DE602004011546T2

DE602004011546T2 - Verfahren zur sequenz-saturations-mutagenese (sesam)

Info

Publication number: DE602004011546T2
Application number: DE602004011546T
Authority: DE
Inventors: Ulrich Schwaneberg
Original assignee: BASF SE
Current assignee: Jacobs University Bremen Ggmbh 28759 Bremen De; Sesam-Biotech 28759 Bremen De GmbH
Priority date: 2003-10-02
Filing date: 2004-09-30
Publication date: 2008-05-29
Anticipated expiration: 2024-10-01
Also published as: JP2007507212A; WO2005035757A1; CN1860227A; EP1670914B1; ES2297492T3; CN1860227B; US20060223148A1; DK1670914T3; EP1670914A1; JP4299342B2; ATE384789T1; US7790374B2; DE602004011546D1

Description

Inspiriert durch die Darwin'sche Evolution in der Natur, wurden Zufallsmutageneseverfahren entwickelt, um Proteine auf unsere Bedürfnisse zuzuschneiden und Struktur-Funktions-Beziehungen aufzuklären (1). Die Erzeugung von Vielfalt auf der genetischen Ebene ist das komplementäre Werkzeug zum Gen-Shuffling, da dadurch die Gelegenheit zur Einführung neuartiger Mutationen entsteht, um Proteine an nicht natürliche Milieus in biotechnologischen Verfahren anzupassen. Der Sequenzraum einer wirklich randomisierten Bibliothek wird aufgrund seiner Beschaffenheit nicht durch eine Vorselektion auf Funktion unter physiologischen Bedingungen beschränkt. In Gen-Shuffling-Experimenten verwendete Ausgangsgene werden durch natürliche Evolution auf Funktion unter physiologischen Bedingungen optimiert.
Unter den Zufallsmutageneseverfahren werden aufgrund ihrer Einfachheit und Vielseitigkeit am häufigsten aufgrund von ungenauer Amplifikation von Genen zu Fehlern neigende PCR-Verfahren verwendet. Zu Fehlern neigende PCR-Verfahren lassen sich in drei Kategorien einteilen: A) Verfahren, die die Treue der Polymerase durch Einführung eines Ungleichgewichts der Nukleotidkonzentrationen und/oder Zugabe von Manganchlorid reduzieren (2-4), B) Verfahren, bei denen Nukleotidanaloge eingesetzt werden (5, 6), und C) kombinierte Verfahren (A und B; (7)).
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mutagenese einer doppelsträngigen Polynukleotidsequenz (Master-Sequenz) aus n Basenpaaren mit einem (+)-Strang und einem komplementären (-)-Strang, bei dem man die folgenden Schritte durchführt:

(i) Erzeugung einer Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten des (+)-Strangs der Master-Sequenz, wobei alle Mitglieder der Sammlung den gleichen 5'-Terminus sowie eine Deletion im 3'-Terminus aufweisen, so daß die Sammlung (+)-Stränge mit einer Länge von n-1, n-2, n-3, ... Nukleotiden repräsentiert;
(ii) Einführung wenigstens eines universellen oder degenerierten Nukleotids am 3'-Terminus des in Schritt (i) hergestellten (+)-Strangs;
(iii) Elongation des in Schritt (ii) hergestellten (+)-Strangs auf die volle Länge der Master-Sequenz unter Verwendung des (-)-Strangs oder von Fragmenten davon als Matrizenstrang für die Elongation;
(iv) Synthese eines (-)-Strangs mittels Verwendung des in Schritt (iii) hergestellten (+)-Strangs als Matrizenstrang, wodurch Mutationen im (-)-Strang an den Positionen der obigen universellen oder degenerierten Nukleotide, verglichen mit der Master-Sequenz, herbeigeführt werden.

Bei einem universellen Nukleotid handelt es sich um ein Nukleotid, das mit allen vier Standardnukleotiden paaren kann. So gestattet beispielsweise der Einbau von Desoxyinosintriphosphat (dITP) in einen Polynukleotidstrang die Basenpaarung mit Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin.
Bevorzugte universelle Nukleotide sind Desoxyinosin, 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol.
Bei einem degenerierten Nukleotid handelt es sich um ein Nukleotid, das mit weniger als allen vier Standardnukleotiden paaren kann. Bevorzugte degenerierte Nukleotide sind N⁶-Methoxy-2,6-diaminopurin (K), N⁶-Methoxyaminopurin (Z), Hydroxylaminopurin (HAP), 2'-Desoxyribonukleosidtriphosphat (dyTP), 6H, 8H-3,4-Dihydropyrimidol-[4,5-c][1,2]-oxazin-7-on (P), N⁴-Aminocytidin, N⁴-Hydroxy-2'-desoxycytidin, N⁴-Methoxy-2'-desoxycytidin und 8-Oxodesoxyguanosintriphosphat (8- oxo-G).
Ein Nukleotidanalog mit promiskuitiver Basenpaarungseigenschaft bedeutet, daß ein auf einer Purin- oder Pyrimidinstruktur (z.B. A, G, C, T), die in einer oder mehreren ihrer funktionellen Gruppen modifiziert ist, beruhendes Nukleotid mit mehr als einem anderen Nukleotid, beispielsweise mit 2, 3 oder 4 Nukleotiden, Basenpaare ausbilden kann. Ebenso sind die universellen Nukleotide und degenerierten Nukleotide von dem Begriff Nukleotidanalog mit promiskuitiver Basenpaarungseigenschaft umfaßt.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist ein wie oben beschriebenes Verfahren, wobei ein Oligonukleotid der allgemeinen Formel p(U)a(N)b*(S)c[TERM]mit

p: = 5'-Phosphat oder Hydroxygruppe oder eine beliebige, zur Bildung von Diesterbindungen fähige chemische Gruppe,
U: = universelle oder degenerierte Basen,
a: = willkürliche ganze Zahl von 0 bis 10000, bevorzugt von 1-100
N: = Gemisch aus vier Basen (A/T/G/C (Standardnukleotide)),
b: = willkürliche ganze Zahl von 0 bis 100, bevorzugt von 1-10,
*: = spaltbare Gruppe, wie z.B. Phosphothioatbindungen in Phosphothioatnukleotiden,
S: = Standardnukleotid oder Nukleotidanalog,
c: = willkürliche ganze Zahl von 0 bis 100, bevorzugt von 1-10
[TERM]: = Farbstoffterminator oder eine beliebige Gruppe, die die Elongation des Oligonukleotids verhindert, mit der Maßgabe, daß a + b > 0, vorzugsweise > 1, stärker bevorzugt > 2, ist,

Bei [TERM] kann es sich um eine beliebige Gruppe handeln, die die Elongation des oben erwähnten Oligonukleotids verhindert, vorzugsweise einen Wasserstoff oder einen Farbstoffterminator. Bevorzugte Farbstoffterminatoren sind Cumarin, 6-FAM, Fluorescein, Fluorescein-dT, JOE, Oregon Green, ROX, TAMRA oder Texas Red-X.
Eine weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ist die Erzeugung einer Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten des (+)-Strangs der Master-Sequenz gemäß Schritt (i) durch Einbau von alpha-Phosphothioat-nukleotiden, vorzugsweise dATPαS, dGTPαS, dTTPαS, dCTPαS, in die PCR-Produkte und anschließende Spaltung der Phosphothioatbindung durch Iod unter alkalischen Bedingungen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das folgende Verfahren für Schritt (iii): ausgehend von einem Doppelstrangplasmid, das die Master-Sequenz enthält, wird eine (-)-Einzelstrangplasmid-Polynukleotidsequenz unter Verwendung eines Primers synthetisiert, der beim Annealing stromabwärts von dem (+)-Strang der Master-Sequenz bindet. Diese (-)-Einzelstrangplasmid-Polynukleotidsequenz wird in einem Annealing-Schritt mit den in Schritt (ii) hergestellten (+)-Strängen gebunden. Die (+)-Stränge werden unter Verwendung des (-)-Strangs als Matrize auf die volle Länge der Master-Sequenz elongiert. Dieses Verfahren ist in 3 dargestellt.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen sind in den Ansprüchen offenbart.
Schritt (i): Erzeugung einer Sammlung von DNA-Fragmenten mit Längenverteilung
Im ersten Schritt wird eine PCR unter Verwendung von biotinyliertem Vorwärtsprimer und nicht biotinyliertem Rückwärtsprimer in Gegenwart sowohl von Standardnukleotiden als auch α-Phosphothioat-Nukleotiden ausgeführt. α-Phosphothioat-Nukleotide sind normalen Nukleotiden ähnlich, außer daß ein Sauerstoffatom des α-Phosphats gegen ein Schwefelatom ausgetauscht ist. Die Phosphothioatbindung ist im alkalischen Milieu für eine Iod-Spaltung anfällig. Durch Zufallsverteilung von Phosphothioaten in der DNA wird in einer einzigen PCR eine Bibliothek von Fragmenten erzeugt, die an jeder einzelnen Base enden. Dabei können sich "Nicks" (Einzelstrangbruchstellen) bilden, falls die Bindung zwischen zwei komplementären Strängen stark ist. Biotinylierte Fragmente werden unter Verwendung von mit Strepavidin beschichteten biomagnetischen Kügelchen isoliert. Anschließend wird eine DNA-Schmelzlösung (0,1 M NaOH) verwendet, um nicht biotinylierte Stränge sowie unerwünschte Fragmente abzutrennen. Biotinylierte Fragmente lassen sich leicht aus biomagnetischen Kügelchen durch Kochen in 0,1% SDS-Lösung freisetzen. Ein Schema des ersten Schritts ist in 1a dargestellt, wobei die entsprechenden experimentellen Daten in 1b dargestellt sind.
Schritt (ii): Enzymatische Elongation
Zur Elongation von DNA-Fragmenten mit universellen Basen oder degenerierten Basen (2) lassen sich zwei Ansätze verwenden. In einem ersten Ansatz wurde terminale Desoxynukleotidyl-Transferase zum Einbau mehrdeutiger Basen (universelle Base oder degenerierte Base) an den 3'-Termini verwendet. Der zweite Ansatz erfordert eine Einzelstrang-DNA-Ligation zwischen DNA-Fragmenten und einem "speziellen" Oligo. Dieses "spezielle" Oligo ist 5'-phosphoryliert, um die Ligation zu erleichtern. Es endet mit Fluorescein, um eine intra- und intermolekulare Ligation zu vermeiden und den Einbau zu quantifizieren. Es gibt drei unterschiedliche Teile in diesem Oligo: 1) "Mutationsteil" mit universellen Basen oder degenerierten Basen, 2) "Anhaftungsteil", bestehend aus drei Basen, der alle 64 Möglichkeiten umfasst, indem äquimolare Mengen an A/T/G/C in der Oligosynthese verwendet werden. Dieser Teil ist dafür vorgesehen, das Annealing in der anschließenden, für die Synthese des Vollängen-Gens verwendeten PCR zu unterstützen. Der "Redundante Teil" ist mit dem "Anhaftungsteil" über eine Phosphothioatbindung verbunden, die seine Spaltung nach dem Iodverfahren gestattet. Die ssDNA-Ligation läßt sich unter Verwendung der ThermoPhage RNA-Ligase II (Prokaria) durchführen. ThermoPhage RNA-Ligase II katalysiert die ATP-abhängige intra- und intermolekulare Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Termini einzelsträngiger DNA oder RNA. Dieses Enzym stammt aus dem thermophilen Phage TS2126, der das thermophile Eubakterium Thermus scotoductus infiziert. Dieses temperaturstabile Enzym ist zu der aus dem Bakteriophagen T4 stammenden RNA-Ligase homolog. Es zeigt im Vergleich mit T4-RNA-Ligase eine bessere Effizienz bei der ssDNA-Ligation. Die Ligationseffizienz wurde durch Ligieren eines mit Fluorescein markierten Oligos an eine einzelsträngige DNA-Matrize bestimmt. Nach der Ligation wird der "Redundante Teil" durch Iodspaltung im alkalischen Milieu abgetrennt.
Schritt (iii): Vollängen-Gen-Synthese
Der dritte Schritt besteht in der Verlängerung der elongierten Fragmente auf die volle Länge (3). Hier wird dabei eine einzelsträngige Matrize verwendet, um die Wildtyp-Amplifikation zu vermeiden. Einzelsträngige Matrize wird unter Verwendung von Rückwärtsprimer synthetisiert. Methylierte und hemimethylierte Ausgangsgene werden mittels Dpn I-Verdauung entfernt. Diese Vorgehensweise ist ähnlich der QuikChange Site-Directed Mutagenesis (Stratagene), außer daß statt eines Paars mutagener Primer nur ein nicht mutagener Primer verwendet wird. Elongierte. Fragmente binden sich beim Annealing aufgrund von Komplementaritäten an einzelsträngige Matrize an, wobei der Einzelstrang auf die Vollänge verlängert wird. In dieser PCR-Reaktion vorhandene Rückwärtsprimer können sich beim Annealing nur an den neu synthetisierten Vollängen-Einzelstrang und nicht an einzelsträngige Matrize binden. Nach Bindung der Rückwärtsprimer werden die doppelsträngigen Vollängen-Gene synthetisiert. Doppelsträngige DNAs enthalten in einem Strang Nukleotidanaloge und im anderen Strang Standardnukleotide.
Falls in dieser PCR statt einer einzelsträngigen Matrize eine doppelsträngige Matrize verwendet wird, so würde man beobachten, daß der Rückwärtsprimer an seinen komplementären Matrizenstrang bindet, wobei doppelsträngige DNA, die keine Nukleotidanaloge enthält, amplifiziert wird.
Schritt (iv): Nukleotidaustausch
In der letzten PCR werden die Nukleotidanalog enthaltenden Stränge als Matrizen verwendet, um Nukleotidanaloge gegen Standardnukleotide auszutauschen (4). Nach Restriktionsverdauung werden mutierte Gene in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert, transformiert und in E. coli exprimiert. Zufällig ausgewählte Klone wurden gepickt und in kleinen Kultivierungsröhrchen (5 ml; LB_amp) aufgezogen. Anschließend wird die isolierte Plasmid-DNA sequenziert. Vorläufige Sequenzierungsergebnisse mit 100 Klonen bewiesen den korrekten Austausch und zeigten, wie erwartet, eine Neigung zu Inosin (5 und 6).
Die Erzeugung von Mutantenbibliotheken unter Verwendung des SeSaM-Verfahrens läßt sich innerhalb von 1-2 Tagen vollständig durchführen. Das SeSaM-Verfahren bietet dabei die folgenden Vorteile:

1) Fähigkeit zur Sättigung jeder einzelnen Position einer Sequenz mit allen 20 möglichen natürlich vorkommenden Aminosäuren.
2) Kein Bias (Verzerrung) bei Mutationsspektren, wenn wirklich universelle Basen verwendet werden.
3) Mutationsspektren lassen sich unter Verwendung von Transition begünstigenden oder Transversion begünstigenden degenerierten Basen manipulieren.
4) Kontrollierbare Länge von Mutationsbereichen durch Konstruktion richtiger spezieller Oligo.
5) Fragmentgrößenverteilung läßt sich über die Verwendung von Sp-dATPαS/Sp-dTTPαS/Sp-dGTPαS/Sp-dCTPαS oder eine Kombination daraus kontrollieren.

Material und Methoden
Alle verwendeten Chemikalien besaßen Analysequalität oder eine höhere Qualität und wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland), Applichem GmbH (Darmstadt, Deutschland) oder Carl Roth GmbH + Co (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Das Plasmid pEGFP wurde von der Firma BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland) bezogen.
In allen PCRs wurden ein Thermocycler-Gerät (Mastercycler Gradient; Eppendorf, Hamburg, Deutschland) sowie dünnwandige PCR-Röhrchen (Multi-Ultra-Röhrchen; 0,2 ml; Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe, Deutschland) verwendet. Das Reaktionsvolumen. aller PCRs betrug durchgehend 50 μl.
(Vorbereitungsschritt 1) Herstellung von EinzelstrangpEGFP:
Für jede PCR wurden jeweils 5 U Pfu Turbo-Polymerase (Stratagene, Amsterdam, Niederlande), 0,2 mM dNTP-Mix (New England Biolab, Frankfurt, Deutschland) 12,6 pmol Rückwärtsprimer (5'-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') und 48,6-54,3 ng Plasmid pEGFP (Miniprep, Qiagen, Hilden, Deutschland) verwendet. Nach der PCR (30 s bei 95°C (1 Zyklus), 30 s bei 95°C/1 min bei 55°C/4 min bei 68°C (40 Zyklen)) wurden 40 U Dpn I zugegeben, und anschließend wurde 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Produktgewinnung erfolgte unter Verwendung eines NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland; Elutionsvolumen: 35 μl für 200 μl PCR-Produkt).
(Vorbereitungsschritt 2) Herstellung des Klonierungsvektors:
24,3-27,1 μg Plasmid pEGFP (Miniprep, QIAGEN) wurden zunächst mit 30 U EcoRI (New England Biolab) in einem Reaktionsansatz von 100 μl verdaut. Der Reaktionsansatz wurde 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Das linearisierte Plasmid wurde mit NucleoSpin Extract aufgereinigt (Machery-Nagel; Elutionsvolumen: 50 μl für 100 μl Reaktionsansatz). 4,9-5,6 μg linearisiertes Plasmid pEGFP wurde einer zweiten Verdauung mit 20 U Age I (New England Biolab) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl unterzogen. Nach einer dreistündigen Inkubation bei 37°C wurde das doppelt verdaute Plasmid mit NucleoSpin Extract aufgereinigt (Macherey-Nagel; Elutionsvolumen: 35 μl für 50 μl Reaktionsansatz). Das doppelt verdaute pEGFP wurde für die anschließende Klonierung verwendet.
(Schritt 1) PCR mit dATPαS:
Für jede PCR (3 min bei 94°C (1 Zyklus), 1 min bei 94°C/1 min bei 59,5°C/75 s bei 72°C (31 Zyklen), 10 min bei 72°C (1 Zyklus)) wurden 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Qiagen), 0,2 mM dNTP-Mix (New England Biolab), 0,2 mM Sp-dATPαS (Biolog Life Science Institute, Bremen, Deutschland), 12,6 pmol 5'-biotinylierter Vorwärtsprimer (5'-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3'), 12,6 pmol Rückwärtsprimer (5'-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') und 242,9-271,4 ng Plasmid pEGFP (Miniprep; Qiagen) verwendet.
(Schritt 2) Iodspaltung des Thiophosphodiester-Rückgrats
Die Phosphothioatbindung wurde mit Iod (gelöst in Ethanol; Endkonzentration im PCR-Röhrchen: 2 μM) gespalten. Der Ansatz wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
(Schritt 3) Herstellung einzelsträngiger DNA-Fragmente mit unterschiedlicher Länge:
Biotinylierte DNA-Fragmente vom Vorwärtsprimer wurden unter Verwendung von Dynabeads MyOne Streptavidin (DYNAL Biotech, Oslo, Norwegen) bei Raumtemperatur isoliert. 50 μl biomagnetische Kügelchen (10 mg/ml) wurden 2x mit 100 μl B & W-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,0 mM EDTA; 2,0 M NaCl) gewaschen. Die gewaschenen biomagnetischen Kügelchen wurden in 100 μl 2x B & W-Puffer resuspendiert und mit 100 μl gespaltenem PCR-Produkt versetzt. Nach 20 Min Inkubation wurden die biotinylierten DNA-Fragmente auf den biomagnetischen Kügelchen immobilisiert und das Iod durch Waschen mit 100 μl 2x B & W-Puffer abgetrennt. Nicht biotinylierte DNA-Fragmente wurden nach Inkubieren in 100 μl DNA-Schmelzlösung (0,1 M NaOH) für 10 min bei 37°C und anschließenden Kügelchenwaschschritten mit 100 μl DNA-Schmelzlösung und 100 μl 1x B & W-Puffer freigesetzt. Die gewaschenen Dynabeads wurden in 60 μl 0,1% SDS zur Freisetzung der DNA-Fragmente vom festen Träger gekocht. Der die DNA-Fragmente enthaltende Überstand wurde sofort in ein anderes Röhrchen überführt.
(Schritt 4) SDS-Salzabtrennung von eluierten einzelsträngigen DNA-Fragmenten:
Die Entsalzung wurde mit dem NucleoTrap-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) durchgeführt. 400 μl Puffer NT2 wurden zu 100 μl eluierter DNA gegeben, gefolgt von 15 μl NucleoTrap-Suspension. Der Ansatz wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle 2-3 min leicht geschüttelt wurde. Anschließend wurde die Probe 30 s bei 10000 g zentrifugiert, und nach Verwerfen des Überstands wurden die Kügelchen mit 500 μl Puffer NT3 gewaschen. Letzterer Schritt wurde einmal wiederholt. Das Pellet wurde 15 min bei 37°C an der Luft getrocknet, um Ethanolrückstände zu entfernen, in 55 μl Tris-HCl-Puffer (5 mM; pH 8,5) resuspendiert und zur DNA-Elution 5 min bei 50°C inkubiert. Die Suspension wurde in NucleoSpin Microfilter pipettiert und 30 s bei 10000 g zentrifugiert, um die Kügelchen von DNA-haltiger Lösung zu trennen.
(Schritt 5) Enzymatische Elongation von DNA-Fragmenten mit universeller Base:
Das Gesamtreaktionsvolumen betrug für jede Elongationsreaktion jeweils 50 μl. In jeder Reaktion wurden jeweils 5 U terminale Transferase (New England Biolabs), 0,25 mM CoCl₂, 0,4 μM dITP (Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) sowie 18 μl entsalzte DNA aus Schritt 4 eingesetzt. Nach Einbau der universellen Basen in der Elongationsreaktion (30 min bei 37°C und 10 Min Hitzedeaktivierung der Transferase bei 70°C) wurde das Produkt nach der Vorschrift des QIAquick Nucleotide Removal Kit aufgereinigt (QIAGEN; Elutionsvolumen: 25 μl für 50 μl Reaktionsansatz).
(Schritt 6) Vollängen-Gen-Synthese: Für jede PCR (3 Min bei 94°C (1 Zyklus), 1 Min bei 94°C/1 Min bei 59,5°C + 0,2°C (0,2°C Anstieg pro Zyklus)/3 Min bei 72°C (30 Zyklen), 10 min bei 72°C (1 Zyklus)) wurden 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Qiagen), 0,2 mM dNTP-Mix (New England Biolab), 13,3 μl elongiertes DNA-Fragment, 20 pmol Rückwärtsprimer (5'-GAC CGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') und 0,66-0,76 μg einzelsträngige Rückwärtsmatrize (Vorbereitungsschritt 1) eingesetzt. Nach Synthese des Vollängen-Gens wurde ein Reinigungsschritt unter Verwendung des NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel; Elutionsvolumen: 35 μl für 150 μl PCR-Produkt) durchgeführt.
(Schritt 7) Austausch universeller Basen: Für jede PCR (3 Min bei 94°C (1 Zyklus), 1 Min bei 94°C/1 Min bei 52,7°C/75 s bei 72°C (30 Zyklen), 10 min bei 72°C (1 Zyklus)) wurden 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Qiagen), 0,2 mM dNTP-Mix (New England Biolabs), 20 pmol Vorwärtsprimer (5'-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3'), 20 pmol Rückwärtsprimer (5'-GAC CGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') sowie 2,5 μl Vollängen-Gen (Schritt 6) eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung von NucleoSpin Extract aufgereinigt (Macherey-Nagel; Elutionsvolumen: 50 μl für 150 μl PCR-Produkt).
(Schritt 8) Verdauung des PCR-Produkts: Nach Austausch der universellen Basen wurden 40 μl aufgereinigtes PCR-Produkt (Schritt 7) mit 30 U EcoRI (New England Biolab) 3 Stunden bei 37°C verdaut. Anschließend wurden 20 U Agel (New England Biolab) zum Verdau gegeben und das Gemisch weitere 3 Stunden bei 37°C inkubiert. Das verdaute Produkt wurde unter Verwendung von NucleoSpin Extract aufgereinigt (Macherey-Nagel; Elutionsvolumen: 25 μl).
(Schritt 9) Ligation und Transformation:
Die Ligation des verdauten PCR-Produkts (Schritt 8) und des pEGFP-Klonierungsvektors (Vorbereitungsschritt 2) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche, Mannheim, Deutschland) ausgeführt und in E.coli XL2 Blue-Zellen (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) transformiert. Kompetente Zellen wurden hergestellt, indem das Zellpellet einer 50-ml-Kultur (OD₅₇₈0,4-0,5) in 2 ml TSS-Puffer (10 g PEG 6000; 5 ml DSMO; 0,6 g MgSO₄; 100 ml LB) resuspendiert wurde. Eine Portion von 200 μl Zellen wurde mit 5 μl Ligationsansatz versetzt, 20 Min in Eis inkubiert, 45 s einem Hitzeschock bei 42°C unterzogen und weitere 2 min auf Eis abgekühlt . Nach Zugabe von 0,8 ml LB wurde die Kultur 1 Stunde bei 37°C und 170 U/min geschüttelt. Die Zellen wurden durch 2 min Zentrifugation bei 3000 g und Raumtemperatur geerntet. 900 μl Überstand wurde verworfen und die Zellen vorsichtig in den verbliebenen 100 μl Überstand resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen auf eine LB/Amp-Platte ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Beschreibung der Figuren:
1: a) Schritt (i): Eine willküliche Fragmentgrößenverteilung wird erzeugt. b) Oberes und mittleres Gelbild: PCR-Produkt vor (linke Spur) und nach (rechte Spur) Iodspaltung. Unteres Gelbild: DNA-Fragmentgrößenverteilung nach DNA-Schmelzen und Aufreinigung für unterschiedliche Konzentrationen von Sp-dATPαS (im unteren Teil der Spur angegeben).
2: a) Schritt (ii): Mit universellen oder degenerierten Basen elongierte DNA-Fragmente. b) Unteres linkes Gelbild: PCR mit bei unterschiedlicher Konzentration von Desoxyinosin an den 3'-Termini unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase elongierten Primern. Unteres rechtes Gelbild: PCR mit bei unterschiedlicher Konzentration von 5-Nitroindol an den 3'-Termini unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase elongierten Primern.
3: Schritt (iii): Synthese von Vollängen-Genen mit Nukleotidanalogen
4: Schritt (iv): Nukleotidanaloge werden gegen Standardnukleotide ausgetauscht.
5: Ergebnis der Sequenzierung von 100 willkürlich gepickten Klonen.
6: Zufallsverteilung von Mutationen von 100 sequenzierten Klonen.
Literatur

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2. Cadwell, R.C. und Joyce, G.F. (1994) PCR Meth. App., 3, 136-140.
3. Lin-Goerke, J.L., Robbins, D. J. und Burczak, J.D. (1997) Biotechniques, 23, 409-412.
4. Cadwell, R.C. und Joyce, G.F. (1992) PCR Meth. Appl., 2, 28-33.
5. Kuipers, O.P. (1996) Meth. Mol. Biol., 57, 351-356.
6. Zaccolo, M., Williams, D.M., Brown, D.M und Gherardi, E. (1996) J. Mol. Biol., 255, 589-603.
7. Xu, H., Petersen, E.I., Petersen, S.B. und el-Gewely, M.R. (1999) Biotechniques, 27, 1102-1108.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Mutagenese einer doppelsträngigen Polynukleotidsequenz (Master-Sequenz) aus n Basenpaaren mit einem (+)-Strang und einem komplementären (-)-Strang, bei dem man die folgenden Schritte durchführt: (i) Erzeugung einer Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten des (+)-Strangs der Master-Sequenz, wobei alle Mitglieder der Sammlung den gleichen 5'-Terminus sowie eine Deletion im 3'-Terminus aufweisen, so daß die Sammlung (+)-Stränge mit einer Länge von n-1, n-2, n-3, ... Nukleotiden repräsentiert; (ii) Einführung wenigstens eines universellen oder degenerierten Nukleotids am 3'-Terminus des in Schritt (i) hergestellten (+)-Strangs; (iii) Elongation des in Schritt (ii) hergestellten (+)-Strangs auf die volle Länge der Master-Sequenz unter Verwendung des (-)-Strangs oder von Fragmenten davon als Matrizenstrang für die Elongation; (iv) Synthese eines (-)-Strangs mittels Verwendung des in Schritt (iii) hergestellten (+)-Strangs als Matrizenstrang, wodurch Mutationen im (-)-Strang an den Positionen der obigen universellen oder degenerierten Nukleotide, verglichen mit der Master-Sequenz, herbeigeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten in Schritt (i) durch Einbau von Nukleotidanalogen und anschließende Spaltung in alkalischer oder saurer Lösung erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei es sich bei dem Nukleotidanalog um ein alpha-Phosphothioat-Nukleotid handelt und die oxidative Spaltung über Iod an den Phosphothioatbindungen erreicht wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (ii) die Elongation der in Schritt (i) hergestellten Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten mit universeller Base oder degenerierter Base mittels enzymatischer oder chemischer Methoden umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei für die Elongation terminale Desoxynukleotidyl-Transferase oder DNA-Polymerasen oder DNA/RNA-Ligasen verwendet werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Desoxyinosin, 3-Nitropyrrol, 5-Nitroindol oder ein Nukleotidanalog mit promiskuitiver Basenpaarungseigenschaft als universelles Nukleotid in Schritt (ii) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei N⁶-Methoxy-2,6-diaminopurin (K), N⁶-Methoxyaminopurin (Z), Hydroxylaminopurin (HAP), 2'-Desoxyribonukleosidtriphosphat (dyTP), 6H, 8H-3,4-Dihydropyrimidol[4,5-c][1,2]-oxazin-7-on (P), N⁴-Aminocytidin, N⁴-Hydroxy-2'-desoxycytidin, N⁴-Methoxy-2'-desoxycytidin, 8-Oxodesoxyguanosintriphosphat (8-oxo-G) oder ein Nukleotidanalog mit promiskuitiver Basenpaarungseigenschaft als degeneriertes Nukleotid in Schritt (ii) verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Oligonukleotid der allgemeinen Formel p(U)_a(N)_b*(S)_c[TERM] mit p = 5'-Phosphat oder Hydroxygruppe oder eine beliebige, zur Bildung von Diesterbindungen fähige chemische Gruppe, U = universelle oder degenerierte Basen, a = willkürliche ganze Zahl von 0 bis 10000, N = Gemisch aus vier Basen (A/T/G/C (Standardnukleotide)), b = willkürliche ganze Zahl von 0 bis 100, * = spaltbare Gruppe, wie z.B. Phosphothioatbindungen in Phosphothioatnukleotiden, S = Standardnukleotid oder Nukleotidanalog, c = willkürliche ganze Zahl von 0 bis 100, [TERM] = Farbstoffterminator oder eine beliebige Gruppe, die die Elongation des Oligonukleotids verhindert, mit der Maßgabe, daß a + b > 0 ist, in Schritt (ii) verwendet wird, um universelle oder degenerierte Basen in die in Schritt (i) erzeugte Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten einzuführen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Oligonukleotid so konstruiert ist, daß (a) Stopp-Codons und/oder (b) Sekundärstrukturen unterbrechende Aminosäuren in der Sammlung der mutagenesierten Polynukleotidsequenzen vermieden werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Oligonukleotid so konstruiert ist, daß (a) Transitionsmutationen oder (b) Transversionsmutationen in der Sammlung der mutagenesierten Polynukleotidsequenzen herbeigeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das in Schritt (i) erzeugte Einzelstrang-Fragment, das nicht mit dem Oligonukleotid ligiert ist, unter Verwendung von Exonuklease entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Elongation in Schritt (iii) über eine PCR-Reaktion erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (iii) die Synthese einer (-)-Einzelstrangplasmid-Polynukleotidsequenz aus einem die Master-Sequenz enthaltenden Doppelstrangplasmid unter Verwendung eines Primers, der in einer Annealing-Reaktion stromabwärts des (+)-Strangs der Master-Sequenz bindet, und das Annealing dieser (-)-ss-Plasmid-Polynukleotidsequenz mit dem in Schritt (ii) hergestellten (+)-Strang sowie die Elongation des (+)-Strangs umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei Schritt (iii) die Synthese eines die Master-Sequenz enthaltenden (-)-Einzelstrangplasmids unter Verwendung eines Primers, der in einer Annealing-Reaktion stromabwärts des (+)-Strangs der Master-Sequenz bindet, in Gegenwart von Uracil und Standardnukleotiden umfaßt, wobei das Uracil tragende (-)-Einzelstrangplasmid im Anschluß an die Elongation des in Schritt (ii) hergestellten (+)-Strangs mit Uracil-Glycosylase verdaut wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei im Anschluß an Schritt (iii) eine PCR-Amplifikation verwendet wird, um einen zu dem in Schritt (iii) hergestellten (+)-Strang komplementären (-)-Strang zu synthetisieren, wodurch eine Mutationen tragende doppelsträngige Master-Sequenz erhalten wird.