DE3936258C1

DE3936258C1 -

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Publication number: DE3936258C1
Application number: DE19893936258
Authority: DE
Inventors: Fritz Prof. Dr. Eckstein; David 3400 Goettingen De Olsen
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1989-10-31
Filing date: 1989-10-31
Publication date: 1991-04-25
Anticipated expiration: 2009-11-01
Also published as: WO1991006645A1

Description

Die Erfindung betrifft das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DNA. Die Ansprüche 2 bis 18 betreffen Aus gestaltungen dieses Verfahrens. Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden Nukleotidanaloga in einen Bereich des mutierten DNA- Strangs eingebaut. Auf diese Weise kann man die Wildtyp- DNA selektiv zerstören, da es möglich ist, Einzel strangbrüche gezielt im nicht modifizierten Wildtyp-DNA- Strang einzuführen.

Die Veränderung der Nukleotidsequenz eines Gens oder eines regulatorischen Elements durch stellenspezifische Mutagenese ist eines der wichtigsten Verfahren, das in der Molekularbiologie verwendet wird, um Struktur-Funk tions-Beziehungen zu erforschen. Um eine hohe Mutations- Effizienz bei der Oligonukleotid-spezifischen Mutagenese zu erhalten, ist es erforderlich, eine Selektion gegen die Wildtyp-Sequenz durchzuführen. Dazu wurden bereits einige Verfahren entwickelt, bei denen es allerdings erforderlich ist, daß das betreffende Gen in einzel strängiger Form vorliegt (Kunkel et al. (1987), Methods in Enzymology, 154, 367-382; Kramer und Fritz (1987), Methods in Enzymology, 154, 350-367; Carter (1987), Methods in Enzymology, 154, 382-403; Nakamaye und Eckstein (1986), Nucleic Acids Res. 14, 9679-9698). Im allgemeinen ist es jedoch erforderlich, Gene in doppel strängige Vektoren zu klonieren. Daher müssen, um eine hohe Mutationseffizienz zu erhalten, die betreffenden DNA-Sequenzen in einen einzelsträngigen Vektor wie M13 (Messing (1983), Methods in Enzymology 101 (Teil C), 20-78) oder in einen speziellen Vektor subkloniert werden, dessen DNA entweder in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form isoliert werden kann (Vieira und Messing (1987), Methods in Enzymology, 153 (Teil D), 3-11).

Weiterhin sind einige Verfahren zur Oligonukleotid- spezifischen Mutagenese unter Verwendung von doppelsträngiger Plasmid-DNA bekannt, die jedoch nur mit einer geringen Mutations-Effizienz im allgemeinen von 1 bis 15% arbeiten (Inouye und Inouye (1987) in "Synthesis and Applications of DNA and RNA" (S.A. Narang, Heraus geber), 181-206, Academic Press, New York; Foss und McClain (1987), Gene 59, 285-290; Stewart et al., (1988) Bio Techniques 6, 511-518. Eine Mutations-Effizienz von 55% wurde für ein Verfahren von Bellini et al., (1988), Gene 69, 325-330 angegeben, wobei dieses Verfahren jedoch nicht allgemein anwendbar ist. Von Sugimoto et al., (1989), Anal. Biochem. 179, 309-311 wurde ein ein zelnes Experiment beschrieben, bei dem eine Mutations rate von 70% unter Verwendung denaturierter doppelsträngiger Plasmid-DNA erzielt wurde.

Die Schwierigkeiten bei Mutagenese-Verfahren unter Ver wendung von doppelsträngiger Plasmid-DNA, eine hohe Mutations-Effizienz zu erzielen, liegen darin, daß eine spezifische Zerstörung der Wildtyp-Sequenzen erforderlich ist. Aufgabe der Erfindung war es demgemäß, ein allgemein anwendbares Verfahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DNA zu entwickeln, das eine hohe Mutations-Effizienz durch spezifische Zerstörung der Wildtyp-Sequenzen aufweist.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch ein Ver fahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DNA, wobei man

a) einen ersten spezifischen Einzelstrangbruch (Nick) im DNA-Molekül in der Nähe der Mutagenese-Stelle einführt,
b) eine erste Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen partiellen Abbau des genickten DNA-Strangs bewirkt, um einen begrenzten einzelsträngigen Bereich auf dem DNA-Molekül zu erzeugen, der auch die Mutagenese- Stelle umfaßt, wobei die Stelle des ersten spezifischen Einzelstrangbruchs bezüglich der Exonuklease- Abbaurichtung nicht weiter als die Hälfte der Nukleotide des zirkulären DNA-Moleküls von der Mutagenese-Stelle entfernt ist,
c) einen Mutagenese-Primer und gegebenenfalls ein weiteres Oligonukleotid an den einzelsträngigen Bereich des DNA- Moleküls hybridisiert,
d) durch Behandlung mit DNA-Polymerase und Ligase ein geschlossenes Heteroduplex-DNA-Molekül erzeugt, in dessen mutierten DNA-Strang eines oder mehrere modifizierte Nukleotide eingebaut sind,
e) einen zweiten spezifischen Einzelstrangbruch im nicht mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Moleküls einführt, wobei der mutierte DNA-Strang an der Spaltstelle eines oder mehrere modifizierte Nukleotide enthält,
f) eine zweite Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen gegebenenfalls partiellen Abbau des nicht mutierten genickten DNA-Strangs bewirkt, so daß die Mutagenese-Stelle in einem einzelsträngigen Bereich liegt, wobei man bei der Auswahl der Exonuklease darauf achtet, daß der Abbau des nicht mutagenisierten Strangs in Richtung der Mutagenese-Stelle stattfindet, und gegebenfalls
g) das partiell einzelsträngige DNA-Molekül aus (f) mit Polymerase behandelt, um ein mutiertes Homoduplex-DNA- Molekül zu erzeugen.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist prinzipiell zur Mutagenese aller doppelsträngiger zirkulärer DNA-Moleküle geeignet. Vorzugsweise wird Plasmid-DNA verwendet, das durch bekannte biochemische Verfahren hergestellt werden kann. Allerdings ist die Qualität der Plasmid-DNA entscheidend für den Erfolg des erfindungsgemäßen Verfahrens. So werden schlechte Ergebnisse erhalten, wenn die DNA-Präparation kleine RNA-Fragmente enthält, die selbst durch Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Gradienten nicht zu entfernen sind. Diese RNA- Fragmente entstehen bei einer RNAse-Behandlung während der DNA- Präparation und werden bei einer Agarosegel-Elektrophorese durch das Auftreten einer großen Menge DNA sicht bar. Die kleinen RNA-Fragmente verringern die Effizienz der Bindung des Mutagenese-Oligonukleotid-Primers, ent weder indem sie für dieselbe Bindungsstelle auf der DNA kompetieren oder indem sie direkt an den Primer binden. Um diese Schwierigkeiten zu beseitigen, werden die RNA- Fragmente durch Spindialyse mit einem Centrikon 30 Mikrokonzentrator abgetrennt. Eine Verringerung der Muta tions-Effizienz wurde auch beobachtet, wenn ein größerer Anteil der Plasmid-DNA mit geringerer gelelektrophore tischer Mobilität als doppelsträngige geschlossen-zir kuläre DNA vorlag. Diese zusätzlichen DNA-Banden stammen vermutlich von konkatemeren Plasmidformen. Es wurde überraschenderweise festgestellt, daß die Amplifizierung der DNA mit Chloramphenicol das Verhältnis von Konkatemer- DNA zu doppelsträngiger geschlossen zirkulärer DNA verringert. Falls es dennoch erforderlich sein sollte, kann die DNA mit höherem Molekulargewicht unter Verwen dung einer Nukleogen-Anionenaustauscher-HPLC-Säule abgetrennt werden.

Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es erforderlich, einen ersten spezifischen Einzel strangbruch (Nick) im DNA-Molekül in der Nähe der Muta genesestelle einzuführen. Die Entfernung des Nicks von der Mutagenese-Stelle kann dabei ca. 10 bis 3500 Nukleotide betragen, bevorzugt sind ca. 10 bis 1300 Nukleo tide. Verwendet man als doppelsträngiges zirkuläres DNA- Molekül das Plasmid pUC19 mit 2,6 kb Länge, so ist jede Position auf dem Plasmid zur Einführung des Nicks geeignet. Die Einführung des Nicks kann z. B. durch die Zugabe eines Oligonukleotids geschehen, das zur Spaltregion komplementär ist und an seinem Ende ein komplexiertes Metallion trägt. Bei dem komplexierten Metallion kann es sich z. B. um Fe¹¹/EDTA (Moser und Dervan, (1987) Science 238, 645-650), Ca¹¹/Phenanthrolin (Chen und Sigman (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7147-7151) oder um andere geeignete Metallkomplexe handeln. Die Spaltung des komplementären DNA-Strangs kann auf an sich bekannte Weise durch Zugabe eines geeigneten Aktivators, z. B. Ascorbinsäure, Dithiothreitol oder Mercaptopro pionsäure bewirkt werden. Man kann den ersten spezifischen Einzelstrangbuch jedoch auch durch Inkubation mit einer geeigneten Restriktionsendonuklease in Gegenwart von Ethidiumbromid einführen. Wie aus Tabelle 1 er sichtlich ist, sind geeignete Restriktionsenzyme z. B. HindIII oder EcoRI. Bei der Verwendung von EcoRI wurde überraschenderweise gefunden, daß der Anteil von genicktem gegenüber linearem Produkt sich erhöht, wenn man Co²⁺ anstelle von Mg²⁺ für die Reaktion verwendet. Das erfindungsgemäße Verfahren ist jedoch nicht auf diese beiden genannten Restriktions-Endonukleasen beschränkt, da geeignete Reaktionsbedingungen für eine spezifische Einzelstrangspaltung in Gegenwart von Ethidiumbromid auch für viele weitere Restriktionsenzyme bekannt sind (Dalbadie-McFarland et al., (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409-6413; Parker (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 851-855; Rawlins und Muzyczka (1980), J. Virol. 36, 611-616; Österlund et al., (1982), Gene 20, 121-125; Shortle und Nathans (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 2170-2174). Auf diese Weise ist eine große Anzahl verschiedener Restriktionsenzyme für das Einführen des ersten Nicks verfügbar, sofern eine Linearisierung des Plasmids durch die Anwesenheit von Ethidiumbromid verhindert wird. Besonders bevorzugt ist, wenn das verwendete Restriktionsenzym nur eine Schnitt stelle auf dem Plasmid hat.

Der nächste Reaktionsschritt ist eine erste partielle Abbaureaktion des genickten DNA-Strangs mit einer Exonuklease, um einen begrenzten einzelsträngigen Bereich auf dem DNA-Molekül zu erzeugen, der auch die Mutage nese-Stelle umfaßt. Als Exonuklease kann man dabei ent weder 3′→5′ oder eine 5′→3′ Exonuklease verwenden. Dabei richtet sich die Wahl der Abbaurichtung nach der Lage des Nicks bezüglich der Mutagenese-Stelle, so daß der Exonuklease-Abbau vom Nick aus in Richtung der Mutagenese-Stelle verläuft. Allgemein gilt, daß die Spaltstelle bezüglich der Exonuklease-Abbaurichtung nicht weiter als die Hälfte der Nukleotide des zirkulären DNA-Moleküls von der Mutagenese-Stelle entfernt sein sollte. Die verwendete Exonuklease sollte bei dieser Reaktion eine geringe Prozessivität besitzen, da man auf diese Weise gut die Ausdehnung des einzelsträngigen Bereichs auf dem DNA-Molekül kontrollieren kann. Vor zugsweise verwendet werden Exonuklease III oder T5 Gen D15 Exonuklease, doch auch andere Exonukleasen mit geringer Prozessivität sind gut geeignet. Weniger geeignet für diesen Schritt sind Exonukleasen mit hoher Prozessivität wie die T7-Exonuklease.

Die anschließende Hybridisierung des Mutagenese-Primers und gegebenenfalls eines weiteren Nukleotids an den einzelsträngigen Bereich des DNA-Moleküls kann nach bekannten biochemischen Verfahren erfolgen. Die Hybri disierungsbedingungen sind dabei je nach Länge und Basenzusammensetzung des oder der verwendeten Oligonuk leotide zu wählen.

Im nächsten Schritt wird ein geschlossenes Heteroduplex- DNA-Molekül erzeugt, indem man das partiell einzel strängige DNA-Molekül mit DNA-Polymerase und Ligase behandelt. In einer Ausführungsform des erfindungsge mäßen Verfahrens kann der durch den vorausgehenden Exonuklease-Abbau erzeugte einzelsträngige DNA-Bereich mit einer Polymerase-Reaktion aufgefüllt werden, bei der man mindestens eines der normalen Desoxyribonukleosid- Triphosphate (dNTPs) durch ein modifiziertes Nukleotid ersetzt. Die Polymerase-Reaktion selbst wird nach bekannten biochemischen Verfahren durchgeführt, wobei darauf zu achten ist, daß die jeweils verwendete DNA- Polymerase das jeweils verwendete modifizierte Nukleotid als Substrat akzeptiert. Verwendet man z. B. [α-S]Desoxyribonukleosid-Triphosphate als Nukleotidana loga, so erweist sich das Klenow-Fragment der DNA-Poly merase I und E. coli als besonders geeignet. In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es auch möglich, Nukleotidanaloga, welche die (nachfolgende) Spaltung mit einem Restriktionsenzym inhibieren, aber nicht enzymatisch in die DNA eingebaut werden können, bereits durch Einbau in den Mutagenese- Primer oder in ein weiteres Oligonukleotid, das die Spaltstelle des zweiten Restriktionsenzyms bedeckt, in den mutierten DNA-Strang einzuführen.

Unter dem Begriff "modifizierte Nukleotide" sind daher ganz allgemein Basen-, Phosphat- oder/und Zuckeranaloga zu verstehen. Vorzugsweise kann man als Zuckeranaloga 2′-Desoxy-2′-fluornukleotide, Ribonukleotide oder/und 3′-Desoxy-3′-thionukleotide verwenden. Als Basenanaloga werden vorzugsweise 4-Thiothymin, 2-Thiothymin, Urazil, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, 6-Thiopurin, 6-Thio-2- aminopurin, 7-Deazaguanin, 7-Deazaadenin, Purin, Hypo xanthin oder/und 5-Methylcytosin verwendet. Als Phosphatanaloga verwendet man vorzugsweise Phosphonate, Phosphorodithioate oder/und Phosphorothioate. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von einem oder mehreren [α-S]Desoxyribonukleosid-Triphosphaten ([α-S]dNTPs) als modifizierte Nukleotide.

Der nächste Schritt ist die Einführung eines zweiten spezifischen Einzelstrangbruches in den nicht-mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Moleküls. Dies geschieht vorzugsweise durch Spaltung mit einem geeigneten Restriktionsenzym. Bei der Wahl des Restriktionsenzyms muß man hier beachten, daß seine Aktivität durch den Einbau von Nukleotidanaloga in den mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Moleküls hemmbar ist, so daß keine Linearisierung, sondern nur eine spezifische Spaltung des nicht-mutierten Strangs erfolgt. Dies ist dann der Fall, wenn sich an der Erkennungsstelle des Restrik tionsenzyms modifizierte Nukleotide im mutierten DNA- Strang befinden. Daher muß die Spaltstelle (bzw. die Spaltstellen) des Enzyms ausschließlich innerhalb des Bereichs liegen, der durch den ersten partiellen Exonuklease-Abbau des DNA-Moleküls einzelsträngig gemacht wurde. Befinden sich an der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms jedoch in beiden DNA-Strängen nur normale Nukleotide, so erfolgt eine Linearisierung.

Verwendet man ein [α-S]dNTP als modifiziertes Nukleotid, so ist als Restriktions-Endonuklease ein Klasse I Enzym nach Taylor et al., (1985), Nucleic Acids Res. 13, 8749-8764 geeignet. Diese Liste umfaßt zur Zeit die Restriktionsenzyme PstI, NciI, HindIII, PvuI, FspI, AvaI, AvaII und BanII. Weiterhin zu dieser Gruppe zählt auch das Restriktionsenzym EcoRV, das nicht in der Lage ist, doppelsträngige DNA zu linearisieren, bei der ein DNA-Strang [α-S]dATP anstelle von ATP an der Erkennungs stelle enthält. Verwendet man jeweils die beiden in Klammern angegebenen [α-S]dNTPs anstelle von normalen Nukleotiden, so sind überraschenderweise auch die Restriktionsenzyme BamHI (A, G), EcoRI (A, G), MspI (G, C), HpaII (C, G), HindIII (T, A), PvuII (G, C) und SacI (C, G) zur spezifischen Einführung von Nicks geeignet. Diese Auflistung ist zur Zeit noch unvollständig, nach weiteren Enzymen wird gesucht.

Daneben können noch weitere Restriktionsenzyme für das erfindungsgemäße Mutagenese-Verfahren verwendet werden, um spezifische Einzelstrangbrüche in doppelsträngige DNA-Moleküle einzuführen, die Nukleotidanaloga enthalten, und zwar indem man die Reaktion gegebenenfalls in Gegenwart von Ethidiumbromid durchführt (Sayers et al., (1988), Nuclei Acids Res. 16, 803-814). Weiterhin ist das Restriktionsenzym EcoRV zur Einführung eines Einzel strangbruchs auch dann geeignet, wenn ein DNA-Strang 2′-Desoxy-2′-fluorthymidin enthält. Auch für DNA/RNA Hybride ist gezeigt worden, daß nur der DNA-Strang gespalten wird (Molloy und Symons (1980), Nuclei Acids Res. 8, 2939-2946). Auch für weitere Basenanaloga konnte eine Verhinderung der Spaltung durch Restriktionsenzyme, z. B. EcoRI oder EvoRV gezeigt werden (McLaughlin et al., (1987) Biochemistry 26, 7238-7245; Mazarelli et al., (1989) Biochemistry 28, 4616-4622).

Der nächste Schritt des Verfahrens ist ein zweiter, gegebenenfalls partieller Exonuklease-Abbau des nicht- mutierten, genickten Strangs des Heteroduplex-DNA-Moleküls. Das Ziel dieses Abbaus ist es, den nicht-mutierten Wildtyp-DNA-Strang an der Mutagenese-Stelle zu zerstören. Bei der Auswahl der Exonuklease muß man darauf achten, daß der Abbau des nicht-mutierten Strangs in Richtung der Mutagenese-Stelle stattfindet. Vorzugsweise verwendet man auch für die zweite Abbaureaktion eine nicht prozessive Exonuklease, z. B. die T5 Exonuklease oder die Exonuklease III. Dies ist vor allem empfehlens wert, wenn die Mutationsstelle sich innerhalb einiger 100 Basenpaare von der Stelle des Einzelstrangbruchs entfernt befindet. Andererseits kann man auch die hoch prozessive T7 Exonuklease verwenden, die einen Großteil oder den gesamten Wildtyp-Strang abbaut.

Gegebenenfalls schließt man noch einen Repolymeri sationsschritt an, bei dem man das partiell einzel ständige DNA-Molekül mit DNA-Polymerase behandelt, um ein mutiertes Homoduplex-DNA-Molekül zu erzeugen. Die aus diesem Schritt erhaltene DNA wird für die Transfor mation von Microorganismen verwendet. Die Mutations effizienz bei der Transformation ist jedoch bereits nach der zweiten Abbaureaktion hoch genug, so daß man den Repolymerisationsschritt am Ende weglassen kann.

Das in Abb. 1 dargestellte Schema soll den Ablauf der einzelnen Reaktionsschritte in einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens veran schaulichen.

Man geht von einem doppelsträngigen, geschlossenen, zirkulären Plasmid aus (Abb. 1A). Zunächst muß ein einzelsträngiger DNA-Bereich erzeugt werden, an den sich der Mutagenese-Primer anlagern kann. Dazu ist es erforder lich, einen Nick in der Nähe der Mutagenese-Stelle einzuführen. Dies kann durch Spaltung der DNA mit der Restriktionsendonuklease HindIII in Gegenwart von Ethi diumbromid geschehen. Diese Spaltung ist allerdings nicht strangspezifisch. Daher entsteht neben linearisierten und noch intakten DNA-Molekülen ein Gemisch an doppelsträngigen DNA-Molekülen, bei denen sich der Nick entweder auf dem kodierenden oder auf dem nicht kodie renden Strang befindet (Abb. 1B).

Der Nick dient wiederum als Ausgangspunkt für eine Abbaureaktion entweder mit einer 3′→5′- oder einer 5′→3′- Exonuklease. Dabei entstehen zwei unterschiedliche partiell einzelsträngige DNA-Moleküle, je nachdem auf welchem Strang sich der Nick befindet (Abb. 1C). Das Produkt der Abbaureaktion, bei dem der zum Mutagenese- Primer komplementäre DNA-Strang intakt bleibt, wird als "produktives Abbauprodukt" bezeichnet (Abb. 1C). Ein Plasmidmolekül, bei dem der zum Mutagenese-Primer komplementäre Strang abgebaut wird, ist hingegen das "unproduktive Abbauprodukt". Die Exonukleasereaktion muß über die Mutagenese-Stelle hinaus fortschreiten, so daß der Mutagenese-Primer sich an den einzelsträngigen Bereich des produktiven Abbauprodukts anlagern kann. Da er nur zu einem der beiden Stränge komplementär ist, erfolgt die Hybridisierung selektiv. Die Lücke in beiden Strängen wird durch eine Polymerisations-Reaktion auf gefüllt, bei der mindestens eines der normalen Nukleo tide durch ein Nukleotidanalogon (hier [α-S]dGTP) ersetzt wird. Die Wahl des Nukleotidanalogons hängt von dem im nächsten Reaktionsschritt verwendeten Restrik tionsenzym ab. Eines der Produkte dieser ersten Polyme risationsreaktion ist ein mutiertes Heteroduplex-DNA- Molekül, das die gewünschte Mutation in einem der beiden Stränge enthält (Abb. 1D).

Bei der Wahl des Restriktionsenzyms für den nächsten Schritt sind zwei Gesichtspunkte zu beachten:

1. Das Enzym sollte durch das eingebaute Nukleotidana logon gehemmt werden.
2. Die Spaltstelle muß für das Enzym in dem, bei der ersten Abbaureaktion erzeugten einzelsträngigen Bereich liegen.

Bei der in Abb. 1 dargestellten Reaktion wurde das Enyzm PstI verwendet. Die zweite Restriktionsspaltung stellt sicher, daß die ursprüngliche Plasmid-DNA, die bei den bisherigen Reaktionsschritten intakt geblieben war, linearisiert wird (Abb. 1E). Zusätzlich werden auch jene DNA-Moleküle linearisiert, die kein Nukleo tidanalogon an der Erkennungsstelle des Enzyms (hier: PstI) in die DNA eingebaut haben. Dabei handelt es sich um ca. 50% der Gesamtzahl an DNA-Molekülen, die aus "unproduktiven Abbauprodukten" entstanden sind, und daher kein [α-S]dGTP an der PstI-Stelle enthalten (Abb. 1E). Somit werden durch die PstI-Reaktion alle Moleküle zerstört, welche die Wildtyp-Sequenz an der Mutagenese-Stelle enthalten.

Die "produktiven Abbauprodukte" enthalten [α-S]dGTP im mutierten Strang und normale Phosphatbindungen im Wildtyp-Strang im Bereich der Erkennungsstelle von PstI. Somit entsteht durch Behandlung mit PstI ein Nick im nicht-mutierten DNA-Strang.

Dieser Nick dient als Ausgangspunkt für die nachfolgende zweite Exonuklease-Reaktion, bei der man die Wildtyp- Sequenz des nicht-mutierten Strangs an der Mutagenese- Stelle zerstört (Abb. 1F). Abschließend kann noch ein Repolymerisationsschritt erfolgen, um ein mutiertes Homoduplex-DNA-Molekül zu erzeugen (Abb. 1G). Die resultierende DNA verwendet man für die Transformation von kompetenten Zellen. Zur Erläuterung von Abb. 1 sei noch hinzugefügt, daß das Symbol "O" die Mutation innerhalb des Mutagenese-Primers darstellt. Eine fette Linie zeigt den Bereich an, in den ein Nukleotidanalogon eingebaut ist. Die bei einer Reaktion linearisierten Plasmid-Moleküle sind durchgestrichen, da sie nicht zur Transformation von Mikroorganismen in der Lage sind.

Das folgende Beispiel soll die Erfindung noch näher verdeutlichen.

Beispiel 1 Mutagenese-Reaktionen an doppelständiger pUC19-Plasmid-DNA Materialien

Exonuklease III (100 U/µl), HindIII (20 U/µl), EcoRI (20 U/µl) und PstI (20 U/µl); T7 Gen 6 Exonuklease (30 oder 100 U/µl); teilweise gereinigte T5 Gen D15 Exonuklease (1 mg/ml); ATP und dNTPs. Das dNTP-Analogon Sp-dGTPαS wurde nach Ludwig und Eckstein (1989) J. Org. Chem. 54, 631-635 synthetisiert oder bezogen. DNA-Polymerase I, T4 DNA-Nuklease und das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I wurden nach Sayers et al., (1988), Nucleic Acids Res. 16, 791-802 hergestellt.

Oligonukleotide

Die Sequenz der als Mutagenese-Primer verwendeten Oligonukleotide war wie folgt, wobei die Mutagenese- Stellen unterstrichen sind:

ACO, 5′-d(GGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCG)-3′;
BCO, 5′-d(CGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACC)-3′;
JAO, 5′-d(GGGTTTTCCTAGTCACG)-3′;
M13SEQ, 5′-d(AGGGTTTTCCCAGTCACG)-3′;
TGO, 5′-d(CGTGACTGGGAAAACCCT)-3′.

Die Oligonukleotide wurden mit dem Phosphoramidit-Ver fahren unter Verwendung eines Applied Biosystems 380 B DNA Synthesizer hergestellt. Die Phosphorylierung und Reinigung der Oligonukleotide erfolgte wie bei Taylor et al., (1985), Nuclei Acids Res. 13, 8749-8764 beschrieben.

Herstellung der Plasmid-DNA

Die Plasmid-DNA wurde aus einer mit Chloramphenicol amplifizierten Kultur nach Miller (1987), Methods in Enzymology 152, 145-170 angereichert. Davon abweichend wurde die Nase A zusammen mit der EDTA-Lösung zugegeben und nach der Zentrifugation der zellulären Rückstände erfolgte die Fällung der Plasmid-DNA durch Zugabe von ein Drittel Volumen einer 30%igen Polyethylenglykol 6000 Lösung mit 1,5 mol/l NaCl während einer dreistündigen Inkubation auf Eis. Nach Zentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten wurde die DNA weiterhin durch Spindialyse mit einem Centrikon-30 Mikrokonzentrator gereinigt. Die Spindialyse wird zum Pufferaustausch, zur Entfernung von Verunrei nigungen mit niedrigem Molekulargewicht und zur Volumen konzentration verwendet. Dabei wird die Probe nach Verdünnung mit 2 ml destilliertem Wasser in den Mikro konzentrator eingebracht und 20 Minuten lang bei 3500 Upm unter Verwendung eines SS34 Rotors oder einer Sepatech Medifuge Zentrifuge abzen trifugiert. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt. Im allgemeinen beträgt das Volumen der DNA-Lösung nach der letzten Zentrifugation 50 bis 60 µl.

Einführung des ersten Nicks in die Plasmid-DNA

20 µg (12 pmol) von pUC19 Plasmid-DNA wurden in 240 µl einer Lösung von 40 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4, 8 mmol/l MgCl₂, 40 mmol/l NaCl, 10 µg Ethidiumbromid und 200 Einheiten HindIII zwei Stunden lang bei 30°C inkubiert. Bei Verwendung von EcoRI wurden 20 µg Plasmid in 260 µl Reaktionslösung mit 90 mmol/l Tris-HCl, pH 7,4, 90 mmol/l NaCl, 370 µmol/l CoCl₂, 36 µg Ethidiumbromid und 600 Einheiten des Enzyms 16 Stunden lang bei 16°C inkubiert. Nach Beendigung der Inkubation wurden jeweils 2 µl für eine gelelektrophoretische Analyse entnommen. Die genickte Plasmid-DNA wurde auf übliche Weise mit Phenol extrahiert und der Puffer unter Verwendung des Centrikon 30 Mikrokonzentrators ausgetauscht.

Erste Abbaureaktion a) Exonuklease III

Die genickte doppelsträngige DNA wurde 6 Minuten lang bei 37°C mit Exonuklease III (100 Einheiten) in einem Reaktionsvolumen von 95 µl mit 110 mmol/l NaCl, 10 mmol/l Tris-HCl, pH 8, 7 mmol/l MgCl₂ und 7 mmol/l DTT behandelt.

b) T5 Gen D15 Exonuklease

Die Reaktion wurde unter denselben Bedingungen wie bei der Exonuklease III durchgeführt, abgesehen davon, daß der Puffer 60 mmol/l NaCl enthielt und der Tris-HCl-Puffer, pH 8, durch 30 mmol/l Ethanolamin- Puffer, pH 9,3, ersetzt wurde. Nach der Inkubation wurden die Enzyme durch 10minütige Hitzebehandlung bei 70°C denaturiert und 2 µl der DNA-Lösung zur Gelelektrophorese entnommen.

Hybridisierung

Die NaCl-Konzentration der ersten Abbaureaktion wurde auf 150 mmol/l erhöht und 2 µl des 5′-phosphorylierten Mutagenese-Primers (25 pmol) zugegeben, der direkt aus dem Ansatz für eine Phosphorylierungsreaktion entnommen wurde. Die Lösung wurde 10 Minuten lang bei 70°C inku biert und dann in einem Thermoblock über 30 Minuten hinweg von 56°C auf 25°C abgekühlt.

Bildung der Heteroduplex-DNA

Zur Polymerisations-Reaktion wurde die DNA-Lösung auf 25 mmol/l Tris-HCl, pH 8, 70 mmol/l NaCl, 5 mmol/l DTT, 8 mmol/l MgCl₂, 1,2 mmol/l ATP, jeweils 280 µmol/l von dATT, dCTP, dTTP und Sp-dGTPαS, 10 Einheiten Klenow- Fragment und 15 Einheiten T4-DNA-Ligase in einem Gesamtvolumen von 210 µl eingestellt. Die Reaktions mischung wurde 16 Stunden lang bei 16°C inkubiert. Danach wurden 5 µl für eine gelelektrophoretische Analyse und 2 µl für die Transformation von kompetenten Zellen ent nommen.

Reaktion der Phosphorothioat enthaltenden Heteroduplex-DNA mit PstI

Die Polymerisationslösung wurde mit Phenol extrahiert und unter Verwendung eines Centrikon 30 Mikrokonzentrators spindialysiert. Anschließend erfolgte eine Reaktion mit 70 Einheiten PstI in 100 µl Reaktionsvolumen mit 100 mmol/l NaCl, 10 mmol/l Tris-HCl, pH 7,5 und 10 mmol/l MgCl₂. Nach 80minütiger Inkubation bei 37°C und 10minütiger Hitzeinaktivierung bei 70°C wurden 4 µl zur gelelektrophoretischen Analyse und 2 µl zur Trans formation entnommen.

Zweite Abbaureaktion des genickten Plasmids

Die DNA-Lösung wurde mit Phenol extrahiert und der Puffer unter Verwendung eines Centrikon 30 Mikrokonzentrators ausgetauscht. Die Lösung enthielt in einem Volumen von 100 µl 10 mmol/l Tris-HCl, pH 8, 60 mmol/l NaCl, 7 mmol/l MgCl₂ und 7 mmol/l DTT. Die Abbaureaktionen mit Exonuklease III oder T5 Exonuklease wurden, wie bereits unter "Erste Abbaureaktion" beschrieben, durchgeführt. Der Abbau mit T7 Exonuklease wurde 30 Minuten lang unter denselben Bedingungen, wie für die T5 Exonuklease beschrieben durchgeführt, außer daß der 30 mmol/l Ethanolaminpuffer durch Tris-HCl, pH 8, ersetzt wurde. Nach der Inkubation wurden die Proben 10 Minuten lang bei 70°C erhitzt und anschließend in einem Thermoblock über 30 Minuten hinweg von 56°C auf 25°C abgekühlt. 8 µl wurden für die Gelelektrophorese und 2 µl für die Transformation entnommen.

Bildung der mutierten Homoduplex-DNA

Die DNA-Lösung wurde auf 220 µl verdünnt. Dabei erfolgte die Zugabe von DNA-Polymerase I (10 Einheiten), 4 dNTPs, ATP, MgCl₂, Tris-HCl, pH 8, DTT und T4-Ligase in den selben Konzentrationen wie bereits unter "Bildung der Heteroduplex-DNA" beschrieben. Nach dreistündiger Inku bation bei 37°C oder bei über Nacht-Inkubation bei 16°C wurden 14 µl zur gelelektrophoretischen Analyse und 2 µl zur Transformation von kompetenten Zellen entnommen.

Transformation aus Ausplattieren der Plasmid-DNA

Kompetente TG-1-Zellen wurden nach Chung et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172-2175 hergestellt und für alle Transformationen verwendet. Es wurden 2 µl Kontrollplasmid (Wildtyp pUC19 oder pUC19 amber DNA, 10 ng/ml) oder mutierte Plasmid-DNA (direkt entnommen aus den verschiedenen Enzymreaktionen) vorsichtig mit 100 µl der kompetenten Zellen vermischt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden 2, 10 und 80 µl der transformierten Zellen auf Ampicillin, IPTG, X-Gal enthaltenden Platten mit 2×YT-Agarmedium ausgestrichen. Die Platten wurden 16 Stunden lang bei 30°C inkubiert und die Mutationseffizienz durch Zählen der blauen und weißen Kolonien bestimmt.

Tabelle 1 zeigt eine Zusammenfassung der Ergebnisse mehrerer Plasmid-Mutagenese-Experimente unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Restriktionsenzymen und Exonukleasen. Daraus wird ersichtlich, daß die Effizienz im allgemeinen zwischen 70 und 80% liegt. Die geringere Effizienz bei den Reaktionen 4 und 5 stammt vermutlich von Unreinheiten innerhalb der T5-Exonuklease-Präpara tion.

Tabelle 1

Tabelle 2 zeigt die Mutations-Effizienz der Plasmid- Mutagenese bei verschiedenen Zwischenstufen des Verfahrens unter Verwendung der Enzymkombination HindIII/ExoIII/PstI/T7-Exonuklease (Tabelle 1, Reaktion 3). Daraus wird ersichtlich, daß die Mutations-Effizienz der DNA bereits nach der zweiten Abbaureaktion relativ hoch ist und daher der abschließende Repolymerisations schritt möglicherweise weggelassen werden kann.

Tabelle 2

Claims

1.Verfahren zur Mutagenese von doppelsträngiger zirkulärer DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) einen ersten spezifischen Einzelstrangbruch (Nick) im DNA-Molekül in der Nähe der Mutagenese-Stelle einführt,
b) eine erste Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen partiellen Abbau des genickten DNA- Strangs bewirkt, um einen begrenzten einzelsträngigen Bereich auf dem DNA-Molekül zu erzeugen, der auch die Mutagenese-Stelle umfaßt, wobei die Stelle des ersten spezifischen Einzelstrangbruchs bezüg lich der Exonuklease-Abbaurichtung nicht weiter als die Hälfte der Nukleotide des zirkulären DNA-Moleküls von der Mutagenese-Stelle entfernt ist,
c) einen Mutagenese-Primer und gegebenenfalls ein weiteres Oligonukleotid an den einzelsträngigen Bereich des DNA-Moleküls hybridisiert,
d) durch Behandlung mit DNA-Polymerase und Ligase ein geschlossenes Heteroduplex-DNA-Molekül erzeugt, in dessen mutierten DNA-Strang eines oder mehrere modifizierte Nukleotide eingebaut sind,
e) einen zweiten spezifischen Einzelstrangbruch im nicht-mutierten Strang des Heteroduplex-DNA-Moleküls einführt, wobei der mutierte DNA-Strang an der Spaltstelle eines oder mehrere modifizierte Nukleotide enthält,
f) eine zweite Exonuklease-Behandlung durchführt, bei der man einen gegebenenfalls partiellen Abbau des nicht-mutierten, genickten DNA-Strangs bewirkt, so daß die Mutagenese-Stelle in einem einzelsträngigen Bereich liegt, wobei man bei der Auswahl der Exonu klease darauf achtet, daß der Abbau des nicht muta genisierten Strangs in Richtung der Mutagenese- Stelle stattfindet und gegebenenfalls
g) das partiell einzelsträngige DNA-Molekül aus (f) mit Polymerase behandelt, um ein mutiertes Homoduplex- DNA-Molekül zu erzeugen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die doppel strängige zirkuläre DNA ein Plasmid ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den ersten spezifischen Einzelstrangbruch durch Spaltung des DNA-Moleküls in der Nähe der Mutagenese-Stelle mit einer Restriktionsnuklease in Gegenwart von Ethidiumbromid erzeugt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man EcoRI in Gegenwart von Co²⁺-Ionen verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man HindIII verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den ersten spezifischen Einzelstrangbruch erzeugt, indem man ein Oligonukleotid zugibt, das der Spaltregion in der Nähe der Mutagenese-Stelle komplementär ist und an seinem Ende ein komplexiertes Metallion und anschließend die Spaltung der DNA durch Zugabe eines geeigneten Aktivators bewirkt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die partiellen Abbaureaktionen des DNA- Moleküls ausgehend vom Einzelstrangbruch durch Behandlung mit 5′→3′ oder 3′→5′ Exonuklease bewirkt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man für den ersten partiellen Abbau des DNA-Moleküls eine nicht-prozessive Exonuklease, vorzugsweise Exonu klease III oder T5 Gen D15 Exonuklease verwendet.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Einbau von modifizierten Nukleotiden in den mutierten DNA-Strang bewirkt, indem man die Polymerase-Reaktion in Gegenwart von Desoxyribo nukleosidtriphosphaten und mindestens einem modi fizierten Nukleotid durchführt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Einbau von modifizierten Nukleotiden in den mutierten DNA-Strang bewirkt, indem man zur Hybridisierung mit dem partiell einzelsträngigen DNA-Molekül einen Mutagenese-Primer oder/und ein weiteres Oligonukleotid mit einem oder mehreren modifizierten Nukleotiden verwendet.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als modifizierte Nukleotide Basen-, Phos phat- oder/und Zuckeranaloga verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zuckeranaloga 2′-Desoxy-2′-fluornukleotide, Ribo nukleotide oder/und 3′-Desoxy-3′-thionukleotide verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Basenanaloga 4-Thiothymin, 2-Thiothymin, Uracil, 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, 6-Thiopurin, 6-Thio-2-aminopurin, 7-Deazaguanin, 7-Deazaadenin, Purin, Hypoxanthin oder/und 5-Methylcytosin verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Phosphatanaloga Phosphonate, Phosphorodithioate oder/und Phosphorothioate verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 11 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß man eines oder mehrere [α-S]Desoxyribonukleosid- triphosphate verwendet.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den zweiten spezifischen Einzelstrangbruch durch Inkubation des modifizierten Heteroduplex- DNA-Moleküls mit einer geeigneten Restriktions endonuklease bewirkt.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als modifiziertes Nukleotid ein geeignetes [α-S]Desoxyribonukleosidtriphosphat und eine Restriktionsendonuklease ausgewählt aus der Gruppe EcoRV, PstI, NciI, HindII, PvuI, FspI, AvaI, AvaII und BanII verwendet.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als modifizierte Nukleotide zwei geeignete [α-S]Desoxyribonukleosidtriphosphate und eine Restriktionsendonuklease ausgewählt aus der Gruppe BamHI, EcoRI, MspI, HpaII, HindIII, PvuII und SacI verwendet.