WO2014034732A1 - 核酸変性装置、核酸変性方法および核酸の増幅方法 - Google Patents

核酸変性装置、核酸変性方法および核酸の増幅方法 Download PDF

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山口　栄雄
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    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid denaturing apparatus, a nucleic acid denaturing method, and a nucleic acid amplification method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • thermal denaturation has been mainly used as a method for denaturing double-stranded nucleic acids into single-stranded nucleic acids, taking advantage of the fact that hydrogen bonds between nucleobases of double-stranded nucleic acids are cleaved by heat. .
  • typical heat denaturation in the PCR method applies heat to a sample containing DNA at about 90 to 95 ° C. to dissociate double-stranded nucleic acids into single-stranded nucleic acids.
  • the sample is cooled to about 50 to 65 ° C., and a primer complementary to DNA is annealed.
  • the extension step the sample is set to about 70 to 72 ° C.
  • a strand complementary to the strand is elongated (see, for example, WO 2008/057375 (JP-A-2010-508813)).
  • the DNA polymerase used for PCR needs to maintain its activity in a high temperature range of 90 to 95 ° C. in a thermal cycle.
  • alkali denaturation for example, polymerase used in the PCR method cannot be added at the time of alkali denaturation, and it is necessary to add an alkali denaturing solution, a neutralizing solution, and a DNA polymerase in each step. For this reason, the operation becomes complicated, and it is difficult to PCR-amplify many types of samples at the same time.
  • an enzyme for example, a polymerase
  • a heat denaturation method that requires the addition of high-temperature heat or a method that replaces an alkali denaturation in which the environment is severe.
  • an object of the present invention is to provide a nucleic acid denaturing apparatus, a nucleic acid denaturing method, and a nucleic acid amplifying method for denaturing a double-stranded nucleic acid into a single-stranded nucleic acid, which can be an alternative to heat denaturation.
  • the nucleic acid denaturing apparatus that achieves the above object has a vibration generating unit that generates vibrations applied to a nucleic acid solution containing double-stranded nucleic acid, and applies the vibrations generated in the vibration generating units to the nucleic acid solution.
  • a vibration generating unit that generates vibrations applied to a nucleic acid solution containing double-stranded nucleic acid, and applies the vibrations generated in the vibration generating units to the nucleic acid solution.
  • the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid solution is denatured into a single-stranded nucleic acid.
  • the nucleic acid denaturing method according to the present invention includes a step of applying a vibration generated in the vibration generating unit to a nucleic acid solution containing a double-stranded nucleic acid to denature the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid solution into a single-stranded nucleic acid. is doing.
  • the nucleic acid amplification method according to the present invention includes a step of obtaining a single-stranded nucleic acid by the nucleic acid denaturing method and a step of amplifying a double-stranded nucleic acid using the single-stranded nucleic acid.
  • FIG. 1 is a front view showing a nucleic acid denaturing apparatus according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view taken along line 2-2 in FIG. 3A and 3B are explanatory diagrams for explaining the amplitude of vibration generated by the vibration generating unit. It is sectional drawing in the same position as FIG. 2 which shows the modification of this invention. It is a perspective view shown about the nucleic acid denaturation apparatus which concerns on the modification of this invention. It is sectional drawing in the position which passes along the axis line of the diaphragm of the speaker which shows the modification about the connection of a vibration generation part and a container holding member.
  • the nucleic acid denaturing apparatus has a vibration generating unit that generates vibrations applied to a nucleic acid solution containing double-stranded nucleic acid, and applies the vibrations generated in the vibration generating units to the nucleic acid solution.
  • This double-stranded nucleic acid is characterized in that it is denatured into a single-stranded nucleic acid.
  • the nucleic acid denaturing method according to the present invention includes a step of applying a vibration generated in the vibration generating unit to a nucleic acid solution containing a double-stranded nucleic acid to denature the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid solution into a single-stranded nucleic acid. is doing.
  • the nucleic acid amplification method according to the present invention includes a step of obtaining a single-stranded nucleic acid by the nucleic acid denaturing method and a step of amplifying a double-stranded nucleic acid using the single-stranded nucleic acid.
  • the vibration generated in the vibration generating unit is imparted to the nucleic acid solution containing the double-stranded nucleic acid, and the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid solution is denatured into a single-stranded nucleic acid.
  • a double-stranded nucleic acid can be denatured into a single-stranded nucleic acid triggered by vibration and does not require addition by heat. Therefore, a double-stranded nucleic acid can be denatured into a single-stranded nucleic acid by a very simple method called vibration.
  • FIG. 1 is a front view showing a nucleic acid denaturing apparatus according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a sectional view taken along line 2-2 of FIG.
  • the nucleic acid denaturing apparatus 100 includes a vibration generating unit 10 that generates vibrations applied to a nucleic acid solution containing double-stranded nucleic acids.
  • the nucleic acid denaturing apparatus 100 denatures the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid solution into a single-stranded nucleic acid by applying the vibration generated in the vibration generating unit 10 to the nucleic acid solution.
  • the nucleic acid denaturing apparatus 100 has a nucleic acid solution storage unit 20 that stores a nucleic acid solution, and the nucleic acid solution storage unit 20 includes a container 21 and a container holding member 22.
  • the nucleic acid solution is stored in a container 21, and the container 21 is held by a container holding member 22.
  • the container holding member 22 is connected to the vibration generating unit 10 by the adhesive B. Thereby, the vibration generating unit 10 and the nucleic acid solution are connected via the container 21 and the container holding member 22.
  • the nucleic acid solution storage unit 20 includes only the container 21 and does not include the container holding member 22. That is, the vibration generating unit 10 and the nucleic acid solution include a form in which the vibration generating unit 10 and the nucleic acid solution are connected only through the container 21 without using the container holding member 22.
  • the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid solution is denatured into a single-stranded nucleic acid by applying the vibration generated in the vibration generating unit 10 to the nucleic acid solution stored in the container 21 supported by the container holding member 22. I am letting.
  • the nucleic acid solution itself is vibrated via the container 21 and the container holding member 22 by connecting the nucleic acid solution to the vibration generating unit 10 via the container 21 and the container holding member 22 in use.
  • the nucleic acid solution itself is vibrated via the container 21 and the container holding member 22 by connecting the nucleic acid solution to the vibration generating unit 10 via the container 21 and the container holding member 22 in use.
  • the vibration generator 10 includes a voice coil 11 that generates vibrations in the speaker, a voice coil bobbin 12 around which the voice coil 11 is wound, a damper 17 that supports the voice coil bobbin 12, and a driving force applied to the voice coil 11.
  • a magnetic circuit 13 that provides vibration, a diaphragm 14 that vibrates in response to vibrations from the voice coil 11, and a frame 15 that supports the peripheral edge of the diaphragm 14.
  • the voice coil 11 is provided upstream of the vibration transmission direction of the diaphragm 14.
  • the voice coil 11 is wound around a voice coil bobbin 12.
  • the end of the voice coil bobbin 12 is covered with a cap 16.
  • the damper 17 is disposed outward in the radial direction of the voice coil bobbin 12 and supports the voice coil bobbin 12.
  • the diaphragm 14 is directly connected to the voice coil bobbin 12. Accordingly, the diaphragm 14 receives vibration from the voice coil 11 and vibrates together with the voice coil 11 via the voice coil bobbin 12.
  • the diaphragm 14 is disposed so as to face the horizontal direction with respect to the ground G.
  • the magnetic circuit 13 includes a plate 13A, a magnet 13B, and a yoke 13C.
  • the plate 13A is fixed to the frame 15.
  • the magnet 13B is sandwiched between the plate 13A and the yoke 13C.
  • a magnetic field is formed by the magnetic circuit 10 having such a configuration, and the voice coil 11 is vibrated by applying an audio current to the voice coil 11, and the diaphragm 14 connected to the voice coil 11 is vibrated.
  • the material and thickness of the diaphragm 14 can be determined in consideration of the container 21 to be used and the amount of the nucleic acid solution.
  • the vibration generator 10 is sandwiched between the plastic plates 31 and 32 from the horizontal direction as shown in FIG.
  • the vibration generating unit 10 is constant from the ground G so that there is no obstacle in the vibration direction of the vibration generating unit 10 while being sandwiched between the plastic plates 31 and 32, and the vibration of the vibration generating unit 10 is not disturbed as much as possible. It is maintained so as to be in a state separated from each other.
  • the plastic plates 31 and 32 are fixed by fastening means such as bolts 33 and 34 with the vibration generating unit 10 interposed therebetween.
  • the vibration generating unit 10 uses the diaphragm 14 used for a speaker or the like, so that the vibration generating unit 10 generates vibrations having a frequency in the audible region.
  • the vibration generated from the vibration generating unit 10 may be appropriately set depending on the shape or size of the container 21, the characteristics of the double-stranded nucleic acid to be denatured, etc., but is preferably an audible region, and is 20 to 20,000 Hz. More preferably, it is 50 to 2,000 Hz.
  • the vibration in the audible region is higher than the frequency of stirring the solution by the stirrer, for example, but lower than the ultrasonic frequency.
  • a speaker is used to generate a vibration having a frequency in the audible region.
  • any other vibration generating source such as a piezoelectric vibrator, may be used as long as the vibration source generates a vibration in the audible region. May be.
  • 3A and 3B are explanatory diagrams for explaining the amplitude of vibration generated by the vibration generating unit. What is necessary is just to set suitably the amplitude of the vibration which generate
  • the amplitude of the vibration as shown in FIG. 3 (A), the diameter at the central portion of the vibration plate 14 when the vibration occurs so as to be perpendicular to the axis of the truncated cone shape of the diaphragm 14 D 1, the distance from one end in the axial direction of the diaphragm 14 when the vibration in the direction of the axis of the vibrating plate 14 is generated as shown in FIG. 3 (B) to the other end when the D 2, the range of amplitude It is preferable that (D 1 orD 2 ) / 10000 to 10 ⁇ (D 1 orD 2 ).
  • the nucleic acid used in this embodiment is DNA, but the nucleic acid is not particularly limited, and various nucleic acids can be used. Specific examples of the nucleic acid include DNA, RNA, PNA, oligodeoxyribonucleotides, oligoribonucleotides, and the like, and chemically modified nucleic acids of the nucleic acids. Examples of the chemically modified nucleic acid include 2'-O-methyl (Me) RNA. Specific examples of the double-stranded nucleic acid include a combination of DNA and DNA; a combination of RNA and RNA, and preferably a combination of DNA and DNA.
  • a conventionally known method can be used as a method for preparing a double-stranded nucleic acid, which is prepared from a biological sample such as human blood or cells, or an environmental sample such as food, soil, river water, or seawater.
  • a method for extracting the double-stranded nucleic acid from these samples for example, a commercially available DNA extraction kit can be used.
  • concentration of the double-stranded nucleic acid in the solution depends on the detection technique and the detection sensitivity of the detection apparatus, it can be determined by specifications or preliminary examination.
  • One preferred embodiment is 1 ng to 1 mg / mL per ml of sample.
  • the container 21 in which the nucleic acid solution is accommodated is preferably a container with a lid because the nucleic acid solution may be scattered by vibration.
  • the container is not particularly limited, and examples include a microtube of about 0.1 to 2.0 ml.
  • the material include plastic and glass, preferably polypropylene and polyethylene.
  • the volume of the microtube is preferably about 0.1 to 2.0 ml.
  • Specific examples of the shape of the microtube include an assist tube type microtube manufactured by Assist and an Eppendorf tube type microtube manufactured by Eppendorf. Product shapes can also be used.
  • the container holding member 22 is a member that fixes and holds the container 21 containing the nucleic acid solution containing the double-stranded nucleic acid on the nucleic acid denaturing apparatus.
  • copper is used for the container holding member 22, but the material is not limited to this as long as the container 21 can be supported.
  • the container holding member 22 has a storage portion 22A that follows the external shape of the container 21, so that the container 21 can be held by the container holding member 22 simply by placing the container 21 on the container holding member 22.
  • the container 21 can be easily attached and detached. Thereby, without removing the nucleic acid solution from the container 21 when the double-stranded nucleic acid is denatured, each container in which the nucleic acid solution is stored is removed from the container holding member 22 and another container in which the nucleic acid solution is stored is placed.
  • the following modification work can be performed simply by doing. Therefore, the denaturation work can be performed easily.
  • the storage portion 22A of the container holding member 22 can be provided with a slip stopper such as rubber.
  • a slip stopper such as rubber.
  • one container 21 is installed in the container holding member 22, but a plurality of samples may be installed, and a plurality of samples can be denatured at a time.
  • FIG. 4 is a cross-sectional view at the same position as in FIG. 2 showing a modification of the connection between the vibration generating portion and the container holding member.
  • the container holding member 22 is connected to the inclined portion that is the peripheral portion of the diaphragm 14 by the adhesive B.
  • vibration is generated as shown in FIG. 4.
  • FIG. 5 is a perspective view showing a nucleic acid denaturing apparatus according to a modification of the present invention.
  • the container holding member 22 also has a function as a vibration transmission member that transmits vibration from the vibration generating unit 10 between the vibration generating unit 10 and the container 21.
  • the vibration transmitting member other than the container holding member 22 has an L-shape provided with a container insertion hole 41A that is fixed to the vibrator 14A by a fixing plate 42 and into which the container 21 can be inserted as shown in FIG.
  • a support plate 41 having a shape may be mentioned.
  • the vibration in the horizontal direction A shown in FIG. 5 generated by the vibrator 14A is also transmitted to the container 21 through the support plate 41, thereby urging the denaturation of the nucleic acid solution in the container 21.
  • vibration transmitting member By configuring the vibration transmitting member in this manner, vibration can be transmitted to the nucleic acid solution in the container 21 via the vibration transmitting member even when it is difficult to directly connect the container 21 to the vibration generating unit 10. Therefore, the denaturation operation can be performed without preparing a dedicated container for denaturation of double-stranded nucleic acid.
  • the nucleic acid denaturing apparatus 100 having the container holding member 22 and the adhesive B has been described.
  • the nucleic acid denaturing apparatus 100 has a vibration generating unit, and double-stranded nucleic acid is converted into single-stranded nucleic acid by vibration generated by the vibration generating unit.
  • the present invention includes any other form as long as the device has an action of modifying.
  • the container may be directly connected to the vibration generating unit using an adhesive member (for example, an adhesive) at the time of use.
  • the container 21 containing the nucleic acid solution is placed on the container holding member 22 and fixed.
  • a voice current is passed through the voice coil 11 of the vibration generator 10 to vibrate the voice coil 11 and vibrate the diaphragm 14.
  • the container holding member 22 is connected to the diaphragm 14 by the adhesive B, the container holding member 22 vibrates in response to the vibration of the diaphragm 14, and the container 21 fixed to the container holding member 22 vibrates. Vibration is transmitted to the nucleic acid solution in the container.
  • the present inventor has made a single-stranded double-stranded nucleic acid such as DNA by a very simple method of applying vibration to a nucleic acid solution rather than applying heat to a nucleic acid such as DNA. It came to find out that it could denature into nucleic acid.
  • the above solution contains four types of deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), a pair of primers, DNA polymerase, and the like necessary for nucleic acid amplification You may let them.
  • dATP deoxynucleoside triphosphates
  • the denaturing step can be performed using the nucleic acid denaturing apparatus 100 described above.
  • the vibration generated in the vibration generating unit 10 is imparted to the nucleic acid solution containing the double-stranded nucleic acid, and the double-stranded nucleic acid in the nucleic acid solution Is denatured into a single-stranded nucleic acid.
  • FIG. 6 is a cross-sectional view at a position passing through the axis of the diaphragm of the speaker showing a modification of the connection between the vibration generating portion and the container holding member.
  • the container holding member 22 is installed so that the vibration plate 14 of the vibration generating unit 10 faces the horizontal direction with respect to the ground G, and in that state, the portion of the vibration plate 14 or the cap 16
  • the embodiment in which vibration is applied to the nucleic acid solution accommodated in the container 21 via the container holding member 22 has been described. However, the present invention is not limited to this.
  • the vibration plate 14 may be installed so as to face a vertical direction with respect to the ground G as shown in FIG.
  • the single-stranded nucleic acid obtained above can be used for various applications.
  • a double-stranded nucleic acid can be amplified by PCR using the single-stranded nucleic acid. That is, in another preferred embodiment of the present invention, a step (1) of applying a vibration generated in a vibration generating unit to a nucleic acid solution containing a double-stranded nucleic acid to denature the double-stranded nucleic acid into a single-stranded nucleic acid (1 And a step (2) of amplifying the double-stranded nucleic acid using the single-stranded nucleic acid as a template.
  • step (1) Since step (1) has been described above, description thereof is omitted here.
  • the above step (1) is used instead of the step of dissociating double-stranded nucleic acid into single-stranded nucleic acid by heat denaturation in PCR method or LCR method. Therefore, as a method for amplifying a nucleic acid, a double-stranded nucleic acid can be amplified using a conventional PCR method and a LCR method other than the heat denaturation step.
  • the denaturation method of the present invention it is not necessary to use a heat-resistant DNA polymerase that is expensive and inferior to the calibration function, unlike denaturation by heating.
  • temperature denaturation is not necessarily required unlike the temperature fluctuation type PCR method, and nucleic acid can be amplified at a constant temperature.
  • the nucleic acid amplification method of the present invention can perform nucleic acid amplification very simply.
  • the sample to be denatured into a single strand can contain various reagents necessary for the subsequent amplification into a double-stranded nucleic acid.
  • reagents necessary for nucleic acid amplification include four types of deoxynucleoside triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), a pair of primers, a DNA polymerase, and a buffer solution.
  • a double-stranded nucleic acid can be amplified even under isothermal conditions. Therefore, it is preferable to perform amplification under isothermal conditions in consideration of the ease of operation.
  • the isothermal condition means a condition in which the temperature of the environment in which the PCR reaction vessel containing the PCR reaction solution is installed is controlled to be constant in each step, and the temperature of the PCR reaction solution itself is It need not be strictly constant. Moreover, isothermal does not need to be exactly the same temperature, for example, means that operation is performed in the temperature of a fixed range. For example, the optimum temperature of a DNA polymerase having an excellent calibration function is usually not so high, and is preferably 10 to 42 ° C.
  • usable DNA polymerases include, but are not limited to, Taq polymerase, EX-Taq, LA-Taq, Expand series, Platinum series, Tbr, Tfl, Tru, Tth, T1i, Tac, Tne, PolI type enzymes typified by Tma, Tih and Tfi, Pfu, Pfuturbo, Pyrobest, Pwo, KOD, Bst, Sac, Sso, Poc, Pab, Mth, Pho, ES4, VENT, and DEEPVENT ⁇ -type enzyme, Bca (exo-) DNA polymerase, E. coli. from Klenow fragment of E.
  • coli DNA polymerase I Vent DNA polymerase, Vent (Exo-) DNA polymerase (excluding exonuclease activity from Vent DNA polymerase), DeepVent DNA polymerase, DeepVent (Exo-) DNA polymerase (DeepVent DNA polymerase) Excluding exonuclease activity), ⁇ 29 phage DNA polymerase, MS-2 phage DNA polymerase, Z-Taq DNA polymerase and the like. These may be used alone or in combination. Commercially available DNA polymerases can be used.
  • the detection of nucleic acid amplification products can be performed by staining with ethidium bromide after agarose gel electrophoresis, or by irradiating with UV after performing nucleic acid amplification in the presence of a fluorescent intercalator. It is also possible to analyze quantitatively by quantitative Real-Time PCR method.
  • the single-strand dissociation method of the present invention can also be used when preparing a single-strand nucleic acid to be used when performing single-strand nucleic acid hybridization.
  • the nucleic acid hybridization reaction refers to Southern hybridization, Northern hybridization, and the like.
  • Example 1 Denaturation of double-stranded nucleic acid
  • an experiment for confirming the denaturation of double-stranded nucleic acid was performed using the nucleic acid denaturing apparatus shown in FIG.
  • genomic DNA 100 ng / ⁇ L genomic DNA was extracted from Arabidopsis thaliana using Dneasy Plant Mini Kit (manufactured by QIAGEN).
  • 0.1 ⁇ l of the obtained genomic DNA was added to a 0.1 ml microtube (manufactured by BIOplastics, model number BPB77201), diluted with 9.9 ⁇ l of Tris-EDTA buffer (TE) to obtain a DNA dilution, and then a loading buffer. 1 ⁇ l (6 ⁇ Loading Buffer, manufactured by Takara Bio Inc.) was added. Eleven samples of this sample were prepared.
  • FIG. 7 is an electrophoretic photograph showing the experimental results of staining with SYBRGreen I using the nucleic acid denaturing apparatus according to the present invention
  • FIG. 8 is an electrophoretic photograph showing the experimental results of staining with SYBRGreen II using the apparatus. 7 and 8, both show the experimental results as examples when 100, 200, 300 and vibrations with increased frequency up to 1,000 Hz are input every 100 Hz from the leftmost side in the figure, and the rightmost side. Shows the experimental results without vibration as a comparative example.
  • the line portion in the graph appears when SYBRGreen I, the indicator used, reacts with double-stranded DNA. If the line portion does not appear in SYBRGreen I and the line portion appears in SYBRGreen II, it can be confirmed that the double-stranded DNA is denatured into single-stranded DNA.
  • the double-stranded DNA can be denatured into single-stranded DNA without applying heat.
  • Example 2 Amplification of double-stranded nucleic acid by PCR method A reaction solution was prepared as follows.
  • sequence of SEQ ID NO: 1 is 5'-GATGGAGTCGGTCCCGTACAACT-3 '
  • sequence of SEQ ID NO: 2 is 5'-GGTTATCGAAATCAGCCACGCGCC-3'.
  • reaction solution 15 ⁇ l was placed in a 0.1 ml microtube (manufactured by BIOplastics, model number BPB77201) to prepare a sample.
  • the brightness of the band of the vibration PCR is darker than that of the non-vibration when the number of cycles is 11, but the brightness is the same at the number of cycles of 13 and is higher than that without vibration at the number of cycles of 15.
  • the band is dark.
  • Vibration generator 11 Voice coil, 12 Voice coil bobbins, 13 Magnetic circuit, 13A plate, 13B magnet, 13C York, 14 Diaphragm, 14A vibrator, 15 frames, 16 cap, 17 Damper, 100 nucleic acid denaturing apparatus, 20 Nucleic acid solution container, 21 containers, 22 container holding member, 22A storage section, 31, 32 plastic plate, 33, 34 volts, 41 support plate, 41A container insertion hole, 42 fixing plate, A vibration direction (horizontal to the ground), B adhesive G Ground.

Abstract

【課題】熱変性の代替手段となりうる、二本鎖核酸の一本鎖核酸への変性装置および二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させる方法を提供する。 【解決手段】本発明に係る核酸変性装置１００は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に付与する振動を発生する振動発生部１０を有し、振動発生部において発生した振動を核酸溶液に付与することによって、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させる。

Description

核酸変性装置、核酸変性方法および核酸の増幅方法
　本発明は核酸変性装置、核酸変性方法および核酸の増幅方法に関する。
　ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などにおいて、試料から準備されるＤＮＡ等の二本鎖を一本鎖に変性させることが要求される。従来、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させる方法としては、二本鎖核酸の核酸塩基間の水素結合が熱により切断される性質を利用して、熱変性が主に用いられてきた。
　例えば、ＰＣＲ法における典型的な熱変性は、約９０～９５℃でＤＮＡを含む試料に熱を付加し、二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離させる。次いで、アニーリング工程で、試料を約５０～６５℃に冷却し、ＤＮＡに相補的なプライマーをアニーリングさせ、伸長工程で、試料を約７０～７２℃とし、ポリメラーゼを用いてプライマーを起点として一本鎖に相補的な鎖を伸長させる（例えば国際公開第２００８／０５７３７５号（ＪＰ－Ａ－２０１０－５０８８１３）参照）。これらの工程は、典型的には２５～４０回繰り返される。
　したがって、ＰＣＲに使用されるＤＮＡポリメラーゼは、熱サイクルにおいて、特に９０～９５℃という高温域で活性を維持する必要がある。
　一方、二本鎖ＤＮＡをアルカリによって変性させて一本鎖とすることも従来より行われている。これは、二本鎖ＤＮＡがｐＨ１０以上の環境において解離し、一本鎖に変性するという性質を用いたものである。
　熱変性の場合、上記のように熱変性時に耐えうる耐熱性のポリメラーゼを用いる必要があり、用いられる酵素が限定されるという問題点があった。例えば、ＰＣＲに典型的に利用されるＴａｑポリメラーゼは最適温度が高いため、熱変性のサイクルに耐えることができるが、エキソヌクレアーゼ活性が低いため、誤ったヌクレオチドを取り込む確率が若干高い。また、変性が起こる温度は、ＤＮＡの塩基構成および長さ（塩基数）によって異なり、長いＤＮＡほどより高い温度が必要となる場合がある。また、Ｔａｑポリメラーゼは非常に高価であることも問題となる。
　また、アルカリ変性の場合、例えば、ＰＣＲ法で用いられるポリメラーゼ等をアルカリ変性時には添加することができず、各工程において、アルカリ変性液、中和液、及びＤＮＡポリメラーゼを添加する必要がある。このため、操作が煩雑となり、多種類のサンプルを同時にＰＣＲ増幅することは困難である。
　したがって、高温の熱を付加させる必要のある熱変性や環境が過酷なアルカリ変性に代わる手法により、酵素、例えばポリメラーゼの選択は格段に広がるものと考えられる。
　したがって、本発明は、熱変性の代替手段となりうる、二本鎖核酸を一本鎖核酸へ変性させる核酸変性装置、核酸変性方法および核酸の増幅方法を提供することを目的とする。
　上記目的を達成する本発明に係る核酸変性装置は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に付与する振動を発生する振動発生部を有し、振動発生部において発生した振動を核酸溶液に付与することによって、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させる点に特徴を有している。
　また、本発明に係る核酸変性方法は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に振動発生部において発生した振動を付与し、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸へ変性させる工程を有している。さらに、本発明に係る核酸の増幅方法は、上記核酸変性方法により一本鎖核酸を得る工程と、前記一本鎖核酸を用いて二本鎖核酸を増幅させる工程を有している。
本発明の一実施形態に係る核酸変性装置を示す正面図である。 図１の２－２線に沿う断面図である。 図３（Ａ）、（Ｂ）は振動発生部の発生する振動の振幅について説明するための説明図である。 本発明の変形例を示す図２と同様の位置における断面図である。 本発明の変形例に係る核酸変性装置について示す斜視図である。 振動発生部と容器保持部材との接続についての変形例を示すスピーカーの振動板の軸線を通る位置における断面図である。 本発明に係る核酸変性装置を使用して二本鎖ＤＮＡに振動を加えて、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩにより染色した実験結果を示す電気泳道写真である。 同装置を使用して二本鎖ＤＮＡに振動を加えて、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩにより染色した実験結果を示す電気泳動写真である。 ＰＣＲ法により二本鎖ＤＮＡを増幅させる際のサイクルを示す図である。 本発明に係る核酸変性装置を使用してＰＣＲ法を行った実験結果を示す電気泳動写真である。
　本発明に係る核酸変性装置は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に付与する振動を発生する振動発生部を有し、振動発生部において発生した振動を核酸溶液に付与することによって、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させる点に特徴を有している。
　また、本発明に係る核酸変性方法は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に振動発生部において発生した振動を付与し、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸へ変性させる工程を有している。さらに、本発明に係る核酸の増幅方法は、上記核酸変性方法により一本鎖核酸を得る工程と、前記一本鎖核酸を用いて二本鎖核酸を増幅させる工程を有している。
　本発明に係る核酸変性装置及び核酸変性方法では、二本鎖核酸を含む核酸溶液に振動発生部において発生した振動を付与し、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させている。そのため、二本鎖核酸は振動をきっかけにして一本鎖核酸に変性させることができ、熱による付加を必要としない。よって、振動という極めて簡便な方法により二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させることができる。
　以下、添付した図面を参照しながら、本発明の実施形態を説明する。なお、以下の記載は特許請求の範囲に記載される技術的範囲や用語の意義を限定するものではない。また、図面の寸法比率は説明の都合上誇張されており、実際の比率とは異なる場合がある。
　図１は本発明の一実施形態に係る核酸変性装置を示す正面図、図２は図１の２－２線に沿う断面図である。
　図１及び図２を参照して概説すれば、本実施形態に係る核酸変性装置１００は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に付与する振動を発生する振動発生部１０を有する。核酸変性装置１００は、振動発生部１０において発生した振動を核酸溶液に付与することによって核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させている。
　また、本実施形態において核酸変性装置１００は、核酸溶液を収容する核酸溶液収容部２０を有し、核酸溶液収容部２０は容器２１と、容器保持部材２２と、を有する。核酸溶液は容器２１に収容され、容器２１は容器保持部材２２によって保持されている。
　容器保持部材２２は接着剤Ｂにより振動発生部１０と接続されている。これにより、振動発生部１０と核酸溶液は、容器２１及び容器保持部材２２を介して接続される。なお、本発明において、核酸溶液収容部２０は容器２１のみを有し、容器保持部材２２を含まない場合をも包含する。つまり、振動発生部１０と核酸溶液は、容器保持部材２２を介さず、容器２１のみを介して接続する形態も含む。本実施形態では振動発生部１０において発生した振動を容器保持部材２２に支持される容器２１に収容された核酸溶液に付与することによって、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させている。
　本実施形態では使用時に容器２１及び容器保持部材２２を介して核酸溶液を振動発生部１０に接続することによって、容器２１および容器保持部材２２を介して核酸溶液自体を振動させる。かように核酸溶液自体に振動を付加して流体全体を振動させることにより、効率的に二本鎖核酸を一本鎖核酸へと変性させることが可能となる。以下、詳述する。
　振動発生部１０は、本実施形態においてスピーカーにおいて振動を発生させるボイスコイル１１と、ボイスコイル１１が巻き回されるボイスコイルボビン１２と、ボイスコイルボビン１２を支持するダンパー１７と、ボイスコイル１１に駆動力を与える磁気回路１３と、ボイスコイル１１による振動を受けて振動する振動板１４と、振動板１４の周縁部を支持するフレーム１５と、を有する。
　ボイスコイル１１は、振動板１４の振動の伝達方向よりも上流側に設けられる。ボイスコイル１１はボイスコイルボビン１２に巻き回されている。ボイスコイルボビン１２の端部はキャップ１６により覆われている。ダンパー１７はボイスコイルボビン１２の径方向における外方に配置され、ボイスコイルボビン１２を支持する。
　振動板１４は、ボイスコイルボビン１２と直接連結されている。これにより、振動板１４はボイスコイル１１からの振動を受け、ボイスコイルボビン１２を介してボイスコイル１１と共に振動する。振動板１４は地面Ｇに対して水平方向を向くように配置されている。
　磁気回路１３は、プレート１３Ａと、マグネット１３Ｂと、ヨーク１３Ｃと、を有する。プレート１３Ａはフレーム１５に固定されている。マグネット１３Ｂはプレート１３Ａとヨーク１３Ｃによって挟持されている。このような構成からなる磁気回路１０によって磁界が形成され、音声電流をボイスコイル１１に与えることによってボイスコイル１１が振動し、ボイスコイル１１に接続された振動板１４が振動する。振動板１４の材料や厚さなどは使用する容器２１や核酸溶液の量などを考慮して定めることができる。
　振動発生部１０は、図１に示すようにプラスチック板３１、３２によって水平方向から挟まれる。振動発生部１０は、プラスチック板３１、３２によって挟まれた状態で振動発生部１０の振動方向に障害物が存在せず、振動発生部１０の振動が極力妨げられないように地面Ｇからも一定距離離した状態となるように維持される。プラスチック板３１、３２は振動発生部１０を挟んだ状態でボルト３３、３４等の締結手段によって固定される。
　振動発生部１０がスピーカー等に使用される振動板１４を用いることで、振動発生部１０は可聴領域の周波数の振動を発生させる。振動発生部１０より発生する振動は、容器２１の形状または大きさ、変性させる二本鎖核酸の特性等により適宜設定すればよいが、可聴領域であることが好ましく、２０～２０，０００Ｈｚであることがより好ましく、より好ましくは５０～２，０００Ｈｚである。
　この範囲の振動を付加することによって、二本鎖を一本鎖へ効率的に変性させることができるとともに、高周波数振動によるＤＮＡへの損傷を懸念する必要がない。上記可聴領域の振動は、例えば撹拌子による溶液の撹拌の周波数よりは高い一方で、超音波周波数よりは低い周波数となっている。なお、上記実施形態では、可聴領域の周波数の振動を発生させるためにスピーカーを用いているが、可聴領域の振動を発生させる振動源であれば、その他の振動発生源、例えば圧電振動子であってもよい。
　図３（Ａ）、（Ｂ）は振動発生部の発生する振動の振幅について説明するための説明図である。上記振動発生部より発生する振動の振幅は、核酸溶液を収容する容器の形状等により適宜設定すればよい。振動の振幅について例示すれば、図３（Ａ）に示すように、振動板１４の円錐台形状の軸線と直交するように振動が発生する場合の振動板１４の中央部分における直径をＤ１、また図３（Ｂ）に示すように振動板１４の軸線の方向に振動が発生する場合の振動板１４の軸線方向における一端部から他端部までの距離をＤ２とすると、振幅の範囲は（Ｄ１ｏｒＤ２）／１００００～１０×（Ｄ１ｏｒＤ２）であることが好ましい。
　本実施形態において使用する核酸はＤＮＡであるが、核酸としては特に制限が無く、多様な核酸を使用することができる。核酸の具体例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）、オリゴリボヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）等、また、前記核酸の化学的修飾核酸を挙げることができる。化学的修飾核酸として２’－Ｏ－メチル（Ｍｅ）ＲＮＡ等を例示することができる。二本鎖核酸の例としては、具体的には、ＤＮＡとＤＮＡとの組み合わせ；ＲＮＡとＲＮＡとの組み合わせ等があるが、好ましくはＤＮＡとＤＮＡとの組み合わせである。
　二本鎖核酸の調製方法は従来公知の方法を用いることができ、人の血液や細胞などのような生体試料や、食品、土壌や河川水、海水などの環境試料から作製される。これらの試料から二本鎖核酸を抽出する方法としては、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いることができる。
　二本鎖核酸の溶液中の濃度は、検出手法や検出装置の検出感度に依存するので、仕様や予備検討により決定することができる。好ましい一実施形態は、試料１ｍｌあたり１ｎｇ～１ｍｇ／ｍＬである。
　核酸溶液が収容された容器２１は、振動により核酸溶液が飛散するおそれがあるため、蓋付きの容器である方が望ましい。容器としては特に限定されるものではなく、例えば、０．１～２．０ｍｌ程度のマイクロチューブが挙げられる。その材質としてはプラスチックやガラスなどが挙げられ、好ましくはポリプロピレンやポリエチレンを挙げることができる。また、マイクロチューブの容積は０．１～２．０ｍｌ程度であることが好ましい。また、マイクロチューブの形状として具体的には、アシスト社製のアシストチューブ型のマイクロチューブやエッペンドルフ社製のエッペンドルフチューブ型のマイクロチューブを挙げることができるが、他社で販売されているほぼ同規格の製品の形状のものも使用することができる。
　容器保持部材２２は、二本鎖核酸を含む核酸溶液を収容した容器２１を核酸変性装置上において固定して保持する部材である。本実施形態において容器保持部材２２には銅を用いているが、容器２１を支持できれば材料はこれに限定されない。
　また、容器保持部材２２は容器２１の外観形状に沿った収納部２２Ａを有しており、これにより容器２１を容器保持部材２２に載置するだけで容器保持部材２２によって容器２１を保持でき、容器２１を容易に着脱することができる。これにより、二本鎖核酸を変性させた際に容器２１から核酸溶液を取り出すことなく、核酸溶液の収容された容器毎、容器保持部材２２から取り出し、核酸溶液を収容した別の容器を載置するだけで次の変性作業を行うことができる。よって、変性作業を簡便に行うことができる。
　また、容器保持部材２２の収納部２２Ａにはゴム等の滑り止めを設けることができる。このように容器保持部材２２に滑り止め部材を設ければ、容器２１が容器保持部材２２から離脱するような大きさの振動を受けたとしても、容器２１は摩擦により容器保持部材２２から容易に離脱することはなく、強固に固定される。よって、振動が大きい場合に容器が容器保持部材２２から離脱して核酸溶液に振動が伝達しない、といった事態や、振動により容器内の核酸溶液が漏れ出てしまうといった事態を防止することができる。
　また、本実施形態において容器保持部材２２には容器２１を１つ設置しているが、複数設置してもよく、複数設置できることで、複数のサンプルを一度に変性させることが可能となる。
　図４は、振動発生部と容器保持部材との接続についての変形例を示す図２と同様の位置における断面図である。図２では、容器保持部材２２が接着剤Ｂによって振動板１４の中でも周辺部分である傾斜部分に接続されているが、容器内の核酸溶液に振動を伝達できれば、図４に示すように振動発生部１０の中央部分であるキャップ１６の部位に容器保持部材２２を接続してもよい。
　図５は本発明の変形例に係る核酸変性装置について示す斜視図である。容器保持部材２２は、振動発生部１０と容器２１との間において、振動発生部１０からの振動を伝達する振動伝達部材としての機能をも有している。容器保持部材２２以外における振動伝達部材の構成には、例えば図５に示すように固定板４２により振動子１４Ａに固定され、かつ容器２１の挿入が可能な容器挿入孔４１Ａが設けられたＬ字形状の支持板４１が挙げられる。
　振動子１４Ａで発生した図５に示す水平方向Ａの振動は、支持板４１を介して容器２１にも伝達され、これにより容器２１内の核酸溶液の変性が促される。このように振動伝達部材を構成することによって、容器２１を直接振動発生部１０に接続することが難しい場合にも振動伝達部材を介して容器２１内の核酸溶液に振動を伝達させることができる。よって、二本鎖核酸の変性専用の容器等を用意しなくても変性作業を行うことができる。
　上記実施形態では、容器保持部材２２および接着剤Ｂを有する核酸変性装置１００について説明したが、振動発生部を有し、該振動発生部により発生する振動により二本鎖核酸が一本鎖核酸に変性する作用を有する装置である限り、他のいかなる形態も本発明は包含する。例えば、使用時において接着部材（例えば接着剤）を用いて容器を振動発生部に直接接続してもよい。
　次に本実施形態に係る核酸変性装置１００を用いた二本鎖核酸の変性方法について説明する。まず、核酸溶液が収容された容器２１を容器保持部材２２に設置し、固定する。次に振動発生部１０のボイスコイル１１に音声電流を流して、ボイスコイル１１を振動させ、振動板１４を振動させる。容器保持部材２２は接着剤Ｂによって振動板１４に接続されており、振動板１４の振動を受けて容器保持部材２２が振動し、さらに容器保持部材２２に固定された容器２１が振動して、容器中の核酸溶液に振動が伝達される。
　本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡのような核酸に熱を付加するのではなく、振動を核酸溶液に付与するという至極簡便な方法によってＤＮＡ等の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性できることを見つけるに至った。
　すなわち、本発明の他の実施形態は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に振動発生部１０において発生した振動を付与し、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸へ変性させる変性工程と、を含む、二本鎖核酸の一本鎖核酸への変性方法である。
　振動により二本鎖核酸が一本鎖核酸に変性する機構は詳細ではないが、外部からの振動エネルギーにより核酸同士の水素結合が切断され一本鎖核酸に変性するものと推察される。
　後にＰＣＲ法等により、核酸を増幅させる場合には、核酸の増幅に必要な４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、一対のプライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等を上記溶液に含有させてもよい。
　上記変性工程は、上述した核酸変性装置１００を用いて行うことができる。
　以上説明したように本実施形態に係る核酸変性装置及び核酸変性方法によれば、二本鎖核酸を含む核酸溶液に振動発生部１０において発生した振動を付与し、核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させている。
　振動による変性は、非常に簡便であり、かつ試料環境が過酷ではないため、従来の熱やアルカリによる変性による種々の制限を受けることなく、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させることができる。そのため、ハイブリダイゼーションへの応用、ＰＣＲとの組み合わせ等に広く利用でき、また生きた細胞や生体での局所的な遺伝子増幅などへの応用も期待でき、遺伝子発現機構の解明に貢献することができると考えられる。
　本発明は上述した実施形態にのみ限定されるものではなく、特許請求の範囲において種々の改変が可能である。
　図６は振動発生部と容器保持部材との接続についての変形例を示すスピーカーの振動板の軸線を通る位置における断面図である。容器保持部材２２は、図２又は図４に示すように、振動発生部１０の振動板１４を地面Ｇに対して水平方向を向くように設置し、その状態において振動板１４又はキャップ１６の部位に容器保持部材２２を介して容器２１に収容された核酸溶液に振動を付与する実施形態について説明した。しかし、本発明はこれに限定されない。
　振動板１４は、図６に示すように地面Ｇに対して鉛直方向を向くように設置して核酸溶液に振動を付与するように構成してもよい。
　また、上記で得られた一本鎖核酸は、種々の用途に用いることができる。
　一実施形態としては、上記一本鎖核酸を用いてＰＣＲにより二本鎖核酸を増幅させることができる。すなわち、本発明の他の好適な一実施形態は、二本鎖核酸を含む核酸溶液に振動発生部において発生した振動を付与し、前記二本鎖核酸を一本鎖核酸へ変性させる工程（１）と、前記一本鎖核酸を鋳型として用いて二本鎖核酸を増幅させる工程（２）と、を含む核酸の増幅方法である。
　工程（１）については、上述したので、ここでは説明を割愛する。
　従来、ＰＣＲ法やＬＣＲ法において、熱変性により二本鎖核酸を一本鎖核酸に解離していた工程の代わりに、本発明では、上記工程（１）を用いる。したがって、核酸の増幅方法としては、熱変性の工程以外は、従来のＰＣＲ法およびＬＣＲ法の工程を用いて二本鎖核酸を増幅することができる。
　上述のように、本発明における変性方法によれば、加熱による変性のように、高価で較正機能に劣る耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを使用する必要がない。また、温度変動型のＰＣＲ法のように温度変性を必ずしも必要とせず、一定の温度で核酸の増幅を行うことができる。さらに、アルカリによる変性のように、各工程において、アルカリ変性液、中和液、及びＤＮＡポリメラーゼを添加する必要がなく、試料溶液を準備した後、変性、アニーリングおよび伸長を行うことができる。したがって、本発明の核酸の増幅方法は非常に簡便に核酸の増幅を行うことができる。
　ＰＣＲ法等により、核酸を増幅させる場合には、工程（１）において、一本鎖に変性させる試料に、後の二本鎖核酸への増幅に必要な各種試薬を含ませることができる。核酸の増幅に必要な試薬としては、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ）、一対のプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、緩衝液等が挙げられる。
　二本鎖核酸を増幅させる方法としては、等温もしくは可変温度条件で行う２つの方法があり、本発明ではいずれの手法でも実施することが可能である。本発明では等温条件下でも二本鎖核酸の増幅を行うことができることから、操作の簡便性を考慮すると、等温条件下で増幅を行うことが好ましい。
　等温条件下とは、ＰＣＲ反応溶液を含有するＰＣＲ反応用容器が設置されている環境の温度が各工程において一定となるように制御されている条件下を意味し、ＰＣＲ反応溶液自体の温度が厳密に一定である必要はない。また、等温とは、厳密に同じ温度である必要はなく、例えば、一定範囲の温度で操作が行われることを指す。例えば、校正機能に優れたＤＮＡポリメラーゼの至適温度は通常、あまり高温ではないため、１０～４２℃であることが好ましい。
　なお、操作の簡便性を考慮すると、工程（１）においても等温条件下で操作を行うことが好ましい。
　また、利用可能なＤＮＡポリメラーゼとしては、限定されるものではないが、Ｔａｑポリメラーゼや、ＥＸ－Ｔａｑ、ＬＡ－Ｔａｑ、Ｅｘｐａｎｄシリーズ、Ｐｌａｔｉｎｕｍシリーズ、Ｔｂｒ、Ｔｆｌ、Ｔｒｕ、Ｔｔｈ、Ｔ１ｉ、Ｔａｃ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｔｉｈ、及び、Ｔｆｉ等に代表されるＰｏｌＩ型酵素、Ｐｆｕ、Ｐｆｕｔｕｒｂｏ、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ、Ｐｗｏ、ＫＯＤ、Ｂｓｔ、Ｓａｃ、Ｓｓｏ、Ｐｏｃ、Ｐａｂ、Ｍｔｈ、Ｐｈｏ、ＥＳ４、ＶＥＮＴ、及び、ＤＥＥＰＶＥＮＴに代表されるα型酵素、Ｂｃａ（ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ．　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（Ｅｘｏ－）ＤＮＡポリメラーゼ（ＤｅｅｐＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラーゼからエクソヌクレアーゼ活性を除いたもの）、Φ２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ－２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ－Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ等が挙げられる。これらを単独で用いても良いし、複数組み合わせて用いても良い。これらのＤＮＡポリメラーゼは市販のものを用いることができる。
　また、核酸増幅産物の検出は、アガロースゲル電気泳動後にエチジウムブロマイドで染色したり、或いは、蛍光インターカレーター存在下で核酸増幅を行った後ＵＶを照射することより行うことができる。また、定量Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ法により定量的に分析することも可能である。
　また、一本鎖同士の核酸ハイブリダイゼーションを行う際に用いる一本鎖核酸を調製する際に、本発明の一本鎖解離方法を用いることもできる。一般的に、核酸ハイブリダイゼーション反応は、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーション、ノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）ハイブリダイゼーションなどをいう。
　以下、実施例および比較例を説明する。ただし、本発明の技術的範囲が以下の実施例のみに制限されるわけではない。
　（１）実施例1：二本鎖核酸の変性
　次に図６に記載の核酸変性装置を使用して二本鎖核酸の変性について確認する実験を行った。
　Ｄｎｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてシロイヌナズナから１００ｎｇ／μＬのゲノムＤＮＡを抽出した。
　得られたゲノムＤＮＡ０．１μｌを０．１ｍｌのマイクロチューブ（ＢＩＯｐｌａｓｔｉｃｓ社製、型番ＢＰＢ７７２０１）に添加し、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡバッファー（ＴＥ）９．９μｌで希釈してＤＮＡ希釈物を得た後、ローディングバッファー（タカラバイオ社製、６×Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ）１μｌを添加した。このサンプルを１１サンプル用意した。
　そして、サンプルである核酸溶液に振動板からの振動が鉛直方向に伝達する状態において１００～１０００Ｈｚ及び振動無しの１１パターンの振動を振幅０．５ｍｍで各１２０秒間、各核酸溶液に入力した。得られた試料を１％のアガロースゲルで電気泳動後、ｄｓＤＮＡを検出するＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ（タカラバイオ社製）及びｓｓＤＮＡを検出するＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩＩ（タカラバイオ社製）で染色した。電気泳動の印加電圧はＤＣ１００Ｖである。
　図７は、本発明に係る核酸変性装置を使用してＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩにより染色した実験結果を示す電気泳動写真、図８は同装置を使用してＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩにより染色した実験結果を示す電気泳動写真である。図７、図８では、いずれも図における一番左側から１００、２００、３００と１００Ｈｚ毎に１，０００Ｈｚまで周波数を増やした振動を入力した場合の実験結果を実施例として表示し、一番右側は振動無しの場合の実験結果を比較例として表示している。
　図７において、グラフ中におけるライン部分は使用した指示薬であるＳＹＢＲＧｒｅｅｎ　Ｉが二本鎖ＤＮＡに反応した場合に現れる。ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩでライン部分が現れず、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩＩでライン部分が現れると、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに変性していることが確認できる。
　図７において、振動無しの場合にラインが表示されているのは二本鎖ＤＮＡが残っていることを表している。一方で周波数１００～１，０００Ｈｚの振動を付加したサンプルには蛍光がなくなった。この結果から、振動を付加することにより、二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡに変性していることが確認できる。
　また、図８によれば、強弱の差はあるものの、ライン部分は十分に視認できることが確認できる。これらを総合すると、二本鎖ＤＮＡは１００～１，０００Ｈｚの周波数の振動を加えることによって一本鎖ＤＮＡに変性させることができると考えられる。
　このように核酸溶液に振動を加えることにより、熱による付加をかけずに二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性できることが確認できた。
　（２）実施例２：ＰＣＲ法による二本鎖核酸の増幅
　下記のように反応液を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　配列番号１の配列は、５’－ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ－３’、配列番号２の配列は、５’－ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ－３’である。
　上記反応液１５μｌを０．１ｍｌのマイクロチューブ（ＢＩＯｐｌａｓｔｉｃｓ社製、型番ＢＰＢ７７２０１）に入れ、サンプルとした。
　次いで、図６の装置を用いて、サンプルである核酸溶液に振動板からの振動が鉛直方向に伝達する状態において、１３０Ｈｚ（波形サイン波）で、１５秒振動を与え、その後、１５秒静止した。振動１５秒、静止１５秒を１サイクルとし、１１、１３、１５のサイクル数で実験を行った（図９）。したがって、トータル時間は、３０秒×サイクル数となる。この際、温度は３７℃に一定に保って行った。一方、比較として、振動を一切与えず、温度だけ３７℃に一定に保ったこと以外は上記実施例と同様に実験を行った。保持時間は、上記のトータル時間に合わせた。電気泳動の結果を図１０に示す。図１０において、振動および静止のサイクルを行ったものを「振動ＰＣＲ」と、振動を一切与えなかったものを「無振動」と表記した。
　図１０の結果によれば、サイクル数が１１では振動ＰＣＲのバンドの明るさは無振動のものより暗いが、サイクル数１３では同程度の明るさとなり、サイクル数１５で無振動のものよりもバンドが濃くなっている。これらのことから、サイクル数を増やすに従い、ＤＮＡが増幅されていることがわかる。
　本出願は、２０１２年８月３０日に出願された日本特許出願番号２０１２－１８９４４１号に基づいており、その開示内容は、参照され、全体として、組み入れられている。
１０　振動発生部、
１１　ボイスコイル、
１２　ボイスコイルボビン、
１３　磁気回路、
１３Ａ　プレート、
１３Ｂ　マグネット、
１３Ｃ　ヨーク、
１４　振動板、
１４Ａ　振動子、
１５　フレーム、
１６　キャップ、
１７　ダンパー、
１００　核酸変性装置、
２０　核酸溶液収容部、
２１　容器、
２２　容器保持部材、
２２Ａ　収納部、
３１、３２　プラスチック板、
３３、３４　ボルト、
４１　支持板、
４１Ａ　容器挿入孔、
４２　固定板、
Ａ　（地面に対して水平の）振動方向、
Ｂ　接着剤、
Ｇ　地面。

Claims (11)

  1. 　二本鎖核酸を含む核酸溶液に付与する振動を発生する振動発生部を有し、
    　前記振動発生部において発生した振動を前記核酸溶液に付与することによって、前記核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性させることを特徴とする核酸変性装置。
  2. 　前記振動発生部は、可聴領域の振動を発生させる、請求項１に記載の核酸変性装置。
  3. 　前記可聴領域の周波数は、２０Ｈｚ乃至２０，０００Ｈｚである請求項２に記載の核酸変性装置。
  4. 　前記核酸溶液を収容する核酸溶液収容部と、
    　前記振動発生部と前記核酸溶液収容部との間に設けられ、前記振動発生部において発生した振動を前記核酸溶液収容部に伝達する振動伝達部材と、
    をさらに有する請求項１～３のいずれかに記載の核酸変性装置。
  5. 　前記核酸溶液収容部は、前記核酸溶液を収容する容器を有する請求項４に記載の核酸変性装置。
  6. 　前記核酸溶液収容部は、前記容器を着脱自在に保持する容器保持部材をさらに有する請求項５に記載の核酸変性装置。
  7. 　前記容器保持部材は、前記振動発生部において発生した振動が与えられた際に前記容器の離脱を防止する離脱防止機構を備える請求項６に記載の核酸変性装置。
  8. 　二本鎖核酸を含む核酸溶液に振動発生部において発生した振動を付与し、前記核酸溶液中の二本鎖核酸を一本鎖核酸へ変性させる工程と、を含む核酸変性方法。
  9. 　前記振動は可聴領域の振動である、請求項８に記載の核酸変性方法。
  10. 　前記可聴領域の周波数は、２０Ｈｚ乃至２０，０００Ｈｚである請求項９に記載の核酸変性方法。
  11. 　請求項８～１０のいずれか１項に記載の核酸変性方法により一本鎖核酸を得る工程と、前記一本鎖核酸を用いて二本鎖核酸を増幅させる工程と、を含む核酸の増幅方法。
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