JP2020506687A - ポリヌクレオチド分子を合成するための方法および試薬 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)足場ポリヌクレオチドを提供することと、
(2)所定の配列のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって足場ポリヌクレオチドに組み込むことであって、ヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
(3)足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
(4)連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、(2)の所定の配列のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、所定の配列のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
(5)(2)の所定の配列のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、方法を提供する。
(1)合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、一本鎖切断によって分離されたプライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含み、支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
(2)所定の配列の1番目のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって合成鎖に組み込むことであって、1番目のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
(3)足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、部位が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、支持鎖を切断すること、およびユニバーサルヌクレオチドを除去して、合成鎖中に1番目のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
(4)二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および1番目のヌクレオチドに対する(ヘルパー鎖に突出した)パートナーヌクレオチドを支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをヘルパー鎖中に含み、連結ポリヌクレオチドの支持鎖と切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖との連結時に、1番目のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
(5)1番目のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
(6)所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって足場ポリヌクレオチドの合成鎖に組み込むことであって、隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
(7)足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、部位が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、支持鎖を切断すること、およびユニバーサルヌクレオチドを除去して、合成鎖中に隣のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
(8)二本鎖連結ポリヌクレオチドを切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、およびヘルパー鎖に突出した隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドをヘルパー鎖中に含み、連結ポリヌクレオチドの支持鎖と切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖との連結時に、隣のヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
(9)隣のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6〜9を複数回繰り返して、所定の塩基配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、方法を提供する。
a)工程(1)/(6)において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、一本鎖切断に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され(位置n)、
b)工程(2)/(6)において、1番目の/隣のヌクレオチドが、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で合成鎖に組み込まれ、そのときに1番目の/隣のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドの適所でユニバーサルヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、支持鎖が、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチド位置(位置n)と、ユニバーサルヌクレオチド位置の隣のヌクレオチド(位置n−1、ヘルパー鎖に対して遠位方向/プライマー鎖に対して近位方向において)との間の位置で切断され、切断が、支持鎖に突出した1番目の/隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を生成し、
d)工程(4)/(8)において、連結ポリヌクレオチドの連結末端が、一塩基突出を含み、
i.支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドの隣に位置付けられ(位置n)、
iii.支持鎖の末端ヌクレオチド(位置n−1)が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)/(6)の1番目の/隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであることを含み得る。
a)工程(1)において、足場ポリヌクレオチドが、工程(2)の1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合するヌクレオチド(位置n)を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドの隣に位置付けられ(位置n+1、ヘルパー鎖の近位方向/プライマー鎖の遠位方向において)、
b)工程(2)/(6)において、1番目の/隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で合成鎖に組み込まれ、そのときに1番目の/隣のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドの適所でパートナーヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対する遠位方向/プライマー鎖に対して近位方向において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから1番目のヌクレオチド(位置n)と2番目のヌクレオチド(位置n−1)との間の位置で切断され、切断が、ユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した1番目の/隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
d)工程(4)/(8)において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、一塩基突出を含み、
i.支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ(位置n+1)、それと対合され、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ(位置n)、
iii.支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程(6)において隣のヌクレオチドのためのパートナーヌクレオチドであり、
iv.支持鎖の末端ヌクレオチド(位置n−1)が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)の1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程(6)の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであることを含み得る。
a)工程(1)/(6)において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、一本鎖切断に隣接するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され(位置n)、
b)工程(2)/(6)において、1番目の/隣のヌクレオチドが、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置で合成鎖に組み込まれ、そのときに1番目の/隣のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドの適所でユニバーサルヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向/プライマー鎖に対して近位方向において支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから1番目のヌクレオチド(位置n−1)と2番目のヌクレオチド(位置n−2)との間の位置で切断され、切断が、ユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した1番目の/隣のヌクレオチド突出を含む足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、合成鎖の末端ヌクレオチドが1番目の/隣のヌクレオチドであり、
d)工程(4)/(8)において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
i.支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ(位置n)、それと対合され、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ(位置n−1)、
iii.支持鎖の最後から2番目のヌクレオチド(位置n−1)が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチド(位置n−2)に突出し、工程(2)/(6)において1番目の/隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであることを含み得る。
a)工程(1)において、足場ポリヌクレオチドが、工程(2)の1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド(位置n)を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、位置n+2(ヘルパー鎖に対して近位方向/プライマー鎖に対して遠位方向において)に位置付けられ、
b)工程(2)/(6)において、1番目の/隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で合成鎖に組み込まれ、そのときに1番目の/隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向/プライマー鎖に対して近位方向において支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから2番目のヌクレオチド(位置n)と3番目のヌクレオチド(位置n−1)との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した1番目の/隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
d)工程(4)/(8)において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、一塩基突出を含み、
i.ユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の支持鎖中の位置n+2に位置付けられ、それと対合され、
ii.支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程(6)における隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであり(位置n)、
iii.支持鎖の末端ヌクレオチド(位置n−1)が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)の1番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程(6)の新たに組み込まれたヌクレオチドのパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
a)工程(1)において、足場ポリヌクレオチドが、工程(2)の1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド(位置n)を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置n+1(ヘルパー鎖に対して近位方向/プライマー鎖に対して遠位方向において)に位置付けられ、
b)工程(2)/(6)において、1番目の/隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で合成鎖に組み込まれ、そのときに1番目の/隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向/プライマー鎖に対して近位方向において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから2番目のヌクレオチド(位置n−1)と3番目のヌクレオチド(位置n−2)との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した1番目の/隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
d)工程(4)/(8)において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
i.支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の位置n+1に位置付けられ、それと対合され、
ii.支持鎖の最後から2番目のヌクレオチド(位置n−1)が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)の1番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程(6)の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
iii.支持鎖の位置nのヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程(6)における隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
a)ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得、
b)プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ヘアピンループによって接続され得る。
a)複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が1つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
b)上記および本明細書に記載される方法のいずれかに従って各反応領域で合成サイクルを行い、それによって所定の配列を有する1つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを各領域で合成することと、を含む、方法を提供する。
図4、5a、6a、7a、8a、9a、10a、11a、12a、13a、14a、15a、16a、17a、18a、19a、20a、21a、21b、22、23、24、25、26、27、および28に図示される構造は、図1、2、および3aに図示されるものと一貫して解釈されるべきである。したがって、これらの図では、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各左手鎖は、支持鎖(図1、2、および3aの鎖「a」に対応する)に関連し、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各右手鎖は、合成鎖(図1、2、および3aの鎖「b」に対応する)に関し、すべての足場ポリヌクレオチド分子は、プライマー鎖部分を含む鎖に対応するより低い合成鎖(図1、2、および3aの鎖「b」の実線および点線に対応する)を含み、ヘルパー鎖部分を含む鎖(図1、2、および3aの鎖「b」の破線に対応する)に対応する上部合成鎖を有する、新たなヌクレオチドの組み込みの前の特定の足場ポリヌクレオチド分子(例えば、図8aおよび16a)が示され、ヘルパー鎖部分を含まない(図1、2、および3aの鎖「b」の破線の欠如に対応する)、特定の足場ヌクレオチド分子(図5a、6a、および7aの)が示され、ヘルパー鎖部分を含む鎖(図1、2、および3aの鎖「b」の破線に対応する)に対応する上部合成鎖を有する、連結工程後の特定の足場ポリヌクレオチド分子(例えば、図26、27、および28の)が示され、ヘルパー鎖部分は、次の合成サイクルにおいて新たなヌクレオチドの組み込みの前に除去される。
一態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供する。
一態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供する。
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、本明細書で足場ポリヌクレオチドと呼ばれる、本明細書に記載されるような表面に付着し得るか、または付着することができる、既存のポリヌクレオチドへの所定のヌクレオチドの組み込みによる本発明の方法によって合成される。本明細書により詳細に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、新たに合成されたポリヌクレオチドを収容するための支持構造を形成し、本明細書の記載から明らかになるように、従来の合成方法におけるように複製される既存の鋳型鎖を含まない。足場ポリヌクレオチドが表面に付着している場合、足場ポリヌクレオチドは、アンカーポリヌクレオチドと呼ばれることがある。足場ポリヌクレオチドを表面に付着させてアンカーポリヌクレオチドを形成するための表面付着化学は、本明細書により詳細に記載されている。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって合成ポリヌクレオチドに組み込まれ得るヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオチドは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって合成ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。
光切断可能な塩基:
本明細書に記載される方法を使用して所定のヌクレオチドを組み込むために任意の好適な酵素を用いることができる。したがって、ポリメラーゼの使用に関して本明細書に定義および記載されるすべての方法において、ポリメラーゼは、本発明の方法の文脈においてポリメラーゼと同じ機能を果たすことができる別の酵素と置換され得る。
本明細書に定義および記載されるすべての方法は、可逆的ブロッキング基または可逆的ターミネーター基を指す。そのような基は、所与の合成サイクルにおいて酵素によるさらなる伸長を防止するように作用し、その結果、所定の配列のヌクレオチドのみが合成鎖を伸長させるために制御可能に使用され得、したがって非特異的ヌクレオチドの組み込みが防止される。この効果を達成する任意の機能性は、本明細書に定義および記載される方法のうちのいずれにおいても使用され得る。ヌクレオチドに付着した可逆的ブロッキング基/可逆的ターミネーター基および脱ブロッキング工程は、この効果を達成するための好ましい手段である。しかしながら、この効果は、必要に応じて代替的な手段によっても達成され得る。
3’−O−アリル−dNTPを以下に示す。
プロパルギル可逆的ターミネーター:
Pd触媒による処理−Na2PdCl4、PdCl2。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン−3,3’,3’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アリル可逆的ターミネーター:
Pd触媒による処理−Na2PdCl4、PdCl2。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン−3,3’,3’’−トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アジドメチル可逆的ターミネーター:
チオール(メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール)、またはトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン−TCEPによる処理。
シアノエチル可逆的ターミネーター:
フッ化物−フッ化アンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)による処理。
ニトロベンジル可逆的ターミネーター:
UV光への曝露
ジスルフィド可逆的ターミネーター:
チオール(メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール)、またはトリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン−TCEPによる処理。
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター:
亜硝酸塩(NO2 −、HNO2)による処理pH=5.5
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有するポリヌクレオチドは二本鎖である。合成されたポリヌクレオチドは全体として二本鎖であり、ここで第1の鎖は、ハイブリダイゼーションによって第2の鎖に付着している。第1の鎖が全体としてハイブリダイゼーションによって第2の鎖に付着しているという条件で、非ハイブリダイゼーションのミスマッチおよび領域は許容され得る。
足場ポリヌクレオチドの存在および連結前の切断工程を必要とする方法において、切断工程を行うための試薬の選択は、用いられる具体的な方法に依存するであろう。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドの特定の位置、および一旦切断された足場ポリヌクレオチド中の一塩基突出または二塩基突出の必要性によって定義される。したがって、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に明らかになるように、所望の切断部位の構成および適切な切断試薬の選択は、その方法で用いられる特定の化学に依存するであろう。
足場ポリヌクレオチドの存在および切断後の連結工程を必要とする方法において、連結ポリヌクレオチドの構成および構造の選択はまた、用いられる具体的な方法に依存するであろう。連結ポリヌクレオチドは、一般に、本明細書に記載される支持鎖および本明細書に記載されるヘルパー鎖を含む。連結ポリヌクレオチドにおいて使用される支持鎖およびヘルパー鎖は、最初の足場ポリヌクレオチド構築物において使用されるものと同じでもまたは異なっていてもよい。例えば、連結ポリヌクレオチドの連結末端の支持鎖における一重塩基突出または二塩基突出の必要性は、用いられる方法に依存するであろう。適切な構造は、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に達成することができる。
連結工程を伴う本発明の方法において、連結は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。好ましくは、連結工程は、リガーゼ酵素によって行われるであろう。リガーゼは、一塩基突出基質に対する活性が増強された修飾リガーゼであり得る。リガーゼは、T3 DNAリガーゼまたはT4 DNAリガーゼであり得る。リガーゼは平滑TAリガーゼであり得る。例えば、平滑TAリガーゼは、New England BioLabs(NEB)から入手可能である。これは、T4 DNAリガーゼと、連結エンハンサーと、平滑末端および一塩基突出基質の両方の連結および形質転換を改善するために特別に調製された最適化反応緩衝液との、すぐに使用できるマスターミックス溶液である。一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを連結(接合)するための分子、酵素、化学物質、および方法は、当業者によく知られている。
本発明の合成方法に従って生産された合成ポリヌクレオチドは、好ましくは固相または可逆的固相技術を使用して合成することができる。様々なそのような技術が当該技術分野において知られており、また、使用され得る。所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、足場ポリヌクレオチドを表面、例えば、ガラスなどの平坦な表面、ゲル系材料、またはビーズもしくは官能化量子ドットなどの微粒子の表面に固定化し得る。表面を構成する材料自体が基質に結合され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドは、例えばポリアクリルアミドなどのゲル系材料に固定化され得、ここでゲル系材料は、ガラスなどの支持基質に結合されている。
所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、合成アンカー/足場ポリヌクレオチドを、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既知の方法によって合成し、表面に繋留させることができる。
所定の配列を有する合成ポリヌクレオチドは、可逆的固定化を促進する、微粒子およびビーズなどの結合表面および結合構造を使用して本発明に従って合成することができる。固相可逆的固定化(SPRI)方法または改良された方法が、当該技術分野において知られており、また用いることができる(例えば、DeAngelis M.M.et al.(1995)Solid−Phase Reversible Immobilization for the Isolation of PCR Products,Nucleic Acids Research,23(22):4742−4743を参照されたい)。
表面は、エレクトロウェッティングオン誘電体システム(EWOD)であり得る。EWODシステムは、微小液滴の形態での非常に小さい液体容量の微小流体操作を促進する誘電体被覆表面を提供する(例えば、Chou,W−L.,et al.(2015)Recent Advances in Applications of Droplet Microfluidics,Micromachines,6:1249−1271.)。液滴容量は、エレクトロウェッティング技術によってチップ上でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。したがって、エレクトロウェッティングシステムは、合成中および合成後にポリヌクレオチドを可逆的に固定化するための代替的な手段を提供する。
オリゴヌクレオチドは典型的には化学的に付着するが、それらはまた、親和性相互作用などを介して間接的な手段によって表面に付着し得る。例えば、オリゴヌクレオチドをビオチンで官能化し、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された表面に結合させることができる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法のうちのいずれかを使用して、ポリヌクレオチドマイクロアレイを製造することができる(Trevino,V.et al.,Mol.Med.2007 13,pp527−541)。したがって、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、表面上の複数の個々にアドレス可能な反応部位に繋留され得、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上にインサイチュで合成され得る。
本明細書に記載される方法によって合成され、任意選択的に本明細書に記載される方法によって増幅される所定の配列を有するポリヌクレオチドは、より大きな合成ポリヌクレオチドを作成するために1つ以上の他のそのようなポリヌクレオチドに接合され得る。
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれか、ならびに本明細書に記載および定義されるその後の増幅および構築工程のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムも提供する。
本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を合成する例示的な方法は、添付の特許請求の範囲を含む本明細書に記載されている。以下の文中の参照符号は、図1、2、3a、3b、および3cのものと対応している。
本発明の合成方法の第1の例示的なバージョンでは、新たなヌクレオチドは、支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドと反対側の二本鎖足場ポリヌクレオチドに組み込まれる(図1の工程1および2、101、102)。各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される(図1の工程3、103)。新たに組み込まれたヌクレオチドを含む一塩基突出が、切断された足場ポリヌクレオチド中に生成される(図1の下部中央に図示される構造を参照されたい)。切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチド(図1の下部の左端に図示される構造を参照されたい)の連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドに組み込み、新たに組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし(図4の工程4、104)、これにより合成サイクルが完了する。
本発明の合成方法の第2の例示的なバージョンでは、新たなヌクレオチドは、支持鎖中に位置付けられた相補的ヌクレオチドと反対側の二本鎖足場ポリヌクレオチドに組み込まれる(図2の工程1および2、201、202)。各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される(図2の工程3、203)。新たに組み込まれたヌクレオチドを含む一塩基突出が、切断された足場ポリヌクレオチド中に生成される(図2の下部中央に図示される構造を参照されたい)。
本発明の合成方法の第3の例示的なバージョンでは、新たなヌクレオチドは、支持鎖中に位置付けられたユニバーサルヌクレオチドと反対側の二本鎖足場ポリヌクレオチドに組み込まれる(図3aの工程1および2、301、302)。各合成サイクルにおいて、足場ポリヌクレオチドは、ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される切断部位で切断される(図3aの工程3、303)。新たに組み込まれたヌクレオチドを含む二塩基突出が、切断された足場ポリヌクレオチド中に生成される(図3aの下部中央に図示される構造を参照されたい)。切断された足場ポリヌクレオチドへの連結ポリヌクレオチド(図3aの下部の左端に図示される構造を参照されたい)の連結は、パートナーヌクレオチドを足場ポリヌクレオチドに組み込み、これにより新しく組み込まれたヌクレオチドがパートナーヌクレオチドと対合することを可能にし(図3aの工程4、304)、よって完全合成サイクルが完了する。
合成方法のバージョン4は、合成方法のバージョン2の変形例である。したがって、合成方法のバージョン2と同様に、合成方法のバージョン4では、新たに組み込まれた所定のヌクレオチドは、工程(2)/(6)の間に位置nで支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の合成鎖に組み込まれ、支持鎖は、工程(3)/(7)の間に位置nとn−1との間で切断される。ユニバーサルヌクレオチドが位置n+1を占める合成方法のバージョン2とは異なり、合成方法のバージョン4では、ユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖に対して近位方向/プライマー鎖に対して遠位方向において、位置n+2を占める。したがって、この違いを考慮に入れて、合成方法のバージョン4は、方法のバージョン2に関する上記の記載の文脈において図3bおよびその記載を参照して記載され得る。この方法のさらなる変形例は、各変形方法において、支持鎖が、工程(3)/(7)の間に位置nとn−1との間で切断され、ユニバーサルヌクレオチドが、例えば位置n+3または位置n+3+xなど、それぞれ位置n+2からさらに1位置ずつ除去された支持鎖中の位置を増分的に占めることが想定され、ここで、xは1〜10以上の整数である。
a)工程(1)において、足場ポリヌクレオチドが、工程(2)の1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド(位置n)を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、位置n+2(ヘルパー鎖に対して近位方向/プライマー鎖に対して遠位方向において)に位置付けられ、
b)工程(2)/(6)において、1番目の/隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で合成鎖に組み込まれ、そのときに1番目の/隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向/プライマー鎖に対して近位方向において支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから2番目のヌクレオチド(位置n)と3番目のヌクレオチド(位置n−1)との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した1番目の/隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
d)工程(4)/(8)において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、一塩基突出を含み、
i.ユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の支持鎖中の位置n+2に位置付けられ、それと対合され、
ii.支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程(6)における隣のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであり(位置n)、
iii.支持鎖の末端ヌクレオチド(位置n−1)が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)の1番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程(6)の新たに組み込まれたヌクレオチドのパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
合成方法のバージョン5は、合成方法のバージョン3の変形例である。したがって、合成方法のバージョン3と同様に、合成方法のバージョン4では、新たに組み込まれた所定のヌクレオチドは、工程(2)/(6)の間に位置nで支持鎖中のパートナーユニバーサルヌクレオチドと反対側の合成鎖に組み込まれ、支持鎖は、工程(3)/(7)の間に位置n−1とn−2との間で切断される。ユニバーサルヌクレオチドが位置nを占める合成方法のバージョン3とは異なり、合成方法のバージョン5では、ユニバーサルヌクレオチドは、ヘルパー鎖に対して近位方向/プライマー鎖に対して遠位方向において、位置n+1を占める。したがって、この違いを考慮に入れて、合成方法のバージョン5は、方法のバージョン3に関する上記の記載の文脈で図3cおよびその記載を参照して記載され得る。この方法のさらなる変形例は、各変形方法において、支持鎖が、工程(3)/(7)の間に位置nとn−1との間で切断され、ユニバーサルヌクレオチドが、例えば位置n+2または位置n+2+xなど、それぞれ位置n+1からさらに1位置ずつ除去された支持鎖中の位置を増分的に占めることが想定され、ここで、xは1〜10以上の整数である。
a)工程(1)において、足場ポリヌクレオチドが、工程(2)の1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるヌクレオチド(位置n)を有する支持鎖中に提供され、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドは、位置n+1(ヘルパー鎖に対して近位方向/プライマー鎖に対して遠位方向において)に位置付けられ、
b)工程(2)/(6)において、1番目の/隣のヌクレオチドが、支持鎖中のパートナーヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で合成鎖に組み込まれ、そのときに1番目の/隣のヌクレオチドが、パートナーヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、支持鎖が、ヘルパー鎖に対して遠位方向/プライマー鎖に対して近位方向において、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドから2番目のヌクレオチド(位置n−1)と3番目のヌクレオチド(位置n−2)との間の位置で切断され、切断がユニバーサルヌクレオチドを除去し、支持鎖に突出した1番目の/隣のヌクレオチドを含む足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
d)工程(4)/(8)において、連結ポリヌクレオチドの相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
i.支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドが、ヘルパー鎖中のヌクレオチドと反対側の位置n+1に位置付けられ、それと対合され、
ii.支持鎖の最後から2番目のヌクレオチド(位置n−1)が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)の1番目のヌクレオチドのパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程(6)の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
iii.支持鎖の位置nのヌクレオチドが、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程(6)における隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、方法を提供する。
上記に記載されるような方法のバージョン1、2、および3を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する方法において、足場ポリヌクレオチドに合成鎖が提供される。合成サイクル中に、所定の配列の各新たなヌクレオチドが合成鎖に組み込まれる。ポリメラーゼ酵素を使用して、各新たなヌクレオチド、ヌクレオチド類似体/誘導体または非ヌクレオチドの組み込みを触媒することができる。合成鎖はプライマー鎖部分を含み、好ましくはヘルパー鎖部分を含む。
切断工程で切断酵素(複数可)の結合を促進するために、足場ポリヌクレオチドにヘルパー鎖が提供され得る。必要に応じて、切断工程での切断酵素(複数可)の結合を確実にし、連結工程での連結を確実にするために代替的な手段が提供されるという条件で、ヘルパー鎖が削除され得る。本発明の好ましい方法において、合成鎖にヘルパー鎖が提供される。
例示的な方法のバージョン1、2、および3を含む、本明細書に記載される合成方法のうちのいずれにおいても、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供する工程(1)(すなわち、第1のサイクルにおいて)(101、106、201、206、301、306)において、合成鎖は、ヘルパー鎖なしで提供され得る。これにより、足場ポリヌクレオチドへのポリメラーゼの結合が改善され得る。
プライマー鎖は十分な長さであるべきであり、ポリメラーゼ酵素が合成を開始することを可能にする、すなわち、ニックの部位でのプライマー鎖の末端における新たなヌクレオチドの組み込みを触媒するのに好適であるような配列および構造を保有するべきである。
方法のバージョン1、2、および3を含むがこれらに限定されない本発明の方法では、上記に記載されるように、足場ポリヌクレオチドに支持鎖が提供される。支持鎖は合成鎖にハイブリダイズされる。上記に記載されるように、支持鎖がプライマー鎖部分と適合し、含まれる場合、合成鎖のヘルパー鎖部分と適合するという条件で、支持鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
DNA合成について記載される方法はRNAの合成に適応され得る。一適応形態では、方法のバージョン1〜3について記載される合成工程が適応され得る。したがって、方法のバージョン1〜3のそれぞれにおいて、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、上記に記載されるように、DNA鎖である。足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分はRNA鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、好ましくはRNA鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、DNA鎖であり得る。
この実施例は、4つの工程:部分二本鎖DNA上への3’−O−修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対側で起こる。
第1の工程は、DNAポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’−O−保護一塩基の制御された添加を記載する(図5a)。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis,Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma−Aldrichから入手した(図5h)。原液を100μMの濃度で調製した。
3.3−O−修飾dNTPを組み込む能力が増強された、New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用した。しかしながら、修飾dNTPを組み込むことができる任意のDNAポリメラーゼを使用することができる。
2種類の可逆的ターミネーターを試験した。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
2.0.5μlの10μMプライマー(合成鎖)(5pmol、1当量)(配列番号1、図5h)および0.75μlの10μM鋳型(支持鎖)(6pmol、1.5当量)(配列番号2、図5h)を反応混合物に加えた。
3.3’−O−修飾−dTTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。しかしながら、修飾dNTPを組み込むことができる任意のDNAポリメラーゼを使用することができる。
5.反応物を65℃で20分間インキュベートした。
6.TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を停止させた。
7.反応物を、TBE緩衝液を含むポリアクリルアミドゲル(15%)上で分離し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
New England BioLabs製のカスタマイズされて操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼは、ユニバーサルヌクレオチド、例えばノシンと反対側に3’−O−修飾−dNTPを組み込むことができる効率的なDNAポリメラーゼである(図5b〜c)。
イノシンと反対側の効率的な組み込みは、65℃の温度で起こった(図5d〜e)。
イノシンと反対側の3’−O−修飾−dTTPの組み込みは、Mn2+イオンの存在を必要とする(図5f〜g)。成功した転化は、図5c、e、g、およびhにおいて太字でマークされている。
イノシンと反対側の3−O−修飾−dTTPの組み込みは、Mn2+イオンの存在下で65℃の温度で、New England BioLabs製のカスタマイズされて操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用して特に高い効率で達成され得る。
第2の工程は、hAAG/Endo VIIIまたはhAAG/化学塩基のいずれかによるポリヌクレオチドの二段階切断を記載する(図6a)。
材料
1.実施例1で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図6(e)の表を参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、41μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.次に、5μlの10×ThermoPol(登録商標)反応緩衝液NEB(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8)を同じエッペンドルフチューブに加えた。
3.各1μlのオリゴヌクレオチド(図6e)、鋳型(配列番号3)または任意の蛍光タグ付きの長オリゴ鎖、Tを有するプライマー(配列番号4)、および対照(配列番号5)をすべて5pmolで同じチューブに加えた。
4.1μlのヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(hAAG)NEB(10単位/μl)を同じチューブに加えた。
5.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
6.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出について、50μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)をカラム膜の中央に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。溶出したDNA濃度を測定し、その後の使用のために−20℃で保存した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
1.2μl(10〜100ng/μl)のDNAを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。
2.40μl(0.2M)のNaOHまたは1.5μlのEndo VIII NEB(10単位/μl)および5μlの10×反応緩衝液NEB(10mMのトリス−HCl、75mMのNaCl、1mMのEDTA、25℃でpH8)も同じチューブに加え、再懸濁して13000rpmで5秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
3.得られた混合物をNaOH処理試料について室温で5分間インキュベートし、その間にEndo VIII反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。
4.インキュベーション時間が経過した後、上記に概説されるような精製プロトコルの工程1〜7を使用して、反応混合物を精製した。
1.5μlのDNAおよびTBE−尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(エッペンドルフ)を使用して2分間95℃まで加熱した。
2.次に、DNA混合物を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲル中のDNAの検出および可視化は、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)で実施した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
ヘルパー鎖によらない切断反応は、切断対未切断DNA比の約7%:93%という低いパーセンテージ収率を示した(図6b〜d)。
第3の工程は、ヘルパー鎖の不在下でのDNAリガーゼとのポリヌクレオチドの連結を記載する。概略図を図7に示す。
材料
1.実施例1で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図7cの表を参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、16μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.次に、10μlの2×Quick Ligation Reaction緩衝液NEB(132mMのトリス−HCl、20mMのMgCl2、2mMのジチオトレイトール、2mMのATP、15%のポリエチレングリコール(PEG6000)および25℃でpH7.6)を同じエッペンドルフチューブに加えた。
3.各1μlのオリゴヌクレオチド(図7c)、TAMRAまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖(配列番号7)、Tを有するプライマー(配列番号8)、およびイノシン鎖(配列番号9)をすべて5pmolで同じチューブに加えた。
4.1μlのQuick T4 DNAリガーゼNEB(400単位/μl)を同じチューブに加えた。
5.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することにより穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で20分間インキュベートした。
6.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を終了させた。
7.上記に記載されるような精製工程1〜7に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop oneをブランクにし、次に、ブランキングの後に工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
5.精製されたDNAをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程5〜8の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
この特定の実施例において、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下で室温(24℃)でのDNAリガーゼ、この特定の場合はクイックT4 DNAリガーゼとのオリゴヌクレオチドの連結は、低減された量の連結生産物をもたらす(図7b)。
この実施例は、4つの工程:ニック部位からの3’−O−修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対側で起こる。この方法は、連結および切断工程の効率を改善するヘルパー鎖を使用する。
第1の工程は、DNAポリメラーゼを使用した酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’−O−保護一塩基の制御された添加を記載する(図8a)。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma−Aldrichから入手した。原液を100μMの濃度で調製した。オリゴヌクレオチドを図8bに示す。
3.3−O−修飾dNTPを組み込む能力が増強された、New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用した。
2種類の可逆的ターミネーターを試験した。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4を、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の10.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
2.0.5μlの10μMプライマー(5pmol、1当量)(配列番号10、図8(b)の表)、0.75μlの10μM鋳型(6pmol、1.5当量)(配列番号11、図8(b)の表)、2μlの10μMのヘルパー鎖(配列番号12、図8(b)の表)を反応混合物に加えた。
3.3’−O−修飾−dTTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を65℃で20分間インキュベートした。
6.TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を停止させた。
7.反応物をポリアクリルアミドゲル(15%)TBE緩衝液上で分離し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
1.5μlの反応混合物を、滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
第2の工程は、hAAG/Endo VIIIまたはhAAG/化学塩基(×2)のいずれかによるポリヌクレオチドの二段階切断を記載する(図9a)。
材料
1.実施例2で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図9fを参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、41μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.5μlの10×ThermoPol(登録商標)反応緩衝液NEB(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8)を同じエッペンドルフチューブに加えた。
3.各1μlのオリゴヌクレオチド(図9f)、鋳型(配列番号13)または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Tを有するプライマー(配列番号14)、対照(配列番号15)、およびヘルパー鎖(配列番号16)をすべて5pmolで同じチューブに加えた。
4.1μlのヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(hAAG)NEB(10単位/μl)を同じチューブに加えた。
5.代替塩基を使用する反応では、1μlのヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(hAAG)NEB(100単位/μl)を加えた。
6.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
7.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出のために、50μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)をカラム膜の中央に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。溶出したDNA濃度を測定し、その後の使用のために−20℃で保存した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
1.2μl(10〜100ng/μl)のDNAを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。
2.40μl(0.2M)のNaOHまたは1.5μlのEndo VIII NEB(10単位/μl)および5μlの10×反応緩衝液NEB(10mMのトリス−HCl、75mMのNaCl、1mMのEDTA、25℃でpH8)も同じチューブに加え、再懸濁して13000rpmで5秒間遠心分離することによって穏やかに混合した。
3.得られた混合物を、0.2MのNaOH処理試料について室温で5分間インキュベートし、その間にEndo VIII反応混合物を37℃で1時間インキュベートした。
4.インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程1〜7を使用して精製した。
1.1μl(10〜100ng/μl)のDNAを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。次に、酢酸溶液シグマ(99.8%)で室温でpH7.4に緩衝化された2μlのN,N’ジメチルエチレンジアミンシグマ(100mM)を同じチューブに加えた。
2.20μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)をチューブに加え、再懸濁して13000rpmで5秒間の遠心分離することによって穏やかに混合した。
3.得られた試料を37℃で20分間インキュベートした。
4.インキュベーション時間が経過した後、反応混合物を上述の精製プロトコルの工程1〜7を使用して精製した。
1.5μlのDNAおよびTBE−尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(エッペンドルフ)を使用して2分間95℃まで加熱した。
2.次に、DNA混合物を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲル中のDNAの検出および可視化は、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)で実施した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
hAAG DNAグリコシラーゼによるユニバーサルヌクレオチド、この場合はイノシンを含む切断部位での切断効率は、ヘルパー鎖の不在下での10%からヘルパー鎖の存在下での50%まで有意に増加した(図9b)。hAAGおよびエンドヌクレアーゼVIIIは、hAAGおよびNaOH(50%)よりも低い効率(10%)でイノシンを切断する。ニックの入ったDNAを使用した記載されるシステムでは、0.2MのNaOHを使用した化学的切断が、エンドヌクレアーゼVIIIよりもAP部位の切断に好ましいことが示された(図9c)。中性pHでの穏やかなN,N’−ジメチルエチレンジアミンは、0.2MのNaOHのような脱塩基部位を切断するのに高い効率を有し、それゆえ、エンドヌクレアーゼVIIIおよびNaOHと比較して好ましい(図9d〜e)。
イノシンを含有するDNAの切断について、3つの方法を評価した。1つの完全酵素法−hAAG/エンドヌクレアーゼVIII、ならびに化学的および酵素的切断を組み合わせた2つの方法−hAAG/NaOHおよびhAAG/ジメチルエチルアミンを、実施例2においてDNA切断について研究した。
第3の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとDNAリガーゼとの連結を記載する。概略図を図10aに示す。
材料
1.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図10dを参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、16μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.次に、10μlの2×Quick Ligation Reaction緩衝液NEB(132mMのトリス−HCl、20mMのMgCl2、2mMのジチオトレイトール、2mMのATP、15%のポリエチレングリコール(PEG6000)および25℃でpH7.6)を同じエッペンドルフチューブに加えた。
3.各1μlのオリゴヌクレオチド(図10d)、TAMRAまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖(配列番号18)、Tを有するプライマー(配列番号19)およびイノシン鎖(配列番号20)およびヘルパー鎖(配列番号21)をすべて5pmolで同じチューブに加えた。
4.1μlのQuick T4 DNAリガーゼNEB(400単位/μl)を同じチューブに加えた。
5.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、20分間室温でインキュベートした。
6.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を終了させた。
7.上記に記載されるような精製工程1〜7に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
5.精製されたDNAをポリアクリルアミドゲルに流し、上記の工程5〜8の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
この特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下では連結活性の低下が観察され(図10b)、ヘルパー鎖の存在下では連結が高い効率で進行し(図10c)、生産物が高効率で形成された。
この実施例は、4つの工程:部分二本鎖DNA上への3’−O−修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、組み込みの第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。
材料および方法
材料
第1の工程は、DNAポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’−O−保護一塩基の制御された添加を記載する(図11a)。
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma−Aldrichから入手した(図11j)。原液を100μMの濃度で調製する。
3.3−O−修飾dNTPを組み込む能力が増強された、New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用した。
すべてのdNTPの3’−O−アジドメチル可逆的ターミネーターを、組み込みについて独立して試験した。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
2.0.5μlの10μMプライマー(5pmol、1当量)(配列番号22、図11j)および0.75μlの10μM鋳型−A/G/T/C(6pmol、1.5当量)(配列番号23〜26、図11j)および1μLの10μMのヘルパー鎖T/C/A/G(10pmol、2当量)(配列番号27〜30、図11j)を反応混合物に加えた。
3.3’−O修飾−dTTP/dCTP/dATP/dGTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を65℃で20分間インキュベートした。
6.TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を停止させた。
7.反応物をポリアクリルアミドゲル(15%)TBE緩衝液上で分離し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
1.5μlの反応混合物を、滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
Therminator IX DNAポリメラーゼを使用した3−O−アジドメチル−dTTPの組み込み時の温度の評価に関して、結果は、連結のためのヘルパー鎖の存在下での3’−O−アジドメチル−dTTPの組み込みが5分後に90%に達することを示す。37℃および47℃で20分後には、10%のプライマーが未伸長のままである。
第2の工程は、エンドヌクレアーゼVによるポリヌクレオチドの一段階切断を記載する(図12a)。
材料
1.実施例3で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図12dの表を参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、41μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.次に、5μlの10×反応緩衝液(登録商標)NEB(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)を同じエッペンドルフチューブに加えた。
3.各1μlのオリゴヌクレオチド(図12d)、鋳型(配列番号31)または任意の蛍光タグ付き長オリゴ鎖、Tを有するプライマー(配列番号32)および対照(配列番号33)およびヘルパー鎖(配列番号34)をすべて5pmolで同じチューブに加えた。
4.1μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(10単位/μl)を同じチューブに加えた。
5.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
6.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出のために、50μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)をカラム膜の中央に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。溶出したDNA濃度を測定し、その後の使用のために−20℃で保存した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
1.5μlのDNAおよびTBE−尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(エッペンドルフ)を使用して2分間95℃まで加熱した。
2.次に、DNA混合物を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲル中のDNAの検出および可視化は、Cy3 LEDを使用してChemidoc MP(BioRad)で実施した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
実施例3からの切断結果は、ヘルパー鎖の存在下または不在下でエンドヌクレアーゼVを用いて有意に高収率の切断DNAを得ることができることを示した(図12c)。
第3の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとDNAリガーゼとの連結を記載する。概略図を図13aに示す。
材料
1.実施例3で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図13bの表を参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、16μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.次に、10μlの2×Quick Ligation Reaction緩衝液NEB(132mMのトリス−HCl、20mMのMgCl2、2mMのジチオスレイトール、2mMのATP、15%のポリエチレングリコール(PEG6000)、25℃でpH7.6)を同じエッペンドルフチューブに加えた。
3.各1μlのオリゴヌクレオチド(図13b)、TAMRAまたは任意の蛍光タグ付きリン酸鎖(配列番号35)、Tを有するプライマー(配列番号36)およびイノシン鎖(配列番号37)およびヘルパー鎖(配列番号38)をすべて5pmolの量を有して同じチューブに加えた。
4.1μlのQuick T4 DNAリガーゼNEB(400単位/μl)を同じチューブに加えた。
5.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で20分間インキュベートした。
6.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を終了させた。
7.上記に記載されるような精製工程1〜7に概説されるプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
5.精製されたDNAをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載される工程5〜8の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
1.5μlのDNAおよびTBE−尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(エッペンドルフ)を使用して2分間95℃まで加熱した。
2.次に、DNA混合物を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲル中のDNAの検出および可視化は、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)で実施した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
Therminator IX DNAポリメラーゼによる3’−O−アジドメチル−dNTPの組み込みによってDNAに導入された3’−O−アジドメチル基を担持するDNAモデルについて、脱保護工程(図14a)を研究した。脱保護をトリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)によって実施し、すべての天然dNTPの混合物を精製された脱保護DNAの溶液に加えたときの伸長反応によってモニターした。
材料
1.実施例3で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図14iを参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
3.酵素は、New England BioLabsから購入した。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)で混合した。
2.1μlの10μMプライマー(10pmol、1当量)(配列番号39、図14i)および1.5μlのいずれかの10μM鋳型−A/G/T/C(15pmol、1.5当量)(配列番号40〜43、図14i)を反応混合物に加えた。
3.3’−O修飾−dTTP/dCTP/dATP/dGTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を37℃で5分間インキュベートした。
6.4μLの試料を取り出し、0.5μlの5mMのdNTP混合物と混合し、制御反応のために10分間反応させた。
7.pH7.4の1Mのトリス緩衝液中の40μLの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
8.20μLの1×Thermopol(登録商標)緩衝液によって溶出するQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
9.1μLの5mMのdNTP混合物および1μLのDeepVent(エキソ)DNAポリメラーゼを精製された反応混合物に加え、10分間反応させた。
10.TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を停止させた。
11.反応物をポリアクリルアミドゲル(15%)TBE緩衝液上で分離し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
50mMのTCEPは、0.2μMのDNAモデル上で3’−O−アジドメチル基を高い効率で切断するのに十分ではなかった(図14h)。対照的に、300mMのTCEPは、0.2μMのDNAモデル上で3’−O−アジドメチル基を95%の効率で首尾よく切断した(図14h)。
この実施例は、2つのヘアピンモデル上での4つの工程:ニック部位からの3’−O−修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接する支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。
第1の工程は、DNAポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’−O−保護一塩基の制御された添加を記載する(図15a)。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma−Aldrichから入手した(図15c)。原液を100μMの濃度で調製した。
3.3−O−修飾dNTPを組み込む能力が増強された、New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用した。
3’−O−アジドメチル−dTTPを組み込みについて試験した。
3’−O−アジドメチル−dTTP:
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4を、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の10.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
2.0.5μlの10μMヘアピンオリゴヌクレオチド(5pmol、1当量)(配列番号44、図15c)を反応混合物に加えた。
3.3’−O−修飾−dTTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を65℃で20分間インキュベートした。
6.TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を停止させた。
7.反応物をポリアクリルアミドゲル(15%)TBE緩衝液上で分離し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
DNAポリメラーゼは、ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対側に3’−O−修飾−dTTPを組み込む。
第2の工程は、この特定の場合におけるエンドヌクレアーゼVによるヘアピンモデルの一段階切断を記載する(図16a)。
材料
1.実施例4で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図16cを参照されたい)。
2.滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、ヘアピンオリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、43μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.次に、5μlの10×反応緩衝液(登録商標)NEB(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)を同じエッペンドルフチューブに加えた。
3.5pmolの量を有する1μlのヘアピンオリゴヌクレオチド(配列番号45、図16c)を同じチューブに加えた。
4.1μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を同じチューブに加えた。
5.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
6.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出のために、50μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)をカラム膜の中央に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。溶出したDNA濃度を測定し、その後の使用のために−20℃で保存した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop Oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
1.5μlのDNAおよびTBE−尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して2分間95℃まで加熱した。
2.次に、DNA混合物を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲル中のDNAの検出および可視化は、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)で実施した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
実施例4からの切断結果は、エンドヌクレアーゼVを用いて37℃で著しく高収率の消化されたヘアピンDNAが得られることを示した(図16b)。
第3の工程は、ヘアピンモデルとDNAリガーゼとの連結を記載する。概略図を図17aに示す。
材料
1.実施例4で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図17cを参照されたい)。
2 滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を使用して、オリゴヌクレオチドを100μMのストック濃度に希釈した。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、1μl(5pmol)のTAMRAまたは任意の蛍光タグ付きリン酸ヘアピンオリゴ(配列番号46)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
2.次に、15μl(100pmol)のイノシン含有ヘアピン構築物(配列番号47)を同じチューブに加え、ピペットで3秒間再懸濁することによって穏やかに混合した。
3.40μlの平滑/TA DNAリガーゼNEB(180単位/μl)を同じチューブに加えた。
4.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で20分間インキュベートした。
5.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を終了させた。
6.上記の精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop Oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
5.精製されたDNAをポリアクリルアミドゲルに流し、上記に記載されるような工程5〜8の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
1.5μlのDNAおよびTBE−尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して2分間95℃まで加熱した。
2.次に、DNA混合物を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲル中のDNAの検出および可視化は、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)で実施した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
ヘルパー鎖の存在下で室温(24℃)での平滑/TA DNAリガーゼとヘアピンオリゴヌクレオチドとの連結は、高収率の連結生産物をもたらした。1分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約85%の比率で、高収率の連結DNA生産物を示した。2分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約85%の比率で、高収率の連結DNA生産物を示した。3分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約85%の割合で、高収率の連結DNA生産物を示した。4分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、>約85%の比率で、高収率の連結DNA生産物を示した(図17b)。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での4つの工程:ニック部位からの3’−O−修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。ヘアピンの一端は付着アンカーとして機能する。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma−Aldrichから入手した(図18c)。原液を100μMの濃度で調製する。
3.3−O−修飾dNTPを組み込む能力が増強された、New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用した。
3’−O−アジドメチル−dTTPを組み込みについて試験した。
3’−O−アジドメチル−dTTP:
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)で混合した。
2.2μlの10μMの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド(20pmol、1当量)(配列番号48、図18c)を反応混合物に加えた。
3.3’−O−修飾−dTTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を37℃で10分間インキュベートした。
6.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物を加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
7.精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
8.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
9.1μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を同じチューブに加えた。
10.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
11.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
12.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、TBE緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル(15%)上で分析し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
13.上記の精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
14.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
15.10μlの連結のための100μMの鎖(1nmol)(配列番号49、図18c)を反応混合物に加えた。
16.40μlの平滑/TA DNAリガーゼNEB(180単位/μl)を精製されたDNA試料に加えた。
17.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で20分間インキュベートした。
18.pH7.4の1Mのトリス緩衝液中の40μLの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
19.20μLの1×Thermopol(登録商標)緩衝液によって溶出するQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop Oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
5.精製されたDNAをポリアクリルアミドゲルに流し、第2節の工程5〜8の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出のために、反応のための20μlの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。溶出したDNA濃度を測定し、その後の使用のために−20℃で保存した。
DNAポリメラーゼは、二重ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対側に3’−O−修飾−dTTPを組み込む(図18b)。
この実施例は、単一ヘアピンモデル上での4つの工程:ニック部位からの3’−O−修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、天然に相補的な塩基と反対側で起こる。DNA合成は、その過程においてヘルパー鎖を使用する。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichから入手した(図19b)。原液を100μMの濃度で調製する。
3.3−O−修飾dNTPを組み込む能力が増強された、New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用した。
3’−O−アジドメチル−dTTPを組み込みについて試験した。
3’−O−アジドメチル−dTTP:
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)で混合した。
2.2μLの10μMの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド(20pmol、1当量)(配列番号50、図19b)およびヘルパー鎖(30pmol、1.5当量)(配列番号51、図19b)を反応混合物に加えた。
3.3’−O修飾−dTTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を37℃で10分間インキュベートした。
6.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物を加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
7.上記の精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
8.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
9.1μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を同じチューブに加えた。
10.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
11.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
12.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、TBE緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル(15%)上で分析し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
13.上記の精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
14.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
15.10μlの連結のための100μMの鎖(1nmol)(配列番号52、図19b)および10μlの連結のための100μMのヘルパー鎖(1nmol)(配列番号53、図19b)を反応混合物に加えた。
16.40μlの平滑/TA DNAリガーゼNEB(180単位/μl)を同じチューブに加えた。
17.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で20分間インキュベートした。
18.pH7.4の1Mのトリス緩衝液中の40μLの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
19.20μLの1×NEB Thermopol(登録商標)緩衝液によって溶出するQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
20.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を終了させた。
1.5μlの反応混合物を、滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop Oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
5.精製されたDNAをポリアクリルアミドゲルに流し、工程5〜8において上記した手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出のために、反応のための20μlの適切な緩衝液をカラム膜の中央に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。溶出したDNA濃度を測定し、その後の使用のために−20℃で保存した。
この実施例は、二重ヘアピン構築物モデルについての4つの工程:ニック部位からの3’−O−修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシン塩基と反対側で起こる。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma−Aldrichから入手した(図20b)。原液を100μMの濃度で調製する。
3.New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼは、3−O−修飾dNTPを組み込む能力を高めた。
3’−O−アジドメチル−dTTPを組み込みについて試験した。
3’−O−アジドメチル−dTTP:
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)で混合した。
2.2μlの10μMの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド(20pmol、1当量)(配列番号54、図20b)を反応混合物に加えた。
3.3’−O−修飾−dTTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を37℃で10分間インキュベートした。
6.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物を加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
7.精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
8.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
9.1μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を同じチューブに加えた。
10.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
11.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
12.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、TBE緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル(15%)上で分析し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
13.上記の精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
14.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
15.10μlの連結のための100μMの鎖(1nmol)(配列番号55、図20b)を反応混合物に加えた。
16.40μlの平滑/TA DNAリガーゼNEB(180単位/μl)を同じチューブに加えた。
17.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で20分間インキュベートした。
18.pH7.4の1Mのトリス緩衝液中の40μLの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
19.20μLの1×NEB Thermopol(登録商標)緩衝液によって溶出するQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
20.典型的には、インキュベーション時間が経過した後、TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を終了させた。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aで電気泳動を行った。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop Oneをブランクにした。次に、ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
5.精製されたDNAをポリアクリルアミドゲルに流し、第2節の工程5〜8の手順に従って可視化した。条件または試薬に変更はなかった。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出のために、反応のための20μlの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。溶出したDNA濃度を測定し、その後の使用のために−20℃で保存した。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上で4つの工程:ニック部位からの3’−O−修飾dNTPの組み込み、脱保護、切断、および連結を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な2サイクル実験を記載しており、第1の工程は、相補的塩基と反対側で起こる。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma−Aldrichから入手した(図21d)。原液を100μMの濃度で調製する。
3.New England BioLabsによって操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼは、3’−O−修飾dNTPを組み込む能力を高めた。
3’−O−アジドメチル−dTTPおよび3’−O−アジドメチル−dCTPを組み込みのために使用した。
第1のサイクル:
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)で混合した。
2.2μlの10μMの二重ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド(20pmol、1当量)(配列番号56、図21d)を反応混合物に加えた。
3.3’−O−修飾−dTTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
4.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
5.反応物を37℃で10分間インキュベートした。
6.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物を加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
7.pH=7.4の1Mのトリス緩衝液中の40μlの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
8.精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
9.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
10.1μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を同じチューブに加えた。
11.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
12.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
13.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、TBE緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル(15%)上で分析し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
14.精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、QIAGENヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
15.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
16.10μlの連結のための100μMの鎖(1nmol)(配列番号57、図21d)を反応混合物に加えた。
17.40μlの平滑/TA DNAリガーゼNEB(180単位/μl)を同じチューブに加えた。
18.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で20分間インキュベートした。
19.精製工程1〜5に概説されたプロトコルを使用して、ストレプトアビジン磁気ビーズキットによって、反応混合物を精製した。
20.非連結オリゴヌクレオチドをラムダエキソヌクレアーゼによって消化した。
21.精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、QIAGENヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
22.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第2のサイクル:
23.3’−O−修飾−dCTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
24.次に、1.5μlのTherminator IX DNAポリメラーゼ(15U、New England BioLabs)を加えた。
25.反応物を37℃で10分間インキュベートした。
26.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物を加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
27.pH=7.4の1Mのトリス緩衝液中の40μlの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
28.精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
29.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
30.1μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を同じチューブに加えた。
31.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、37℃で1時間インキュベートした。
32.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
33.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、TBE緩衝液を使用してポリアクリルアミドゲル(15%)上で分析し、ChemiDoc MP撮像システム(BioRad)によって可視化した。
34.精製工程1〜7に概説されたプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
35.20μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
36.10μlの連結のための100μMの鎖(1nmol)(配列番号58、図21d)を反応混合物に加えた。
37.40μlの平滑/TA DNAリガーゼNEB(180単位/μl)を同じチューブに加えた。
38.次に、反応混合物をピペットで再懸濁することによって穏やかに混合し、5秒間13,000rpmで遠心分離し、室温で10分間インキュベートした。
39.インキュベーション時間が経過した後、TBE−尿素試料緩衝液(Novex)を加えて反応を終了させた。
1.5μlの反応混合物を、滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE−尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して5分間95℃まで加熱した。
2.次に、5μlの試料を、予熱した1×TBE緩衝液Thermo Scientific(89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA)を含有する15%のTBE−尿素ゲル1.0mm×10ウェル(Invitrogen)のウェルに入れた。
3.X−cell sure lockモジュール(Novex)を適所に固定し、以下の条件、室温で40分間、260V、90Aを適用することによって、電気泳動に供した。
4.ゲルを、Cy3 LEDを使用してChemiDoc MP(BioRad)によって可視化した。可視化および分析は、Image lab 2.0プラットフォーム上で実施した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
2.平衡化の後、糸くずの出ないレンズ洗浄用ティッシュ(Whatman)を使用して、水をやさしく拭き取った。
3.2μlの緩衝液EB QIAGEN(10mMのトリス.CL、pH8.5)を加えることによって、NanoDrop Oneをブランクにした。ブランキングの後に、工程2を繰り返した。
4.2μlの試料を台座に加え、タッチスクリーン上の測定アイコンを選択することによって、DNA濃度を測定した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
2.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
3.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
4.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
5.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
6.DNA溶出のために、反応のための20μlの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で1分間放置した。
7.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。
1.200μlの結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)によって、100μlのストレプトアビジン磁気ビーズ(New England BioLabs)を3回洗浄した。
2.連結工程後の反応混合物を10容量の結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に20℃で15分間インキュベートする。
3.200μlの結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを3回洗浄した。
4.脱イオン水によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを3回洗浄した。
5.95℃で3分間加熱することによる40μlの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での5つの工程:ニック部位からの3’−O−修飾dNTPの組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な3サイクル実験を記載しており、第1の工程は、相補的塩基と反対側で起こる。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis,Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’−O−修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template−Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
2.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Integrated DNA Technologies,Sigma−Aldrichから入手した(図29)。原液を100μMの濃度で調製する。
3.3−O−修飾dNTPを組み込む能力が増強された、New England BioLabsによって操作されたTherminator X DNAポリメラーゼを使用した。代替的に、任意のDNAポリメラーゼまたは修飾dNTPを組み込むことができる他の酵素を使用することができる。
3’−O−アジドメチル−dTTPを組み込みのために使用した。
第1のサイクル:
1.20μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)およびMnCl2溶液(10μlの40mM)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の139μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
2.20μlの100μMの単一ヘアピンモデルオリゴヌクレオチド(2nmol、1当量)(配列番号59、図29)を反応混合物に加えた。
3.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを追加し、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
4.3’−O−修飾−dTTP(10μlの2mM)を加えた。
5.次に、5μlのTherminator X DNAポリメラーゼ(50U、New England BioLabs)を加えた。しかしながら、修飾dNTPを組み込むことができる任意のDNAポリメラーゼまたは他の酵素を使用することができる。
6.反応物を37℃で30分間インキュベートした。
7.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
8.200μlのTE緩衝液によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
9.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを追加し、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
10.400μLの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
11.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
12.150μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
13.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを追加し、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
14.5μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を溶出液に加え、37℃で30分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
15.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
16.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
17.精製工程66〜72に概説されたプロトコルを使用して、QIAGENヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
18.100μlのT3 DNAリガーゼ緩衝液(2倍濃縮物)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
19.20μlの連結のための100μMのイノシン鎖(2nmol)および20μlの連結のための100μMのヘルパー鎖(2nmol)(配列番号60、51、図29)、ならびに40μlの水を反応物に加えた。
20.20μlのT3 DNAリガーゼNEB(3000単位/μl)を同じチューブに加え(これは任意のDNA連結酵素を含み得る)、室温で30分間インキュベートした。
精製工程73〜78に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
21.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
22.100μlのTE緩衝液によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第2のサイクル:
23.15μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)、MnCl2溶液(7.5μlの40mM)、および19μlの脱イオン水を加えた。
24.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
25.3’−O−修飾−dTTP(7.5μlの2mM)を加えた。
26.次に、5μlのTherminator X DNAポリメラーゼ(50U、New England BioLabs)を加えた。修飾dNTPを組み込むことができる任意のDNAポリメラーゼを使用することができる。
27.反応物を37℃で30分間インキュベートした。
28.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
29.100μlのTE緩衝液によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
30.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
31.200μLの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
32.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
33.100μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
34.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを追加し、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
35.5μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を溶出液に加え、37℃で30分間インキュベートした。任意の好適な代替エンドヌクレアーゼを使用することができる。
36.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
37.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
38.精製工程66〜72に概説されたプロトコルを使用して、QIAGENヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
39.60μlのT3 DNAリガーゼ緩衝液(2倍濃縮物)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
40.20μlの連結のための100μMのイノシン鎖(2nmol)および20μlの連結のための100μMのヘルパー鎖(2nmol)(配列番号60、51、図29)、ならびに10μlの脱イオン水を反応混合物に加えた。
41.10μlのT3 DNAリガーゼNEB(3000単位/μl)を同じチューブに加え、室温で30分間インキュベートした。任意の好適なDNAリガーゼを使用することができる。
42.精製工程73〜78に概説された変性工程を含むストレプトアビジン磁気ビーズキットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
43.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットのためのプロトコルを使用して、反応混合物を精製した。
44.46μlのTE緩衝液によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
第3のサイクル:
45.6μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス−HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のトリトン(登録商標)X−100、pH8.8、New England Biolabs)、MnCl2溶液(3μlの40mM)を加えた。
46.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
47.3’−O−修飾−dTTP(6μlの200μM)を加えた。
48.次に、3μlのTherminator X DNAポリメラーゼ(30U、New England BioLabs)を加えた。修飾dNTPを組み込むことができる任意のDNAポリメラーゼまたは他の好適な酵素を使用することができる。
49.反応物を37℃で30分間インキュベートした。
50.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
51.50μlのTE緩衝液によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
52.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを追加し、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
53.100μLの500mMのTCEPを反応混合物に加え、37℃で10分間反応させた。
54.精製工程66〜72に概説されたQIAGENヌクレオチド除去キットを使用して、反応混合物を精製した。
55.49μlのNEB反応緩衝液(登録商標)(50mMの酢酸カリウム、20mMのトリス−酢酸、10mMの酢酸マグネシウム、1mMのDTT、25℃でpH7.9)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
56.アリコート(4μl)を反応混合物から取り出し、0.5μlの天然dNTP混合物(4mM)および0.5μlのBst DNAポリメラーゼならびに0.5μlのSulfolobus DNAポリメラーゼIVを加え、10分間反応させた。ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
57.5μlのヒトエンドヌクレアーゼV(Endo V)NEB(30単位/μl)を溶出液に加え、37℃で30分間インキュベートした。代替的に、任意の好適なエンドヌクレアーゼを使用することができる。
58.インキュベーション時間が経過した後、酵素的熱不活性化(すなわち、65℃で20分間)によって反応を終了させた。
59.アリコート(5μl)を反応混合物から取り出し、ポリアクリルアミドゲル上で分析した。
60.精製工程66〜72に概説されたプロトコルを使用して、QIAGENヌクレオチド除去キットによって、反応混合物を精製した。
61.30μlのT3 DNAリガーゼ緩衝液(2倍濃縮物)によって、DNA試料を清浄なエッペンドルフチューブに溶出した。
62.10μlの連結のための100μMのイノシン鎖(2nmol)、10μlの連結のための100μMのヘルパー鎖(2nmol)(配列番号60、51、図29)、および5μlの水を反応混合物に加えた。
63.5μlのT3 DNAリガーゼNEB(3000単位/μl)を同じチューブに加えた。(これは任意のDNA連結酵素を含み得)、室温で30分間インキュベートした。
64.ゲル電気泳動によって反応物を分析した。
65.10容量の緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
66.混合物をQIAquickスピンカラム(QIAGEN)に移し、6000rpmで1分間遠心分離した。
67.遠心分離後、フロースルーを廃棄し、750μlの緩衝液PE QIAGEN(10mMのトリス−HCl、pH7.5および80%のエタノール)をスピンカラムに加え、6000rpmで1分間遠心分離した。
68.フロースルーを廃棄し、スピンカラムを13000rpmでさらに1分間遠心分離して、残留PE緩衝液を除去した。
69.次に、スピンカラムを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに入れた。
70.DNA溶出のために、反応のための20〜200μlの適切な緩衝液をカラム膜の中心に加え、室温で1分間放置した。
71.次に、チューブを13000rpmで1分間遠心分離した。
72.200μlの結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)によって、100μlのストレプトアビジン磁気ビーズ(New England BioLabs)を3回洗浄した。
73.連結工程後の反応混合物を10容量の結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)と混合し、ストレプトアビジン磁気ビーズと共に20℃で15分間インキュベートさせた。
74.200μlの結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)によって、ストレプトアビジン磁気ビーズを3回洗浄した。
75.ヘルパー鎖を除去するために、ストレプトアビジン磁気ビーズを200μlの結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)中で80℃まで加熱し、磁石にかけ、上清を迅速に廃棄した。
76.脱イオン水を用いて、ストレプトアビジン磁気ビーズを3回洗浄した。
77.95℃で3分間加熱することによる50〜100μlの脱イオン水によって、オリゴヌクレオチドを溶出した。
図30は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全3サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲルを図示する。示されている結果は、本発明の例示的な方法を使用した3つの完全合成サイクルの実行を実証している。
この実施例は、N−(5−ブロモアセトアミジルペンチル)アクリルアミド(BRAPA)を使用したポリアクリルアミド表面上のブロモアセチル基の提示、およびその後のブロモアセチル基へのそれらの共有結合によるチオール化分子の表面固定化を記載する。
顕微鏡用スライドガラスおよびカバーガラスを、アセトン、エタノール、および水中でそれぞれ10分間ずつ順次超音波処理することによって洗浄し、アルゴンで乾燥させた。清浄なガラス製のカバーガラスを、ポリスチレン製ペトリ皿中で気相でトリクロロ(1H、1H、2H、2H−ペルフルオロオクチル)シランでシラン化し、エタノール中で2回超音波処理し、Arで乾燥させた(以後、「フッ素化カバーガラス」)。顕微鏡用スライドガラス上で、4%アクリルアミド/N,N’−メチレンビスアクリルアミド(19:1)溶液を、100μlの10%(w/v)過硫酸アンモニウム(APS)、10μlのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)と混合し、0、0.1、0.2、および0.3%(w/v)でN−(5−ブロモアセトアミジルペンチル)アクリルアミド(BRAPA)を添加し、直径4mmのゴム製ガスケットに素早く分配し、続いてアクリルアミド溶液に向かって面するフッ素化側を含むフッ素化カバーガラスで挟み、10分間重合した。10分後、表面を脱イオン水に浸し、合計4時間浸したままにし、その間にフッ素化カバーガラスを注意深く取り除いた。重合されたポリアクリルアミド表面をアルゴンで乾燥させた。
図31は蛍光シグナルを示し、図32は、FITC−PEG−SHおよびFITC−PEG−COOHに曝露された異なる量のBRAPAを添加したポリアクリルアミドゲル表面から測定された蛍光を示す。フルオレセインの固定化は、カルボキシル化フルオレセインのゼロに近い非特異的吸着を伴って、BRAPAおよびチオール化フルオレセインのみを添加したポリアクリルアミド表面でのみ成功した。
この実施例は以下を記載する。
(1)薄いポリアクリルアミド表面上にブロモアセチル基を提示する方法、
(2)チオリン酸官能化ヘアピンDNAのリンカーを有するか、または有しない共有結合を介したヘアピンDNAのその後の固定化、および
(3)ヘアピンDNAへの2’−デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の組み込み。
材料および方法
最初に、顕微鏡用スライドガラスを、純粋なDecon 90(30分)、水(30分)、1MのNaOH(15分)、水(30分)、0.1MのHCl(15分)、水(30分)中で超音波処理によって洗浄し、最後にアルゴンで乾燥させた。
材料および方法
直径4mmの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、BRAPA修飾表面およびBRAPA制御表面上に置いて固定した。最初に、表面をリン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH7)で10分間下塗りした。続いて緩衝液を除去し、表面を、それぞれ1μMの濃度の6個の単一のチオリン酸で修飾されたリンカーを含み、かつ含まない5’−蛍光標識された(Alexa 647)ヘアピンDNAオリゴマーに曝露し、暗所で1時間インキュベートした。対照として、リンカーを有するおよび有しないが、チオリン酸を有しないDNAオリゴマーと共に、BRAPA修飾表面をインキュベートした(この実施例では、以後「オリゴマー制御表面」と呼ばれる)。インキュベーション後、リン酸ナトリウム(100mM、pH7)、続いてトリス−EDTA緩衝液(10mMのトリス、10mMのEDTA、pH8)で表面をすすぎ、最後に水ですすいだ。任意の非特異的に吸着されたDNAオリゴマーを除去するために、続いて1Mの塩化ナトリウムおよび0.05%(v/v)のTween20を含有する水で表面を洗浄し、水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。Alexa 647チャネルのChemiDoc撮像装置上で表面をスキャンした。
結果を図34および35に示す。図34は、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンDNAオリゴマーから生じるが、BRAPAまたはオリゴマー対照からは生じない蛍光シグナルを示す。
DNAからの蛍光シグナルは、BRAPAを添加したBRAPA修飾表面からのみ顕著に存在し、チオリン酸官能基を介した表面へのDNAの共有結合の成功を示している。リンカーを有しないDNAと比較して、リンカーを有するDNAから、均一かつより高いシグナルが得られた。
材料および方法
直径9mmの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、リンカーを有するDNAオリゴマーで固定化されたBRAPA修飾表面上に置き、組み込み緩衝液(50mMのトリス、pH8、1mMのEDTA、6mMのMgSO4、0.05%のtween20、および2mMのMnCl2)で10分間下塗りした。続いて表面を、DNAポリメラーゼ(0.5U/μlのTherminator X DNAポリメラーゼ)および三リン酸(20μMのAlexa 488標識dUTP)を含有する組み込み緩衝液に曝露し、1時間インキュベートした(この実施例では、以後「ポリメラーゼ表面」と呼ばれる)。陰性対照として、追加の表面の組も、Therminator X DNAポリメラーゼを含まない組み込み緩衝液に1時間曝露した(この実施例では、以後「陰性表面」と呼ばれる)。1時間後、両方の種類の試料を水中で洗浄し、続いて1Mの塩化ナトリウムおよび0.05%(v/v)のTween20を含有する水にさらし、再び水で洗浄した。表面からの蛍光シグナルを、Alexa 647およびAlexa 488チャネルのChemiDocを使用して測定し、ヘアピンDNAの存在(Alexa 647)およびdUTPの組み込み(Alexa 488)の両方をモニターした。
図36は、Alexa 488標識dUTPの組み込み前および後のAlexa 647およびAlexa 488チャネルから検出された蛍光シグナルを示す。組み込み前および後のAlexa 647からの不変の陽性シグナルは、表面固定化ヘアピンDNAが組み込み反応中に安定的であることを示し、Alexa 488からの陽性シグナルは、ポリメラーゼの存在によってのみ、dUTPの組み込みの成功を示す、組み込み反応後のポリメラーゼ表面からのみ観察された。
結果は、本発明の方法において使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応と適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。結果はさらに、そのような分子が、合成鎖を伸長させるために新たなdNTPの組み込みを許容し得ると同時に、分子が安定的で、基質に付着したままであることを実証する。
この実施例は、リンカーを有するチオリン酸官能化ヘアピンDNAの誘導体化表面への共有結合、その後の切断および連結反応を記載する。基質調製およびヘアピンDNAの結合を、実施例11に記載されるように実施した。
材料および方法
実施例11に記載されるような表面BRAPA修飾表面上に、ヘアピンDNAを固定化した。切断および連結反応のためのすべての実験対照を含む4組の三重表面を調製した。実験条件を図38aに記載した。図38bは、異なる試料に固定化されたヘアピンDNAの配列を示す。
図39は、切断反応前および後のヘアピンDNAオリゴマーからの蛍光シグナルを示す。
材料および方法
(1)に記載されるような切断反応の後、試料AおよびB(図38aに記載されるような)を、試料AについてはT3 DNAリガーゼ(250U/μl)を用い、試料Bについては陰性対照としてT3 DNAリガーゼを用いずに、MnCl2を含有する1×T3 DNAリガーゼ緩衝液(2mM)、5′末端でAlexa 647で標識されたイノシン鎖(16μM)、および相補的「ヘルパー」鎖(16μM)(配列を下記の図41に示す)に曝露した。試料をそれぞれの溶液中で1時間インキュベートした。1時間後、表面を水中で洗浄し、続いて1Mの塩化ナトリウムおよび0.05%(v/v)のTween20を含有する水にさらし、再び水で洗浄した。Alexa 647チャネルのChemiDocを使用して、表面からの蛍光シグナルを測定した。図41は、連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖についての配列を示す。
図42は、連結反応のモニタリングに関する結果を示す。連結反応の前および後に、Alexa 647チャネルから検出された蛍光シグナル。連結後のAlexa 647チャネルにおける蛍光シグナルの増加は、T3 DNAリガーゼを有する試料Aからのみ得られたが、T3 DNAリガーゼの不在のため、試料Bについては連結反応後、蛍光シグナルは同じレベルのままであった。
この実施例の結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化でき、同時に安定的で基質に付着したままでありながら、切断および連結に曝露され得ることを実証する。
Claims (89)
- 所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、第1の鎖が前記所定の配列のヌクレオチドの組み込みによって伸長され、前記第1の鎖にハイブリダイズされた第2の鎖がヌクレオチドの組み込みによって伸長され、それによって前記第1の鎖の前記組み込まれたヌクレオチドとヌクレオチド対を形成する、方法。
- 各サイクルが、前記所定の配列の前記ヌクレオチドを付着した可逆的ブロッキング基と一緒に組み込むことによって前記第1の鎖を伸長させ、続いて前記第2の鎖を伸長させることを含み、前記可逆的ブロッキング基が、前記第2の鎖が伸長される前または後に除去される、請求項1に記載の方法。
- 各サイクルにおいて、前記ヌクレオチドが足場ポリヌクレオチドに組み込まれる、請求項1または2に記載の方法。
- 各サイクルが、
(1)足場ポリヌクレオチドを提供することと、
(2)前記所定の配列のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドに組み込むことであって、前記ヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
(3)前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することと、
(4)連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが前記所定の配列の前記ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを含み、連結時に、前記所定の配列の前記ヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
(5)前記所定の配列の前記ヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、請求項3に記載の方法。 - 工程(1)が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がプライマー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含み、工程(3)が、前記足場ヌクレオチドを切断部位で切断することを含み、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含み、工程(4)において、前記連結ポリヌクレオチドが、次のサイクルで使用するための切断部位を定義するユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖を含み、前記連結ポリヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖に連結される、請求項4に記載の方法。
- 前記方法が、
(1)合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、一本鎖切断によって分離されたプライマー鎖部分およびヘルパー鎖部分を含み、前記支持鎖がユニバーサルヌクレオチドを含む、提供することと、
(2)前記所定の配列の1番目のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記合成鎖に組み込むことであって、前記1番目のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
(3)前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記1番目のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
(4)二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記1番目のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
(5)前記1番目のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
(6)前記所定のヌクレオチド配列の隣のヌクレオチドを、ポリメラーゼの作用によって前記足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖に組み込むことであって、前記隣のヌクレオチドが、ポリメラーゼによるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、組み込むことと、
(7)前記足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、前記部位が、前記支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義され、切断が、前記支持鎖を切断すること、および前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記合成鎖中に前記隣のヌクレオチドを含む突出末端を提供することを含む、切断することと、
(8)二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記連結ポリヌクレオチドが、支持鎖、ヘルパー鎖、および相補的連結末端を含み、前記連結末端が、ユニバーサルヌクレオチド、および前記ヘルパー鎖に突出した前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドを前記支持鎖中に含み、かつリン酸基を欠く末端ヌクレオチドを前記ヘルパー鎖中に含み、前記支持鎖の連結時に、前記隣のヌクレオチドが前記パートナーヌクレオチドと対合する、連結することと、
(9)前記隣のヌクレオチドから前記ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6〜9を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、請求項4または5に記載の方法。 - 所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、(a)工程1および6における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置nを占め、位置nが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ(b)工程4および8における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置nを占め、位置nが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置n−1が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向/前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程3および7における位置nとn−1との間で切断される、請求項5または6に記載の方法。
- 所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、(a)工程1および6における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置n+1を占め、位置nが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ(b)工程4および8における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置n+1を占め、位置nが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置n−1が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向/前記プライマー鎖に対して近位方向において位置nに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置n+1が、前記ヘルパー鎖に対して近位方向/前記プライマー鎖に対して遠位方向において位置nに対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程3および7における位置nとn−1との間で切断される、請求項5または6に記載の方法。
- 所与の合成サイクルにおいて、前記ユニバーサルヌクレオチドが、(a)工程1および6における前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置nを占め、位置nが、そのサイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記ヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、かつ(b)工程4および8における前記連結ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の位置nを占め、位置nが、次の合成サイクルに組み込まれたときに前記所定の配列の前記隣のヌクレオチドによって占められることになる前記合成鎖中の位置と反対側の前記支持鎖中の前記ヌクレオチド位置であり、位置n−1が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向/前記プライマー鎖に対して近位方向において前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、位置n−2が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向/前記プライマー鎖に対して近位方向において位置n−1に対する前記支持鎖中の前記隣のヌクレオチド位置であり、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、工程3および7における位置n−1とn−2との間で切断される、請求項5または6に記載の方法。
- a)工程(1)/(6)において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され(位置n)、
b)工程(2)/(6)において、前記1番目の/隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記1番目の/隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、前記支持鎖が、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置(位置n)と、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチド位置の隣の前記ヌクレオチド(位置n−1、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向/前記プライマー鎖に対して近位方向において)との間の位置で切断され、切断が、前記支持鎖に突出した前記1番目の/隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を生成し、
d)工程(4)/(8)において、前記連結ポリヌクレオチドの連結末端が、一塩基突出を含み、
i.前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ(位置n)、それと対合され、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドの隣に位置付けられ、
iii.前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド(位置n−1)が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)/(6)の前記1番目の/隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、請求項6または7に記載の方法。 - a)工程(1)において、前記足場ポリヌクレオチドが、工程(2)の前記1番目のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであるヌクレオチド(位置n)を有する前記支持鎖中に提供され、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドの隣に位置付けられ(位置n+1、前記ヘルパー鎖に対して近位方向/前記プライマー鎖に対して遠位方向において)、
b)工程(2)/(6)において、前記1番目の/隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記パートナーヌクレオチドと反対側の位置(位置n)で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記1番目の/隣のヌクレオチドが、前記パートナーヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向/前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドから前記1番目のヌクレオチド(位置n)と2番目のヌクレオチド(位置n−1)との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記1番目の/隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に一塩基突出を作成し、
d)工程(4)/(8)において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が一塩基突出を含み、
i.前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドと反対側に位置付けられ(位置n+1)、それと対合され、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ(位置n)、
iii.前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチド(位置n)が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合され、次の合成サイクルの工程(6)において前記隣のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
iv.前記支持鎖の前記末端ヌクレオチド(位置n−1)が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)の前記1番目のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであるか、または現在の合成サイクルの工程(6)の新たに組み込まれたヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドである、請求項6または8に記載の方法。 - a)工程(1)/(6)において、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記一本鎖切断に隣接する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ、それと対合され(位置n)、
b)工程(2)/(6)において、前記1番目の/隣のヌクレオチドが、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドと反対側の位置で前記合成鎖に組み込まれ、そのときに前記1番目の/隣のヌクレオチドが前記ユニバーサルヌクレオチドと対合し、
c)工程(3)/(7)において、前記支持鎖が、前記ヘルパー鎖に対して遠位方向/前記プライマー鎖に対して近位方向において、前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドからの前記1番目のヌクレオチド(位置n−1)と前記2番目のヌクレオチド(位置n−2)との間の位置で切断され、切断が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、前記支持鎖に突出した前記1番目の/隣のヌクレオチドを含む前記足場ポリヌクレオチド中に二塩基突出を作成し、
d)工程(4)/(8)において、前記連結ポリヌクレオチドの前記相補的連結末端が、二塩基突出を含み、
i.前記支持鎖中の前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと反対側に位置付けられ(位置n)、それと対合され、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドの隣に位置付けられ、
iii.前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチド(位置n−1)が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、工程(2)/(6)における前記1番目の/隣のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドである、請求項6または9に記載の方法。 - 前記所定の配列の1番目の/隣のヌクレオチドと対合するヌクレオチドが、前記1番目の/隣のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(1)および/または(6)が、合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖とを含む足場ポリヌクレオチドを提供することを含み、前記合成鎖がヘルパー鎖なしで提供される、請求項6〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 任意の1つ以上の合成サイクルにおいて、またはすべての合成サイクルにおいて、前記二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程の後で、かつ前記所定のヌクレオチド配列の前記隣のヌクレオチドを前記足場ヌクレオチドの前記合成鎖に組み込む工程の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、請求項6〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、(i)前記足場ポリヌクレオチドを約80℃〜約95℃の温度に加熱し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、(ii)前記足場ポリヌクレオチドを8M尿素などの尿素溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、(iii)100%ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で前記足場ポリヌクレオチドを処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、または(iv)前記足場ポリヌクレオチドを、前記ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させ、それによって前記ヘルパー鎖部分と前記足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害すること、によって前記足場ポリヌクレオチドから除去される、請求項15に記載の方法。
- 各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、よって脱塩基部位を形成することを含む第1の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第2の工程と、を含む、請求項4〜7、10および13〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、請求項17に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド除去酵素が、3−メチルアデニンDNAグリコシラーゼ酵素である、請求項18に記載の方法。
- 前記ヌクレオチド除去酵素が、ヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(hAAG)である、請求項19に記載の方法。
- 前記第2の工程が、塩基である化学物質を用いて行われる、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩基が、NaOHである、請求項21に記載の方法。
- 前記第2の工程が、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われる、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有機化学物質が、N,N’−ジメチルエチレンジアミンである、請求項23に記載の方法。
- 前記第2の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われる、請求項17〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、エンドヌクレアーゼVIIIである、請求項25に記載の方法。
- 前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、請求項4および13〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、前記ユニバーサルヌクレオチドの隣にある前記ヌクレオチドの後の前記支持鎖を切断し、それによって前記1番目の/隣のヌクレオチドを含む前記合成鎖中に前記突出末端を作成する、請求項27に記載の方法。
- 前記酵素がエンドヌクレアーゼVである、請求項28に記載の方法。
- 前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖がDNA鎖である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成鎖および前記支持鎖がDNA鎖である、請求項5〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 組み込まれたヌクレオチドがdNTPである、請求項30または31に記載の方法。
- 組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むdNTPである、請求項32に記載の方法。
- 可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの1つ以上が、3’−O−アリル−dNTPである、請求項33に記載の方法。
- 可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの1つ以上が、3’−O−アジドメチル−dNTPである、請求項33に記載の方法。
- 前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖がDNA鎖であり、前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの第2の鎖がRNA鎖である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記合成鎖がRNA鎖であり、前記支持鎖がDNA鎖である、請求項1〜29および36のいずれか一項に記載の方法。
- 組み込まれたヌクレオチドがNTPである、請求項37に記載の方法。
- 組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むNTPである、請求項38に記載の方法。
- 可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、3’−O−アリル−NTPである、請求項39に記載の方法。
- 可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、3’−O−アジドメチル−NTPである、請求項39に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、DNAポリメラーゼ、好ましくは未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むdNTPを組み込む能力が増強された修飾DNAポリメラーゼである、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、Thermococcus種9°N、好ましくは種9°N−7由来の天然DNAポリメラーゼの変異体である、請求項42に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼが、T3またはT7 RNAポリメラーゼなどのRNAポリメラーゼ、任意選択的に、未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むNTPを組み込む能力が増強された修飾RNAポリメラーゼである、請求項1〜29および36〜41のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1番目の/隣のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する工程が、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を用いて行われる、請求項3〜44のいずれか一項に記載の方法。
- 二本鎖連結ポリヌクレオチドを前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結する工程が、リガーゼ酵素を用いて行われる、請求項3〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リガーゼ酵素が、T3 DNAリガーゼまたはT4 DNAリガーゼである、請求項46に記載の方法。
- 工程(1)および/または(6)において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、請求項3〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(1)において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、請求項3〜47のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(1)および/または(6)において、
a)前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続され、
b)前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続されている、請求項3〜47のいずれか一項に記載の方法。 - 前記連結ポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループを含む単一分子として提供される、請求項3〜50のいずれか一項に記載の方法。
- 各合成サイクルの前記連結ポリヌクレオチドが、前記突出末端と反対側の末端で前記支持鎖と前記ヘルパー鎖とを接続するヘアピンループをそれぞれ含む単一分子として提供される、請求項3〜51のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(1)において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが共通の表面に繋留されている、請求項3〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがそれぞれ切断可能なリンカーを含み、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、請求項53に記載の方法。
- 工程(1)において、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とがヘアピンループによって接続され、前記ヘアピンループが表面に繋留されている、請求項3〜52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ヘアピンループが切断可能なリンカーを介して表面に繋留され、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、請求項55に記載の方法。
- 前記切断可能なリンカーがUV切断可能なリンカーである、請求項54または56に記載の方法。
- 前記表面が微粒子である、請求項53〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面が平坦な表面である、請求項53〜57のいずれか一項に記載の方法。
- 前記表面がゲルを含む、請求項59に記載の方法。
- 前記表面が、約2%のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは前記ポリアクリルアミド表面がガラスなどの固体支持体に結合されている、請求項60に記載の方法。
- 前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、1つ以上の共有結合を介して前記共通の表面に繋留されている、請求項53〜61のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と前記足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、請求項62に記載の方法。
- 前記共通の表面上の前記官能基がブロモアセチル基であり、任意選択的に前記ブロモアセチル基が、N−(5−ブロモアセトアミジルペンチル)アクリルアミド(BRAPA)を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、請求項63に記載の方法。
- 前記所定の配列のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する工程が、前記切断工程の前、または前記連結工程の前に行われる、請求項3〜59のいずれか一項に記載の方法。
- 合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われる、請求項1〜65のいずれか一項に記載の方法。
- 前記微小流体システムがエレクトロウェッティングシステムである、請求項66に記載の方法。
- 前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム(EWOD)である、請求項66に記載の方法。
- 合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得る、請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法。
- 合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはPCRによって増幅される、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。
- 所定の配列を有するポリヌクレオチドを構築する方法であって、所定の配列を有する第1のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する1つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
- 前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが二本鎖である、請求項71に記載の方法。
- 前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが一本鎖である、請求項71に記載の方法。
- 前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、連結によって一緒に接合される、請求項71〜73のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、請求項74に記載の方法。
- 前記合成および/または構築工程が、微小流体システム内の液滴中で行われる、請求項68〜75のいずれか一項に記載の方法。
- 前記構築工程が、所定の配列を有する第1の合成ポリヌクレオチドを含む第1の液滴と、所定の配列を有する追加の1つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第2の液滴とを提供することを含み、前記液滴が互いに接触し、前記合成ポリヌクレオチドが一緒に接合され、それによって前記第1のポリヌクレオチドおよび前記追加の1つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを構築する、請求項76に記載の方法。
- 前記合成工程が、複数の液滴を提供することであって、各液滴が前記合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、提供することと、前記合成サイクルの前記工程に従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を順次送達することと、によって行われる、請求項77に記載の方法。
- 液滴の送達後かつ次の液滴の送達の前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施される、請求項78に記載の方法。
- 前記微小流体システムがエレクトロウェッティングシステムである、請求項78および79に記載の方法。
- 前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム(EWOD)である、請求項80に記載の方法。
- 合成工程および構築工程が、同じシステム内で行われる、請求項78〜81のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜76および78〜82のいずれか一項に記載の方法を実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、(a)反応領域のアレイであって、各反応領域が少なくとも1つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、(b)前記反応試薬を前記反応領域に送達するための手段と、任意選択的に(c)前記足場ポリヌクレオチドからの前記合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む、ポリヌクレオチド合成システム。
- 前記反応試薬を液滴で提供するための手段と、前記合成サイクルに従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を送達するための手段とをさらに含む、請求項83に記載のシステム。
- 請求項83または84に記載のシステムと共に使用され、請求項1〜75のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、前記合成サイクルの前記工程に対応する反応試薬の容量を含む、キット。
- ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法であって、前記マイクロアレイが複数の反応領域を含み、各領域が所定の配列を有する1つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記方法が、
a)複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が1つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
b)各反応領域で請求項1〜68のいずれか一項に記載の方法に従って合成サイクルを行い、それによって各領域で所定の配列を有する1つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む、方法。 - 合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、各領域が所定の配列を有する1つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイを提供する、請求項86に記載の方法。
- 配列番号1〜67のいずれか1つに定義されるような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物。
- 配列番号1〜67のいずれか1つに定義されるような配列を有するポリヌクレオチド分子を含むヌクレオチド分子構築物であって、配列番号1〜67のいずれか1つに定義されるような各ポリヌクレオチド配列が、存在する場合、図に示されるそれぞれの修飾(複数可)によって修飾される、ヌクレオチド分子構築物。
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