立叶变得换，得到样本的核磁图谱。
谱图预处理将3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠做内标物，化学位移设为0.00进行谱峰对齐；基线校正选择polynomial fit拟合方式；相校正选择global和metabonomics算法先自动优化；
数据提取 将1H 化学位移δ 为4．69-5．20 区间的谱峰强度置为零，并从数据矩阵中剔除，同时将内标的化学位移δ0.00-0.10之间的谱峰也从数据矩阵中剔除。采用分段积分的方法，积分范围为化学位移δ0.10-10.0之间，按每段宽度△δ为0.03ppm进行分段积分；
模型的建立 对麦卢卡蜂蜜的强度积分相对数据矩阵进行标准化， pareto作为数据的标准化方法；选取前4个主成分建立SIMCA模型，4个主成分能够解释所有变量的97.7%;建立的模型；采用SIMCA算法，将经过标准化处理的纯麦卢卡蜂蜜样本的强度积分相对数据矩阵与类别变量进行自动回归建模，得到鉴别模型。模型如图1所示。
实施例2 模型有效性验证
通过随机置换测试，对模型的有效性进行验证，评价模型质量的参数有R2和Q2，其中R2分别表示模型对X和Y矩阵的解释能力，Q2 表示模型的预测能力，R2和Q2越接近于1说明模型越稳定可靠，一般情况下该值高于0.5就能说明模型较好。
如图2所示实施例1中所建立模型的R2和Q2分别是0.99和0.95。表明本发明所建立的鉴别模型稳定可靠。
实施例3 未知样本鉴别
分别将3个未知样本按照实施例1中样本制备的方法进行样本处理，并按照实施例1中核磁共振波谱分析条件对其进行1HNMR测试，分别收集3个未知样本的氢核磁共振波谱数据。运用建立好的SMICA模型进行预测，其SIMCA分布图分别如图3-图5所示。根据未知样品距离模型的位置和距离模型中心的远近来综合评估，结果如表1所示。
表1：
| 样品编号 | 模型结果 | 到模型中心的相对距离 | 到模型的相对距离 |
| 1 | 模型外 | 3.114 | 2.312 |
| 2 | 可疑 | 0.375 | 1.014 |
| 3 | 模型中 | 0.278 | 0.769 |
根据表1所公开的知样品距离模型的位置和距离模型中心的远近，得到相应的模型结果如表1所公开的。
据此，判定样品1为非麦卢卡蜂蜜，样品2为可疑样品，样品3为麦卢卡蜂蜜。
Claims (10)
1.基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：包括如下步骤：
A1.收集不同产地的麦卢卡蜂蜜巢蜜样本和不同品牌的麦卢卡商品化样本作为麦卢卡蜂蜜样本集S1；
A2.收集不同产地的卡努卡蜂蜜巢蜜样本、瑞瓦瑞瓦蜂蜜巢蜜样本、卡玛西蜂蜜巢蜜样本、圣诞花蜂蜜巢蜜样本、瑞塔蜂蜜巢蜜样本、塔瓦瑞蜂蜜巢蜜样本作为非麦卢卡蜂蜜样本集S2；
A3.分别测定麦卢卡蜂蜜样本集S1中的样本和非麦卢卡蜂蜜样本集S2中的样本的氢核磁共振数据；
A4.将A3获得的数据进行校正、提取、剔除，然后以筛选后的数据进行分段强度积分，并以这些强度积分数据矩阵进行标准化处理，选取前4个主成分建立SIMCA模型；将经过标准化处理的纯麦卢卡蜂蜜样本的强度积分相对数据矩阵与类别变量进行自动回归建模，得到鉴别模型；
A5.测定未知样本的氢核磁共振数据，并将该数据代入已建立的鉴别模型，判定未知样本是否为麦卢卡蜂蜜。
2.根据权利要求1所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：测定麦卢卡蜂蜜样本集S1中的样本和非麦卢卡蜂蜜样本集S2中的样本的氢核磁共振数据中核磁共振波谱的分析条件为：采用BBI探头；测定温度: 室温20-35 ℃；环境湿度: 20-35%；观察频率400 MHz；采用预饱和方法压制水峰；脉冲程序为：noesygppr1d或者为zg30或者zgpr；谱宽: 6410 Hz；90°脉冲宽度: pl= 6. 45μs；脉冲延迟时间: dl= 15 s；发射中心: O1=4.7；累加次数: 16或者为64。
3.根据权利要求1所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：步骤A4中SIMCA模型的建立方法详细描述为：
A4.1数据获取：以核磁共振谱仪自带的数据处理软件对所得的核磁共振信号进行傅立叶变得换，得到样本的核磁图谱数据；
A4.2谱图预处理：将3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠做内标物，化学位移设为0.00进行谱峰对齐；基线校正选择polynomial fit拟合方式；相校正选择global和metabonomics算法先自动优化；
A4.3数据提取：将1H 化学位移δ 为4．69 ～ 5．20 区间的谱峰强度置为零，并从数据矩阵中剔除，同时将内标的化学位移δ0.00-0.10之间的谱峰也从数据矩阵中剔除，采用分段积分的方法，积分范围为化学位移δ0.10-10.0之间，按每段宽度△δ为0.03ppm进行分段积分；
A4.4模型的建立：对麦卢卡蜂蜜的强度积分相对数据矩阵进行标准化， pareto作为数据的标准化方法；选取前4个主成分建立SIMCA模型。
4.根据权利要求1所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：还包括蜂蜜样本的前处理：
A0.包括样本溶解、除杂、以及检测样本制备。
5.根据权利要求4所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：所述的样本溶解对无结晶的蜂蜜样本，直接将其搅拌均匀；对有结晶的蜂蜜样本，在密闭情况下，置于不超过40-60℃的水浴中温热，振荡，待样本全部融化后搅匀，迅速冷却至室温。
6.根据权利要求5所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：置于不超过60℃的水浴中温热。
7.根据权利要求4所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：所述的除杂采用滤布过滤。
8.根据权利要求7所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：利用0.10mm-0.14mm孔径尼龙滤布过滤除杂。
9.根据权利要求4所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是：所述的检测样本制备包括以下步骤：
A0.1准确称取一定量的样本于离心管中，加入1mL 重水，溶解完全；
A0.2取A0.1中的溶液，并向其中加入浓度为0.5-2.0 mol/L的磷酸盐缓冲溶液，其中，磷酸盐缓冲溶液中含体积分数为0.05-0.3%的3-三甲基硅烷基-1-丙基磺酸钠内标溶液和0.1-3.0 mM的叠氮化钠，涡旋振荡至均匀混合，调整最终溶液的pH值为2.5-4.0，取其中600μl于核磁管中。
10. 根据权利要求9所述的基于SIMCA模型的麦卢卡蜂蜜鉴别方法，其特征是： A0.1溶液与磷酸盐缓冲溶液两者的体积比为 800-1500：100-300。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 210000 1 / F, half mezzanine, 2-6 / F, 7 / F, half mezzanine, 3 / F, 39 Chuangzhi Road, Jianye District, Nanjing City, Jiangsu Province Applicant after: Nanjing Customs animal and plant and food testing center Address before: No.39 Chuangzhi Road, Jianye District, Nanjing City, Jiangsu Province, 210000 Applicant before: ANIMALS, PLANTS AND FOOD INSPECTION CENTER OF JIANGSU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20181002 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |