JP5638806B2 - ポリメラーゼ連鎖反応試験のためのランダムアクセスシステムおよび方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に２００６年１１月３日に出願された米国仮出願第６０／８５６,４５３号（その開示を本明細書に参照により組み入れる）の利益を主張する。

連邦政府支援研究または開発に関する陳述
（該当せず）

発明の背景
本発明は、生物試料を単離および精製するための、および生物試料を試験するためのシステムおよび方法に、より特定すると、生物試料中に含まれる核酸を単離および精製するための、および、例えばポリメラーゼ連鎖反応試験によって、生物試料を試験するためのハイスループットランダムアクセスシステムおよび方法に関する。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験は、普遍的に受け入れられておりそして広く実行されている、試験管中でＤＮＡのような核酸（ＮＡ）の濃度を複製または増幅するための研究室方法である。複製／増幅は、ある濃度のＤＮＡ分子を含む水溶液中で行われる。次いで、事前に決定された量のポリメラーゼ酵素、オリゴヌクレオチドプライマー、４つの核酸の三リン酸塩または基質、活性化剤、および安定剤が水溶液に加えられ、次いでこれは、変性サイクル、アニーリングサイクル、および伸長サイクルといわれる３つの温度サイクルに供される。

第１の変性サイクルの間、水溶液中のＤＮＡ二重らせんは約９０〜９５℃で融解し、その結果、二重らせんの各々の鎖は他方から分離される。第２のアニーリングサイクルの間、変性された水溶液は約５０〜約６５℃の温度に冷却され、これによりオリゴヌクレオチドプライマーは各々の変性されたＤＮＡ鎖の相補的ヌクレオチド配列に結合させられる。最後に、伸長サイクルの間、約７０〜約７２℃の温度でのプライマーの伸長によってＤＮＡ二重らせんが再形成される。より具体的には、Ｔａｑポリメラーゼのような耐熱性ポリメラーゼが、相補的ヌクレオチド配列に結合されたプライマー鋳型へヌクレオチドを結合させ、これが以前に１つのみ存在した所に２つの新たなＤＮＡ二重らせんを形成する。従って、完全なサイクルごとに、ＤＮＡ分子の数の倍加が存在し、それで、ｎサイクル後のＤＮＡ分子の数は２^ｎに等しい。

３つの温度サイクルの各々の持続時間は非常に短く、そして典型的には秒で測定される。例えば、ＤＮＡ分子は、変性サイクルの間に約９５℃で瞬間的に融解する。プライマーが十分な濃度で利用可能である場合、アニーリングサイクルの間のプライマーハイブリダイゼーションには、約１秒または２秒が必要とされるのみである。最後に、伸長サイクルの間の再形成は、毎秒約８０の結合速度で起こり得る。従って、伸長サイクルには約２秒のみが必要とされる。従って、理論上は、各々のＰＣＲサイクルは完了するのに約５秒を必要とする。

しかし、実際には、各々の温度サイクルの持続時間は、事前に決定された温度サイクル温度で水溶液を加熱または冷却するための、熱伝達の速度に依存する。加熱／冷却速度に影響を及ぼし得る変数には、とりわけ、溶液の体積、水溶液の濃度、水溶液中にＮＡを保持する容器の熱伝導率、容器を保持する器具の熱伝導率、および、例えば伝導または対流による、熱を加えそして除く方法が含まれる。

従来、ＰＣＲ試験は「バッチ」で行われている。例えば、典型的には、温度サイクルデバイス（例えば、ＰＣＲプレート）は、近接して間隔を置かれた８×１２の容器ウェルパターンの９６個の容器を保持する。しかし、バッチ処理およびバッチ処理のために使用される大きな温度サイクルデバイスはいくつかの欠点を有する。

第１に、温度サイクルデバイス中の各々のウェルが容器で満たされるまで試験は開始されず、これは時間を追加する。第２に、アニーリングおよび伸長温度サイクルのための事前に決定された温度はＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＤＢのような試験される核酸に依存して変動するので、温度サイクルデバイス中の各々のウェルが同じＤＮＡ分子のある濃度を有する水溶液を含む各々の容器で満たされるまで試験は開始されず、これはさらに多くの時間を追加する。第３に、容器および温度サイクルデバイスはユニットとして一度に導入されるので、容器および温度サイクルデバイスを温度サイクルに関連する事前に決定された温度にするための時間の量は、個別の容器を温度サイクルに関連する事前に決定された温度にするための時間の量より大きくなる。

バッチ処理のこれらの欠点には、温度サイクルの各々へのランダムアクセスを提供しそして、さらに、水溶液を含む各々の容器に渡って個別の温度制御を提供するシステムおよび方法によって取り組むことができる。

Lund, et al.に対する米国特許第６,５５８,９４７号は、隣接する容器ウェルの温度と独立してデバイス中の各々の容器ウェルの温度を制御することを可能にする、バッチ型温度サイクルデバイスを開示する。しかし、温度サイクルデバイスがバッチ処理される前に９６個の容器ウェルの各々を満たすのに時間がなお費やされるので、これは問題の半分に取り組むのみである。

それゆえ、温度サイクルの各々へのランダムアクセスを提供し、そして水溶液を含む各々の容器に渡って個別の温度制御を提供するハイスループットシステムおよび試験方法を提供することが所望される。

発明の概要
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験のための核酸（ＮＡ）の初期濃度を有する生物試料を調製するためのシステムおよび方法を開示する。システムは、核酸単離／精製器具およびＰＣＲ試験器具を含む。核酸単離／精製器具は、生物試料からＮＡ固体を磁気的に捕獲し、次いでＮＡを溶出緩衝溶液中に懸濁する。ＰＣＲ試験器具は、溶出された溶液を、ＰＣＲ試験に関連する変性、アニーリングおよび伸長温度サイクルの複数のサイクルに供する。

より具体的には、ＰＣＲ試験器具は、隣接する単一容器サーマルサイクラーがそれぞれのＰＣＲ試験プロセスの異なる温度サイクルに対応する異なる温度に加熱または冷却され得るように各々が個別に温度制御可能である複数の単一容器サーマルサイクラーを有する多容器サーマルサイクラーアレイを含む。

本発明は、以下のより詳細な説明および添付の図面を参照することによってより十分に理解され、ここで同様の参照番号は同様の部分を指す。

図１は、開示される本発明によるＰＣＲ試験のためのランダムアクセスシステムの模式図を示す。 図２は、開示される本発明によるＰＣＲ試験のためのランダムアクセスシステムの核酸単離／精製器具を示す。 図３は、開示される本発明によるランダムアクセスシステムのＰＣＲ試験器具を示す。 図４は、開示される本発明による、増幅および検出デバイス中に配置される、反応液を含むキュベットを個別に加熱するための、単一容器サーマルサイクラーを示す。 図５は、開示される本発明による蛍光光度計および増幅および検出デバイスのブロック図を示す。

発明の詳細な説明
開示される本発明は、生物試料中に含まれる核酸（ＮＡ）を単離および精製するための、および、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験によって、生物試料を試験するためのランダムアクセスシステムおよび前記システムを使用する方法を提供する。ＰＣＲ試験は当技術分野において周知であり、そして詳細には記載しない。また、本明細書において言及される磁性粒子を使用して核酸を単離および精製するための「Boom特許」技術は、Boom, et al.に対する米国特許第５，２３４，８０９号（その全体を本明細書に参照により組み入れる）の課題である。

図１〜３を参照して、生物試料中に含まれるＮＡを単離および精製するための、および単離および精製されたＮＡを試験するためのランダムアクセスシステム１０が示される。システム１０は、何らかの濃度のＮＡを含む水性試料、すなわち「反応液」、のハイスループットおよび連続的試験を提供する。本明細書において、ＮＡは、一本鎖核酸、すなわちＲＮＡ、および二本鎖核酸、すなわちＤＮＡ、を指すために使用される。

システム１０（図１）は、核酸（ＮＡ）単離／精製器具２０（図２）およびＰＣＲ試験器具３０（図３）を含み、それらは以下で別々に考察される。

核酸単離／精製器具
Boom特許は、何らかの内在性ＮＡおよび／または何らかの外来性ＮＡを最初に含む生物材料中のＮＡを単離および精製するための手段を開示する。Boomプロセスは、迅速で再現性がありそして単純であり、そして精製された最終生成物は損傷を受けておらず、そしてＰＣＲのような他の分子生物学的反応において使用可能である。

Boomプロセスは、血液、血清、精液、尿、糞便、唾液、組織培養物、細胞培養物などのようなＮＡ保有生物材料を、微粒子シリカ粒子の存在下で、多量のカオトロピック物質と混合することによって開始する。カオトロピック物質により、生物試料のＮＡの全てがほぐされる。ほぐされたＮＡはシリカ粒子に結合する。

カオトロピック物質には、限定するものではないが、グアニジン塩酸塩、グアニジン（イソ）チオシアネート、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウムなどが含まれ得る。ＮＡ結合固相シリカ粒子には、ガラス粉末、酸化ケイ素、二酸化ケイ素結晶、無定形酸化ケイ素などが含まれ得る。

次いで、固体シリカ−ＮＡ複合体を、例えばボルテックスを使用して遠心的に、水溶液から分離する。水溶液を捨てる。固体を再びカオトロピック緩衝液で洗浄し、そして再び水性洗浄液からの分離に供する。この洗浄および分離プロセスを複数回繰り返し得る。

固体シリカ−ＮＡ複合体を、水−アルコール溶液およびアセトンを使用して最終的に洗浄する。アセトンを除去するために溶液を乾燥し、固体シリカ−ＮＡ複合体が残る。固体シリカ−ＮＡ複合体を、水性溶出緩衝液を用いて最終的に溶出し、そして溶液、すなわち「溶出された溶液」、中の精製されたＮＡを回収する。

開示される本発明のＮＡ単離／精製器具２０は、生物試料中に存在するＮＡの単離および精製におけるBoom特許の教示に一般に従う方法の実行を可能にする。図１および２を参照して、既知または未知の濃度のＮＡを含む試料を、Siemens Medical Solutions Diagnostics of Tarrytown, New Yorkによって製造されるＡｄｖｉａ Ｃｅｎｔａｕｒ（登録商標）イムノアッセイシステムにおいて使用されるような試料ハンドラー２１から取り出し、そしてボルテックス／インキュベーションデバイス２２中のチューブ中に分注する。環状ボルテックス／インキュベーションデバイス２２は、チューブを保持するための４５個の位置を含み、そして約１１００回毎分（ＲＰＭ）で回転することができる。各々のサイクルでＮＡ試料をボルテックス／インキュベーションデバイス２２に挿入し、そしてそれから取り出す。有利なことに、従来のバッチ処理とは異なり、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＤＢなどのような異なるＮＡを含む試料を、ボルテックス／インキュベーションデバイス２２にランダムに挿入することができる。

環状ボルテックス／インキュベーションデバイス２２中の位置の数が、所望されるスループットおよび時間を含む多くの事柄の関数であることを当業者は理解することができる。それゆえ、４５個より多いかまたは少ない位置を有する環状ボルテックス／インキュベーションデバイス２２の使用は、本開示の範囲および精神内にある。

ＮＡ試料を含むチューブに、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）のようなＮＡのタンパク質構造を分解するための酵素を加え、そして混合物を、ボルテックス／インキュベーションデバイス２２中で約５６℃の温度で約５分間インキュベートする。次いで、Ｓ９のような溶解緩衝液、磁性シリカ粒子（ＭＰ）、キャリアーＲＮＡ、および内部標準（ＩＣ）を、ＮＡ試料と混合する。一旦プロテイナーゼＫ酵素がＮＡ試料のタンパク質構造を分解すると、溶解緩衝液がＮＡを遊離させる。

次いで、この混合物をボルテックス／インキュベーションデバイス２２中で約５６℃で約１５分間インキュベートおよび攪拌する。インキュベーションおよび攪拌により、ＮＡ保有試料が分解され、試料からのＮＡの遊離が引き起こされる。次いで、遊離されたＮＡは磁性シリカ粒子（ＭＰ）によって捕獲される。攪拌の代替手段には、例えば超音波振動が含まれ得る。

各々のインキュベーションおよび攪拌サイクルの完了時に、ＮＡ試料を保有するチューブを、ボルテックス／インキュベーションデバイス２２から連続的および逐次的に取り出し、そして適切な寸法の置き場を有するコンベアベルトのような、試料チューブコンベア２４上に配置する。例えば、空気稼動昇降機（pneumatically-activated elevator）を使用して、チューブをボルテックス／インキュベーションデバイス２２からチューブコンベア２４に持ち上げることができる（示さず）。

チューブコンベア２４上にある間に、液体溶解緩衝液、すなわちＳ９、および上清を、例えば吸引によって、磁性シリカ粒子（ＭＰ）から分離し、そして磁性シリカ粒子（ＭＰ）を洗浄する。各々の洗浄サイクルは、チューブへ水性洗浄溶液を分注すること；チューブを攪拌して、磁性シリカ粒子（ＭＰ）を再懸濁すること；チューブの内容物に対して磁気的分離を行なうこと；および水溶液を吸引しそして捨てることを含む。４回の洗浄サイクルが許容される数である；しかし、より多い洗浄サイクルからはより多くのＮＡの単離および精製が存在し得、そしてより少ない洗浄サイクルからはより少ないＮＡの単離および精製が存在し得ることを理解し、より多いかまたはより少ない洗浄サイクルを使用することができる。

磁性シリカ粒子の使用は、捕獲されたＮＡの液体溶解緩衝液および上清からの磁気的分離を可能にする。以前に記載するように、固体の非常に微粒子の磁性シリカ粒子がＮＡを捕獲する。例えばシリンジポンプを使用して、チューブに洗浄溶液を加え、そしてチューブを攪拌し、ＮＡ保有磁性シリカ粒子を再懸濁した後に、チューブに磁場を加える。１つの実施態様において、磁場は、チューブコンベア２４の通路に沿った選択された位置に隣接して配置された１つ以上の磁石から生じる。磁場は、ＮＡ保有磁性シリカ粒子を、それぞれのチューブの一方の内部表面に迅速に誘引する。

チューブの攪拌は、コンベアベルト２４の上でおよびそれによって達成される。例えば、二部分ばね押し駆動プーリー（two-part, spring-loaded drive pulley）のような、コンベアベルト２４の駆動プーリー（示さず）に、ソレノイド（示さず）を機械的に連結することができる。ソレノイドが稼動されると、それは駆動プーリーおよびコンベアベルト２４を振動させる。あるいは、駆動モーター（示さず）を事前に決定された振動数で前後に動かすことができ、これはコンベアベルト２４を震動させる。

最終洗浄サイクルの後に、溶出緩衝液（Ｅ）をＮＡ保有磁性シリカ粒子に加え、そして溶出された試料を含むチューブを別のインキュベーション／攪拌リング２６へ移し、そこで分析物富化ＮＡを磁性シリカ粒子から分離する。溶出緩衝液（Ｅ）は、溶出された試料中の磁性シリカ粒子のｐＨを変化させる。１つの実施態様において、空気稼動昇降機を使用して、溶出された試料を含むチューブをチューブコンベア２４からインキュベーション／攪拌リング２６へ降下させることによって、溶出された試料を含むチューブを別のインキュベーション／攪拌リング２６へ移す（示さず）。

図２に示すインキュベーション／攪拌リング２６は、溶出された試料を含むチューブを保持するための２０個の位置を含み、そしてインキュベーションの間に約１１００ＲＰＭの速度で回転することができる。インキュベーション／攪拌リング２６中の位置の数が、所望されるスループットおよび時間を含む多くの事柄の関数であることを当業者は理解することができる。それゆえ、２０個より多いかまたは少ない位置を有するインキュベーション／攪拌リング２６の使用は、本開示の範囲および精神内にある。

溶出された試料を含むチューブを、個別に挿入しそして取り出す。一旦インキュベーション／攪拌リング２６の２０個全ての位置がチューブで満たされると、チューブを一群として集合的にインキュベートおよび攪拌する。インキュベーションおよび攪拌を約１０分間約７０℃のインキュベーション温度で行う。もう一度、有利なことに、従来のバッチ処理とは異なり、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＤＢなどのような異なるＮＡを含む試料を、インキュベーション／攪拌リング２６中にランダムに挿入することができる。

変化したｐＨ、インキュベーション温度、および攪拌は、磁性シリカ粒子からのＮＡの解離、および溶出された試料の溶液中のＮＡの再懸濁を促進する。次いで、溶出された溶液（これは、溶出緩衝液およびＮＡ富化試料を懸濁状態で含む水溶液である）を、例えば磁気的誘引および使い捨てピペットチップを使用する吸引によって、固体磁性シリカ粒子から分離することができる。

溶出された溶液を直ちにＰＣＲ試験することができるか（下記のように）、または下記のように溶出された溶液を含む別個のチューブにキャップをしそして後に試験するために一時的に貯蔵することができるか、またはこれもまた下記のように溶出された溶液およびＭａｓｔｅｒｍｉｘ試薬を含む別個のチューブにキャップをしそして後に試験するために一時的に貯蔵することができる。磁性シリカ粒子は処分される。

いくつかの適用において、ＮＡ精製され溶出された試料を、後の時間および／または場所で試験することが所望され得る。そのような場合のために、システム１０は、洗浄サイクルの後に移動点３１を含む。より具体的には、洗浄および溶出、および磁性シリカ粒子からの溶出された溶液の分離の後に、ＮＡ精製され溶出された溶液を含むチューブをキャッピングデバイス２８に輸送し、ここでＮＡ精製され溶出された試料を含むチューブを堅固に密封するかまたはキャップをすることができる。キャップをした後、溶出された溶液に、例えば無線「タグ付け器」（radio "tagger"）３３を使用する電波識別（ＲＦＩＤ）によって、タグ付けし、次いで冷蔵ユニット３５中に貯蔵することができる。

ＰＣＲ試験器具
上記で与えられるように、溶出された溶液からの磁性シリカ粒子の分離の後に、例えば使い捨てチップを有するピペッターを使用して、ＮＡ精製され溶出された溶液をチューブから回収する。図３を参照して、回収された溶出された溶液を、インキュベーションリングまたはコンベアベルト３２上に一時的に配置される、着脱可能な反応容器またはキュベット４０（以下「キュベット」）中に分注する。キュベット４０は、キャッピングおよび温度サイクルの少なくとも１つの間に反応液（下記で定義する）を保持するように構築および配置される。

好ましくは、溶出された溶液を、Madison, WisconsinのPromega Corporationによって製造されるＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ試薬（ＭＭ１またはＭＭ２）のようなＭａｓｔｅｒｍｉｘ試薬を含むキュベット４０中に分注する。あるいは、溶出された溶液をまずキュベット４０に加え、その後Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ試薬を加えることができる。Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ試薬および溶出された溶液を含む水溶液を「反応液」という。

Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ試薬は当業者に周知であり、そしてより詳細には記載しない。その各々が前もって調製されそして試薬トレー３４中に貯蔵されるＭａｓｔｅｒｍｉｘ試薬の組成は、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＤＢなどのような試験されるＮＡに依存して異なる。各々のＭａｓｔｅｒｍｉｘ試薬は試薬ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）を含む。ＵＮＧは、より高い温度では不活性の試薬であるが；周囲温度または室温のようなより低い温度では、ＵＮＧは、反応液となお混合され得るいかなるＮＡコピーも破壊する。従って、ＵＮＧを反応液に加えて、単離／精製器具２０からＰＣＲ試験器具３０へのキャリーオーバーコンタミネーションを軽減する。

一旦Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ試薬および溶出された溶液がキュベット４０に加えられると、インキュベーションリング３２に沿って配置されたキャッピングデバイス２８が、各々のキュベット４０を堅固に密封するかキャップをする。以前に記載するように、全ての試料、またはこの場合、反応液を、即時のＰＣＲ試験のために調製するわけではない。いくつかの場合、別個の反応液を後の時間または場所で試験することが所望され得る。そのような場合、ＵＮＧインキュベートされた反応液を含む別個のキャップをされたキュベット４０を、移動点３１でインキュベーションリング３２から取り出し、そこからそれをＲＦＩＤ無線「タグ付け器」のようなタグ付けデバイス３３に移すことができる。その様にして取り出したキャップをされたキュベット４０をタグ付けし、次いで冷蔵ユニット３５中に貯蔵することができる。

図３に示すように、例示的な実施態様において、インキュベーションリング３２はキュベット４０を保持するための１６個の位置を含み、そして運搬ベルトは、各々のキュベット４０がインキュベーションリング３２に沿った約１０分間の処理を費やすような速度で連続的に進むことができる。インキュベーションリング３２の温度は約２５℃に維持される。

インキュベーションリング３２中の位置の数が、所望されるスループットおよび時間を含む多くの事柄の関数であることを当業者は理解することができる。それゆえ、１６個より多いかまたは少ない位置を有するインキュベーションリング３２の使用は、本開示の範囲および精神内にある。

インキュベーションリング３２の運搬ベルトが進み続ける時に、反応液を含むキャップをされたＵＮＧインキュベートされたキュベット４０は、ＲＴインキュベーション部３８例えばオーブン、の中で約４５℃の温度でさらにインキュベートされる。約４５℃の温度でキュベット４０をインキュベートする目的は、ＰＣＲ試験の前にいかなる一本鎖ＲＮＡ試料も二本鎖ＤＮＡに変換するためである。より特定すると、ＤＮＡ試料ではなくＲＮＡ試料を含むキュベット４０に加えられるＭａｓｔｅｒｍｉｘ試薬は、逆転写酵素（ＲＴ）、一本鎖ＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへ転写するＤＮＡポリメラーゼ酵素、を含む。

図３に示すように、ＲＴインキュベーション部３８はキュベット４０を保持するための５０個の位置を含み、そしてインキュベーションリング３２は、各々のキュベット４０がＲＴインキュベーションを受けながら約３０分間を費やすような速度で漸増的（incrementally）または連続的に進むことができる。インキュベーションリング３２のＲＴインキュベーション部３８中の位置の数が、所望されるスループットおよび時間を含む多くの事柄の関数であることを当業者は理解することができる。それゆえ、５０個より多いかまたは少ない位置を有するＲＴインキュベーション部３８の使用は、本開示の範囲および精神内にある。

ＰＣＲ試験器具３０をさらに、ＲＴインキュベーション部３８の終了点がＰＣＲ移動点３７に近接するように、構築し配置する。その結果、ＲＴインキュベーションの完了時に、各々のキャップをされたＲＴインキュベートされたキュベット４０は、インキュベーションリング３２から変性加熱ステーションリング３９へ移される。

図３に示すように、変性加熱ステーションリング３９は、キュベット４０を保持するための１６個の位置を含む。リング３９は、各々のキュベット４０が変性温度サイクルを受けながら約１０分間を費やすような速度で漸増的または連続的に進むことができる。変性加熱ステーションリング３９中の位置の数が、所望されるスループットおよび時間を含む多くの事柄の関数であることを当業者は理解することができる。それゆえ、１６個より多いかまたは少ない位置を有する変性加熱ステーションリング３９の使用は、本開示の範囲および精神内にある。

変性温度サイクルの間に、各々のキャップをされたキュベット４０を、例えばオーブンを使用して、約９０〜９５℃の温度に加熱して、反応液中のポリメラーゼ酵素（典型的にはＴａｑ）を活性化する。上記のように、約９０および９５℃で、ＤＮＡ二重らせんは融解し、その結果、二重らせんの各々の鎖は他方から分離される。

次いで、変性したＮＡを含むキャップをされたキュベット４０を、増幅および検出（Ａ＋Ｄ）モジュール５０中の任意の空のキュベットウェル５２に移す。好ましくは、キャップをされたキュベット４０を変性加熱ステーションリング３９から取り上げそして空のキュベットウェル５２中にそれを配置するように構築および配置されたラジアルアーム５５を使用して、キュベット４０を移す。

Ａ＋Ｄモジュール５０は、最初のアニーリングおよび最初の伸長温度サイクルの間、およびＰＣＲプロセスの全てのそれに続く温度サイクルの間にキュベット４０を保持するように構築および配置された、４０個の個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーを有するサーマルサイクラーアレイである。Ａ＋Ｄモジュール５０中の、個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーの数が、所望されるスループットおよび時間を含む多くの事柄の関数であることを当業者は理解することができる。それゆえ、４０個より多いかまたは少ない個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーを有するＡ＋Ｄモジュール５０の使用は、本開示の範囲および精神内にある。

各々のキャップをされたキュベット４０がそれぞれのキュベットウェル５２中に配置される間に、ＰＣＲプロセスの最初のアニーリングおよび最初の伸長温度サイクルを、それぞれ約５０〜６５℃（アニーリング用）および約７０〜７２℃（伸長用）の範囲の適切な事前に決定された温度で行う。各々の完全なＰＣＲサイクルの後に、各々の反応液の光強度を検出および測定する。一旦光強度が事前に決定された閾値強度、Ｉ_ＴＨ、に達するかまたはそれを越えると、例えばルックアップテーブル（look-up table）を使用して、ＮＡ試料の初期ＤＮＡ濃度を評価することができる。

図５を参照して、Ａ＋Ｄモジュール５０は光ファイバー束５１を介して蛍光光度計５８と作動的に結合している。より具体的には、光ファイバー束５１の少なくとも一本の光ファイバー５３が各々のキュベットウェル５２に光学的に連結されるように構築および配置され、より特定すると各々のキュベット４０は必要とされる波長で光透過性である。各々の光ファイバー５３は蛍光光度計５８に光学的に連結され、その結果、各々の完全なＰＣＲサイクルの後で、反応液の光の強度を複数（例えば４つ）の波長で測定することができる。

蛍光光度計５８は、異なる波長を有する複数（例えば４つ）の光源（示さず）、または異なる波長を生成することができるフィルタホイール５６と組み合わせた狭帯域波長を有する単一光源５４を含む。単一光源５４を使用する場合、第一の波長の蛍光光度計５８からの光が、少なくとも一本の結合された光ファイバー５３を介して各々のキュベットウェル５２中に配置された反応液を照射する。反応液からの蛍光シグナルは、少なくとも一本の結合された光ファイバー５３を介して蛍光光度計５８に透過し戻される。蛍光光度計５８は、蛍光シグナルの強度レベルを検出するかまたは測定する。このプロセスを、反応液を含む各々のキュベットウェル４０について少なくとも３つの異なる波長について繰り返す。

蛍光光度計５８はまた、プロセシングユニット５７およびメモリコンポーネント５９ａおよび５９ｂを含むか、またはそれらと作動的に結合している。非揮発性メモリ５９ａは、蛍光光度計５８の作動のためのアプリケーションまたはドライバープログラム、閾値強度データ、Ｉ_ＴＨ、および／または測定された強度レベルおよびＰＣＲ増幅サイクルの数を相関させて初期ＤＮＡ濃度レベルを評価するルックアップテーブル、ＬＵＴ、などを記憶することができる。メモリコンポーネント５９ｂは、アプリケーションまたはドライバープログラムの１つ以上を実行するための揮発性ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）を含むことができる。

システム１０およびＰＣＲ試験器具３０の作動の間に、特定の波長で検出された蛍光シグナル強度、Ｉ_ｍ、を、全ての反応液に適用可能な共通の事前に決定された閾値強度、Ｉ_ＴＨ、と、または特定の反応液に適用可能な事前に決定された閾値強度、Ｉ_ＴＨ、と比較することができる。蛍光シグナルの検出された強度レベルが閾値強度を越えるとき（Ｉ_ｍ＞Ｉ_ＴＨ）、ルックアップテーブル（ＬＵＴ）を使用して、初期ＮＡ濃度を、測定された強度レベル、Ｉ_ｍ、波長、および増幅サイクルの数、ｎ、と相関させることができる。各々の反応液（ＮＡ試料に対応する）についての初期濃度を揮発性または非揮発性メモリ５９ｂまたは５９ａ中に記録および保存することができる。

一旦反応液についての初期濃度データが記録されると、反応液を含むキュベット４０をＡ＋Ｄモジュール５０から取り除いて、最終処分を待つことができる。任意に、キュベット４０にＲＦＩＤ無線タグ付け器３３によってタグ付けし、そして冷蔵ユニット３５中に貯蔵することができる。

単一容器サーマルサイクラー
上記で与えられるように、Ａ＋Ｄモジュール５０は、複数（例えば４０個）の個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーを有する環状のサーマルサイクラーアレイである。単一容器サーマルサイクラーは、各々のキュベット４０を台座中に保持するように構築および配置される。さらに、各々のキュベット４０がＡ＋Ｄモジュール５０中の台座中に配置される間に、最初のアニーリングおよび最初の伸長温度サイクルの間の、およびＰＣＲプロセスの全てのそれに続く温度サイクルの間のキュベット４０の温度を個別に制御することができる。個別の温度制御、ならびに連続的にＡ＋Ｄモジュール５０中にキュベット４０を挿入するおよび／またはそれからキュベット４０を取り出す能力が、ランダムアクセス試験を可能にし、そして実用的にする。

図４を参照して、複数の単一容器サーマルサイクラー６０を有するバルブレス多容器サーマルサイクラーアレイ６５が示される。バルブレスアプローチを使用して本発明を記載するが、キュベット４０を温度制御するためのバルブベースのアプローチも、本開示の範囲および精神にそむくことなく使用できる。有利なことに、バルブベースの制御システムは、より迅速であり、そしてより正確な温度調節を与え得る。不利なことに、バルブベースの制御システムは、より高価であり、より複雑であり、そしてより信頼性が低い。

多容器サーマルサイクラーアレイ６５は、反応液を含む放射対称のキュベット４０を収容するかまたはそれを乗せるための複数の台座６９を含む。台座６９は、それぞれの加熱アセンブリ（下記）に対するキュベット４０の正確な位置決めを提供するように構築および配置される。好ましくは、台座６９は、気体容器流ガイド（gas-to-vessel flow guide）６７（下記）と同軸である。より好ましくは、キュベット４０の底部と気体容器流ガイド６７との間に空隙７５を与えるように、台座６９は気体容器流ガイド６７と物理的に接触しない。

台座６９はまた、Ｖ字形切れ込み（示さず）または中心合わせ特徴（centering feature）としての何らかの他の要素もしくは様相と組み合わせて、わずかな傾斜を含み得る。任意に、例えば反応液４５中の温度勾配を低下させ、そして／または光学的検査を妨害し得る気泡をガス抜きするために、台座６９を、キュベット４０中の反応液４５を振動させるように構築および配置することができる。例えば、各々の容器台座６９は、その中にキュベット４０が配置されることができるセンターホール領域を有する電気的に作動されるＡＣ駆動圧電ディスク（electrically-actuated, AC- driven, piezoelectric disk）であり得る。

独立した温度制御を提供するために、各々の単一容器サーマルサイクラー６０は、加熱アセンブリおよび気体容器流ガイド６７を含む。加熱アセンブリは、電気抵抗性発熱体のような発熱体６４を含み、それは管状の気体ヒーター流ガイド（gas-to-heater flow guide）６３の内部に配置される。気体ヒーター流ガイド６３は、発熱体６４に対して気体流６８を制限および分配して、発熱体６４と気体６８との間の適正な熱伝達を達成する。

気体容器流ガイド６７は、「熱交換器」の外殻として作用する。より具体的には、気体容器流ガイド６７は、反応液で濡れる内表面領域４３に対応するキュベット４０の外表面領域４１を含む領域を横切って気体６８の流れを分配することによって、気体容器熱交換を促進するように構築および配置されるシュラウド様デバイスである。気体容器流ガイド６７はまた、好ましくは上記の光ファイバー束５１の光ファイバー５３と作動的に結合した、光透過性領域６６を含む。

気体６８（これは単一の気体または気体の混合物であり得る）は、キュベット４０との熱交換ための作業流体である。空気圧縮機またはダイヤフラム型エアポンプのような気体流駆動装置（gas flow driver）６１を使用して、気体容器流ガイド６７の各々に、主導管６２を通じて気体６８を配送することができる。

プロセシングユニットならびに揮発性および非揮発性メモリを有する制御装置７５は、気体流駆動装置６１および発熱体６４の各々に電気的に連結される。制御装置７５は、気体容器流ガイド６７への気体６８の流速を制御する。制御装置はまた、各々の気体容器流ガイド６７についての抵抗性発熱体６４と気体６８との間の熱交換を、いかなる他の気体容器流ガイド６７とも独立して制御する目的で、各々の発熱体６４への電流のタイミングおよび量を制御する。従って、任意の時点で、任意のキュベット４０上の温度は容器特異的であり、そして独立して可変性である。

例えば５.４リットル／分の気流およびＮｉＣｒ線のコイルの電気的加熱を使用して、達成可能な気温変化特性は、６０℃から９０℃への約３.７℃／秒の加熱変化速度、および９０℃から６０℃への約２.５℃／秒の冷却速度を含む。

本発明を、その好ましい実施態様を含めて詳細に記載した。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲内で改変および改良をし得る。

Claims (21)

1. 少なくとも１つの第１生物試料を試験する方法であって：
   第１の核酸（ＮＡ）の第１初期ＮＡ濃度を有する第１生物試料をランダムに選択する工
   程；
   前記第１生物試料中に含まれる第１のＮＡを磁気的に捕獲することによって、前記第１
   のＮＡを単離および精製する工程；
   磁気的に捕獲された前記第１のＮＡを、第１の水性溶出緩衝液を使用して溶出して、磁
   気的に捕獲された前記第１のＮＡを、前記第１の水性溶出緩衝液中に再懸濁して、溶液中
   の精製された第１のＮＡを形成する工程；
   事前に決定された第１の試薬混合物を、前記溶液中の精製された第１のＮＡに加えて、
   第１の反応液を提供する工程；
   変性、アニーリング、および伸長の温度サイクルからなる複数のポリメラーゼ連鎖反応
   （ＰＣＲ）サイクルを通じて、前記第１の反応液に対して連続的ランダムアクセスＰＣＲ
   試験を行う工程であって、
   ここで、連続的ランダムアクセスＰＣＲ試験は、少なくとも１つの第２生物試料の少な
   くとも１つの第２の反応液が、多容器サーマルサイクラーアレイ中の隣接する単一容器サ
   ーマルサイクラーに連続的かつランダムに挿入されることができるように、かつ、異なる
   温度サイクルを異なる温度で同時に受けることができるように、連続的に行われる工程；
   および
   前記第１生物試料の第１初期ＮＡ濃度を評価する工程、を含み、
   前記第２生物試料は、第２のＮＡの第２初期ＮＡ濃度を有し、前記第２のＮＡは、前記
   第１のＮＡと異なる、方法。
2. 前記第１生物試料中に含まれる第１のＮＡを磁気的に捕獲することによって第１のＮＡ
   を単離および精製する工程が：
   ＮＡに、プロテイナーゼＫ、溶解緩衝液Ｓ９、複数の磁性シリカ粒子、および内部標準
   材料の少なくとも１つを加えて、第一の水溶液を提供すること；
   第一の水溶液をインキュベートおよび攪拌して、磁性シリカ粒子による捕獲のために前
   記第１生物試料からの第１のＮＡをほぐすこと；および
   磁性シリカ粒子を洗浄して、前記磁性シリカ粒子によって捕獲された第１のＮＡを精製
   すること
   をさらに含む、請求項１記載の方法。
3. 磁気的に捕獲された第１のＮＡを溶出して、磁気的に捕獲された第１のＮＡを第１の水
   性溶出緩衝液中に再懸濁する工程が、前記第１の水性溶出緩衝液の存在下で７０℃の温度
   で磁性シリカ粒子をインキュベートおよび攪拌することを含む、請求項１記載の方法。
4. 事前に決定された第１の試薬混合物を前記第１の水性溶出緩衝液に加えて第１の反応液
   を提供する工程が、前記第１の反応液をウラシルＤＮＡグリコシラーゼを用いてインキュ
   ベートして、キャリーオーバーコンタミネーションを低下させることを含む、請求項１記
   載の方法。
5. 第１の反応液を用いて逆転写酵素をインキュベートして、一本鎖ＲＮＡを二本鎖ＤＮＡ
   に転写する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
6. ＰＣＲ試験が、個別に温度制御可能な複数の単一容器サーマルサイクラーを使用するこ
   とを含み、単一容器サーマルサイクラーの各々が、気体ヒーター流ガイドを通じて流動す
   る気体を所望の温度に加熱または冷却するための、前記気体ヒーター流ガイド中に配置さ
   れた制御可能な発熱体を含む、請求項１記載の方法。
7. 前記第１生物試料の第１のＮＡの第１初期ＮＡ濃度を評価する工程が：
   行われたＰＣＲサイクルの数を計数すること；
   光を透過して、多容器サーマルサイクラーアレイ中の選択された第１の単一容器サーマ
   ルサイクラー中の第１の反応液を照射すること；
   多容器サーマルサイクラーアレイ中の選択された第１の単一容器サーマルサイクラー中
   の第１の反応液から蛍光シグナルを受けること；および
   受けられた蛍光シグナルおよび行われたＰＣＲサイクルの数を使用して、前記第１生物
   試料の第１のＮＡの前記第１初期ＮＡ濃度を算出すること
   を含む、請求項１記載の方法。
8. 単一容器サーマルサイクラーの各々の中の各々の制御可能な発熱体における温度を連続
   的に感知する工程；および
   電流の量および電流配送のタイミングを制御して、単一容器サーマルサイクラーの各々
   の中の各々の制御可能な発熱体を個別に温度制御する工程
   をさらに含む、請求項６記載の方法。
9. 多容器サーマルサイクラーアレイであって、
   複数の個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラー；
   反応液を含む反応容器を収容するための複数の受け入れ位置；
   気体源から複数の単一容器サーマルサイクラーの各々へ気体を輸送するための複数の気
   体流導管；
   加圧気体を、気体源から複数の単一容器サーマルサイクラーの各々に提供するための気
   体流駆動装置；および
   気体流駆動装置を制御するための制御装置、を含み、
   前記多容器サーマルサイクラーアレイは、反応液を含む反応容器を、連続的かつランダ
   ムに、前記複数の受け入れ位置の１つに挿入し、及び、前記複数の受け入れ位置の１つか
   ら抜き出すように構築および配置される、
   多容器サーマルサイクラーアレイ。
10. 複数の受け入れ位置が、わずかな傾斜、Ｖ字形切れ込み、および反応容器中心合わせ特
    徴の少なくとも１つを含むように構築および配置される、請求項９記載の多容器サーマル
    サイクラーアレイ。
11. 反応容器中の反応液を振動させるための振動デバイスをさらに含む、請求項９記載の多
    容器サーマルサイクラーアレイ。
12. 各々の個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーは、
    対流的に前記反応液を加熱または冷却するための、複数の受け入れ位置の各々に近接し
    て配置された気体容器流ガイド；
    気体流導管から気体容器流ガイドへ気体を輸送するための、気体流導管の少なくとも１
    つに連結された気体ヒーター流ガイド；
    前記気体ヒーター流ガイドを通じて流動する気体を所望の温度に加熱または冷却するた
    めの、気体ヒーター流ガイド内に配置され、そして制御装置に電気的に連結された制御可
    能な発熱体；および
    反応液を含む反応容器が受け入れ位置に設置される場合に、反応液への光および反応液
    からの蛍光シグナルを透過するための、光透過性領域
    を含む、請求項９記載の多容器サーマルサイクラーアレイ。
13. 制御可能な発熱体によって加熱された気体が単一容器サーマルサイクラーから免れるこ
    とができるように空隙を提供するために、前記個別に制御可能な単一容器サーマルサイク
    ラーの気体容器流ガイドが、それぞれの受け入れ位置に設置された反応容器から空間的に
    分離された漏斗部を含む、請求項１２記載の多容器サーマルサイクラーアレイ。
14. 前記個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーが、制御可能な発熱体の１つ以上お
    よび気体の温度を感知し、そして制御装置に温度データを提供する少なくとも１つの温度
    センサーをさらに含む、請求項１２記載の多容器サーマルサイクラーアレイ。
15. 各々の前記個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーの制御可能な発熱体への電流
    の量および電流の印加時間が、制御装置によって独立して制御される、請求項１２記載の
    多容器サーマルサイクラーアレイ。
16. 前記個別に制御可能な単一容器サーマルサイクラーの光透過性領域が、少なくとも１つ
    の光ファイバーに光学的に連結される、請求項１２記載の多容器サーマルサイクラーアレ
    イ。
17. ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験のための初期濃度の核酸（ＮＡ）を有する少なく
    とも１つの生物試料を調製するためのシステムであって、
    少なくとも１つの生物試料からＮＡを磁気的に捕獲し、そして前記ＮＡを水溶液中に懸
    濁するための核酸単離／精製器具、および
    水溶液中の前記ＮＡを変性、アニーリング、および伸長させるためのＰＣＲ試験器具、
    を含み、
    前記ＰＣＲ試験器具は、多容器サーマルサイクラーアレイを含み、
    前記多容器サーマルサイクラーアレイは、個別に温度制御可能な複数の単一容器サーマ
    ルサイクラーを含み、
    前記多容器サーマルサイクラーアレイは、連続的ランダムアクセスＰＣＲ試験のために
    、連続的かつランダムに、各々が反応液を含む複数の反応容器を複数の受け入れ位置の１
    つに挿入し、及び、各々が反応液を含む複数の反応容器を複数の受け入れ位置の１つから
    抜き出すように、構築および配置される、
    システム。
18. 多容器サーマルサイクラーアレイが：
    気体源から気体を輸送するための気体流導管；
    気体源から複数の単一容器サーマルサイクラーの各々へ加圧気体を提供するための気体
    流駆動装置；および
    複数の単一容器サーマルサイクラーの各々の気体流駆動装置を制御するための制御装置
    をさらに含む、請求項１７記載のシステム。
19. 多容器サーマルサイクラーアレイが、それによって制御装置が複数の単一容器サーマル
    サイクラーの選択された単一容器サーマルサイクラーの個別の温度を制御する気体温度モ
    ジュレーターをさらに含む、請求項１８記載のシステム。
20. 複数の単一容器サーマルサイクラーの各々が、さらに：
    反応液を対流的に加熱または冷却するための、前記反応液を含む反応容器に近接して配
    置された気体容器流ガイド；
    気体流導管から気体容器流ガイドへ気体を輸送するための、気体ヒーター流ガイド；
    前記気体ヒーター流ガイドを通じて流動する気体を所望の温度に加熱または冷却するた
    めの、気体ヒーター流ガイド中に配置された制御可能な発熱体；および
    反応液への光および反応液からの蛍光シグナルを透過するための、光透過性領域
    を含む、請求項１８記載のシステム。
21. 多容器サイクラーアレイの中の選択された単一容器サーマルサイクラーアレイ中の反応
    液から受けた蛍光シグナルに基づいて、少なくとも１つの生物試料中の核酸の初期濃度を
    算出するためのデバイスをさらに含む、請求項１８記載のシステム。

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