JP7393412B2 - ポリヌクレオチドの合成法、キット、およびシステム - Google Patents
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Description
(A)二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が、リガーゼ酵素の作用によって、所定の配列の第1のヌクレオチドの付加により伸長され、
(B)次いで、二本鎖ポリヌクレオチドが、切断部位で切断され、
(C)次いで、第1の鎖にハイブリダイズされる第2の鎖が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素によって、所定の配列の第2のヌクレオチドの付加により伸長され、
各サイクルの所定の配列の第1および第2のヌクレオチドが、切断後に、二本鎖ポリヌクレオチドにおいて保持される。
(1)合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、支持鎖が、二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖であり、合成鎖が、二本鎖ポリヌクレオチドの第2の鎖である、提供することと、
(2)平滑末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を足場ポリヌクレオチドに連結することであって、ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
(i)支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび所定の配列の第1のヌクレオチドと、
(ii)ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が第1のヌクレオチドで伸長され、切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドの第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(3)連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、支持鎖を切断することと、足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、組み込まれた第1のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(4)ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、第2のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、第2のヌクレオチドが、第1のヌクレオチドに対するパートナーであり、組み込み時に、第2のヌクレオチドおよび第1のヌクレオチドが、ヌクレオチド対を形成する、伸長することと、
(5)第2のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第1の合成サイクルを行うことを含み得、
本方法は、
(6)平滑末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
(i)支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよびさらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドと、
(ii)ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が、さらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドで伸長され、切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドの第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(7)連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、支持鎖を切断することと、足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、前のサイクル(複数可)のヌクレオチド対(複数可)と、さらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドと、を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(8)ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなる合成サイクルの第2のヌクレオチドの組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、第2のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、さらなる合成サイクルの第2のヌクレオチドが、さらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドに対するパートナーであり、組み込み時に、さらなる合成サイクルの第2および第1のヌクレオチドが、さらなるヌクレオチド対を形成する、伸長することと、
(9)第2のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6~9を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む。
(a)第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
i.そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nが、その組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置n+1が、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する支持鎖中の次のヌクレオチド位置であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドが、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
(b)第1のサイクルの切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、切断された足場ポリヌクレオチドの第1の鎖に付着したそのサイクルの第1のヌクレオチドを保持し、
(c)第1のサイクルの伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第2のヌクレオチドが、第1の鎖における第1のヌクレオチドとは反対の第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルの第1のヌクレオチドによって占められる位置は、次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される。
(a)第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
i.そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中のヌクレオチド位置n+2を占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nが、その組み込み時にそのサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置n+2が、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する支持鎖における第2のヌクレオチド位置であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドが、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
(b)第1のサイクルの切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、切断された足場ポリヌクレオチドの第1の鎖に付着したそのサイクルの第1のヌクレオチドを保持し、
(c)第1のサイクルの伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第2のヌクレオチドが、第1の鎖における第1のヌクレオチドとは反対の第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルの第1のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される。
(a)第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
i.そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中のヌクレオチド位置n+2+xを占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置n+2は、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する支持鎖における第2のヌクレオチド位置であり、xは、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置n+2に対するヌクレオチド位置の数であり、数は、1~10以上の整数であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
(b)第1のサイクルの切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、切断された足場ポリヌクレオチドの第1の鎖に付着したそのサイクルの第1のヌクレオチドを保持し、
(c)第1のサイクルの伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第2のヌクレオチドが、第1の鎖における第1のヌクレオチドとは反対の第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのサイクルの第1のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される。
(1)合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、合成鎖が、プライマー鎖部分を含む、提供することと、
(2)粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を足場ポリヌクレオチドに連結することであって、ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
(i)支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび所定の配列の第1のヌクレオチドと、
(ii)ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が第1のヌクレオチドで伸長され、切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドの第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(3)連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、支持鎖を切断することと、足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、組み込まれた第1のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(4)ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、第2のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、第2のヌクレオチド、伸長することと、
(5)第2のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第1の合成サイクルを行うことを含み得、
本方法は、
(6)粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、連結末端が、
(i)支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよびさらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドと、
(ii)ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が、さらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドで伸長され、切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドの第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(7)連結された足場ポリヌクレオチドを切断部位で切断することであって、切断が、支持鎖を切断することと、足場ポリヌクレオチドからユニバーサルヌクレオチドを除去して、前のサイクル(複数可)のヌクレオチド対(複数可)と、さらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドと、を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(8)ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなる合成サイクルの第2のヌクレオチドの組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、第2のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
(9)第2のヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6~9を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む。
工程(2)において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端に、ヘルパー鎖の末端がヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、支持鎖の末端ヌクレオチドが、そのサイクルの第1のヌクレオチドであり、次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端が、ヌクレオチド突出を含み、支持鎖の末端および最後から2番目のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドが、工程(8)において組み込まれたさらなる合成サイクルの第2のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端に、ヘルパー鎖の末端がヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、支持鎖の末端ヌクレオチドが、さらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドであり、次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
第1およびさらなる合成サイクルにおいて、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端のヌクレオチド突出および足場ポリヌクレオチドのヌクレオチド突出が、同じ数のヌクレオチドを含み、数は、足場ポリヌクレオチドの突出中のヌクレオチドの数が、相補的連結末端の突出中のヌクレオチドの数よりも1つ多いという条件で、1つ以上である。
(a)第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
i.そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置n+2を占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドに突出するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置n+1およびn+2は、それぞれ、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する支持鎖における第1/次のおよび第2のヌクレオチド位置であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
(b)第1のサイクルの切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第1の鎖に付着したそのサイクルの第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中に作成され、支持鎖の末端および最後から2番目のヌクレオチドが、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、
(c)第1のサイクルの伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第2のヌクレオチドが、第2の鎖に組み込まれ、かつ突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのさらなるサイクルの第1のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される。
(a)第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
i.そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中のヌクレオチド位置n+3を占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドに突出するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置n+1、n+2、およびn+3は、それぞれ、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する支持鎖における次の、第2の、および第3のヌクレオチド位置であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
(b)第1のサイクルの切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第1の鎖に付着したそのサイクルの第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中に作成され、支持鎖の末端および最後から2番目のヌクレオチドが、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、
(c)第1のサイクルの伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第2のヌクレオチドが、第2の鎖に組み込まれ、かつ突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのさらなるサイクルの第1のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される。
(a)第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、
i.そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドであり、支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.ユニバーサルヌクレオチドが、支持鎖中のヌクレオチド位置n+3+xを占め、ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドに突出するヘルパー鎖の末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、位置n+1およびn+3は、それぞれ、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する支持鎖における第1/次のおよび第3のヌクレオチド位置であり、xは、相補的連結末端に対する遠位方向において、位置n+3に対するヌクレオチド位置の数であり、数は、1~10以上の整数であり、連結時に、ポリヌクレオチド連結分子の支持鎖の末端ヌクレオチドは、合成鎖のプライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、ヘルパー鎖の末端ヌクレオチドと合成鎖のプライマー鎖部分との間に作成され、
(b)第1のサイクルの切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、連結された足場ポリヌクレオチドの支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、足場ポリヌクレオチドからポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、切断された足場ポリヌクレオチドの第1の鎖に付着したそのサイクルの第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中に作成され、支持鎖の末端および最後から2番目のヌクレオチドが、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、
(c)第1のサイクルの伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの第2のヌクレオチドが、第2の鎖に組み込まれ、かつ突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、切断された足場ポリヌクレオチドの支持鎖中のそのさらなるサイクルの第1のヌクレオチドによって占められる位置が、次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される。
工程(2)において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端に、ヘルパー鎖の末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の1+yヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の1+y突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドが、そのサイクルの第1のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置n+2+xを占め、第3の合成サイクルにおいて形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、プライマー鎖部分に対して近位にある支持鎖の末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、支持鎖の1+yヌクレオチドが、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出し、突出の第1のヌクレオチドが、突出の末端に対して遠位にある突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置nを占め、工程(8)において組み込まれたさらなる合成サイクルの第2のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、位置n+1を占める突出のヌクレオチドが、次の合成サイクルの第2のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端に、ヘルパー鎖の末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、ヘルパー鎖の1+yヌクレオチドが、支持鎖の末端ヌクレオチドに突出し、足場ポリヌクレオチドの支持鎖の1+y突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、相補的連結末端の支持鎖の末端ヌクレオチドが、さらなる合成サイクルの第1のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置n+2+xを占め、次の合成サイクルにおいて形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
i.位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドとは反対であるヌクレオチド位置であり、
ii.連結後、位置n+1およびn+2は、ヘルパー鎖に対する近位方向/プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置nに対する支持鎖における第1および第2のヌクレオチド位置であり、
iii.yは、1以上である整数であり、
iv.xは、0以上である整数であり、
v.足場ポリヌクレオチドにおけるyの数は、好ましくは、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端におけるyの数と同じ数であり、yが異なる数である場合、ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端におけるyの数は、好ましくは、足場ポリヌクレオチドにおけるyの数よりも少なく、
vi.任意の所与の一連の第1およびさらなるサイクルにおいて、xに対して選択される数は、足場ポリヌクレオチドで、yに対して選択される数-1である。
(i)工程(2)において、ポリヌクレオチド連結分子には、第1のサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドを含み、第1のサイクルの所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
(ii)切断後の工程(3)において、第1のサイクルの所定の配列の第1およびさらなるヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持されるように、
(iii)工程(4)において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、第1のサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、プライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、第1のサイクルの所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、第1のサイクルの第2およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、可逆的ターミネーター基が、次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、
(iv)工程(6)において、ポリヌクレオチド連結分子には、さらなるサイクルの所定の配列の第1のヌクレオチドを含み、さらなるサイクルの所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
(v)切断後の工程(7)において、さらなるサイクルの所定の配列の第1およびさらなるヌクレオチドが、切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持されるように、
(vi)工程(8)において、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなるサイクルの所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、プライマー鎖部分の末端が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、さらなるサイクルの所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、さらなるサイクルの第2およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、可逆的ターミネーター基が、次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、修正され得る。
a)工程(1)/(6)において、プライマー鎖部分を含む合成鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されており、
b)工程(2)/(6)において、ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた支持鎖の部分とが、ポリヌクレオチド連結分子において、相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている。
a)複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が1つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
b)上記および本明細書に記載される方法のいずれかに従って各反応領域で合成サイクルを行い、それによって所定の配列を有する1つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを各領域で合成することと、を含む、方法を提供する。
図16、17a、18a、19a、20a、21a、22a、23a、24a、25a、26a、27a、28a、29a、30a、31a、32a、33a、33b、34、35、36、37、38、39、および40に示される構造は、図11、12、13、14、および15に示されるものと一貫して解釈されるべきである。したがって、これらの図では、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各左手鎖は、支持鎖(図11~15の鎖「a」に対応する)に関し、二本鎖足場ポリヌクレオチド分子の各右手鎖は、合成鎖(図11~15の鎖「b」に対応する)に関し、すべての足場ポリヌクレオチド分子は、プライマー鎖部分(図6~10の鎖「b」の実線および点線に対応する)を含む鎖に対応するより低い合成鎖を含み、ヘルパー鎖部分(図11~15の鎖「b」の破線に対応する)を含む鎖に対応する上部合成鎖を有する、新たなヌクレオチドの組み込みの前のある特定の足場ポリヌクレオチド分子(例えば、図20aおよび28a)が示され、ヘルパー鎖部分(図11~15の鎖「b」の破線の欠如に対応する)を含まない、ある特定の足場ヌクレオチド分子(例えば、図17a、18a、および19aの)が示され、ヘルパー鎖部分(図11~15の鎖「b」の破線に対応する)を含む鎖に対応する上部合成鎖を有する、連結工程後のある特定の足場ポリヌクレオチド分子(例えば、図38、39、および40の)が示され、ヘルパー鎖部分は、次の合成サイクルにおいて新たなヌクレオチドの組み込みの前に除去される。
一態様では、本発明は、所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを合成するための方法を提供する。
所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドは、本明細書で足場ポリヌクレオチドと呼ばれる、本明細書に記載されるような表面に付着し得るか、または付着することができる、既存のポリヌクレオチドへの所定のヌクレオチドの組み込みによる本発明の方法によって合成される。本明細書により詳細に記載されるように、足場ポリヌクレオチドは、新たに合成されたポリヌクレオチドを収容するための支持構造を形成し、本明細書の記載から明らかになるように、従来の合成方法におけるように複製される既存の鋳型鎖を含まない。足場ポリヌクレオチドが表面に付着している場合、足場ポリヌクレオチドは、アンカーポリヌクレオチドと呼ばれることがある。足場ポリヌクレオチドを表面に付着させてアンカーポリヌクレオチドを形成するための表面付着化学は、本明細書により詳細に記載されている。
本明細書に記載される方法のうちのいずれかによって合成ポリヌクレオチドに組み込まれ得るヌクレオチドは、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、および修飾ヌクレオチドであり得る。
光切断可能な塩基:
エンドヌクレアーゼIIIにより切断可能な塩基類似体:
ホルムアミドピリミジンDNAグリコシラーゼ(Fpg)によって切断可能な塩基類似体:
8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ(hOGG1)によって切断可能な塩基類似体:
hNeil1によって切断可能な塩基類似体:
チミンDNAグリコシラーゼ(TDG)によって切断可能な塩基類似体:
ヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(hAAG)によって切断可能な塩基類似体:
ウラシルDNAグリコシラーゼによって切断可能な塩基:
ヒト一本鎖選択的単官能性ウラシルDNAグリコシラーゼ(SMUG1)によって切断可能な塩基
5-メチルシトシンDNAグリコシラーゼ(ROS1)によって切断可能な塩基:
(see S.S.David,S.D.Williams Chemical reviews 1998,98,1221-1262およびM.I.Ponferrada-Marin,T.Roldan-Arjona,R.R.Ariza,Nucleic Acids Res 2009,37,4264-4274を参照されたい)。
ここで、R1=F、Cl、Br、I、アルキル、アリール、蛍光標識、アミノプロパルギル、アミノアリルである。
ここで、塩基=アルキンまたはアルケンリンカーを有するA、T、G、またはCである。
ここで、塩基=アルキンまたはアルケンリンカーを有するA、T、G、またはCである。
ヌクレオチドの付加により、二本鎖ポリヌクレオチド分子の一本鎖ポリヌクレオチド部分を伸長することができる、かつ/または平滑末端二本鎖ポリヌクレオチド分子の一本鎖を伸長することができる酵素が利用可能である。これには、鋳型非依存性ポリメラーゼまたは鋳型非依存性トランスフェラーゼ活性など、鋳型非依存性酵素活性を有する酵素が含まれる。
本明細書に定義および記載される本発明の合成方法のうちのいずれにおいても、ポリメラーゼ酵素またはトランスフェラーゼ酵素の作用によって合成鎖に組み込まれるヌクレオチドは、好ましくは、本明細書に記載されるような可逆的ターミネーター基とも称される、1つ以上の可逆的ブロッキング基を含むヌクレオチドとして組み込まれる。
プロパルギル可逆的ターミネーター:
アリル可逆的ターミネーター:
シクロオクテン可逆的ターミネーター:
シアノエチル可逆的ターミネーター:
ニトロベンジル可逆的ターミネーター:
ジスルフィド可逆的ターミネーター:
アジドメチル可逆的ターミネーター:
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター:
3’-O-アリル-dNTPを以下に示す。
3’-O-アジドメチル-dNTPを以下に示す。
プロパルギル可逆的ターミネーター:
Pd触媒による処理-Na2PdCl4、PdCl2。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン-3,3’,3’’-トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アリル可逆的ターミネーター:
Pd触媒による処理-Na2PdCl4、PdCl2。
リガンド、例えば、トリフェニルホスフィン-3,3’,3’’-トリスルホン酸三ナトリウム塩を使用することができる。
アジドメチル可逆的ターミネーター:
チオール(メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール)、またはトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン-TCEPによる処理。
シアノエチル可逆的ターミネーター:
フッ化物-フッ化アンモニウム、フッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)による処理。
ニトロベンジル可逆的ターミネーター:
UV光への曝露
ジスルフィド可逆的ターミネーター:
チオール(メルカプトエタノールまたはジチオトレイトール)、またはトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン-TCEPによる処理。
アミノアルコキシ可逆的ターミネーター:
亜硝酸塩(NO2 -、HNO2)による処理pH=5.5
足場ポリヌクレオチドの存在および連結工程を必要とする方法において、ポリヌクレオチド連結分子の構成および構造の選択はまた、用いられる具体的な方法に依存する。ポリヌクレオチド連結分子は、一般に、本明細書に記載されるような支持鎖および本明細書に記載されるようなヘルパー鎖を含む。ポリヌクレオチド連結分子は、分子の一方の末端に相補的連結末端を含む。ポリヌクレオチド連結分子の相補的連結末端は、足場ポリヌクレオチドの末端に連結される。
連結工程を伴う本発明の方法において、連結は、任意の好適な手段を使用して達成され得る。好ましくは、連結工程は、リガーゼ酵素によって行われるであろう。リガーゼは、一塩基突出基質に対する活性が増強された修飾リガーゼであり得る。リガーゼは、T3 DNAリガーゼまたはT4 DNAリガーゼであり得る。リガーゼは平滑TAリガーゼであり得る。例えば、平滑TAリガーゼは、New England BioLabs(NEB)から入手可能である。これは、T4 DNAリガーゼと、連結エンハンサーと、平滑末端および一塩基突出基質の両方の連結および形質転換を改善するために特別に調製された最適化反応緩衝液との、すぐに使用できるマスターミックス溶液である。一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを連結(接合)するための分子、酵素、化学物質、および方法は、当業者によく知られている。
足場ポリヌクレオチドの存在および切断工程を必要とする方法において、切断工程を行うための試薬の選択は、用いられる具体的な方法に依存する。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドの具体的な配列によって定義される。したがって、本明細書に記載される例示的な方法を参照することによって容易に明らかになるように、所望の切断部位の構成および適切な切断試薬の選択は、その方法で用いられる特定の化学に依存するであろう。
限定されないが、図1~10およびさらに本明細書に記載されるような本発明の合成方法のバージョンの1~4およびそれらの変形例を含む、本明細書に記載されるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを合成する方法において、足場ポリヌクレオチドには、合成鎖が提供される。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。合成サイクル中に、所定の配列の各新たな第2のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれ、所定の配列の第1のヌクレオチドが支持鎖に組み込まれる。ポリメラーゼ酵素または末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素などの酵素を使用して、各新たな第2のヌクレオチドの組み込み/付加を触媒することができる。所定の配列の各新たに組み込まれた第2のヌクレオチドは、次の組み込み工程におけるプライミング組み込みで使用するためのプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドとして作用する。したがって、任意の所与の合成サイクルにおいて、合成鎖のプライマー鎖部分は、適切な酵素によるプライミングを可能にするのに十分なポリヌクレオチド配列を含む。さらに本明細書に記載されるある特定の実施形態において、所与の合成サイクルにおいて、所定の配列の第2のヌクレオチドは、合成鎖に組み込まれ、続いて、1つ以上のさらなるヌクレオチドの合成鎖に組み込まれる。このような実施形態において、所定の配列の第2のヌクレオチドおよびさらなるヌクレオチドは、可逆的ターミネーター基を含み、本方法は、組み込み後、および次のヌクレオチドの組み込み前に、ヌクレオチドから可逆的ターミネーター基を除去する工程を追加的に含む。
ヘルパー鎖は、連結工程でポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結を容易にするために、ポリヌクレオチド連結分子に提供され得る。ヘルパー鎖はまた、切断工程で切断酵素(複数可)の結合を促進し得る。必要に応じて、切断工程での切断酵素(複数可)の結合を確実にし、連結工程での連結を確実にするために代替的な手段が提供されるという条件で、ヘルパー鎖が削除され得る。本発明の好ましい方法において、ポリヌクレオチド連結分子にはヘルパー鎖が提供される。
本明細書に記載される本発明の合成方法のうちのいずれにおいても、所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込み工程の前に、ポリヌクレオチド連結分子によって提供されるヘルパー鎖が、足場ポリヌクレオチドから除去され得る。
プライマー鎖部分は、ポリメラーゼ酵素または末端トランスフェラーゼ活性を有する酵素などの酵素が合成を開始できるようにする、すなわち、プライマー鎖部分の末端での新たなヌクレオチドの付加を触媒するのに好適であるべきである。
限定されないが、本発明の合成方法のバージョン1および2ならびにそれらの変形例を含む本発明の方法では、上記に記載されるように、足場ポリヌクレオチドには、支持鎖が提供される。支持鎖は合成鎖にハイブリダイズされる。上記に記載されるように、支持鎖がプライマー鎖部分と適合し、存在する場合、上記に記載されるように、合成鎖のヘルパー鎖部分と適合するという条件で、支持鎖の長さ、配列、および構造のパラメーターについて特別な要件はない。
本明細書に記載される方法に従って合成された所定の配列を有するポリヌクレオチドは二本鎖である。合成されたポリヌクレオチドは全体として二本鎖であり、ここで第1の鎖は、ハイブリダイゼーションによって第2の鎖に付着している。第1の鎖が全体としてハイブリダイゼーションによって第2の鎖に付着しているという条件で、非ハイブリダイゼーションのミスマッチおよび領域は許容され得る。
DNA合成について記載される方法はRNAの合成に適応され得る。1つの適応において、本発明の合成方法のバージョン1~4およびそれらの変形例について記載された合成工程が適応され得る。したがって、合成方法のバージョン1~4およびそれらの変形例の各々において、足場ポリヌクレオチドの支持鎖は、上記に記載されるように、DNA鎖である。足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分はRNA鎖である。ヘルパー鎖は、存在する場合、RNA鎖であり得る。ヘルパー鎖は、存在する場合、DNA鎖であり得る。
本発明の合成方法に従って生産された合成ポリヌクレオチドは、好ましくは固相または可逆的固相技術を使用して合成することができる。様々なこのような技術が当該技術分野において知られており、また、使用され得る。所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、足場ポリヌクレオチドを表面、例えば、ガラスなどの平坦な表面、ゲル系材料、またはビーズもしくは官能化量子ドットなどの微粒子の表面に固定化し得る。表面を構成する材料自体が基質に結合され得る。例えば、足場ポリヌクレオチドは、例えばポリアクリルアミドなどのゲル系材料に固定化され得、ここでゲル系材料は、ガラスなどの支持基質に結合されている。
所定の配列の新たな二本鎖ポリヌクレオチドの合成を開始する前に、合成アンカー/足場ポリヌクレオチドを、本明細書に記載されるものを含む当該技術分野で既知の方法によって合成し、表面に繋留させることができる。
所定の配列を有する合成ポリヌクレオチドは、可逆的固定化を促進する、微粒子およびビーズなどの結合表面および結合構造を使用して本発明に従って合成することができる。固相可逆的固定化(SPRI)方法または改良された方法が、当該技術分野において知られており、また用いることができる(例えば、DeAngelis M.M.et al.(1995)Solid-Phase Reversible Immobilization for the Isolation of PCR Products,Nucleic Acids Research,23(22):4742-4743を参照されたい)。
表面は、エレクトロウェッティングオン誘電体システム(EWOD)であり得る。EWODシステムは、微小液滴の形態での非常に小さい液体容量の微小流体操作を促進する誘電体被覆表面を提供する(例えば、Chou,W-L.,et al.(2015)Recent Advances in Applications of Droplet Microfluidics,Micromachines,6:1249-1271.)。液滴容量は、エレクトロウェッティング技術によってチップ上でプログラム可能に作成、移動、区分化、および組み合わせることができる。したがって、エレクトロウェッティングシステムは、合成中および合成後にポリヌクレオチドを可逆的に固定化するための代替的な手段を提供する。
合成もしくはアセンブリの中間生産物、または最終的なポリヌクレオチド合成生産物は、所望のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドが正しく合成またはアセンブリされているかどうかを決定するための品質管理チェックとして配列決定され得る。目的のポリヌクレオチドまたは複数のポリヌクレオチドを、固相合成プラットフォームから除去し、Oxford Nanopore Technologies Ltdによって販売されているMinION(商標)デバイスを使用したナノポアシーケンシングなど、いくつかの既知の市販の配列決定技術のうちのいずれか1つによって配列決定することができる。特定の実施例では、配列決定は、固相プラットフォーム自体で実施され得、ポリヌクレオチドを別の合成デバイスに移す必要がなくなる。配列決定は、合成に使用されるEWODデバイスなどの同じエレクトロウェッティングデバイス上で都合よく実施することができ、それにより、合成デバイスは、1つ以上の測定電極対を含む。目的のポリヌクレオチドを含む液滴は、電極対の電極のうちの1つと接触することができ、液滴は、電極対の第2の電極と接触する第2の液滴と液滴界面二重層を形成し、液滴二重層界面は、両親媒性膜中にナノポアを含む。ポリヌクレオチドは、例えば、酵素制御下でナノポアを移動させることができ、ナノポアを通るイオン電流の流れは、ポリヌクレオチドがナノポアを通過する間の電極対間の電位差の下で測定することができる。経時的なイオン電流測定値を記録し、ポリヌクレオチド配列を決定するために使用することができる。配列決定の前に、ポリヌクレオチドは、特許出願第PCT/GB2015/050140号に開示されるような配列決定のためにそれを最適化するために、1つ以上の試料調製工程に供され得る。好適に用いられ得る酵素、両親媒性膜、およびナノポアの例は、特許出願第PCT/GB2013/052767およびPCT/GB2014/052736に開示されている。ポリヌクレオチド、ナノポア、両親媒性膜などの試料調製に必要な試薬は、試料注入口を介してEWODデバイスに供給することができる。試料注入口は、試薬チャンバーに接続され得る。
オリゴヌクレオチドは典型的には化学的に付着するが、それらはまた、親和性相互作用などを介して間接的な手段によって表面に付着し得る。例えば、オリゴヌクレオチドをビオチンで官能化し、アビジンまたはストレプトアビジンで被覆された表面に結合させることができる。
本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成方法のうちのいずれかを使用して、ポリヌクレオチドマイクロアレイを製造することができる(Trevino,V.et al.,Mol.Med.2007 13,pp527-541)。したがって、アンカーまたは足場ポリヌクレオチドは、表面上の複数の個々にアドレス可能な反応部位に繋留され得、所定の配列を有するポリヌクレオチドは、マイクロアレイ上にインサイチュで合成され得る。
本明細書に記載される方法によって合成され、任意選択的に本明細書に記載される方法によって増幅される所定の配列を有するポリヌクレオチドは、より大きな合成ポリヌクレオチドを作成するために1つ以上の他のこのようなポリヌクレオチドに接合され得る。
本発明はまた、本明細書に記載および定義される合成方法のうちのいずれか、ならびに本明細書に記載および定義されるその後の増幅および構築工程のうちのいずれかを実施するためのポリヌクレオチド合成システムも提供する。
本発明によるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド分子を合成する例示的で非限定的な方法は、添付の特許請求の範囲を含む本明細書に記載されている。
図1を参照すると、本発明の合成方法の第1の特定の非限定的で例示的なバージョンでは、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供される(図1の工程1;101)。二本鎖足場ポリヌクレオチドは、支持鎖と、それにハイブリダイズされた合成鎖と、を含む。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。二本鎖足場ポリヌクレオチドには、少なくとも1つの平滑末端が提供され、少なくとも1つの平滑末端は、プライマー鎖部分の末端と、それにハイブリダイズされた支持鎖の末端と、を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、好ましくはリン酸基または他の連結可能基を含む。
本発明の合成方法の例示的なバージョン1では、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、工程(1)で提供される(101)。合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供され、合成鎖は、プライマー鎖部分を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドと対合され、したがって平滑末端を形成する。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、連結可能基、好ましくはリン酸基を含む。
方法の工程(2)において、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子は、平滑末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドに連結される(102)。
方法の工程(3)において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される(103)。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断(工程3)は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。
方法の工程(4)において、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結および足場ポリヌクレオチドの切断後、次いで、所定の配列の第2のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれる。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、すべてのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第1のヌクレオチドから除去しなければならない(脱保護工程;105)。これは、図1に示されるように、工程(4)での第2のヌクレオチドの組み込みの後に、方法の工程(5)として行われる(105)。組み込まれていない第2のヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおける第2のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、工程(4)の後に最初に除去されるべきである。
第1の合成サイクルの完了後、第2およびさらなる合成サイクルは、同じ方法の工程を使用して行われ得る。
図2を参照すると、本発明の合成方法の第2の特定の非限定的で例示的なバージョンでは、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供される(図2の工程1;201)。二本鎖足場ポリヌクレオチドは、支持鎖と、それにハイブリダイズされた合成鎖と、を含む。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。二本鎖足場ポリヌクレオチドには、少なくとも1つの平滑末端が提供され、少なくとも1つの平滑末端は、プライマー鎖部分の末端と、それにハイブリダイズされた支持鎖の末端と、を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、好ましくはリン酸基または他の連結可能基を含む。
本発明の合成方法の例示的なバージョン2では、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、工程(1)で提供される(201)。合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供され、合成鎖は、プライマー鎖部分を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドと対合され、したがって平滑末端を形成する。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、連結可能基、好ましくはリン酸基を含む。
方法の工程(2)において、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子は、平滑末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドに連結される(202)。
方法の工程(3)において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される(203)。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断(工程3)は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。
方法の工程(4)において、ポリヌクレオチド連結分子の足場ヌクレオチドへの連結後、次いで、所定の配列の第2のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれる。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、すべてのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第1のヌクレオチドから除去しなければならない(脱保護工程;205)。これは、図2に示されるように、工程(4)での第2のヌクレオチドの組み込みの後に、方法の工程(5)として行われる(205)。組み込まれていない第2のヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおける第2のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、工程(4)の後に最初に除去されるべきである。
第1の合成サイクルの完了後、第2およびさらなる合成サイクルは、同じ方法の工程を使用して行われ得る。
上記に記載される方法に加えて、合成方法のバージョン2の変形例が提供され、本方法は、以下の変形例を除いて、上記に記載される合成方法のバージョン2と同じ方法で行われる。
図4を参照すると、本発明の合成方法の第3の特定の非限定的で例示的なバージョンでは、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供される(図4の工程1;401)。二本鎖足場ポリヌクレオチドは、支持鎖と、それにハイブリダイズされた合成鎖と、を含む。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。二本鎖足場ポリヌクレオチドには、少なくとも1つの突出末端が提供され、少なくとも1つの突出末端は、プライマー鎖部分の末端に突出する支持鎖の末端を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、好ましくはリン酸基または他の連結可能基を含む。
本発明の合成方法の例示的なバージョン3では、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、工程(1)で提供される(401)。合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供され、合成鎖は、プライマー鎖部分を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドが対合されず、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する、単一ヌクレオチド突出を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、連結可能基、好ましくはリン酸基を含む。
方法の工程(2)において、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子は、粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドに連結される(402)。
方法の工程(3)において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される(403)。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断(工程3)は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。
方法の工程(4)において、ポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結および足場ポリヌクレオチドの切断後、次いで、所定の配列の第2のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれる。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、すべてのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第1のヌクレオチドから除去しなければならない(脱保護工程;405)。酵素および残りの組み込まれていない第2のヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおける第2のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、工程(5)の後に最初に除去されるべきである。
第1の合成サイクルの完了後、第2およびさらなる合成サイクルは、同じ方法の工程を使用して行われ得る。
図5を参照すると、本発明の合成方法の第4の特定の非限定的で例示的なバージョンでは、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供される(図5の工程1;501)。二本鎖足場ポリヌクレオチドは、支持鎖と、それにハイブリダイズされた合成鎖と、を含む。合成鎖はプライマー鎖部分を含む。二本鎖足場ポリヌクレオチドには、少なくとも1つの突出末端が提供され、少なくとも1つの突出末端は、プライマー鎖部分の末端に突出する支持鎖の末端を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、好ましくはリン酸基または他の連結可能基を含む。
本発明の合成方法の例示的なバージョン4では、二本鎖足場ポリヌクレオチドは、工程(1)で提供される(501)。合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、二本鎖足場ポリヌクレオチドが提供され、合成鎖は、プライマー鎖部分を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、支持鎖の末端ヌクレオチドが対合されず、合成鎖のプライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する、単一ヌクレオチド突出を含む。支持鎖の末端ヌクレオチドは、リガーゼ酵素の基質として作用することができ、連結可能基、好ましくはリン酸基を含む。
方法の工程(2)において、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子は、粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって足場ポリヌクレオチドに連結される(502)。
方法の工程(3)において、連結された足場ポリヌクレオチドは、切断部位で切断される(504)。切断部位は、支持鎖中のユニバーサルヌクレオチドを含む配列によって定義される。切断は、足場ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす。足場ポリヌクレオチドの切断(工程3)は、存在し、切断の直前に支持鎖にハイブリダイズされる場合、ヘルパー鎖の喪失、およびユニバーサルヌクレオチドを含む支持鎖の喪失をもたらす。
方法の工程(4)において、ポリヌクレオチド連結分子の足場ヌクレオチドへの連結後、次いで、所定の配列の第2のヌクレオチドが、プライマー鎖部分の伸長によって合成鎖に組み込まれる。
本発明のこの例示的な方法のバージョンでは、すべてのバージョンと同様に、隣のヌクレオチドを次の合成サイクルに組み込むことを可能にするために、可逆的ターミネーター基を第1のヌクレオチドから除去しなければならない(脱保護工程;505)。酵素および残りの組み込まれていない第2のヌクレオチドは、同じ合成サイクルにおける第2のヌクレオチドの多重組み込みを防止するために、工程(5)の後に最初に除去されるべきである。
第1の合成サイクルの完了後、第2およびさらなる合成サイクルは、同じ方法の工程を使用して行われ得る。
上記に記載される方法に加えて、合成方法のバージョン4の変形例が提供され、本方法は、以下の変形例を除いて、上記に記載される合成方法のバージョン4と同じ方法で行われる。
上記に記載される変形例に加えて、合成方法のバージョン3および4のさらなる変形例である方法が提供される。これらの方法は、以下に記載される変形例を除いて、上記に記載される合成方法のバージョン3および4と同じ方法で行われる。合成方法のバージョン3および4のこれらのさらなる変形例は、すぐ下に記載される同じ一般的なフォーマットに従って行われる。合成方法のバージョン3のさらなる変形例と合成方法のバージョン4のさらなる変形例との間の相違は、ヌクレオチド位置nに対するユニバーサルヌクレオチドの位置付けにおけるものである。
第1のサイクルの工程(1)において、足場ポリヌクレオチドは、プライマー鎖部分に対して近位にある足場ポリヌクレオチドの支持鎖の末端が、1+yヌクレオチドを含む多重ヌクレオチド突出を含むように提供される。yに対して選択される数は、1以上の整数である。したがって、突出は、2つ以上のヌクレオチドを含む。支持鎖の1+yヌクレオチドは、プライマー鎖部分の末端ヌクレオチドに突出する。
本発明はさらに、合成方法のバージョン3の特定のさらなる変形例を提供する。この変形例の方法は、以下の追加の特徴と共に、上記に記載される合成方法のバージョン3および4のさらなる変形例のための一般的なフォーマットに従って行われる。
本発明はさらに、合成方法のバージョン4の特定のさらなる変形例を提供する。この変形例の方法は、以下の追加の特徴と共に、上記に記載される合成方法のバージョン3および4のさらなる変形例のための一般的なフォーマットに従って行われる。
本発明はさらに、上記に記載される特定のバージョン1、2、3、および4、ならびにそれらの変形例に基づくまたさらに追加の変形例の方法を含む、1サイクル当たり3つ以上のヌクレオチドが組み込まれる、またさらに追加の変形例の方法を提供する。これらのまたさらにさらなる変形例の方法のいずれかは、以下の修正が行われ得ることを除いて、上記に記載されるように行われ得る。
この実施例は、4つの工程:部分二本鎖DNA上への3’-O-修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対側で起こる。
第1の工程は、DNAポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’-O-保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する(図17a)。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis,Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
New England BioLabs製のカスタマイズされて操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼは、ユニバーサルヌクレオチド、例えばノシンと反対に3’-O-修飾-dNTPを組み込むことができる効率的なDNAポリメラーゼである(図17b~c)。
イノシンと反対側の3-O-修飾-dTTPの組み込みは、Mn2+イオンの存在下で65℃の温度で、New England BioLabs製のカスタマイズされて操作されたTherminator IX DNAポリメラーゼを使用して特に高い効率で達成され得る。
第2の工程は、hAAG/Endo VIIIまたはhAAG/化学塩基のいずれかによるポリヌクレオチドの2工程切断を記載する(図18a)。
材料
1.実施例1で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図18(e)の表を参照されたい)。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、41μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.2μl(10~100ng/μl)のDNAを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。
1.5μlのDNAおよびTBE-尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(Eppendorf)を使用して2分間95℃まで加熱した。
ヘルパー鎖によらない切断反応は、切断対未切断DNA比の約7%:93%という低いパーセンテージ収率を示した(図18b~d)。
第3の工程は、ヘルパー鎖の不在下でのDNAリガーゼとのポリヌクレオチドの連結を記載する。概略図を図19に示す。
材料
1.実施例1で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図19cの表を参照されたい)。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、16μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
この特定の実施例において、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下で室温(24℃)でのDNAリガーゼ、この特定の場合はクイックT4 DNAリガーゼとのオリゴヌクレオチドの連結は、低減された量の連結生産物をもたらす(図19b)。
この実施例は、4つの工程:ニック部位からの3’-O-修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンと反対側で起こる。この方法は、連結および切断工程の効率を改善するヘルパー鎖を使用する。
第1の工程は、DNAポリメラーゼを使用した酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’-O-保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する(図20a)。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の10.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
第2の工程は、hAAG/Endo VIIIまたはhAAG/化学塩基(×2)のいずれかによるポリヌクレオチドの2工程切断を記載する(図21a)。
材料
1.実施例2で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図21fを参照されたい)。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、41μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.2μl(10~100ng/μl)のDNAを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。
1.1μl(10~100ng/μl)のDNAを滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。次に、酢酸溶液シグマ(99.8%)で、室温でpH7.4に緩衝化された2μlのN,N’ジメチルエチレンジアミンシグマ(100mM)を同じチューブに加えた。
1.5μlのDNAおよびTBE-尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(Eppendorf)を使用して2分間95℃まで加熱した。
hAAG DNAグリコシラーゼによるユニバーサルヌクレオチド、この場合はイノシンを含む切断部位での切断効率は、ヘルパー鎖の不在下での10%からヘルパー鎖の存在下での50%まで有意に増加した(図21b)。hAAGおよびエンドヌクレアーゼVIIIは、hAAGおよびNaOH(50%)よりも低い効率(10%)でイノシンを切断する。ニックの入ったDNAを使用した記載されるシステムでは、0.2MのNaOHを使用した化学的切断が、エンドヌクレアーゼVIIIよりもAP部位の切断に好ましいことが示された(図21c)。中性pHでの穏やかなN,N’-ジメチルエチレンジアミンは、0.2MのNaOHのような脱塩基部位を切断するのに高い効率を有し、それゆえ、エンドヌクレアーゼVIIIおよびNaOHと比較して好ましい(図21d~e)。
イノシンを含有するDNAの切断について、3つの方法を評価した。1つの完全酵素法-hAAG/エンドヌクレアーゼVIII、ならびに化学的および酵素的切断を組み合わせた2つの方法-hAAG/NaOHおよびhAAG/ジメチルエチルアミンを、実施例2においてDNA切断について研究した。
第3の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとDNAリガーゼとの連結を記載する。概略図を図22aに示す。
材料
1.オリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図22dを参照されたい)。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、16μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
この特定の実施例では、使用される特定の試薬に基づいて、ヘルパー鎖の不在下では連結活性の低下が観察され(図22b)、ヘルパー鎖の存在下では連結が高い効率で進行し(図22c)、生産物が高効率で形成された。
この実施例は、4つの工程:部分二本鎖DNA上への3’-O-修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、組み込みの第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。
材料および方法
材料
第1の工程は、DNAポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’-O-保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する(図23a)。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
Therminator IX DNAポリメラーゼを使用した3-O-アジドメチル-dTTPの組み込み時の温度の評価に関して、結果は、連結のためのヘルパー鎖の存在下での3’-O-アジドメチル-dTTPの組み込みが5分後に90%に達することを示す。37℃および47℃で20分後には、10%のプライマーが未伸長のままである。
第2の工程は、エンドヌクレアーゼVによるポリヌクレオチドの1工程切断を記載する(図24a)。
材料
1.実施例3で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図24dの表を参照されたい)。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、41μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.5μlのDNAおよびTBE-尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(Eppendorf)を使用して2分間95℃まで加熱した。
実施例3からの切断結果は、ヘルパー鎖の存在下または不在下でエンドヌクレアーゼVを用いて有意に高収率の切断DNAを得ることができることを示した(図24c)。
第3の工程は、ヘルパー鎖の存在下でのポリヌクレオチドとDNAリガーゼとの連結を記載する。概略図を図25aに示す。
材料
1.実施例3で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図25bの表を参照されたい)。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、16μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.5μlのDNAおよびTBE-尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモブロック(Eppendorf)を使用して2分間95℃まで加熱した。
Therminator IX DNAポリメラーゼによる3’-O-アジドメチル-dNTPの組み込みによってDNAに導入された3’-O-アジドメチル基を担持するDNAモデルについて、脱保護工程(図26a)を研究した。脱保護をトリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)によって実施し、すべての天然dNTPの混合物を精製された脱保護DNAの溶液に加えたときの伸長反応によってモニターした。
材料
1.実施例3で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図26iを参照されたい)。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
50mMのTCEPは、0.2μMのDNAモデル上で3’-O-アジドメチル基を高い効率で切断するのに十分ではなかった(図26h)。対照的に、300mMのTCEPは、0.2μMのDNAモデル上で3’-O-アジドメチル基を95%の効率で首尾よく切断した(図26h)。
この実施例は、2つのヘアピンモデル上での4つの工程:ニック部位からの3’-O-修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接する支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。
第1の工程は、DNAポリメラーゼによる酵素的組み込みによるオリゴヌクレオチドへの3’-O-保護単一ヌクレオチドの制御された付加を記載する(図27a)。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の10.25μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
DNAポリメラーゼは、ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対側に3’-O-修飾-dTTPを組み込む。
第2の工程は、この特定の場合におけるエンドヌクレアーゼVによるヘアピンモデルの1工程切断を記載する(図28a)。
材料
1.実施例4で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図28cを参照されたい)。
以下の手順を使用して、ヘアピンオリゴヌクレオチド上の切断反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、43μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop one(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.5μlのDNAおよびTBE-尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱サーモミキサー(エッペンドルフ)を使用して2分間95℃まで加熱した。
実施例4からの切断結果は、エンドヌクレアーゼVを用いて37℃で著しく高収率の消化されたヘアピンDNAが得られることを示した(図28b)。
第3の工程は、ヘアピンモデルとDNAリガーゼとの連結を記載する。概略図を図29aに示す。
材料
1.実施例4で利用されたオリゴヌクレオチドを社内で設計し、Sigma Aldrichによって合成した(配列については図29cを参照されたい)。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチド上の連結反応を実施した。
1.ピペット(Gilson)を使用して、1μl(5pmol)のTAMRAまたは任意の蛍光タグ付きリン酸ヘアピンオリゴ(配列番号46)を1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.5μlのDNAおよびTBE-尿素試料緩衝液(Novex)を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブに加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して2分間95℃まで加熱した。
ヘルパー鎖の存在下で室温(24℃)での平滑/TA DNAリガーゼとヘアピンオリゴヌクレオチドとの連結は、高収率の連結生産物をもたらした。1分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約85%の比率で、高収率の連結DNA生産物を示した。2分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約85%の比率で、高収率の連結DNA生産物を示した。3分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約85%の割合で、高収率の連結DNA生産物を示した。4分後の連結ヘアピンオリゴヌクレオチドは、約>85%の比率で、高収率の連結DNA生産物を示した(図29b)。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での4つの工程:ニック部位からの3’-O-修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシンに隣接して支持鎖中に位置付けられた天然に相補的なヌクレオチドと反対側で起こる。ヘアピンの一端は付着アンカーとして機能する。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
DNAポリメラーゼは、二重ヘアピン構築物中のその天然に相補的な塩基と反対に3’-O-修飾-dTTPを組み込む(図30b)。
この実施例は、単一ヘアピンモデル上での4つの工程:ニック部位からの3’-O-修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、天然に相補的な塩基と反対側で起こる。DNA合成は、その過程においてヘルパー鎖を使用する。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
この実施例は、二重ヘアピン構築物モデルについての4つの工程:ニック部位からの3’-O-修飾dNTPの組み込み、切断、連結、および脱保護を使用したポリヌクレオチドの合成を記載しており、第1の工程は、ユニバーサルヌクレオチド、この特定の場合はイノシン塩基と反対側で起こる。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上で4つの工程:ニック部位からの3’-O-修飾dNTPの組み込み、脱保護、切断、および連結を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な2サイクル実験を記載しており、第1の工程は、相補的塩基と反対側で起こる。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis.Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
第1のサイクル:
1.2μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の12.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
23.3’-O-修飾-dCTP(2μlの100μM)およびMnCl2(1μlの40mM)を加えた。
1.5μlの反応混合物を滅菌1.5mlのエッペンドルフチューブ中の5μlのTBE-尿素試料緩衝液(Novex)に加え、熱ThermoMixer(Eppendorf)を使用して5分間95℃まで加熱した。
1.2μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を台座に加えることによって、NanoDrop One(Thermo Scientific)を平衡化した。
1.500μlの緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
1.200μlの結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)によって、100μlのストレプトアビジン磁気ビーズ(New England BioLabs)を3回洗浄した。
この実施例は、二重ヘアピンモデル上での5つの工程:ニック部位からの3’-O-修飾dNTPの組み込み、脱保護、切断、連結、および変性工程を使用したポリヌクレオチドの合成のための完全な3サイクル実験を記載しており、第1の工程は、相補的塩基と反対側で起こる。
材料
1.Jian Wu:Molecular Engineering of Novel Nucleotide Analogues for DNA Sequencing by Synthesis,Columbia University,2008のPhD論文に記載されるプロトコルに従って、3’-O-修飾dNTPを社内で合成した。合成のためのプロトコルはまた、米国特許出願公開:J.William Efcavitch,Juliesta E.Sylvester,Modified Template-Independent Enzymes for Polydeoxynucleotide Synthesis,Molecular Assemblies US2016/0108382A1にも記載されている。
3’-O-アジドメチル-dTTPを組み込みのために使用した。
第1のサイクル:
1.20μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England Biolabs)およびMnCl2溶液(10μlの40mM)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の139μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
23.15μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)、MnCl2溶液(7.5μlの40mM)、および19μlの脱イオン水を加えた。
45.6μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England BioLabs)、MnCl2溶液(3μlの40mM)を加えた。
65.10容量の緩衝液PNI QIAGEN(5Mの塩化グアニジニウム)を試料に加え、ピペットで穏やかに再懸濁することによって混合した。
72.200μlの結合緩衝液(20mMのトリス、500mMのNaCl、pH=7.4)によって、100μlのストレプトアビジン磁気ビーズ(New England BioLabs)を3回洗浄した。
図42は、組み込み、脱ブロック、切断、および連結工程を含む完全3サイクル実験に対応する反応生産物を示すゲルを示す。示されている結果は、本発明の例示的な方法を使用した3つの完全合成サイクルの実行を実証している。
この実施例は、N-(5-ブロモアセトアミジルペンチル)アクリルアミド(BRAPA)を使用したポリアクリルアミド表面上のブロモアセチル基の提示、およびその後のブロモアセチル基へのそれらの共有結合によるチオール化分子の表面固定化を記載する。
顕微鏡用スライドガラスおよびカバーガラスを、アセトン、エタノール、および水中でそれぞれ10分間ずつ順次超音波処理することによって洗浄し、アルゴンで乾燥させた。清浄なガラス製のカバーガラスを、ポリスチレン製ペトリ皿中で気相でトリクロロ(1H、1H、2H、2H-ペルフルオロオクチル)シランでシラン化し、エタノール中で2回超音波処理し、Arで乾燥させた(以後、「フッ素化カバーガラス」)。顕微鏡用スライドガラス上で、4%アクリルアミド/N,N’-メチレンビスアクリルアミド(19:1)溶液を、100μlの10%(w/v)過硫酸アンモニウム(APS)、10μlのテトラメチルエチレンジアミン(TEMED)と混合し、0、0.1、0.2、および0.3%(w/v)でN-(5-ブロモアセトアミジルペンチル)アクリルアミド(BRAPA)を添加し、直径4mmのゴム製ガスケットに素早く分配し、続いてアクリルアミド溶液に面しているフッ素化側を含むフッ素化カバーガラスで挟み、10分間重合した。10分後、表面を脱イオン水に浸し、合計4時間浸したままにし、その間にフッ素化カバーガラスを注意深く取り除いた。重合されたポリアクリルアミド表面をアルゴンで乾燥させた。
図43は蛍光シグナルを示し、図44は、FITC-PEG-SHおよびFITC-PEG-COOHに曝露された異なる量のBRAPAを添加したポリアクリルアミドゲル表面からの測定された蛍光を示す。フルオレセインの固定化は、カルボキシル化フルオレセインのゼロに近い非特異的吸着を伴って、BRAPAおよびチオール化フルオレセインのみを添加したポリアクリルアミド表面でのみ成功した。
この実施例は以下を記載する。
(1)薄いポリアクリルアミド表面上にブロモアセチル基を提示する方法、
(2)チオリン酸官能化ヘアピンDNAのリンカーを有するか、または有しない共有結合を介したヘアピンDNAのその後の固定化、および
(3)ヘアピンDNAへの2’-デオキシヌクレオチド三リン酸(dNTP)の組み込み。
材料および方法
最初に、顕微鏡用スライドガラスを、純粋なDecon 90(30分)、水(30分)、1MのNaOH(15分)、水(30分)、0.1MのHCl(15分)、水(30分)中で超音波処理によって洗浄し、最後にアルゴンで乾燥させた。
材料および方法
直径4mmの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、BRAPA修飾表面およびBRAPA制御表面上に置いて固定した。最初に、表面をリン酸ナトリウム緩衝液(10mM、pH7)で10分間下塗りした。続いて緩衝液を除去し、表面を、それぞれ1μMの濃度の6個の単一のチオリン酸で修飾されたリンカーを含んだ、および含まない5’-蛍光標識された(Alexa 647)ヘアピンDNAオリゴマーに曝露し、暗所で1時間インキュベートした。対照として、リンカーを有するおよび有しないが、チオリン酸を有しないDNAオリゴマーと共に、BRAPA修飾表面をインキュベートした(この実施例では、以後「オリゴマー制御表面」と呼ばれる)。インキュベーション後、リン酸ナトリウム(100mM、pH7)、続いてトリス-EDTA緩衝液(10mMのトリス、10mMのEDTA、pH8)で表面をすすぎ、最後に水ですすいだ。任意の非特異的に吸着されたDNAオリゴマーを除去するために、続いて1Mの塩化ナトリウムおよび0.05%(v/v)のTween20を含有する水で表面を洗浄し、水で洗浄し、アルゴンで乾燥させた。Alexa 647チャネルのChemiDoc撮像装置上で表面をスキャンした。
結果を図46および47に示す。図46は、ブロモアセチル官能化ポリアクリルアミド表面に固定化されたリンカーを有するおよび有しないヘアピンDNAオリゴマーから生じるが、BRAPAまたはオリゴマー対照からは生じない蛍光シグナルを示す。
DNAからの蛍光シグナルは、BRAPAを添加したBRAPA修飾表面からのみ顕著に存在し、チオリン酸官能基を介した表面へのDNAの共有結合の成功を示している。リンカーを有しないDNAと比較して、リンカーを有するDNAから、均一かつより高いシグナルが得られた。
材料および方法
直径9mmの円形開口部を有するゴム製ガスケットを、リンカーを有するDNAオリゴマーで固定化されたBRAPA修飾表面上に置き、組み込み緩衝液(50mMのトリス、pH8、1mMのEDTA、6mMのMgSO4、0.05%のtween20、および2mMのMnCl2)で10分間下塗りした。続いて表面を、DNAポリメラーゼ(0.5U/μlのTherminator X DNAポリメラーゼ)および三リン酸(20μMのAlexa 488標識dUTP)を含有する組み込み緩衝液に曝露し、1時間インキュベートした(この実施例では、以後「ポリメラーゼ表面」と呼ばれる)。陰性対照として、追加の表面の組も、Therminator X DNAポリメラーゼを含まない組み込み緩衝液に1時間曝露した(この実施例では、以後「陰性表面」と呼ばれる)。1時間後、両方の種類の試料を水中で洗浄し、続いて1Mの塩化ナトリウムおよび0.05%(v/v)のTween20を含有する水にさらし、再び水で洗浄した。表面からの蛍光シグナルを、Alexa 647およびAlexa 488チャネルのChemiDocを使用して測定し、ヘアピンDNAの存在(Alexa 647)およびdUTPの組み込み(Alexa 488)の両方をモニターした。
図48は、Alexa 488標識dUTPの組み込み前および後のAlexa 647およびAlexa 488チャネルから検出された蛍光シグナルを示す。組み込み前および後のAlexa 647からの不変の陽性シグナルは、表面固定化ヘアピンDNAが組み込み反応中に安定的であることを示し、Alexa 488からの陽性シグナルは、ポリメラーゼの存在によってのみ、dUTPの組み込みの成功を示す、組み込み反応後のポリメラーゼ表面からのみ観察された。
結果は、本発明の方法において使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応と適合する表面基質上に容易に固定化され得ることを実証する。結果はさらに、このような分子が、合成鎖を伸長させるために新たなdNTPの組み込みを許容し得ると同時に、分子が安定的で、基質に付着したままであることを実証する。
この実施例は、リンカーを有するチオリン酸官能化ヘアピンDNAの誘導体化表面への共有結合、その後の切断および連結反応を記載する。基質調製およびヘアピンDNAの結合を、実施例11に記載されるように実施した。
材料および方法
実施例11に記載されるような表面BRAPA修飾表面上に、ヘアピンDNAを固定化した。切断および連結反応のためのすべての実験対照を含む4組の三重表面を調製した。実験条件を図50aに記載する。図50bは、異なる試料に固定化されたヘアピンDNAの配列を示す。
図51は、切断反応前および後のヘアピンDNAオリゴマーからの蛍光シグナルを示す。
材料および方法
(1)に記載されるような切断反応の後、試料AおよびB(図50aに記載されるような)を、試料AについてはT3 DNAリガーゼ(250U/μl)を用い、試料Bについては陰性対照としてT3 DNAリガーゼを用いずに、MnCl2を含有する1×T3 DNAリガーゼ緩衝液(2mM)、5′末端でAlexa 647で標識されたイノシン鎖(16μM)、および相補的「ヘルパー」鎖(16μM)(配列を以下の図53に示す)に曝露した。試料を、それぞれの溶液中で1時間インキュベートした。1時間後、表面を水中で洗浄し、続いて1Mの塩化ナトリウムおよび0.05%(v/v)のTween20を含有する水に曝露し、再び水で洗浄した。Alexa 647チャネルのChemiDocを使用して、表面からの蛍光シグナルを測定した。図53は、連結反応のためのイノシン含有鎖および相補的「ヘルパー」鎖についての配列を示す。
図54は、連結反応のモニタリングに関する結果を示す。連結反応の前および後に、Alexa 647チャネルから検出された蛍光シグナル。連結後のAlexa 647チャネルにおける蛍光シグナルの増加は、T3 DNAリガーゼを有する試料Aからのみ得られたが、T3 DNAリガーゼの不在のため、試料Bについては連結反応後、蛍光シグナルは同じレベルのままであった。
この実施例の結果は、本発明の方法で使用するための支持鎖および合成鎖を含む分子が、本明細書に記載されるポリヌクレオチド合成反応に適合する表面基質上に容易に固定化でき、同時に安定的で基質に付着したままでありながら、切断および連結に曝露され得ることを実証する。
この実施例は、平滑末端二本鎖DNAの3’末端への3’-O-アジドメチル-dNTPの組み込みを記載する。
材料
1.社内で合成された3’-O-アジドメチル-dNTP。
1.5μlの10×Thermopol(登録商標)緩衝液(20mMのトリス-HCl、10mMの(NH4)2SO4、10mMのKCl、2mMのMgSO4、0.1%のTriton(登録商標)X-100、pH8.8、New England Biolabs)を、1.5mlのエッペンドルフチューブ中の33.5μlの滅菌脱イオン水(ELGA VEOLIA)と混合した。
図56bは、37℃でMn2+イオンの存在下で、Therminator X DNAポリメラーゼによる3’-O-修飾-dNTPの組み込みの結果を示すゲルを示す。データは、Therminator X DNAポリメラーゼが、3’-O-修飾-dNTPを平滑末端DNAオリゴヌクレオチドの3’末端に首尾よく組み込んで単一塩基突出を作成できたことを示す。
この実施例は、DNAリガーゼを使用したポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結を記載する。この実施例は、図2に示されるように、本発明の合成方法のバージョン2と一致する、平滑末端を有する分子の連結を伴う。
材料:
1.この実施例で利用されるオリゴヌクレオチドは社内で設計され、Integrated DNA technologiesによって合成された。これらを図58に記載する。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチドを用いた連結反応を実施した。
1.12μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。
結果を図59に示す。
この実施例は、DNAリガーゼを使用したポリヌクレオチド連結分子の足場ポリヌクレオチドへの連結を記載する。この実施例は、図5に示される本発明の合成方法のバージョン4、および図8に示される本発明の合成方法のバージョン4のさらなる変形例と一致する、突出末端を有する分子の連結を伴う。
材料:
1.この実施例で利用されるオリゴヌクレオチドは社内で設計され、Integrated DNA technologiesによって合成された。これらを図62に記載する。
以下の手順を使用して、オリゴヌクレオチドを用いた連結反応を実施した。
1.12μlの滅菌蒸留水(ELGA VEOLIA)を1.5mlのエッペンドルフチューブに加えた。
結果を図63に示す。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、
(A)二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が、リガーゼ酵素の作用によって、前記所定の配列の第1のヌクレオチドの付加により伸長され、
(B)次いで、前記二本鎖ポリヌクレオチドが、切断部位で切断され、
(C)次いで、前記第1の鎖にハイブリダイズされる第2の鎖が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素によって、前記所定の配列の第2のヌクレオチドの付加により伸長され、
各サイクルの前記所定の配列の前記第1および第2のヌクレオチドが、切断後に、前記二本鎖ポリヌクレオチドにおいて保持される、方法。
2.前記切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によって定義される、上記1に記載の方法。
3.各サイクルにおいて、前記第2の鎖の伸長の前に、前記二本鎖ポリヌクレオチド中に切断部位が作成される、上記1または2に記載の方法。
4.前記リガーゼ酵素の作用による工程(A)の間に、ユニバーサルヌクレオチドが、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に組み込まれて、前記切断部位を定義する、上記3に記載の方法。
5.所与の合成サイクルにおいて、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第2の鎖に付加される、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記可逆的ターミネーター基が、次のサイクルの前記第2のヌクレオチドの前記次の合成サイクルにおける前記付加の前に、そのサイクルの前記組み込まれた第2のヌクレオチドから除去される、上記1~4のいずれかに記載の方法。
6.各サイクルにおいて、前記第1のヌクレオチドが、前記第2のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記二本鎖ポリヌクレオチドへの組み込み時に、前記第1および第2のヌクレオチドが、ヌクレオチド対を形成する、上記1~5のいずれかに記載の方法。
7.連結反応が、平滑末端連結反応を含む、上記6に記載の方法。
8.前記第1のヌクレオチドおよび前記ユニバーサルヌクレオチドが、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、前記ポリヌクレオチド連結分子が、平滑末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用による工程(A)の間に、前記二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が伸長され、前記切断部位が作成される、上記7に記載の方法。
9.前記方法が、
(1)合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、前記支持鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖であり、前記合成鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第2の鎖である、提供することと、
(2)平滑末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を前記足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記所定の配列の第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が、前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(3)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記組み込まれた第1のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(4)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記第2のヌクレオチドが、第1のヌクレオチドに対するパートナーであり、組み込み時に、前記第2のヌクレオチドおよび前記第1のヌクレオチドが、ヌクレオチド対を形成する、伸長することと、
(5)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第1の合成サイクルを行うことを含み、
前記方法が、
(6)平滑末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよびさらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(7)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記前のサイクル(複数可)の前記ヌクレオチド対(複数可)と、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(8)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドに対するパートナーであり、組み込み時に、前記さらなる合成サイクルの前記第2および第1のヌクレオチドが、さらなるヌクレオチド対を形成する、伸長することと、
(9)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6~9を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む、上記6~8のいずれかに記載の方法。
10.(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖中の次のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第1の鎖における前記第1のヌクレオチドとは反対の前記第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される、上記9に記載の方法。
11.(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+2を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+2は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第2のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第1の鎖における前記第1のヌクレオチドとは反対の前記第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される、上記9に記載の方法。
12.(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+2+xを占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+2は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第2のヌクレオチド位置であり、xは、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置n+2に対するヌクレオチド位置の数であり、前記数は、1~10以上の整数であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第1の鎖における前記第1のヌクレオチドとは反対の前記第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される、上記9に記載の方法。
13.各サイクルにおいて、組み込に時に、前記第1のヌクレオチドおよび前記第2のヌクレオチドが、前記合成二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対においてパートナーヌクレオチドになる、上記1~5のいずれかに記載の方法。
14.前記連結反応が、粘着末端連結反応を含む、上記13に記載の方法。
15.前記第1のヌクレオチドおよび前記ユニバーサルヌクレオチドが、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、前記ポリヌクレオチド連結分子が、粘着末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用による工程(A)の間に、前記二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が伸長され、前記切断部位が作成される、上記14に記載の方法。
16.前記方法が、
(1)合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含む、提供することと、
(2)粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を前記足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記所定の配列の第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が、前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への前記組み込みによって作成される、連結することと、
(3)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記組み込まれた第1のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(4)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、所定の配列の第2のヌクレオチドの前記組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、第2のヌクレオチド、伸長することと、
(5)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第1の合成サイクルを行うことを含み、
前記方法が、
(6)粘着末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよびさらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への前記組み込みによって作成される、連結することと、
(7)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記前のサイクル(複数可)の前記ヌクレオチド対(複数可)と、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(8)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
(9)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6~9を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する前記二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む、上記13~15のいずれかに記載の方法。
17.工程(1)において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(2)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第1のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドが、工程(8)において組み込まれた前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
第1およびさらなる合成サイクルにおいて、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端の前記ヌクレオチド突出および前記足場ポリヌクレオチドの前記ヌクレオチド突出が、同じ数のヌクレオチドを含み、前記数は、前記足場ポリヌクレオチドの前記突出中の前記ヌクレオチドの数が、前記相補的連結末端の前記突出中の前記ヌクレオチドの数よりも1つ多いという条件で、1つ以上である、上記16に記載の方法。
18.(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+2を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.前記突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1およびn+2は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第1/次のおよび第2のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中に作成され、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第2の鎖に組み込まれ、前記突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのさらなるサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される、上記17に記載の方法。
19.(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+3を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.前記突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1、n+2、およびn+3は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における次の、第2の、および第3のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中に作成され、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第2の鎖に組み込まれ、前記突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのさらなるサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される、上記17に記載の方法。
20.(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+3+xを占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.前記突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1およびn+3は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第1/次のおよび第3のヌクレオチド位置であり、xは、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置n+3に対するヌクレオチド位置の数であり、前記数は、1~10以上の整数であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中に作成され、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第2の鎖に組み込まれ、前記突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのさらなるサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される、上記17に記載の方法。
21.工程(1)において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第1のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置nを占め、工程(4)において組み込まれた前記第1のサイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置n+1を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、工程(8)において組み込まれた前記次の/第2の合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(2)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記1+y突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第1のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置n+2+xを占め、前記第3の合成サイクルにおいて形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第1のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置nを占め、工程(8)において組み込まれた前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置n+1を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、前記次の合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記1+y突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置n+2+xを占め、前記次の合成サイクルにおいて形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
i.位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、
ii.連結後、位置n+1およびn+2は、前記ヘルパー鎖に対する近位方向/前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第1および第2のヌクレオチド位置であり、
iii.yは、1以上である整数であり、
iv.xは、0以上である整数であり、
v.前記足場ポリヌクレオチドにおける前記yの数は、好ましくは、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端における前記yの数と同じ数であり、yが異なる数である場合、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端における前記yの数は、好ましくは、前記足場ポリヌクレオチドにおける前記yの数よりも少なく、
vi.任意の所与の一連の第1およびさらなるサイクルにおいて、xに対して選択される前記数は、前記足場ポリヌクレオチドで、yに対して選択される数-1である、上記16に記載の方法。
22.第1およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置n+3+xを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置n+3+xとn+2+xとの間で切断される、上記21に記載の方法。
23.第1およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置n+4+xを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置n+3+xとn+2+xとの間で切断される、上記21に記載の方法。
24.前記方法が、
(i)工程(2)において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記第1のサイクルの前記所定の配列の第1のヌクレオチドを含み、前記第1のサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
(ii)切断後の工程(3)において、前記第1のサイクルの前記所定の配列の前記第1およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持されるように、
(iii)工程(4)において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第1のサイクルの前記所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第1のサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記第1のサイクルの前記第2およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、前記次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、
(iv)工程(6)において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第1のヌクレオチドを含み、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
(v)切断後の工程(7)において、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の前記第1およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持されるように、
(vi)工程(8)において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記さらなるサイクルの前記第2およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、前記次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、修正される、上記8~23のいずれかに記載の方法。
25.前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程(3)および(7)において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第1およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、上記24に記載の方法。
26.前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程(3)および(7)において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第1およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次+1のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、上記24に記載の方法。
27.任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、前記所定の配列の第1のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第1のヌクレオチドと相補的な、好ましくは天然に相補的なヌクレオチドである、上記1~26のいずれかに記載の方法。
28.任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、工程(3)および/または(7)の前に、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、前記足場ポリヌクレオチドが提供され、前記合成鎖が、ヘルパー鎖なしで提供される、上記9~27のいずれかに記載の方法。
29.任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、工程(3)および/または(7)の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、上記9~28のいずれかに記載の方法。
30.前記合成鎖の前記ヘルパー鎖部分が、(i)前記足場ポリヌクレオチドを約80℃~約95℃の温度に加熱し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、(ii)前記足場ポリヌクレオチドを8M尿素などの尿素溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、(iii)前記足場ポリヌクレオチドを100%ホルムアミドなどのホルムアミドまたはホルムアミド溶液で処理し、前記足場ポリヌクレオチドから前記ヘルパー鎖部分を分離すること、または(iv)前記足場ポリヌクレオチドを、前記ヘルパー鎖部分の配列と相補的であるヌクレオチド配列の領域を含む一本鎖ポリヌクレオチド分子と接触させて、それにより前記ヘルパー鎖部分と前記足場ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを競合的に阻害することによって、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、上記29に記載の方法。
31.各切断工程が、2工程切断プロセスを含み、各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、したがって脱塩基部位を形成することを含む第1の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第2の工程と、を含む、上記1~10、13~17、18、21、22、24、および25のいずれかに記載の方法。
32.前記第1の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、上記31に記載の方法。
33.前記ヌクレオチド除去酵素が、3-メチルアデニンDNAグリコシラーゼ酵素である、上記32に記載の方法。
34.前記ヌクレオチド除去酵素が、
i.ヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼ(hAAG)、または
ii.ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)である、上記33に記載の方法。
35.前記第2の工程が、塩基である化学物質を用いて行われる、上記31~34のいずれかに記載の方法。
36.前記塩基が、NaOHである、上記35に記載の方法。
37.前記第2の工程が、脱塩基部位切断活性を有する有機化学物質を用いて行われる、上記31~34のいずれかに記載の方法。
38.前記有機化学物質が、N,N’-ジメチルエチレンジアミンである、上記37に記載の方法。
39.前記第2の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われ、任意選択的に、脱塩基部位リアーゼ活性を有する前記酵素が、
(i)APエンドヌクレアーゼ1、
(ii)エンドヌクレアーゼIII(N番目)、または
(iii)エンドヌクレアーゼVIIIである、上記31~34のいずれかに記載の方法。
40.各切断工程が、切断酵素を用いて前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含む1工程切断プロセスを含み、前記酵素が、
(i)エンドヌクレアーゼIII、
(ii)エンドヌクレアーゼVIII、
(iii)ホルムアミドピリミジンDNAグリコシラーゼ(Fpg)、または
(iv)8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ(hOGG1)である、上記1~10、13~17、18、21、22、24、および25のいずれかに記載の方法。
41.前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、上記1~9、11、13~17、19、21、23、24、および26のいずれかに記載の方法。
42.前記酵素が、ヌクレオチド位置n+1とnとの間の前記支持鎖を切断する、上記41に記載の方法。
43.前記酵素が、エンドヌクレアーゼVである、上記41または上記42に記載の方法。
44.前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖がDNA鎖である、上記1~43のいずれかに記載の方法。
45.組み込まれたヌクレオチドが、dNTPである、上記44に記載の方法。
46.組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むdNTPである、上記45に記載の方法。
47.可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの1つ以上が、3’-O-アリル-dNTPである、上記46に記載の方法。
48.可逆的ターミネーター基を含む前記組み込まれたヌクレオチドのうちの1つ以上が、3’-O-アジドメチル-dNTPである、上記46に記載の方法。
49.前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖が、DNA鎖であり、前記合成二本鎖ポリヌクレオチドの他方の鎖が、RNA鎖である、上記1~43のいずれかに記載の方法。
50.前記合成鎖が、RNA鎖であり、前記支持鎖が、DNA鎖である、上記49に記載の方法。
51.組み込まれたヌクレオチドが、NTPである、上記50に記載の方法。
52.組み込まれたヌクレオチドが、可逆的ターミネーター基を含むNTPである、上記51に記載の方法。
53.可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、3’-O-アリル-NTPである、上記52に記載の方法。
54.可逆的ターミネーター基を含む組み込まれたヌクレオチドが、3’-O-アジドメチル-NTPである、上記52に記載の方法。
55.前記ポリメラーゼ酵素が、DNAポリメラーゼ、好ましくは未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むdNTPを組み込む能力が増強された修飾DNAポリメラーゼである、上記1~48のいずれかに記載の方法。
56.前記ポリメラーゼが、Thermococcus種9°N、好ましくは種9°N-7由来の天然DNAポリメラーゼのバリアントである、上記55に記載の方法。
57.前記ポリメラーゼ酵素が、T3またはT7 RNAポリメラーゼなどのRNAポリメラーゼ、任意選択的に、未修飾ポリメラーゼと比較して可逆的ターミネーター基を含むNTPを組み込む能力が増強された修飾RNAポリメラーゼである、上記1~43および49~54のいずれかに記載の方法。
58.前記トランスフェラーゼ酵素が、末端トランスフェラーゼ活性を有し、任意選択的に、前記酵素が、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)、polラムダ、polマイクロ、またはΦ29DNAポリメラーゼである、上記1~57のいずれかに記載の方法。
59.前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去する前記工程が、トリス(カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を用いて行われる、上記5~58のいずれかに記載の方法。
60.前記リガーゼ酵素が、T3 DNAリガーゼまたはT4 DNAリガーゼである、上記1~59のいずれかに記載の方法。
61.任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、工程(1)/(6)において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されている、上記9~60のいずれかに記載の方法。
62.任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、工程(2)/(6)において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、上記9~60のいずれかに記載の方法。
63.任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、
c)工程(1)/(6)において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されており、
d)工程(2)/(6)において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、上記9~60のいずれかに記載の方法。
64.工程(1)および(6)において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖および/またはそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分が、共通の表面に繋留されている、上記9~60のいずれかに記載の方法。
65.前記プライマー鎖部分および/またはそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分が、切断可能なリンカーを含み、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、上記64に記載の方法。
66.工程(1)および(6)において、前記足場ポリヌクレオチド中の前記ヘアピンループが表面に繋留されている、上記62および63に記載の方法。
67.前記ヘアピンループが、切断可能なリンカーを介して表面に繋留され、前記リンカーが、合成後に前記表面から前記二本鎖ポリヌクレオチドを切り離すために切断され得る、上記66に記載の方法。
68.前記切断可能なリンカーが、UV切断可能なリンカーである、上記65または67に記載の方法。
69.前記表面が、微粒子である、上記64~68のいずれかに記載の方法。
70.前記表面が、平坦な表面である、上記64~68のいずれかに記載の方法。
71.前記表面が、ゲルを含む、上記66~70のいずれかに記載の方法。
72.前記表面が、約2%のポリアクリルアミドなどのポリアクリルアミド表面を含み、好ましくは、前記ポリアクリルアミド表面が、ガラスなどの固体支持体に結合されている、上記71に記載の方法。
73.前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、1つ以上の共有結合を介して前記共通の表面に繋留されている、上記64~72のいずれかに記載の方法。
74.前記1つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成され、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、上記73に記載の方法。
75.前記共通の表面上の前記官能基が、ブロモアセチル基であり、任意選択的に、前記ブロモアセチル基が、N-(5-ブロモアセトアミジルペンチル)アクリルアミド(BRAPA)を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、上記74に記載の方法。
76.合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われる、上記1~75のいずれかに記載の方法。
77.前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、上記76に記載の方法。
78.前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム(EWOD)である、上記77に記載の方法。
79.合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得る、上記1~78のいずれかに記載の方法。
80.合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、好ましくはPCRによって増幅される、上記1~79のいずれかに記載の方法。
81.所定の配列を有するポリヌクレオチドを構築する方法であって、所定の配列を有する第1のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する1つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために上記1~80のいずれかに記載の方法を行うことと、前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
82.前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、二本鎖である、上記81に記載の方法。
83.前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、一本鎖である、上記81に記載の方法。
84.前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、好ましくは連結によって一緒に接合される、上記81~83のいずれかに記載の方法。
85.前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、上記84に記載の方法。
86.前記合成および/またはアセンブリ工程が、微小流体システム内の液滴中で行われる、上記77~85のいずれかに記載の方法。
87.前記アセンブリ工程が、所定の配列を有する第1の合成ポリヌクレオチドを含む第1の液滴と、所定の配列を有する追加の1つ以上の合成ポリヌクレオチドを含む第2の液滴と、を提供することを含み、前記液滴が、互いに接触し、前記合成ポリヌクレオチドが、一緒に接合され、それにより前記第1および追加の1つ以上のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドをアセンブリする、上記86に記載の方法。
88.前記合成工程が、各液滴が前記合成サイクルの工程に対応する反応試薬を含む、複数の液滴を提供することと、前記合成サイクルの前記工程に従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を順次送達することと、によって行われる、上記87に記載の方法。
89.液滴の送達後かつ次の液滴の送達の前に、過剰の反応試薬を除去するために洗浄工程が実施される、上記88に記載の方法。
90.前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、上記88および89に記載の方法。
91.前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム(EWOD)である、上記90に記載の方法。
92.合成工程およびアセンブリ工程が、同じシステム内で行われる、上記87~91のいずれかに記載の方法。
93.上記1~92のいずれかに記載の方法を実施するためのポリヌクレオチド合成システムであって、(a)各反応領域が少なくとも1つの足場ポリヌクレオチドを含む、反応領域のアレイと、(b)前記反応試薬を前記反応領域に送達するための手段と、任意選択的に(c)前記足場ポリヌクレオチドからの前記合成二本鎖ポリヌクレオチドを切断するための手段と、を含む、ポリヌクレオチド合成システム。
94.前記反応試薬を液滴で提供するための手段と、前記合成サイクルに従って前記足場ポリヌクレオチドに前記液滴を送達するための手段と、をさらに含む、上記93に記載のシステム。
95.上記93または94に記載のシステムと共に使用するため、かつ上記1~92のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、前記合成サイクルの前記工程に対応する反応試薬の容量を含む、キット。
96.ポリヌクレオチドマイクロアレイを作製する方法であって、前記マイクロアレイが複数の反応領域を含み、各領域が所定の配列を有する1つ以上のポリヌクレオチドを含み、前記方法が、
a)複数の反応領域を含む表面を提供することであって、各領域が1つ以上の二本鎖アンカーまたは足場ポリヌクレオチドを含む、提供することと、
b)各反応領域で上記1~78のいずれかに記載の方法に従って合成サイクルを行い、それにより各領域で所定の配列を有する1つ以上の二本鎖ポリヌクレオチドを合成することと、を含む、方法。
97.合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、マイクロアレイを提供し、各領域が、所定の配列を有する1つ以上の一本鎖ポリヌクレオチドを含む、上記96に記載の方法。
Claims (42)
- 所定の配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドをインビトロで合成する方法であって、前記方法が、合成サイクルを行うことを含み、各サイクルにおいて、
(A)二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が、リガーゼ酵素の作用によって、前記所定の配列の第1のヌクレオチドの付加により伸長され、
(B)次いで、前記二本鎖ポリヌクレオチドが、切断部位で切断され、
(C)次いで、前記第1の鎖にハイブリダイズされる第2の鎖が、ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素によって、前記所定の配列の第2のヌクレオチドの付加により伸長され、
各サイクルの前記所定の配列の前記第1および第2のヌクレオチドが、切断後に、前記二本鎖ポリヌクレオチドにおいて保持され、
所与の合成サイクルにおいて、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第2の鎖に付加される、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記可逆的ターミネーター基が、次のサイクルの前記第2のヌクレオチドの前記次の合成サイクルにおける前記付加の前に、そのサイクルの組み込まれた第2のヌクレオチドから除去される、
方法。 - (a)前記切断部位が、ユニバーサルヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によって定義される、および/または
(b)各サイクルにおいて、前記第2の鎖の伸長の前に、前記二本鎖ポリヌクレオチド中に切断部位が作成される、請求項1に記載の方法。 - 前記リガーゼ酵素の作用による工程(A)の間に、ユニバーサルヌクレオチドが、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に組み込まれて、前記切断部位を定義する、請求項2に記載の方法。
- 各サイクルにおいて、前記第1のヌクレオチドが、前記第2のヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記二本鎖ポリヌクレオチドへの組み込み時に、前記第1および第2のヌクレオチドが、ヌクレオチド対を形成する、
請求項2または3に記載の方法。 - 連結反応が、平滑末端連結反応を含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第1のヌクレオチドおよび前記ユニバーサルヌクレオチドが、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、前記ポリヌクレオチド連結分子が、平滑末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用による工程(A)の間に、前記二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が伸長され、前記切断部位が作成される、請求項4または5に記載の方法。
- 前記方法が、
(1)合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含み、前記支持鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖であり、前記合成鎖が、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第2の鎖である、提供することと、
(2)平滑末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を前記足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記相補的連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記所定の配列の第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が、前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(3)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記組み込まれた第1のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(4)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記第2のヌクレオチドが、第1のヌクレオチドに対するパートナーであり、組み込み時に、前記第2のヌクレオチドおよび前記第1のヌクレオチドが、ヌクレオチド対を形成する、伸長することと、
(5)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第1の合成サイクルを行うことを含み、
前記方法が、
(6)平滑末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記相補的連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよびさらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの第1の鎖が、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への組み込みによって作成される、連結することと、
(7)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記前のサイクル(複数可)の前記ヌクレオチド対(複数可)と、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(8)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドに対するパートナーであり、組み込み時に、前記さらなる合成サイクルの前記第2および第1のヌクレオチドが、さらなるヌクレオチド対を形成する、伸長することと、
(9)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6~9を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む、請求項4~6のいずれか一項に記載の方法。 - (I)(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖中の次のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第1の鎖における前記第1のヌクレオチドとは反対の前記第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される、または
(II)(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+2を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+2は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第2のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第1の鎖における前記第1のヌクレオチドとは反対の前記第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される、または
(III)(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置nを占め、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+2+xを占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、かつ
iii.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+2は、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第2のヌクレオチド位置であり、xは、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置n+2に対するヌクレオチド位置の数であり、前記数は、1~10以上の整数であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+1とnとの間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第1の鎖における前記第1のヌクレオチドとは反対の前記第2の鎖に組み込まれ、かつそれと対合し、そのときに、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置n-1として定義される、請求項7に記載の方法。 - 各サイクルにおいて、組み込み時に、前記第1のヌクレオチドおよび前記第2のヌクレオチドが、前記合成二本鎖ポリヌクレオチド中の異なるヌクレオチド対においてパートナーヌクレオチドになる、請求項2または3に記載の方法。
- 前記連結反応が、粘着末端連結反応を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記第1のヌクレオチドおよび前記ユニバーサルヌクレオチドが、ポリヌクレオチド連結分子の構成成分であり、前記ポリヌクレオチド連結分子が、粘着末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用による工程(A)の間に、前記二本鎖ポリヌクレオチドに連結され、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記二本鎖ポリヌクレオチドへの連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が伸長され、前記切断部位が作成される、請求項9または10に記載の方法。
- 前記方法が、
(1)合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、足場ポリヌクレオチドを提供することであって、前記合成鎖が、プライマー鎖部分を含む、提供することと、
(2)粘着末端連結反応におけるリガーゼ酵素の作用によって、二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を前記足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記相補的連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよび前記所定の配列の第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が、前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への前記組み込みによって作成される、連結することと、
(3)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記組み込まれた第1のヌクレオチドを含む切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(4)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、所定の配列の第2のヌクレオチドの前記組み込みにより、二本鎖足場ポリヌクレオチドの合成鎖のプライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、第2のヌクレオチド、伸長することと、
(5)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、を含む、第1の合成サイクルを行うことを含み、
前記方法が、
(6)粘着末端連結反応における前記リガーゼ酵素の作用によって、さらなる二本鎖ポリヌクレオチド連結分子を、前記切断された足場ポリヌクレオチドに連結することであって、前記ポリヌクレオチド連結分子が、支持鎖と、それにハイブリダイズされたヘルパー鎖と、を含み、相補的連結末端をさらに含み、前記相補的連結末端が、
(i)前記支持鎖中に、ユニバーサルヌクレオチドおよびさらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、
(ii)前記ヘルパー鎖中に、連結不可能な末端ヌクレオチドと、を含み、
連結時に、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記第1の鎖が、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドで伸長され、前記切断部位が、前記ユニバーサルヌクレオチドの前記第1の鎖への前記組み込みによって作成される、連結することと、
(7)前記連結された足場ポリヌクレオチドを前記切断部位で切断することであって、切断が、前記支持鎖を切断することと、前記足場ポリヌクレオチドから前記ユニバーサルヌクレオチドを除去して、前記前のサイクル(複数可)の前記ヌクレオチド対(複数可)と、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドと、を含む、切断された二本鎖足場ポリヌクレオチドを提供することと、を含む、切断することと、
(8)前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドの組み込みにより、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端を伸長することであって、前記第2のヌクレオチドが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含む、伸長することと、
(9)前記第2のヌクレオチドから前記可逆的ターミネーター基を除去することと、
(10)工程6~9を複数回繰り返して、所定のヌクレオチド配列を有する前記二本鎖ポリヌクレオチドを得ることと、を含む、さらなる合成サイクルを行うことをさらに含む、請求項9~11のいずれか一項に記載の方法。 - (a)工程(1)において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(2)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第1のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドが、工程(8)において組み込まれた前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、ヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドであり、前記次の合成サイクルで形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
第1およびさらなる合成サイクルにおいて、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端の前記ヌクレオチド突出および前記足場ポリヌクレオチドの前記ヌクレオチド突出が、同じ数のヌクレオチドを含み、前記数は、前記足場ポリヌクレオチドの前記突出中の前記ヌクレオチドの数が、前記相補的連結末端の前記突出中の前記ヌクレオチドの数よりも1つ多いという条件で、1つ以上である、または
(b)工程(1)において、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第1のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置nを占め、工程(4)において組み込まれた前記第1のサイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置n+1を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、工程(8)において組み込まれた前記次の/第2の合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(2)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記1+y突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、そのサイクルの前記第1のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置n+2+xを占め、前記第3の合成サイクルにおいて形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて、前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記支持鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記支持鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記突出の前記第1のヌクレオチドが、前記突出の前記末端に対して遠位にある前記突出中の位置を占め、ヌクレオチド位置nを占め、工程(8)において組み込まれた前記さらなる合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、位置n+1を占める前記突出の前記ヌクレオチドが、前記次の合成サイクルの前記第2のヌクレオチドに対する前記パートナーヌクレオチドであり、
工程(6)において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端に、前記ヘルパー鎖の前記末端が、1+yヌクレオチドを含むヌクレオチド突出を含み、前記ヘルパー鎖の前記1+yヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドに突出し、前記足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖の前記1+y突出ヌクレオチドに対するパートナーヌクレオチドであり、前記相補的連結末端の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドが、前記さらなる合成サイクルの前記第1のヌクレオチドであり、ヌクレオチド位置n+2+xを占め、前記次の合成サイクルにおいて形成される異なるヌクレオチド対におけるパートナーヌクレオチドであり、
i.位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、
ii.連結後、位置n+1およびn+2は、前記ヘルパー鎖に対する近位方向/前記プライマー鎖部分に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第1および第2のヌクレオチド位置であり、
iii.yは、1以上である整数であり、
iv.xは、0以上である整数であり、
v.yが異なる数である場合、、
v.任意の所与の一連の第1およびさらなるサイクルにおいて、xに対して選択される前記数は、前記足場ポリヌクレオチドで、yに対して選択される数-1である、
請求項12に記載の方法。 - 前記足場ポリヌクレオチドにおける前記yの数は、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端における前記yの数と同じ数である、請求項13に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端における前記yの数は、前記足場ポリヌクレオチドにおける前記yの数よりも少ない、請求項13に記載の方法。
- (i)(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖の前記最後から2番目のヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+2を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.前記突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1およびn+2は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第1/次のおよび第2のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中に作成され、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第2の鎖に組み込まれ、前記突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのさらなるサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される、または
(ii)(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+3を占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.前記突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1、n+2、およびn+3は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における次の、第2の、および第3のヌクレオチド位置であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中に作成され、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第2の鎖に組み込まれ、前記突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのさらなるサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される、または
(iii)(a)前記第1のサイクルの連結工程(工程2)において、およびすべてのさらなるサイクルの連結工程において、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、
i.そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドが、前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドであり、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+1を占め、前記ヘルパー鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合するように、
ii.前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記支持鎖中のヌクレオチド位置n+3+xを占め、前記ヘルパー鎖中のパートナーヌクレオチドと対合するように、
iii.前記突出が、1つのヌクレオチド突出を含み、そのサイクルの前記所定の配列の前記第1のヌクレオチドに突出する前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドを含むように、かつ
iv.前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドが、連結不可能なヌクレオチドであるように、構造化され、
位置nは、その組み込み時に、そのサイクルの前記所定の配列の前記第2のヌクレオチドとは反対である前記ヌクレオチド位置であり、位置n+1およびn+3は、それぞれ、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置nに対する前記支持鎖における前記第1/次のおよび第3のヌクレオチド位置であり、xは、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、位置n+3に対するヌクレオチド位置の数であり、前記数は、1~10以上の整数であり、連結時に、前記ポリヌクレオチド連結分子の前記支持鎖の前記末端ヌクレオチドは、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分に対して近位にある前記足場ポリヌクレオチドの前記末端ヌクレオチドに連結され、一本鎖切断が、前記ヘルパー鎖の前記末端ヌクレオチドと前記合成鎖の前記プライマー鎖部分との間に作成され、
(b)前記第1のサイクルの前記切断工程(工程3)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、前記連結された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖が、位置n+2とn+1との間で切断され、それによって、前記足場ポリヌクレオチドから前記ポリヌクレオチド連結分子を放出し、対合されず、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記第1の鎖に付着したそのサイクルの前記第1のヌクレオチドを保持し、切断時に、二重ヌクレオチド突出が、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中に作成され、前記支持鎖の前記末端および最後から2番目のヌクレオチドが、前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の前記末端ヌクレオチドに突出し、
(c)前記第1のサイクルの前記伸長工程(工程4)において、およびすべてのさらなるサイクルにおいて、そのサイクルの前記第2のヌクレオチドが、前記第2の鎖に組み込まれ、前記突出している支持鎖の最後から2番目のヌクレオチドと対合し、工程(8)および(9)の後、前記切断された足場ポリヌクレオチドの前記支持鎖中のそのさらなるサイクルの前記第1のヌクレオチドによって占められる位置が、前記次の合成サイクルにおいて、ヌクレオチド位置nとして定義される、
請求項13~15のいずれか一項に記載の方法。 - (a)第1およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置n+3+xを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置n+3+xとn+2+xとの間で切断される、または
(b)第1およびさらなるサイクルの両方において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド連結分子および前記連結された足場ポリヌクレオチドの両方において、位置n+4+xを占め、前記足場ポリヌクレオチドが、位置n+3+xとn+2+xとの間で切断される
請求項13(b)に記載の方法。 - 前記方法が、
(i)工程(2)において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記第1のサイクルの前記所定の配列の第1のヌクレオチドを含み、前記第1のサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
(ii)切断後の工程(3)において、前記第1のサイクルの前記所定の配列の前記第1およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持されるように、
(iii)工程(4)において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第1のサイクルの前記所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記第1のサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記第1のサイクルの前記第2およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、前記次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、
(iv)工程(6)において、前記ポリヌクレオチド連結分子には、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第1のヌクレオチドを含み、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドをさらに含む、相補的連結末端が提供されるように、
(v)切断後の工程(7)において、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の前記第1およびさらなるヌクレオチドが、前記切断された足場ポリヌクレオチドにおいて保持されるように、
(vi)工程(8)において、前記二本鎖足場ポリヌクレオチドの前記合成鎖の前記プライマー鎖部分の末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の第2のヌクレオチドの組み込みにより伸長され、前記プライマー鎖部分の前記末端が、前記ヌクレオチドトランスフェラーゼまたはポリメラーゼ酵素の作用による、前記さらなるサイクルの前記所定の配列の1つ以上のさらなるヌクレオチドの組み込みによりさらに伸長され、前記さらなるサイクルの前記第2およびさらなるヌクレオチドのそれぞれが、前記酵素によるさらなる伸長を防止する可逆的ターミネーター基を含み、各さらなる伸長後、前記可逆的ターミネーター基が、前記次のヌクレオチドの組み込みの前にヌクレオチドから除去されるように、修正される、請求項7~8のいずれか一項に記載の方法。 - (a)前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程(3)および(7)において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第1およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記ユニバーサルヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、または
(b)前記ポリヌクレオチド連結分子の前記相補的連結末端が、切断前の工程(3)および(7)において、前記ユニバーサルヌクレオチドが、前記相補的連結末端に対する遠位方向において、前記第1およびさらなるヌクレオチドの前記ヌクレオチド位置の後の、前記支持鎖中の次+1のヌクレオチド位置である前記支持鎖中の位置を占めるように、かつ前記支持鎖が、最後のさらなるヌクレオチドによって占められる位置と、前記支持鎖中の次のヌクレオチドによって占められる位置との間で切断されるように、構造化される、
請求項18に記載の方法。 - 任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、前記所定の配列の第1のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第1のヌクレオチドと相補的なヌクレオチドである、請求項1~19のいずれか一項に記載の方法。
- 任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、前記所定の配列の第1のヌクレオチドと対合するパートナーヌクレオチドが、前記第1のヌクレオチドと天然に相補的なヌクレオチドである、請求項20に記載の方法。
- (a)任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、工程(3)および/または(7)の前に、合成鎖と、それにハイブリダイズされた支持鎖と、を含む、前記足場ポリヌクレオチドが提供され、前記合成鎖が、ヘルパー鎖なしで提供される、および/または
(b)任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、工程(3)および/または(7)の前に、前記合成鎖の前記ヘルパー鎖の部分が、前記足場ポリヌクレオチドから除去される、
請求項7~8及び18~19、並びに請求項7に従属する請求項20~21のいずれか一項に記載の方法。 - (a)各切断工程が、2工程切断プロセスを含み、各切断工程が、前記ユニバーサルヌクレオチドを除去し、したがって脱塩基部位を形成することを含む第1の工程と、前記支持鎖を前記脱塩基部位で切断することを含む第2の工程と、を含み、または
(b)各切断工程が、切断酵素を用いて前記ユニバーサルヌクレオチドを除去することを含む1工程切断プロセスを含み、前記酵素が、
(i)エンドヌクレアーゼIII、
(ii)エンドヌクレアーゼVIII、
(iii)ホルムアミドピリミジンDNAグリコシラーゼ(Fpg)、または
(iv)8-オキソグアニンDNAグリコシラーゼ(hOGG1)である、
請求項7~8(i)、請求項18および19(a)のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の工程が、ヌクレオチド除去酵素を用いて行われる、請求項23に記載の方法。
- 前記第2の工程が、脱塩基部位リアーゼ活性を有する酵素を用いて行われる、請求項23または24に記載の方法。
- 脱塩基部位リアーゼ活性を有する前記酵素が、
(i)APエンドヌクレアーゼ1、
(ii)エンドヌクレアーゼIII(N番目)、または
(iii)エンドヌクレアーゼVIIIである、
請求項25に記載の方法。 - 前記切断工程が、前記支持鎖を酵素で切断することを含む、請求項7~8(ii)、請求項18および19(b)のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、ヌクレオチド位置n+1とnとの間の前記支持鎖を切断する、および/または前記酵素が、エンドヌクレアーゼVである、請求項27に記載の方法。
- 任意の1つ以上またはすべての合成サイクルにおいて、
(a)工程(1)/(6)において、前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記足場ポリヌクレオチドにおいて、ヘアピンループによって接続されており、
(b)工程(2)/(6)において、前記ヘルパー鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、前記ポリヌクレオチド連結分子において、前記相補的連結末端とは反対の末端でヘアピンループによって接続されている、請求項7~8、18~19、及び22~28、並びに請求項7に従属する20~21のいずれか一項に記載の方法。 - 前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、共通の表面に繋留されている、請求項7~8、18~19、及び22~29、並びに請求項7に従属する請求項20~21のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プライマー鎖部分を含む前記合成鎖とそれにハイブリダイズされた前記支持鎖の前記部分とが、1つ以上の共有結合を介して共通の表面に繋留されている、請求項30に記載の方法。
- 前記1つ以上の共有結合が、前記共通の表面上の官能基と足場分子上の官能基との間に形成されており、前記足場分子上の前記官能基が、アミン基、チオール基、チオリン酸基、またはチオアミド基である、請求項31に記載の方法。
- 前記共通の表面上の前記官能基が、ブロモアセチル基である、請求項32に記載の方法。
- 前記ブロモアセチル基が、N-(5-ブロモアセトアミジルペンチル)アクリルアミド(BRAPA)を使用して得られるポリアクリルアミド表面上に提供される、請求項33に記載の方法。
- (a)合成サイクルが、微小流体システム内の液滴中で行われ、および/または
(b)合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドの前記鎖が分離されて、所定の配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを得る、および/または
(c)合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、増幅される、
請求項1~34のいずれか一項に記載の方法。 - 前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングシステムである、請求項35に記載の方法。
- 前記微小流体システムが、エレクトロウェッティングオン誘電体システム(EWOD)である、請求項36に記載の方法。
- 合成後、前記二本鎖ポリヌクレオチドまたはその領域が、PCRによって増幅される、請求項35~37のいずれか一項に記載の方法。
- 所定の配列を有するポリヌクレオチドを構築する方法であって、所定の配列を有する第1のポリヌクレオチドおよび所定の配列を有する1つ以上の追加のポリヌクレオチドを合成するために請求項1~38のいずれか一項に記載の方法を行うことと、前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドを一緒に接合することと、を含む、方法。
- 前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、接合される、請求項39に記載の方法。
- 前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、適合する末端を作成するために切断され、連結によって一緒に接合される、請求項39に記載の方法。
- 前記第1のポリヌクレオチドおよび前記1つ以上の追加のポリヌクレオチドが、切断部位で制限酵素によって切断される、請求項39~41のいずれか一項に記載の方法。
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