DE3534359C1 - Vektoren und deren Verwendung zur Herstellung von cDNA-Genbanken - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft linearisierte Vektoren und Verfahren zur Herstellung dieser Vektoren (vgl. die Ansprüche 1 bis 5). Außerdem betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Vektoren zur Herstellung von cDNA-Genbanken (vgl. Anspruch 6).

Die Clonierung und Isolierung von Genen, die für wertvolle Produkte codieren sowie die Expression dieser Gene ist durch die in den letzten Jahren entwickelten Methoden der DNA-Rekombination möglich geworden. Wenn vom Genprodukt, nämlich dem Protein, bereits Primärstrukturdaten in Form von Aminosäure-Teilsequenzen oder sogar gesamten Aminosäuresequenzen vorliegen, werden in der Regel Oligonucleotid-Sondenmoleküle, die für einige der erkannten Aminosäuren des gewünschten Genproduktes codieren, synthetisiert. Diese Oligonucleotid-Sondermoleküle können dann zur Suche nach dem für das Protein codierenden Gen in Genbanken verwendet werden. Sofern in diesen Genbanken die genetische Information für das gewünschte Protein in geeigneter Weise exprimiert wird, können für das Absuchen dieser Genbanken auch Antikörper verwendet werden.

Es wurden Methoden entwickelt, die mRNA (Boten-RNA, messenger RNA) aus Zellen zu clonieren, die das gewünschte Protein herstellen. Da diese mRNA jedoch nicht direkt cloniert werden kann, muß sie zunächst in ihre entsprechende cDNA umgeschrieben werden. Bei diesem Umschreibungsprozeß wird ein Tumorvirus-Enzym verwendet, das als reverse Transkriptase bezeichnet wird. Unter Verwendung dieses Enzyms gelangt man schließlich in mehreren Verfahrensstufen zu einer Reihe von rekombinanten Vektoren, die cDNA-Bereiche enthalten, die mRNA-Molekülen entsprechen. Diese Reihe von rekombinanten, cDNA enthaltenden Vektoren bezeichnet man als cDNA-Genbank.

Ein bereits als klassisches Verfahren zu bezeichnendes Verfahren zur Herstellung von cDNA-Genbanken ist in Fig. 7 dargestellt. Bei diesem Verfahren wird zunächst mRNA aus bestimmten Zellen isoliert (1) und dann in mehreren Verfahrensstufen mit verschiedenen Enzymen und Alkali behandelt (Schritte [2] bis [6]). Parallel zu diesen Verfahrensschritten wird ein Vektor - hier DNA des Plasmids pBR322 aus E. coli - vorbehandelt, um den Einbau der synthetisierten cDNA-Moleküle zu gestatten. Nachdem die cDNA-Moleküle mit den vorbehandelten Vektor-Molekülen kombiniert worden sind, werden geeignete Wirtsorganismen, beispielsweise E. coli K12-Stämme, damit transformiert und auf geeigneten Substraten ausplattiert und inkubiert. Die Gesamtheit der auf diese Weise gewonnenen Kolonien von Transformanten stellt die vorstehend erwähnte cDNA-Genbank dar.

Dieses Verfahren zur Herstellung von cDNA-Genbanken hat jedoch den Nachteil, daß die aus den Zellen isolierte mRNA mehreren Verfahrensstufen (1) bis (6) unterworfen werden muß. Da die mRNA ein verhältnismäßig empfindliches Molekül ist, treten dabei häufig Strangbrüche auf. Als Folge dieser Strangbrüche enthält die letztlich hergestellte cDNA-Genbank meistens nur verhältnismäßig kleine cDNA-Insertionen in der Größenordnung von etwa 300 bis 1000 Nucleotiden. Folglich lassen sich die Erbinformationen von großen Proteinen, die mehr als etwa 300 Aminosäuren enthalten, aus solchen cDNA-Genbanken nur selten vollständig isolieren. Ein weiterer Nachteil des in Fig. 7 dargestellten Verfahrens besteht darin, daß die Richtung, in der die cDNA in den Vektor eingebaut wird, nicht vorbestimmt werden kann. Bei der Suche mit Anitkörpern können in falscher Orientierung eingebaute cDNA-Moleküle nicht identifiziert werden.

Nach dem Verfahren von H. Okayama und B. Berg (Mol. Cell. Biol. 2 [1982], S. 161-170) ist der gerichtete Einbau von cDNA-Kopien der aus Zellen isolierten mRNA-Moleküle möglich. Dieses Verfahren ist in Fig. 8 zusammengefaßt. Bei diesem Verfahren wird zunächst der Vektor gespalten und mit oligo (dT)-Bereichen unter Verwendung des Enzyms terminale Transferase versehen. Dabei entsteht ein lineares Vektormolekül, das an beiden 3′-Enden oligo (dT)-Bereiche trägt. Einer dieser oligo (dT)-Bereiche wird mit Hilfe der Restriktionsendonuclease HpaI abgespalten.

An den nunmehr nur noch an einem Ende einen oligo (dT)-Bereich tragenden Vektor wird nachfolgend die mRNA über ihren polyA-Bereich angelagert. Da die mRNA nur an ihrem 3′-Ende einen polyA-Bereich trägt und auch der manipulierte Vektor nur noch an einem seiner Enden einen oligo (dT)-Bereich trägt, ist die Anlagerung der mRNA nur in einer Richtung möglich. In den weiteren Schritten dieses Verfahrens wird mit Hilfe verschiedener Enzyme (siehe Fig. 8) der entsprechende cDNA-Bereich hergestellt und schließlich ein zirkuläres, rekombinantes Vektormolekül gewonnen. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist jedoch, daß das Anhängen von oligo (dC)-Bereichen (siehe Fig. 8) erschwert ist, weil der an der mRNA synthetisierte erste cDNA-Strang meistens unvollständig ist und damit ein "eingezogenes Ende" vorliegt.

Die Folge dieser Schwierigkeit beim Anhängen von oligo (dC)-Bereichen ist eine niedrige Ausbeute an Endprodukten, d. h. an rekombinanten, cDNA enthaltenden Vektoren.

Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, daß nach der Synthese des ersten cDNA-Stranges eine Spaltung mit der Restriktionsendonuclease Hind III durchgeführt werden muß. Bei dieser Spaltung werden auch die im Molekül enthaltenen DNA/RNA-Hybridbereiche mit einer gewissen Häufigkeit gespalten, sofern sie die Erkennungssequenz für die Restritkionsendonuclease Hind III aufweisen. Auf diese Weise gespaltene DNA/RNA-Hybridbereiche können nicht zu Endprodukten weiter verarbeitet werden, dabei die oligo (dC)-Bereiche am ersten cDNA-Strang mit abgespalten werden. Somit wird infolge dieser Spaltungsvorgänge die Endausbeute verringert.

Schließlich besteht ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens darin, daß beim Einsetzen des oligo (dG)-verlängerten Hind III-Linkers ein Konzentrationseffekt auftritt. Wenn nicht die richtige Konzentration dieses Linkers (Fig. 8) gewählt wird, so ist die Ausbeute an rekombinanten, cDNA enthaltenden Vektoren bei diesem Verfahren niedrig.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, Vektoren bereitzustellen, mit deren Hilfe cDNA-Genbanken mit hoher Ausbeute konstruiert werden können, die rekombinante Vektoren enthalten, deren cDNA-Insertionen möglichst groß sind und in einer vorbestimmten Richtung in den Vektor integriert sind.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein linearisierter Vektor, der dadurch gekennzeichnet ist, daß er an einem 3′-Ende einen oligo (dT)-Bereich und an dem anderen 3′-Ende einen oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereich mit einem terminalen Didesoxynucleotid-Rest trägt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung dieses linearisierten Vektors, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen einen Polylinker enthaltenden Vektor mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die 3′-Enden mit oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereichen versieht, an die Enden der oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereiche einen Didesoxynucleotid-Rest anhängt, den oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereich an einem 3′-Ende mit einer anderen Restriktionsendonuclease abspaltet, und das erhaltene freie 3′-Ende mit einem oligo (dT)-Bereich versieht.

Vorzugsweise werden bei diesem Verfahren zur Herstellung linearisierter Vektoren als Ausgangsmaterial die Polylinkerenthaltenden Vektoren pUC931, der entsprechende Vektor pOM1 oder der Vektor pUC830 und der entsprechende Vektor pOM2 verwendet.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der linearisierten Vektoren zur Herstellung von cDNA-Genbanken. Dabei werden die linearisierten Vektormoleküle über einen oligo (dT)-Bereich an einem ihrer 3′-Enden jeweils an das polyA-Ende eines mRNA-Moleküls einer mRNA Population hybridisiert. Anschließend wird in enzymatischen Reaktionen ausgehend vom mRNA-Molekül als Matrize jeweils eine doppelsträngige cDNA synthetisiert. Dann werden die Vektoren rezirkularisiert. Die Schlüsselfunktion bei der Rezirkularisierung hat das 3′-Ende der linearisierten Vektormoleküle, das einen oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereich mit einem terminalen Didesoxynucleotid-Rest trägt.

Allgemein werden als Polylinker kurze DNA-Sequenzen bezeichnet, die mindestens zwei Erkennungssequenzen für Restriktionsendonucleasen aufweisen, die im Polylinker nur einmal vorliegen und ansonsten im Vektor nicht enthalten sind.

Um eine möglichst große Ausbeute beim erfindungsgemäßen Verfahren zu erhalten, können Polylinker verwendet werden, die mindestens zwei Spaltstellen für Restriktionsendonucleasen enthalten, die keine eingezogenen 3′-Enden bilden. Es müssen nämlich zwei aufeinanderfolgende Verfahrensschritte ausgeführt werden, bei denen Desoxynucleotidbereiche angehängt werden.

Das Konstruktionsprinzip der Vektoren pUC931 und pOM1 ist in Fig. 1 schematisch dargestellt.

Zunächst wird der Vektor pUC9 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, unter der Hinterlegungs-Nummer DSM 3421) mit der Restriktionsendonuclease Hind III gespalten, für die dieser Vektor nur eine einzige Spaltstelle aufweist. Die überstehenden Enden werden anschließend mit der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zu glatten Enden aufgefüllt. Durch die Auffüllreaktion entsteht im Leseraster des in diesem Bereich des Vektors befindlichen β-Galactosidase-Gens eine Verschiebung um ein Basenpaar. Der so behandelte Vektor wird mit der T4 DNA-Ligase rezirkularisiert. Es wird das Plasmid pUC9 (H^-) erhalten. Nachfolgend wird dieses Plasmid mit den Restriktionsendonucleasen Pst I sowie Eco RI gespalten. In einem parallelen Spaltungsansatz wird der Vektor M13 tg 131 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nr. DSM 3494) ebenfalls mit den Restriktionsendonucleasen Pst I und Eco RI gespalten. Auf diese Weise wird aus dem Plasmid M13 tg 131 der Polylinker herausgetrennt, der Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonucleasen Pst I, Sal I, BamH I, Hind III, Xba I, Kpn I, Sph I, Eco R V, Sac I, Sma I, Xma I, EcoR I und für die Isoschizomere dieser Restriktionsendonucleasen enthält. Der so erhaltene Polylinker aus M13 tg 131 wird nachfolgend in das Pst I/EcoR I gespaltene Plasmid pUC 9 (H^-) eingesetzt, wobei der Rasterschub korrigiert wird. Nach kovalenter Verknüpfung mit der T4-DNA-Ligase wird das Plasmid pUC 931 erhalten.

Im wesentlichen nach dem gleichen Konstruktionsschema wird das erfindungsgemäß einsetzbare Plasmid pOM1 erhalten. Es wird jedoch nach der anfänglichen Hind III = Spaltung und der nachfolgenden Auffüllreaktion mit der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) ein Xho I-Linker eingesetzt. Dieser Xho I-Linker ist in an sich bekannter Weise synthetisch herstellbar und hat die Sequenz 5′CTCGAG.

Der wesentliche Unterschied der erfindungsgemäß verwendeten Vektoren pUC931 und pOM1 besteht darin, daß der Vektor pUC931 im Bereich der ursprünglich aufgefüllten Hind III-Spaltstelle ein Stopcodon enthält, wogegen der erfindungsgemäß verwendete Vektor pOM I dieses Stopcodon infolge des Einsetzens des Xho I-Linkers nicht aufweist (Fig. 2). Demzufolge ist die Expression der in den Vektor pUC931 eingesetzten genetischen Information nur in Suppressor-Wirtsorganismen möglich, die dahingehend mutiert sind, daß sie eine tRNA (Transfer-RNA) herstellen können, deren Anticodon komplementär zum im Vektor pUC 931 enthaltenen Stopcodon ist.

Die Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Vektoren pUC 830 und pOM2 erfolgt im wesentlichen nach dem in Fig. 1 abgebildeten Konstruktionsschema. Die Ausgangsprodukte sind in diesem Falle das Plasmid pUC8 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nr. DSM 3420) sowie der Vektor M13tg 131 (hinterlegt bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Hinterlegungs-Nr. DSM 3494). Im Vergleich zu den Vektoren pUC931 und pOM I enthalten die Vektoren pUC830 und pOM2 den Polylinker aus M13tg 131 in umgekehrter Orientierung. pUC830 und pOM2 enthalten kein Stoppcodon (Fig. 2 und 3).

Am Beispiel der genannten Vektoren wird die Konstruktion von cDNA-Genbanken erläutert, die aus rekombinanten DNA-Molekülen bestehen, welche gerichtete, lange cDNA-Insertionen enthalten. Erfindungsgemäß werden bei der Herstellung der cDNA-Genbanken hohe Ausbeuten erzielt. Das Verfahren zur Herstellung von cDNA-Genbanken ist in den Fig. 4 und 5 schematisch dargestellt. Bei Verwendung der Plasmide pUC931 oder pOM1 wird die Herstellung einer cDNA-Genbank durch Spaltung dieser Vektoren mit der Restriktionsendonuclease Kpn I eingeleitet (Fig. 4 und 5, I und II).

Das so erhaltene linearisierte Plasmid wird mit dem Enzym terminale Transferase in einer Ausführungsform mit einem oligo (dC)-Bereich an den 3′-Enden der doppelsträngigen DNA versehen (Zugabe von dCTP). Entsprechend kann es auch mit einem oligo (dG)-Bereich versehen werden. Anschließend wird jeweils ein Didesoxycytidin-Rest angehängt. Durch diesen Didesoxycytidinrest, der an seiner 3′-Position ein Wasserstoffatom anstelle einer OH-Gruppe trägt, ist eine weitere Kettenverlängerung des oligo (dC)-Bereichs nicht möglich (Fig. 4 und 5, II). Erfindungsgemäß sind auch andere Didesoxynucleotide zur Blockierung der verlängerten 3′-Enden geeignet. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Anzahl der Cytidinreste 12 bis 20 (in den Fig. 4 und 5 entspricht dies: n = 10 bis 18). Die Länge der angehängten oligo (dC)-Bereiche ist überprüfbar durch Zugabe von ³²P-markiertem dCTP während der Reaktion der terminalen Transferase, Spaltung mit einer Restriktionsnuclease, deren Erkennungssequenz im Polylinker liegt, und anschließender Auftrennung der Spaltprodukte auf einem Polyacrylamidgel, wobei zur Bestimmung der Größe geeignete Standardmoleküle auf dem Gel mit aufgetragen werden.

Im nächsten Verfahrensschritt wird der erhaltene, mit oligo (dC)-Bereichen versehene Vektor mit einer Restriktionsnuclease gespalten, die ein asymmetrisches Molekül erzeugt, das lediglich an einem 3′-Ende der doppelsträngigen DNA einen oligo (dC)-Bereich trägt. An dieses Molekül wird an das freie 3′-Ende mit dem Enzym terminale Transferase ein oligo (dT)-Bereich unter Verwendung von dTTP angehängt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt dieser Bereich ungefähr 60 bis 100 Desoxythymidin-Reste (in den Fig. 4 und 5 ist die Anzahl dieser Reste mit m bezeichnet). Das Anhängen von Desoxythymidinresten kann im erfindungsgemäßen Verfahren nur an das durch die Nachspaltung entstandene 3′-Ende erfolgen, da am durch den oligo (dC)-Bereich gebildeten 3′-Ende keine für die weitere Verlängerung erforderliche OH-Gruppe in 3′-Stellung vorliegt.

Im nächsten Verfahrensschritt (Fig. 4 und 5 IV) wird eine m RNA aus einer aus den gewünschten Zellen isolierten m RNA-Population über ihren polyA-Bereich an den oligo (dT)-Bereich des wie vorstehend erhaltenen asymmetrischen linearisierten Vektors angelagert. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens (Fig. 4) wird im nächsten Schritt mit dem Enzym reverse Transkriptase unter Zugabe der entsprechenden Nucleotide der zur m RNA komplementäre erste cDNA-Strang synthetisiert. Anschließend wird der neusynthetisierte cDNA-Strang mit terminaler Transferase und dGTP mit oligo (dG)-Bereichen versehen. Gegenüber dem bislang bekannten Verfahren besteht der Vorteil bei diesem Verfahrensschritt darin, daß sich an eingezogene 3′-Enden des ersten cDNA-Stranges Guanosin-Reste leichter anhängen lassen als Cytosin-Reste (Fig. 4 und 8). Danach werden die oligo (dC)-Bereiche des Vektors und die oligo (dG)-Bereiche des cDNA-Stranges aneinander gelagert. Schließlich werden erfindungsgemäß rekombinante doppelsträngige cDNA-enthaltende Vektoren mit den Enzymen DNA-Polymerase I, RNaseH und E. coli DNA = Ligase erhalten. In einer weiteren Ausführungsform wird zuerst der zweite cDNA-Strang synthetisiert und dann der oligo (dG)-Bereich angehängt (Fig. 5). Da bei dieser Verfahrensweise überstehende 3′-Enden generiert werden, können auch oligo (dC)-Bereiche in hoher Ausbeute angehängt werden. Für die spätere Rezirkularisierung des Vektors ist es dann jedoch erforderlich, zu Beginn des Verfahrens den Vektor nicht mit oligo (dC)-, sondern mit oligo (dG)-Bereichen zu verlängern.

Der Unterschied der beiden in den Fig. 4 und 5 abgebildeten und vorstehend beschriebenen Ausführungsformen besteht somit lediglich darin, daß die letzten Verfahrensstufen in einer anderen Reihenfolge ausgeführt werden.

Mit den vorstehend beschriebenen Verfahren werden erfindungsgemäß ausgehend von einer zellulären m RNA-Population jeweils verschiedene rekombinante, cDNA-enthaltende Plasmide erhalten. Diese Plasmide werden nachfolgend zur Transformation geeigneter Wirtsorganismen, beispielsweise von E. coli K12 JM109 eingesetzt. Dieser E. coli-Stamm ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Göttingen, Bundesrepublik Deutschland, hinterlegt unter der Nr. DSM 3423. Durch Ausplattieren der Transformanten wird schließlich eine cDNA-Genbank erhalten.

Die durch Verwendung der erfindungsgemäßen linearisierten Vektoren erhaltenen cDNA-Genbanken können durch Absuchen nach entsprechenden Expressionsprodukten analysiert werden. Je nach verwendetem E. coli-Stamm wird in diesem Fall Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) beim Ausplattieren der cDNA-Genbank zugesetzt. IPTG induziert in den transformierten Wirtsorganismen die Expression des β-Galactosidaseoperons. Infolgedessen werden bei der Expression der rekombinanten, cDNA enthaltenden Vektoren der Genbank Fusionsproteine gebildet. Diese Fusionsproteine bestehen aus einem N-terminalen β-Galactosidase-Bereich und einem daran anschließenden Bereich, der von durch die cDNA codierten Aminosäuren gebildet wird.

Bei Verwendung der Vektoren pUC830 und pOM2 zur Herstellung der cDNA-Genbanken wird im wesentlichen nach dem in den Fig. 4 und 5 beschriebenen Verfahren vorgegangen. Der einzige Unterschied besteht darin, daß wegen der umgekehrten Polarität des in diesen Vektoren enthaltenen Polylinkers die erste Restritkionsspaltung mit dem Enzym Sac I durchgeführt wird und nicht mit Kpn I.

Zusammenfassend sind die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von cDNA-Genbanken unter Verwendung der genannten Vektoren die folgenden: Bei dem in Fig. 4 beschriebenen Verfahren werden oligo (dG)-Bereiche anstelle der im Stand der Technik verwendeten oligo (dC)-Bereiche mit der terminalen Transferase angehängt (vgl. Verfahren von Okayama und Berg (a. a. O., Fig. 8). Das Anhängen von oligo (dG)-Bereichen an eingezogenen 3′-Enden erfolgt in höherer Ausbeute. Beim in Fig. 5 beschriebenen Verfahren zur Herstellung von cDNA enthaltenden rekombinanten Vektoren werden die oligo (dG)-Bereiche an überstehende 3′-Enden angehängt. Dies erfolgt auch für dCTP mit hoher Ausbeute.

Da somit bei den erfindungsgemäßen Verfahren die Verfahrensstufe des Anhängens von oligo (dG)-Bereichen mit höherer Ausbeute als im Stand der Technik erfolgt, ist auch die Ausbeute an cDNA-Clonen beim erfindungsgemäßen Verfahren höher als bei dem aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren.

Außerdem werden beim erfindungsgemäßen Verfahren im Gegensatz zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren alle Manipulationen mit Restriktionsendonucleasen durchgeführt, bevor die m RNA in das Verfahren eingebracht wird. Da somit die m RNA nicht in Form von DNA/RNA-Hybriden durch die Restriktionsendonucleasen gespalten werden kann, ergeben sich beim erfindungsgemäßen Verfahren lange cDNA-Clone, die auch die genetische Information für große Proteine vollständig repräsentieren können.

Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Verfahren besteht darin, daß weniger Verfahrensschritte erforderlich sind, z. B. muß kein besonderer oligo (dG)-verlängerter Hind III-Linker, wie im Verfahren von Okayama und Berg (Fig. 8) verwendet werden.

Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß konstruierten cDNA-Clone besteht darin, daß der cDNA-Bereich im rekombinanten Plasmid innerhalb des aus dem Vektor M13tg 131 gewonnen Polylinkers lokalisiert ist. Da somit die Insertion von mehreren Restriktionsspaltstellen für übliche Restriktionsenzyme umgeben ist, kann sie in einfacher Weise wiedergewonnen werden. Die Wiedergewinnung der cDNA-Insertion ist bei nach herkömmlichen Verfahren gewonnen cDNA-Clonen schwierig oder sogar unmöglich, da entweder keine oder nur wenige Spaltstellen in Nachbarschaft der cDNA-Insertion vorlagen. Auch für die Erstellung von Restriktionskarten der cDNA-Insertion ist die Vielzahl der umgebenden Restriktionsendonuclease-Spaltstellen günstig. Schließlich können die erfindungsgemäß konstruierten cDNA-Clone von 5′-Ende der Insertion her direkt unter Verwendung üblicher "Reverse sequencing primer" sequenziert werden (E. Y. Chen und P. H. Seeburg, DNA 4 [1985], Seiten 165 bis 170). Mit dem nach dem Verfahren von Okayama und Berg (a. a. O.) hergestellten cDNA-Clonen ist eine solche direkte Sequenzierung nicht möglich, da sie keine zu den üblichen "Reverse sequencing primern" komplementären DNA-Sequenzen am 5′-Ende der cDNA-Insertion aufweisen.

Fig. 1: Konstruktionsschema der Vektoren pUC931 und pOM1.

Fig. 2: Sequenz des Polylinker-Bereichs von pUC931 und pOM1.

Fig. 3: Sequenz des Polylinker-Bereichs von pUC830 und pOM2.

Fig. 4: Konstruktionsschema einer cDNA-Genbank.

Fig. 5: Konstruktionsschema einer cDNA-Genbank.

Fig. 6: Größenvergleich von cDNA-Clonen aus herkömmlichen und erfindungsgemäßen cDNA-Genbanken.

Fig. 7: Konstruktionsschema von cDNA-Genbanken, bei dem die cDNA direkt an freier mRNA synthetisiert wird.

Fig. 8: Konstruktionsschema von cDNA-Genbanken nach Okayama und Berg.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die in den folgenden Beispielen verwendeten Enzyme wurden bezogen von den Firmen Boehringer Mannheim, Mannheim, Bundesrepublik Deutschland; Pharmacia, Freiburg, Bundesrepublik Deutschland oder New England Biolabs, Bad Schwalbach, Bundesrepublik Deutschland. Die reverse Transkriptase wurde von Life Science, Florida, Vereinigte Staaten von Amerika, bezogen.

Die Enzymreaktionen wurden unter den von den einzelnen Herstellern jeweils empfohlenen Bedingungen durchgeführt und sind außerdem in T. Maniatis, E. F. Frisch und J. Sambrock, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour, 1982, New York, beschrieben.

Beispiel 1 Konstruktion des Vektors pUC931

2 µg DNA des Plasmids pUC9 (DSM 3421) werden mit 10 U Hind III gespalten. Beide überstehenden Enden werden mit 2 U DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt und mit 2 U T4 DNA-Ligase religiert. Dabei ergibt sich ein Rasterschub von +1.

Nach Transformation von E. coli K12 JM 109 (DSM 3423) mit den Ligierungsprodukten und Ausplattieren unter Zugabe von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) und IPTG werden weiße Kolonien isoliert. Die Plasmid-DNA dieser isolierten Kolonien wird nach Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research 7 [1979], Seiten 1513 bis 1522) isoliert. Es wird das Plasmid pUC (H^-) erhalten.

2 µg des Plasmids pUC9 (H^-) werden mit 10 U Pst I und 10 U Eco RI gespalten und über eine Sephacryl-300-Säule in einer 1 ml Spritze zentrifugiert, um das anfallende Polylinker-Fragment zu entfernen. Die Säulenchromatographie wird gemäß der Vorschrift von T. Maniatis et al. (a. a. O.) für zentrifugierte G 50-Säulenchromatographien durchgeführt, mit der Ausnahme, daß 2 Minuten bei 1000 Umdrehungen pro Minute in einer Minifuge 2 zentrifugiert wird.

In einem weiteren Ansatz werden 2 µg doppelsträngige DNA von M13tg 131 (DSM 3494) mit 10 U Pst I und 10 U Eco RI gespalten. Ein Zehntel des Spaltansatzes wird mit 10 U Polynucleotid-Kinase markiert, dem gesamten Ansatz wieder zugesetzt und auf einem 5prozentigen Polyacrylamidgel mit Tris-Borat-Puffer aufgetrennt (siehe auch T. Maniatis et al. a. a. O.). Anschließend wird der Polylinker von M13tg 131 aus dem Polyacrylamidgel durch Elektroelution der entsprechenden ausgeschnittenen Bande in einem Dialyseschlauch isoliert.

Der so erhaltene Polylinker wird in das wie vorstehend vorbereitete, mit Pst I und Eco RI geschnittene Plasmid pUC9 (H^-) mit T4 DNA-Ligase eingesetzt. Der Einbau des Polylinkers aus M13g 131 in pUC9 (H^-) bewirkt eine Verschiebung des Leserasters um -1, so daß das ursprüngliche Leseraster für den die β-Galactosidase-codierenden Bereich wieder hergestellt ist.

Durch die wie vorstehend beschrieben aufgefüllte Hind III-Spaltstelle entsteht ein Stopp-Codon (TAG) im Leseraster des β-Galactosidase-codierenden Bereichs. Deshalb sind zur Expression der in pUC931 inserierten genetischen Information in Form eines β-Galactosidase-Fusionsproteins Bakterien mit der Supressormutation supE und/oder supF erforderlich. Der E. coli-Stamm JM 109 trägt die supE-Mutation.

Anschließend werden E. coli K12 JM109 Bakterien (DSM 3423) mit den Ligierungsprodukten transformiert und zusammen mit X-Gal und IPTG auf YT-Platten enthaltend 100 µ/ml Ampicillin ausplattiert (vgl. Maniatis et al., a. a. O.). Aus einer blauen Kolonie wird nach der Methode von Birnboim und Doly (a. a. O.) das Plasmid pUC931 isoliert.

Das Konstruktionsprinzip des Vektors pUC931 ist in Fig. 1 schematisch zusammengefaßt.

Beispiel 2 Konstruktion des Vektors pOM1

In an sich bekannter Weise wird nach der Phosphoamidid-Methode ein XhoI-Linker mit der DNA-Sequenz CTCGAG synthetisiert. In einem weiteren Ansatz wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, das Plasmid pUC9 mit dem Restriktionsenzym Hind III gespalten und die Enden des so linearisierten Plasmids werden mit DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt. An das so erhaltene lineare Zwischenprodukt werden die nicht phosphorylierten Stränge des Xho I-Linkers ligiert (R. Lathe et al., DNA 3 [1984], Seiten 173 bis 182). Dabei werden nur die 3′-Enden des Linkers mit dem linearisierten Plasmid verbunden. Für diesen Ligierungsprozeß wird die T4 DNA-Ligase verwendet (vgl. T. Maniatis et al.).

Erfindungsgemäß eignen sich für den Einbau alle Linker mit 3 oder n × 3 Basen, da keine Verschiebung im Leseraster erzeugt werden darf. Vorzugsweise dabei Linker für Restriktionsenzyme verwendet, für die keine Erkennungssequenz im nachfolgend einzusetzenden Polylinker aus M13tg 131 enthalten ist und welche den Vektor nicht schneiden.

Die weiteren Verfahrensschritte zur Herstellung des Plasmids pOM1 werden wie in Beispiel 1 und Fig. 1 beschrieben durchgeführt. Daraus folgt, daß sich der so konstruierte Vektor pOM1 vom Vektor pUC931 lediglich durch eine zusätzliche Xho I-Erkennungsstelle in der aufgefüllten Hind III-Erkennungssequenz des Plasmids pUC931 unterscheidet (siehe Fig. 1 und Fig. 2).

Durch das Einfügen der Xho I-Erkennungssequenz wird die Bildung eines Stop-Codons im Leseraster des β-Galactosidasecodierenden Bereichs verhindert. Damit ist die Expression der in diesem Plasmid enthaltenen genetischen Information auch in Wirtsorganismen ohne Supressor-Mutationen möglich.

Beispiel 3 Konstruktion der Vektoren pUC830 und pOM2

Ausgehend von 2 µg DNA des Plasmids pUC8 (DSM 3420) wird nach der in Beispiel 1 erläuterten Verfahrensweise der Vektor pUC830 konstruiert.

Der Vektor pUC830 unterscheidet sich somit vom Vektor pUC931 durch die umgekehrte Orientierung des aus dem Vektor M13tg 131 abgeleiteten Polylinkers. Beginnend mit 2 µg DNA des Vektors pUC8 wird gemäß Beispiel 1 und 2 der Vektor pOM2 hergestellt.

Die Vektoren pUC830 und pOM2 enthalten kein Stop-Codon (Fig. 3).

Beispiel 4 Herstellung eines linearisierten Vektors

400 µg DNA des Vektors pUC931 werden mit 200 U Kpn I linearisiert und mit dCTP sowie 200 U terminaler Transferase behandelt (Fig. 2). Die Länge der so angehängten oligo (dC)-Bereiche wird auf 10prozentige Polyacrylamidgelen nach Abspaltung dieser Bereiche mit den Restriktionsnucleasen Bam H I durch Vergleich mit Oligonucleotiden bekannter Länge ermittelt.

Auf diese Weise werden die Reaktionsbedingungen so eingestellt, daß die Anzahl der Cytosin-Reste in den oligo (dC)-Bereichen 10 bis 20 beträgt. Vektormoleküle mit oligo (dC)-Bereichen der genannten Länge werden anschließend mit Didesoxynucleosid-triphosphat-Derivaten und terminaler Transferase behandelt. Bei Verwendung von ddCTP weist das Produkt dieser Reaktion an seinen beiden 3′-Enden oligo (dC)-Bereiche mit einem terminalen Didesoxycytidin-Rest auf. Dadurch können diese Bereiche in weiteren Reaktionen mit terminaler Transferase nicht zusätzlich verlängert werden.

Der oligo (dC)-Bereich am nicht codierenden Strang wird mit 100 U Sac I abgespalten. Es entsteht ein asymmetrisches Produkt (siehe Fig. 4), das durch eine Chromatographie an (dI)-Cellulose (Pharmacia) gereinigt werden kann.

Das asymmetrische Reaktionsprodukt wird mit dTTP und terminaler Transferase behandelt. Dabei wird an das 3′-Ende des nicht codierenden Stranges ein oligo (dT)-Bereich angehängt. Die Reaktionsbedingungen werden so gewählt, daß dieser Bereich 60 bis 100 Thymidin-Reste aufweist. Nachfolgend kann das erhaltene Reaktionsprodukt durch Chromatographie mit oligo (dA)-Cellulose gereinigt werden.

Beispiel 5 Konstruktion einer cDNA-Genbank mit dem linearisierten Vektor

DNA des gemäß Beispiel 4 erhaltenen linearisierten und asymmetrischen Vektors (Fig. 4) wird mit in an sich bekannter Weise isolierter m RNA vermischt, beispielsweise mit 1 bis 2 µg poly A RNA isoliert aus PYS-Zellen (Maus) pro µg Vektor-DNA. Das Gemisch wird 10 Minuten auf 57°C erwärmt (150 mM KCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,3). Beim Abkühlen entsteht ein Gemisch linearer Vektormoleküle, an deren oligo (dT)-Bereich jeweils ein mRNA-Molekül hybridisiert ist.

Anschließend erfolgt die Synthese des zur mRNA komplementären cDNA-Strangs in einer Umsetzung mit 25 U reverser Transkriptase und dATP, dTTP, dGTP sowie dCTP.

Nachfolgend wird der neu synthetisierte cDNA-Strang mit terminaler Transferase unter Zugabe von dGTP mit einem 15 bis 20 Desoxyguanosinreste enthaltenden oligo (dG)-Bereich versehen. Unter Standardbedingungen werden dann die oligo (dC)-Bereiche des Vektors mit den oligo (dG)-Bereichen der cDNA hybridisiert (T. Maniatis et al., a. a. O.). Es entstehen doppelsträngige rekombiante Vektormoleküle, die einen hybriden DNA/RNA-Bereich aufweisen.

In einer weiteren Reaktion wird der im Molekül enthaltene m RNA-Strang durch den zweiten cDNA-Strang ersetzt. Dazu werden die Enzyme DNA-Polymerase I, RNase H und E. Coli Ligase sowie dATP, dTTP, dCTP und dGTP verwendet (U. Gubler und B. J. Hoffmann, Gene 25 [1983], S. 283 bis 286).

Das Ergebnis der vorstehend beschriebenen Reaktionsschritte (Fig. 4) ist eine Reihe rekombinanter doppelsträngiger Vektoren, die einen doppelsträngigen cDNA-Bereich enthalten. An der Stelle, an der in diesem rekombinanten Vektor das Didesoxyderivat von Cytosin enthalten ist, sind die DNA-Stränge nicht kovalent miteinander verknüpft. Diese Lücke wird später bei der Replikation im Wirtsorganismus in den Tochtermolekülen geschlossen.

Dieses Gemisch von rekombinanten, cDNA-enthaltenden Vektoren, wird bevorzugt in einen recA^--Stamm, wie E. coli K 12 DH 1 (ATCC 33 849) oder E. coli K 12 JM 109 (DSM 3423) in an sich bekannter Weise durch Transformation eingebracht (T. Maniates et al., a. a. O.). Die Transformanten werden anschließend in an sich bekannter Weise auf Nitrocellulosefilter ausplattiert, die auf YT-Platten (100 µg Ampicillin/ml) aufgelegt werden. Die Platten werden anschließend über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert.

Es werden Kolonien erhalten, die jeweils eine Transformante eines rekombinanten cDNA-enthaltenden Vektors repräsentieren. Die Gesamtheit dieser Kolonien wird als cDNA-Genbank bezeichnet.

Zur Aufbewahrung dieser cDNA-Genbank können die Kolonien von den Filtern abgewaschen und mit 15% Glycerin als amplifizierte Bakteriensuspension eingefroren werden. Je nach Bedarf werden dann Teile dieser Suspension aufgetaut und neu ausplattiert.

Zur Sequenzierung positiver Clone werden aus der wie vorstehend hergestellten cDNA-Genbank einzelne Kolonien entnommen und jeweils vermehrt. Anschließend wird aus diesen Bakteriensuspensionen die Plasmid-DNA nach Birnboim und Doly (a. a. O.) isoliert. Die DNA-Sequenz der so erhaltenen Plasmid-DNA kann durch Maxam und Gilbert-Sequenzierung nach Rüther et al. (Nucleic Acids Res., 9 [1981]), Seiten 4087 bis 4097) oder unter Verwendung von üblichen Primern nach F. Sanger et al. (J. Mol. Biol. 143 [1980]), Seiten 161 bis 178) ermittelt werden.

Als Vorstufe zur Sequenzierung ist auch eine Subclonierung der cDNA-Insertion in andere Vektoren möglich.

Beispiel 6 Konstruktion weiterer cDNA-Genbanken mit dem Vektor pUC931

Mit dem Vektor pUC931 und m RNA aus der Mauszellinie PYS-2 werden die cDNA-Genbanken cI und cII gemäß den Beispielen 4 und 5 konstruiert.

150 µg poly A-RNA werden auf einem Saccharose-Gradienten von 10% bis 36% Saccharose in einer Beckmann Ultra-Zentrifuge L 8-70 im SW 28-Motor 21 Stunden bei 26 000 Upm zentrifugiert. Es werden Fraktionen zu 1,2 ml gesammelt. Die poly A-RNA der Fraktionen wird gefällt und in RNase-freiem, sterilem H₂O bidest. wieder aufgenommen. Ein Zehntel der vereinigten Fraktionen 20 bis 25 wird zur Herstellung der cDNA-Genbank cI verwendet und ein Zehntel der vereinigten Fraktionen 26 bis 32 zur Herstellung der cDNA-Bank cII. Es werden jeweils 0,3 µg DNA des Vektors pUC931 eingesetzt. Als Wirtsorganismus für die Rekombinanten, cDNA-enthaltenden Plasmide wird E. coli K 12 DH 1 verwendet.

Die ausplattierte cDNA-Genbank wird mit einem synthetischen Oligonucleotid wie beschrieben in I. Oberbäumer et al. (Eur. J. Biochem. 147 [1985], Seiten 217 bis 224) abgesucht.

Aus der cDNA-Genbank cI wird der Clon pA I4 isoliert. Er enthält eine cDNA-Insertion mit einer Länge von 1,6 kb. Aus der cDNA-Genbank cII wird der Clon pA I5 isoliert. Er enthält eine cDNA-Insertion einer Länge von etwa 2,6 kb (vgl. Fig. 6).

Durch eine Sequenzierung nach Sanger gemäß Beispiel 5 werden die 5′-Enden der isolierten Clone charakterisiert. Die Clone pA I4 und pA I5 codieren demzufolge für die α₁-Kette vom Typ IV Kollagen. Der Clon pA I5 enthält den gesamten nicht-translatierten Bereich, den für die NC1-Domäne codierenden Bereich und den C-terminalen Bereich der Tripel-Helix.

Alle bisher für α₁ Typ IV-Kollagen bekannten Clone enden bereits innerhalb von 200 Basenpaaren des Tripel-Helixcodierenden Bereichs. Viele der Clone überstreichen jedoch lediglich den nicht translatierten Bereich. cDNA-Clone, die eine vergleichbare Größe erreichen, konnten bislang nur mit Größen-fraktionierter cDNA und noch angereicherter mRNA konstruiert und isoliert werden (H. Lehrach et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA [1978], Seite 5417 bis 5412; T. Pihlajaniemi et al., J. Biol. Chem. 260 [1985], Seiten 7681 bis 7687). Der längste bisher für die α₁-Kette vom Kollagen Typ IV codierende cDNA-Clon, der nach der Okayama und Berg-Methode (a. a. O.) isoliert werden konnte, enthielt eine Insertion von lediglich 1,3 kb (Y. Yamada, pers. Mitt.) (vgl. Fig. 6).

Claims (6)

1. Linearisierter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er an einem 3′-Ende einen oligo (dT)-Bereich und an dem anderen 3′-Ende einen oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereich mit einem terminalen Didesoxynucleotid-Rest trägt.

2. Linearisierter Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereich 12 bis 20 Cytidin- oder Guanosin-Reste umfaßt.

3. Linearisierter Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der oligo (dT)-Bereich 60-100 Thymindin-Reste umfaßt.

4. Verfahren zur Herstellung eines Vektors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen einen Polylinker enthaltenden Vektor mit einer Restriktionsendonuclease linearisiert, die 3′-Enden mit oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereichen versieht, an die Enden der oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereiche einen Didesoxynucleotid-Rest anhängt, den oligo (dC)- oder oligo (dG)-Bereich an einem 3′-Ende mit einer anderen Restriktionsendonuclease abspaltet, und das erhaltene freie 3′-Ende mit einem oligo (dT)-Bereich versieht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als einen Polylinker enthaltenden Vektor eines der Plasmide pUC931, pUC830, pOM1 oder pOM2 einsetzt.

6. Verwendung der linearisierten Vektoren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung von cDNA-Genbanken.