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Inspiriert
durch die Darwin'sche
Evolution in der Natur, wurden Zufallsmutageneseverfahren entwickelt,
um Proteine auf unsere Bedürfnisse
zuzuschneiden und Struktur-Funktions-Beziehungen aufzuklären (1).
Die Erzeugung von Vielfalt auf der genetischen Ebene ist das komplementäre Werkzeug
zum Gen-Shuffling, da dadurch die Gelegenheit zur Einführung neuartiger
Mutationen entsteht, um Proteine an nicht natürliche Milieus in biotechnologischen
Verfahren anzupassen. Der Sequenzraum einer wirklich randomisierten
Bibliothek wird aufgrund seiner Beschaffenheit nicht durch eine
Vorselektion auf Funktion unter physiologischen Bedingungen beschränkt. In
Gen-Shuffling-Experimenten verwendete Ausgangsgene werden durch
natürliche Evolution
auf Funktion unter physiologischen Bedingungen optimiert.
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Unter
den Zufallsmutageneseverfahren werden aufgrund ihrer Einfachheit
und Vielseitigkeit am häufigsten
aufgrund von ungenauer Amplifikation von Genen zu Fehlern neigende
PCR-Verfahren verwendet. Zu Fehlern neigende PCR-Verfahren lassen
sich in drei Kategorien einteilen: A) Verfahren, die die Treue der
Polymerase durch Einführung
eines Ungleichgewichts der Nukleotidkonzentrationen und/oder Zugabe
von Manganchlorid reduzieren (2-4), B) Verfahren, bei denen Nukleotidanaloge
eingesetzt werden (5, 6), und C) kombinierte Verfahren (A und B;
(7)).
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Beschreibung
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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Mutagenese einer doppelsträngigen Polynukleotidsequenz (Master-Sequenz) aus n Basenpaaren
mit einem (+)-Strang und einem komplementären (-)-Strang, bei dem man
die folgenden Schritte durchführt:
- (i) Erzeugung einer Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten des (+)-Strangs
der Master-Sequenz, wobei alle Mitglieder der Sammlung den gleichen
5'-Terminus sowie
eine Deletion im 3'-Terminus
aufweisen, so daß die
Sammlung (+)-Stränge
mit einer Länge
von n-1, n-2, n-3, ... Nukleotiden repräsentiert;
- (ii) Einführung
wenigstens eines universellen oder degenerierten Nukleotids am 3'-Terminus des in
Schritt (i) hergestellten (+)-Strangs;
- (iii) Elongation des in Schritt (ii) hergestellten (+)-Strangs auf die volle
Länge der
Master-Sequenz unter Verwendung des (-)-Strangs oder von Fragmenten
davon als Matrizenstrang für
die Elongation;
- (iv) Synthese eines (-)-Strangs mittels Verwendung des in Schritt
(iii) hergestellten (+)-Strangs als Matrizenstrang, wodurch Mutationen
im (-)-Strang an den Positionen der obigen universellen oder degenerierten Nukleotide,
verglichen mit der Master-Sequenz, herbeigeführt werden.
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Bei
einem universellen Nukleotid handelt es sich um ein Nukleotid, das
mit allen vier Standardnukleotiden paaren kann. So gestattet beispielsweise
der Einbau von Desoxyinosintriphosphat (dITP) in einen Polynukleotidstrang
die Basenpaarung mit Adenin, Guanin, Thymin und Cytosin.
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Bevorzugte
universelle Nukleotide sind Desoxyinosin, 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol.
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Bei
einem degenerierten Nukleotid handelt es sich um ein Nukleotid,
das mit weniger als allen vier Standardnukleotiden paaren kann.
Bevorzugte degenerierte Nukleotide sind N6-Methoxy-2,6-diaminopurin
(K), N6-Methoxyaminopurin (Z), Hydroxylaminopurin
(HAP), 2'-Desoxyribonukleosidtriphosphat
(dyTP), 6H, 8H-3,4-Dihydropyrimidol-[4,5-c][1,2]-oxazin-7-on
(P), N4-Aminocytidin,
N4-Hydroxy-2'-desoxycytidin, N4-Methoxy-2'-desoxycytidin und 8-Oxodesoxyguanosintriphosphat
(8- oxo-G).
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Ein
Nukleotidanalog mit promiskuitiver Basenpaarungseigenschaft bedeutet,
daß ein
auf einer Purin- oder Pyrimidinstruktur (z.B. A, G, C, T), die in
einer oder mehreren ihrer funktionellen Gruppen modifiziert ist, beruhendes
Nukleotid mit mehr als einem anderen Nukleotid, beispielsweise mit
2, 3 oder 4 Nukleotiden, Basenpaare ausbilden kann. Ebenso sind
die universellen Nukleotide und degenerierten Nukleotide von dem
Begriff Nukleotidanalog mit promiskuitiver Basenpaarungseigenschaft
umfaßt.
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Eine
bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform
ist ein wie oben beschriebenes Verfahren, wobei ein Oligonukleotid
der allgemeinen Formel p(U)a(N)b*(S)c[TERM]mit
- p
- = 5'-Phosphat oder Hydroxygruppe
oder eine beliebige, zur Bildung von Diesterbindungen fähige chemische
Gruppe,
- U
- = universelle oder
degenerierte Basen,
- a
- = willkürliche ganze
Zahl von 0 bis 10000, bevorzugt von 1-100
- N
- = Gemisch aus vier
Basen (A/T/G/C (Standardnukleotide)),
- b
- = willkürliche ganze
Zahl von 0 bis 100, bevorzugt von 1-10,
- *
- = spaltbare Gruppe,
wie z.B. Phosphothioatbindungen in Phosphothioatnukleotiden,
- S
- = Standardnukleotid
oder Nukleotidanalog,
- c
- = willkürliche ganze
Zahl von 0 bis 100, bevorzugt von 1-10
- [TERM]
- = Farbstoffterminator
oder eine beliebige Gruppe, die die Elongation des Oligonukleotids
verhindert, mit der Maßgabe,
daß a
+ b > 0, vorzugsweise > 1, stärker bevorzugt > 2, ist,
in Schritt (ii) verwendet wird, um universelle
oder degenerierte Basen in die in Schritt (i) erzeugte Sammlung von
Einzelstrang-Fragmenten einzuführen.
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Bei
[TERM] kann es sich um eine beliebige Gruppe handeln, die die Elongation
des oben erwähnten Oligonukleotids
verhindert, vorzugsweise einen Wasserstoff oder einen Farbstoffterminator.
Bevorzugte Farbstoffterminatoren sind Cumarin, 6-FAM, Fluorescein,
Fluorescein-dT, JOE, Oregon Green, ROX, TAMRA oder Texas Red-X.
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Eine
weitere bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform
ist die Erzeugung einer Sammlung von Einzelstrang-Fragmenten des
(+)-Strangs der Master-Sequenz
gemäß Schritt
(i) durch Einbau von alpha-Phosphothioat-nukleotiden,
vorzugsweise dATPαS,
dGTPαS,
dTTPαS,
dCTPαS,
in die PCR-Produkte und anschließende Spaltung der Phosphothioatbindung
durch Iod unter alkalischen Bedingungen.
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Eine
weitere bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist das folgende Verfahren für
Schritt (iii): ausgehend von einem Doppelstrangplasmid, das die
Master-Sequenz enthält,
wird eine (-)-Einzelstrangplasmid-Polynukleotidsequenz unter Verwendung
eines Primers synthetisiert, der beim Annealing stromabwärts von
dem (+)-Strang der Master-Sequenz
bindet. Diese (-)-Einzelstrangplasmid-Polynukleotidsequenz wird in einem Annealing-Schritt
mit den in Schritt (ii) hergestellten (+)-Strängen gebunden. Die (+)-Stränge werden
unter Verwendung des (-)-Strangs als Matrize auf die volle Länge der
Master-Sequenz elongiert.
Dieses Verfahren ist in 3 dargestellt.
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Weitere
bevorzugte Ausführungsformen
sind in den Ansprüchen
offenbart.
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Schritt (i): Erzeugung einer Sammlung
von DNA-Fragmenten
mit Längenverteilung
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Im
ersten Schritt wird eine PCR unter Verwendung von biotinyliertem
Vorwärtsprimer
und nicht biotinyliertem Rückwärtsprimer
in Gegenwart sowohl von Standardnukleotiden als auch α-Phosphothioat-Nukleotiden ausgeführt. α-Phosphothioat-Nukleotide
sind normalen Nukleotiden ähnlich,
außer
daß ein
Sauerstoffatom des α-Phosphats
gegen ein Schwefelatom ausgetauscht ist. Die Phosphothioatbindung
ist im alkalischen Milieu für
eine Iod-Spaltung anfällig.
Durch Zufallsverteilung von Phosphothioaten in der DNA wird in einer
einzigen PCR eine Bibliothek von Fragmenten erzeugt, die an jeder
einzelnen Base enden. Dabei können
sich "Nicks" (Einzelstrangbruchstellen)
bilden, falls die Bindung zwischen zwei komplementären Strängen stark
ist. Biotinylierte Fragmente werden unter Verwendung von mit Strepavidin
beschichteten biomagnetischen Kügelchen
isoliert. Anschließend
wird eine DNA-Schmelzlösung
(0,1 M NaOH) verwendet, um nicht biotinylierte Stränge sowie
unerwünschte
Fragmente abzutrennen. Biotinylierte Fragmente lassen sich leicht
aus biomagnetischen Kügelchen
durch Kochen in 0,1% SDS-Lösung freisetzen.
Ein Schema des ersten Schritts ist in 1a dargestellt,
wobei die entsprechenden experimentellen Daten in 1b dargestellt
sind.
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Schritt (ii): Enzymatische Elongation
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Zur
Elongation von DNA-Fragmenten mit universellen Basen oder degenerierten
Basen (2) lassen sich zwei Ansätze verwenden. In einem ersten
Ansatz wurde terminale Desoxynukleotidyl-Transferase zum Einbau
mehrdeutiger Basen (universelle Base oder degenerierte Base) an
den 3'-Termini verwendet.
Der zweite Ansatz erfordert eine Einzelstrang-DNA-Ligation zwischen
DNA-Fragmenten und
einem "speziellen" Oligo. Dieses "spezielle" Oligo ist 5'-phosphoryliert,
um die Ligation zu erleichtern. Es endet mit Fluorescein, um eine
intra- und intermolekulare Ligation zu vermeiden und den Einbau
zu quantifizieren. Es gibt drei unterschiedliche Teile in diesem
Oligo: 1) "Mutationsteil" mit universellen
Basen oder degenerierten Basen, 2) "Anhaftungsteil", bestehend aus drei Basen, der alle
64 Möglichkeiten
umfasst, indem äquimolare
Mengen an A/T/G/C in der Oligosynthese verwendet werden. Dieser
Teil ist dafür
vorgesehen, das Annealing in der anschließenden, für die Synthese des Vollängen-Gens
verwendeten PCR zu unterstützen.
Der "Redundante
Teil" ist mit dem "Anhaftungsteil" über eine Phosphothioatbindung
verbunden, die seine Spaltung nach dem Iodverfahren gestattet. Die
ssDNA-Ligation läßt sich
unter Verwendung der ThermoPhage RNA-Ligase II (Prokaria) durchführen. ThermoPhage
RNA-Ligase II katalysiert die ATP-abhängige intra- und intermolekulare
Ausbildung von Phosphodiesterbindungen zwischen 5'-Phosphat- und 3'-Hydroxyl-Termini
einzelsträngiger
DNA oder RNA. Dieses Enzym stammt aus dem thermophilen Phage TS2126,
der das thermophile Eubakterium Thermus scotoductus infiziert. Dieses
temperaturstabile Enzym ist zu der aus dem Bakteriophagen T4 stammenden
RNA-Ligase homolog. Es zeigt im Vergleich mit T4-RNA-Ligase eine
bessere Effizienz bei der ssDNA-Ligation. Die Ligationseffizienz
wurde durch Ligieren eines mit Fluorescein markierten Oligos an
eine einzelsträngige
DNA-Matrize bestimmt. Nach der Ligation wird der "Redundante Teil" durch Iodspaltung
im alkalischen Milieu abgetrennt.
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Schritt (iii): Vollängen-Gen-Synthese
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Der
dritte Schritt besteht in der Verlängerung der elongierten Fragmente
auf die volle Länge
(3). Hier wird dabei eine einzelsträngige Matrize
verwendet, um die Wildtyp-Amplifikation zu vermeiden. Einzelsträngige Matrize
wird unter Verwendung von Rückwärtsprimer
synthetisiert. Methylierte und hemimethylierte Ausgangsgene werden
mittels Dpn I-Verdauung
entfernt. Diese Vorgehensweise ist ähnlich der QuikChange Site-Directed
Mutagenesis (Stratagene), außer
daß statt
eines Paars mutagener Primer nur ein nicht mutagener Primer verwendet
wird. Elongierte. Fragmente binden sich beim Annealing aufgrund
von Komplementaritäten
an einzelsträngige
Matrize an, wobei der Einzelstrang auf die Vollänge verlängert wird. In dieser PCR-Reaktion
vorhandene Rückwärtsprimer
können
sich beim Annealing nur an den neu synthetisierten Vollängen-Einzelstrang
und nicht an einzelsträngige
Matrize binden. Nach Bindung der Rückwärtsprimer werden die doppelsträngigen Vollängen-Gene
synthetisiert. Doppelsträngige
DNAs enthalten in einem Strang Nukleotidanaloge und im anderen Strang
Standardnukleotide.
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Falls
in dieser PCR statt einer einzelsträngigen Matrize eine doppelsträngige Matrize
verwendet wird, so würde
man beobachten, daß der
Rückwärtsprimer
an seinen komplementären
Matrizenstrang bindet, wobei doppelsträngige DNA, die keine Nukleotidanaloge
enthält,
amplifiziert wird.
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Schritt (iv): Nukleotidaustausch
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In
der letzten PCR werden die Nukleotidanalog enthaltenden Stränge als
Matrizen verwendet, um Nukleotidanaloge gegen Standardnukleotide
auszutauschen (4). Nach Restriktionsverdauung
werden mutierte Gene in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert,
transformiert und in E. coli exprimiert. Zufällig ausgewählte Klone wurden gepickt und
in kleinen Kultivierungsröhrchen
(5 ml; LBamp) aufgezogen. Anschließend wird
die isolierte Plasmid-DNA sequenziert. Vorläufige Sequenzierungsergebnisse
mit 100 Klonen bewiesen den korrekten Austausch und zeigten, wie
erwartet, eine Neigung zu Inosin (5 und 6).
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Die
Erzeugung von Mutantenbibliotheken unter Verwendung des SeSaM-Verfahrens
läßt sich
innerhalb von 1-2 Tagen vollständig
durchführen.
Das SeSaM-Verfahren bietet dabei die folgenden Vorteile:
- 1) Fähigkeit
zur Sättigung
jeder einzelnen Position einer Sequenz mit allen 20 möglichen
natürlich
vorkommenden Aminosäuren.
- 2) Kein Bias (Verzerrung) bei Mutationsspektren, wenn wirklich
universelle Basen verwendet werden.
- 3) Mutationsspektren lassen sich unter Verwendung von Transition
begünstigenden
oder Transversion begünstigenden
degenerierten Basen manipulieren.
- 4) Kontrollierbare Länge
von Mutationsbereichen durch Konstruktion richtiger spezieller Oligo.
- 5) Fragmentgrößenverteilung
läßt sich über die
Verwendung von Sp-dATPαS/Sp-dTTPαS/Sp-dGTPαS/Sp-dCTPαS oder eine
Kombination daraus kontrollieren.
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Material und Methoden
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Alle
verwendeten Chemikalien besaßen
Analysequalität
oder eine höhere
Qualität
und wurden von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Deutschland),
Applichem GmbH (Darmstadt, Deutschland) oder Carl Roth GmbH + Co
(Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Das Plasmid pEGFP wurde von der
Firma BD Biosciences (Heidelberg, Deutschland) bezogen.
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In
allen PCRs wurden ein Thermocycler-Gerät (Mastercycler Gradient; Eppendorf,
Hamburg, Deutschland) sowie dünnwandige
PCR-Röhrchen
(Multi-Ultra-Röhrchen;
0,2 ml; Carl Roth GmbH + Co., Karlsruhe, Deutschland) verwendet.
Das Reaktionsvolumen. aller PCRs betrug durchgehend 50 μl.
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(Vorbereitungsschritt 1) Herstellung von
EinzelstrangpEGFP:
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Für jede PCR
wurden jeweils 5 U Pfu Turbo-Polymerase (Stratagene, Amsterdam,
Niederlande), 0,2 mM dNTP-Mix (New England Biolab, Frankfurt, Deutschland)
12,6 pmol Rückwärtsprimer
(5'-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') und 48,6-54,3 ng
Plasmid pEGFP (Miniprep, Qiagen, Hilden, Deutschland) verwendet.
Nach der PCR (30 s bei 95°C
(1 Zyklus), 30 s bei 95°C/1
min bei 55°C/4
min bei 68°C
(40 Zyklen)) wurden 40 U Dpn I zugegeben, und anschließend wurde
3 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Produktgewinnung erfolgte unter Verwendung eines
NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland; Elutionsvolumen:
35 μl für 200 μl PCR-Produkt).
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(Vorbereitungsschritt 2) Herstellung des
Klonierungsvektors:
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24,3-27,1 μg Plasmid
pEGFP (Miniprep, QIAGEN) wurden zunächst mit 30 U EcoRI (New England
Biolab) in einem Reaktionsansatz von 100 μl verdaut. Der Reaktionsansatz
wurde 3 Stunden bei 37°C
inkubiert. Das linearisierte Plasmid wurde mit NucleoSpin Extract
aufgereinigt (Machery-Nagel; Elutionsvolumen: 50 μl für 100 μl Reaktionsansatz).
4,9-5,6 μg
linearisiertes Plasmid pEGFP wurde einer zweiten Verdauung mit 20 U
Age I (New England Biolab) in einem Reaktionsvolumen von 50 μl unterzogen.
Nach einer dreistündigen
Inkubation bei 37°C
wurde das doppelt verdaute Plasmid mit NucleoSpin Extract aufgereinigt
(Macherey-Nagel; Elutionsvolumen: 35 μl für 50 μl Reaktionsansatz). Das doppelt
verdaute pEGFP wurde für
die anschließende Klonierung
verwendet.
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(Schritt 1) PCR mit dATPαS:
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Für jede PCR
(3 min bei 94°C
(1 Zyklus), 1 min bei 94°C/1
min bei 59,5°C/75
s bei 72°C
(31 Zyklen), 10 min bei 72°C
(1 Zyklus)) wurden 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Qiagen), 0,2 mM dNTP-Mix
(New England Biolab), 0,2 mM Sp-dATPαS (Biolog Life Science Institute,
Bremen, Deutschland), 12,6 pmol 5'-biotinylierter Vorwärtsprimer (5'-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3'), 12,6 pmol Rückwärtsprimer
(5'-GACCGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') und 242,9-271,4
ng Plasmid pEGFP (Miniprep; Qiagen) verwendet.
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(Schritt 2) Iodspaltung des Thiophosphodiester-Rückgrats
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Die
Phosphothioatbindung wurde mit Iod (gelöst in Ethanol; Endkonzentration
im PCR-Röhrchen:
2 μM) gespalten.
Der Ansatz wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
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(Schritt 3) Herstellung einzelsträngiger DNA-Fragmente
mit unterschiedlicher Länge:
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Biotinylierte
DNA-Fragmente vom Vorwärtsprimer
wurden unter Verwendung von Dynabeads MyOne Streptavidin (DYNAL
Biotech, Oslo, Norwegen) bei Raumtemperatur isoliert. 50 μl biomagnetische
Kügelchen (10
mg/ml) wurden 2x mit 100 μl
B & W-Puffer
(10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1,0 mM EDTA; 2,0 M NaCl) gewaschen. Die
gewaschenen biomagnetischen Kügelchen
wurden in 100 μl
2x B & W-Puffer
resuspendiert und mit 100 μl
gespaltenem PCR-Produkt versetzt. Nach 20 Min Inkubation wurden
die biotinylierten DNA-Fragmente auf den biomagnetischen Kügelchen
immobilisiert und das Iod durch Waschen mit 100 μl 2x B & W-Puffer abgetrennt. Nicht biotinylierte
DNA-Fragmente wurden nach Inkubieren in 100 μl DNA-Schmelzlösung (0,1
M NaOH) für
10 min bei 37°C
und anschließenden
Kügelchenwaschschritten
mit 100 μl
DNA-Schmelzlösung
und 100 μl
1x B & W-Puffer
freigesetzt. Die gewaschenen Dynabeads wurden in 60 μl 0,1% SDS
zur Freisetzung der DNA-Fragmente vom festen Träger gekocht. Der die DNA-Fragmente
enthaltende Überstand
wurde sofort in ein anderes Röhrchen überführt.
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(Schritt 4) SDS-Salzabtrennung von eluierten
einzelsträngigen
DNA-Fragmenten:
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Die
Entsalzung wurde mit dem NucleoTrap-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland)
durchgeführt. 400 μl Puffer
NT2 wurden zu 100 μl
eluierter DNA gegeben, gefolgt von 15 μl NucleoTrap-Suspension. Der Ansatz
wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, wobei alle 2-3 min leicht
geschüttelt
wurde. Anschließend wurde
die Probe 30 s bei 10000 g zentrifugiert, und nach Verwerfen des Überstands
wurden die Kügelchen
mit 500 μl
Puffer NT3 gewaschen. Letzterer Schritt wurde einmal wiederholt.
Das Pellet wurde 15 min bei 37°C
an der Luft getrocknet, um Ethanolrückstände zu entfernen, in 55 μl Tris-HCl-Puffer
(5 mM; pH 8,5) resuspendiert und zur DNA-Elution 5 min bei 50°C inkubiert.
Die Suspension wurde in NucleoSpin Microfilter pipettiert und 30
s bei 10000 g zentrifugiert, um die Kügelchen von DNA-haltiger Lösung zu
trennen.
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(Schritt 5) Enzymatische Elongation von
DNA-Fragmenten mit universeller Base:
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Das
Gesamtreaktionsvolumen betrug für
jede Elongationsreaktion jeweils 50 μl. In jeder Reaktion wurden
jeweils 5 U terminale Transferase (New England Biolabs), 0,25 mM
CoCl2, 0,4 μM dITP (Amersham Biosciences
Europe GmbH, Freiburg, Deutschland) sowie 18 μl entsalzte DNA aus Schritt
4 eingesetzt. Nach Einbau der universellen Basen in der Elongationsreaktion
(30 min bei 37°C
und 10 Min Hitzedeaktivierung der Transferase bei 70°C) wurde
das Produkt nach der Vorschrift des QIAquick Nucleotide Removal
Kit aufgereinigt (QIAGEN; Elutionsvolumen: 25 μl für 50 μl Reaktionsansatz).
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(Schritt
6) Vollängen-Gen-Synthese:
Für jede
PCR (3 Min bei 94°C
(1 Zyklus), 1 Min bei 94°C/1
Min bei 59,5°C
+ 0,2°C
(0,2°C Anstieg
pro Zyklus)/3 Min bei 72°C
(30 Zyklen), 10 min bei 72°C
(1 Zyklus)) wurden 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Qiagen), 0,2 mM dNTP-Mix
(New England Biolab), 13,3 μl
elongiertes DNA-Fragment, 20 pmol Rückwärtsprimer (5'-GAC CGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') und 0,66-0,76 μg einzelsträngige Rückwärtsmatrize
(Vorbereitungsschritt 1) eingesetzt. Nach Synthese des Vollängen-Gens
wurde ein Reinigungsschritt unter Verwendung des NucleoSpin Extract
(Macherey-Nagel; Elutionsvolumen: 35 μl für 150 μl PCR-Produkt) durchgeführt.
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(Schritt
7) Austausch universeller Basen: Für jede PCR (3 Min bei 94°C (1 Zyklus),
1 Min bei 94°C/1 Min
bei 52,7°C/75
s bei 72°C
(30 Zyklen), 10 min bei 72°C
(1 Zyklus)) wurden 2,5 U Taq-DNA-Polymerase (Qiagen), 0,2 mM dNTP-Mix
(New England Biolabs), 20 pmol Vorwärtsprimer (5'-GACCATGATTACGCCAAGCTTGC-3'), 20 pmol Rückwärtsprimer
(5'-GAC CGGCGCTCAGTTGGAATTCTAG-3') sowie 2,5 μl Vollängen-Gen
(Schritt 6) eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung von
NucleoSpin Extract aufgereinigt (Macherey-Nagel; Elutionsvolumen:
50 μl für 150 μl PCR-Produkt).
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(Schritt
8) Verdauung des PCR-Produkts: Nach Austausch der universellen Basen
wurden 40 μl
aufgereinigtes PCR-Produkt (Schritt 7) mit 30 U EcoRI (New England
Biolab) 3 Stunden bei 37°C
verdaut. Anschließend
wurden 20 U Agel (New England Biolab) zum Verdau gegeben und das
Gemisch weitere 3 Stunden bei 37°C
inkubiert. Das verdaute Produkt wurde unter Verwendung von NucleoSpin
Extract aufgereinigt (Macherey-Nagel; Elutionsvolumen: 25 μl).
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(Schritt 9) Ligation und Transformation:
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Die
Ligation des verdauten PCR-Produkts (Schritt 8) und des pEGFP-Klonierungsvektors
(Vorbereitungsschritt 2) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur unter
Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche, Mannheim, Deutschland) ausgeführt und
in E.coli XL2 Blue-Zellen (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) transformiert.
Kompetente Zellen wurden hergestellt, indem das Zellpellet einer
50-ml-Kultur (OD5780,4-0,5) in 2 ml TSS-Puffer
(10 g PEG 6000; 5 ml DSMO; 0,6 g MgSO4;
100 ml LB) resuspendiert wurde. Eine Portion von 200 μl Zellen
wurde mit 5 μl
Ligationsansatz versetzt, 20 Min in Eis inkubiert, 45 s einem Hitzeschock
bei 42°C
unterzogen und weitere 2 min auf Eis abgekühlt . Nach Zugabe von 0,8 ml
LB wurde die Kultur 1 Stunde bei 37°C und 170 U/min geschüttelt. Die
Zellen wurden durch 2 min Zentrifugation bei 3000 g und Raumtemperatur
geerntet. 900 μl Überstand
wurde verworfen und die Zellen vorsichtig in den verbliebenen 100 μl Überstand
resuspendiert. Anschließend
wurden die Zellen auf eine LB/Amp-Platte ausplattiert und über Nacht
bei 37°C
inkubiert.
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Beschreibung der Figuren:
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1:
a) Schritt (i): Eine willküliche
Fragmentgrößenverteilung
wird erzeugt. b) Oberes und mittleres Gelbild: PCR-Produkt vor (linke
Spur) und nach (rechte Spur) Iodspaltung. Unteres Gelbild: DNA-Fragmentgrößenverteilung
nach DNA-Schmelzen und Aufreinigung für unterschiedliche Konzentrationen
von Sp-dATPαS
(im unteren Teil der Spur angegeben).
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2:
a) Schritt (ii): Mit universellen oder degenerierten Basen elongierte
DNA-Fragmente. b) Unteres linkes Gelbild: PCR mit bei unterschiedlicher
Konzentration von Desoxyinosin an den 3'-Termini unter Verwendung von terminaler
Desoxynukleotidyl-Transferase elongierten Primern. Unteres rechtes
Gelbild: PCR mit bei unterschiedlicher Konzentration von 5-Nitroindol
an den 3'-Termini
unter Verwendung von terminaler Desoxynukleotidyl-Transferase elongierten
Primern.
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3:
Schritt (iii): Synthese von Vollängen-Genen
mit Nukleotidanalogen
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4:
Schritt (iv): Nukleotidanaloge werden gegen Standardnukleotide ausgetauscht.
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5:
Ergebnis der Sequenzierung von 100 willkürlich gepickten Klonen.
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6:
Zufallsverteilung von Mutationen von 100 sequenzierten Klonen.
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Literatur
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- 1. Arnold, F.H., Wintrode, P.L., Miyazaki, K. und Gershenson,
A. (2001) Trends Biochem. Sci., 26, 100-106.
- 2. Cadwell, R.C. und Joyce, G.F. (1994) PCR Meth. App., 3, 136-140.
- 3. Lin-Goerke, J.L., Robbins, D. J. und Burczak, J.D. (1997)
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- 4. Cadwell, R.C. und Joyce, G.F. (1992) PCR Meth. Appl., 2,
28-33.
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- 6. Zaccolo, M., Williams, D.M., Brown, D.M und Gherardi, E.
(1996) J. Mol. Biol., 255, 589-603.
- 7. Xu, H., Petersen, E.I., Petersen, S.B. und el-Gewely, M.R. (1999)
Biotechniques, 27, 1102-1108.
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