DE10030376A1 - Neues Verfahren zum Auffinden neuer Wirkstoffe - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren, seine Verwendung zum Auffinden neuer Wirkstoffe, seine Verwendung in Screening-Assays sowie für diagnostische und präparative Zwecke.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren, seine Verwendung zum Auf
finden neuer Wirkstoffe, seine Verwendung in Screening-Assays sowie für
diagnostische und präparative Zwecke.
Zur Detektion der Aktivität DNA-modifizierender Enzyme stehen eine Reihe von
Verfahren zur Verfügung, wie z. B. gelelektrophoretische Verfahren, welche die
unterschiedliche Wanderungsgeschwindigkeit modifizierter und nicht-modifizierter
DNA-Spezies zur Grundlage haben (z. B. Detektion der Aktivität von Restrik
tionsenzymen mittels Agarosegelelektrophorese (Sambrook, J., Fritsch, E. F.,
Maniatis, T. (1989), 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY). Auch die katalytische Aktivität der Terminasen der Herpesviren, in vitro eine
doppelsträngige superspiralisierte Plasmid-DNA zu nicken, wurde bislang mittels
Gel-shift-Assays abgegriffen (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol.,
72: 2259-2264). Assays zur Messung der Aktivität von HIV-Integrase sind z. B.
Gelshiftassays mit und ohne radioaktive Markierung (Sherman, P. A., Fyfe, J. A.
(1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123); eine HTS-Fähigkeit ist hier
nicht gegeben. Beschrieben sind auch Eintopfverfahren, welche auf FRET
(fluorescence resonance energy transfer) beruhen (Lee, S. P., Censullo, M. L., Kim,
H. G., Knutson, J. R., Han, M. K. (1995), Analytical biochemistry 227: 295-301).
Weiterhin zu erwähnen ist ein Microtiter-strand-transfer-assay, welcher mit
immobilisierten bzw. biotinylierten Oligonukleotiden arbeitet (Hazuda, D. J.,
Hastings, J. C., Wolfe, A. L., Emini, E. A. (1994), Nucleic Acids Res. 22: 1121-1122).
Die Messung der Aktivität von Ligasen, welche die katalytische Aktivität besitzen,
lineare oder genickte DNA-Moleküle zu zirkularisieren, erfolgt klassisch mittels
radioaktiver Methoden entweder über die Umwandlung von [32P] Pyrophosphat in
ein Norit-absorbierbares Material (Weiss unit) oder über die Messung der Circu
larisierung eines radioaktiv markierten d(A-T)n polymers (Modrich, P., Lehman, I. R.
(1979), J. Biol. Chem. 245: 3626-3631). All diese Verfahren beruhen jedoch auf der
Verwendung von Radioaktivität und Filtrations- bzw. Absorptionsschritten oder
benötigen entsprechende Waschschritte, welche im Hochdurchsatzverfahren nicht
durchführbar sind.
Ausgehend vom derzeitigen Stand der Technik zum Nachweis der Aktivität von
DNA-modifizierenden Enzymen, stellten sich die Erfinder die Aufgabe, ein Ver
fahren zu entwickeln, welches als Eintopfreaktion leicht durchführbar ist.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren, das die Schritte umfasst:
- 1. Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität dieser DNA-Spezies zu verändern,
- 2. die Behandlung mit Exonuklease, und
- 3. der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA.
Das erfindungsgemäße Verfahren kommt ohne die Hilfe von gelelektrophoretischen
oder sonstigen Trennungsvorgängen aus und ist daher Zeit- und kostensparend und
im high-throughput-Maßstab einsetzbar. Es eignet sich insbesondere zum Aufbau
von Screening Assays, insbesondere High-throughput-Screening (HTS) Assays oder
Test-Kits, um Inhibitoren DNA-modifizierender Enzyme zu identifizieren. Sind diese
DNA-modifizierenden Enzyme z. B. für Pathogene essentiell, so stellen die hierdurch
identifizierten Inhibitoren wertvolle therapeutisch oder prophylaktisch einsetzbare
Wirkstoffe dar. Im Rahmen eines Screening Assays werden eine Vielzahl von Ver
bindungen auf ihre Fähigkeit hin getestet, die enzymatische Aktivität des DNA-
modifizierenden Enzyms zu inhibieren. Dies erfolgt bevorzugt automatisiert im
Hochdurchsatzverfahren (HTS). Ein Test-Kit stellt die für die Durchführung des
Assays notwendigen Komponenten zur Verfügung.
Die Behandlung der DNA-Spezies mit einem oder mehreren DNA-modifizierenden
Enzymen erfolgt in an sich bekannter Weise durch Inkubieren in einem geeigneten
wässrigen Puffermedium (wässrige Lösung mit geeigneter Ionenstärke, geeignetem
pH-Wert, geeigneter Proteinkonzentration, geeigneten Redoxmitteln bei geeigneter
Temperatur). Die genauen Inkubationsbedingungen hängen von der Art des DNA-
modifizierenden Enzyms ab. Diesbezüglich wird auf die Beispiele und auf bekannte
Literatur (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), 2nd ed., Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) verwiesen.
Geeignete, im Verfahren umsetzbare DNA-Spezies schließen zweckmäßig ein:
eine geschlossene, eine genickte oder eine lineare DNA mit gegebenenfalls derart modifizierten Enden, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können. Z. B. können eine doppelsträngige circuläre DNA, eine doppelsträngige lineare DNA, deren Enden gegebenenfalls so modifiziert sind, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können oder eine doppelsträngige circuläre genickte DNA verwendet werden. Die DNA-Spezies können natürlichen, synthetischen oder gen technologischen Ursprungs (z. B. Polymerase-Chain-Reaction (PCR)) sein.
eine geschlossene, eine genickte oder eine lineare DNA mit gegebenenfalls derart modifizierten Enden, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können. Z. B. können eine doppelsträngige circuläre DNA, eine doppelsträngige lineare DNA, deren Enden gegebenenfalls so modifiziert sind, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt werden können oder eine doppelsträngige circuläre genickte DNA verwendet werden. Die DNA-Spezies können natürlichen, synthetischen oder gen technologischen Ursprungs (z. B. Polymerase-Chain-Reaction (PCR)) sein.
Als DNA-modifizierende Enzyme können z. B. Enzyme folgender Enzymklassen
verwendet werden: Terminasen, Ligasen, Topoisomerasen, Restriktionsendo
nukleasen, Integralen, Telomerasen, Methylasen, Demethylasen etc. und/oder Kom
binationen daraus. Im Falle der Terminasen, Ligasen, Integrasen, Topoisomerasen
und Restriktionsendonukleasen erfolgt die Änderung der Exonucleasesensitivität
unmittelbar, im Falle der Methylasen oder Demethylasen wird durch deren Aktivität
die Suszeptibilität der Substrat-DNA für eine ebenfalls im Reaktionsansatz vor
handene restriktive Endonuklease modifiziert, welche dann letzten Endes zur Modi
fizierung der Exonuklease-Sensitivität führt. Im Falle der Anwendung des erfin
dungsgemäßen Verfahrens beim Auffinden neuer Wirkstoffe wie beispielsweise bei
Screening-Assays sind die DNA-modifizierenden Enzyme zweckmäßig solche
Enzyme, die für das Pathogen von essentieller Bedeutung sind. Bevorzugt werden
Terminasen der Herpes-Viren, Integrasen von HIV 1 oder HIV 2 oder bakterielle
Ligasen verwendet. Die Fähigkeit der DNA-modifizierenden Enzyme, die Exonuklease-Sensitivität
besagter DNA-Spezies zu verändern, schließt im Sinne der
Erfindung die Fähigkeit ein, die DNA-Spezies für den Angriff der Exonuklease zu
sensibilisieren oder zu desensibilisieren. Dies bedeutet beispielsweise im Falle der
Terminase oder Integrase die Spaltung eines oder beider DNA-Stränge einer doppel
strängigen circulären Substrat-DNA, wie dies schematisch in Fig. 1 gezeigt ist. Im
Falle der Ligase bedeutet dies das kovalente Schließen beider DNA-Stränge einer
doppelsträngigen linearen Substrat-DNA, wie schematisch in Fig. 6 gezeigt.
Die Behandlung der DNA-Spezies mit dem DNA-modifizierenden Enzym kann
simultan in Gegenwart von Exonuklease erfolgen (z. B. im Falle der Terminase, Bei
spiel 1 oder Integrase, Beispiel 2), oder die Behandlung mit der Exonuklease kann
nachfolgend erfolgen (z. B. im Falle der Ligase, Beispiel 3). Bevorzugterweise erfolgt
die Behandlung, wenn möglich, simultan. Exonukleasen im Sinne der Erfindung
schließen solche Enzyme ein, welche DNA-Stränge von den Enden her hydrolytisch
abbauen. Beispielsweise können 3'-5'-Exonukleasen, wie Exonuklease III (Roche
Molecular Biochemicals Best. Nr. 779 709) oder 5'-3'-Exonukleasen, wie λ-Exo
nuklease (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr. 1666908), verwendet werden.
Ebenso besitzen auch einige DNA-Polymerasen (z. B. T4-DNA-Polymerase (Roche
Molecular Biochemicals Best. Nr. 1004786)) unter geeigneten Reaktionsbedin
gungen eine Exonuklease-Aktivität, diese sind ebenfalls in der vorliegenden Erfin
dung enthalten.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren erfolgt nach oder während der Behandlung mit
Exonuklease die Analyse und/oder präparative Umsetzung der aus der Behandlung
resultierenden DNA, bevorzugterweise erfolgt die Analyse und/oder präparative Um
setzung nachfolgend. Die Analyse schließt hierbei insbesondere die Quantifizierung
der resultierenden DNA ein. Die Quantifizierung von DNA ist möglich unter
Verwendung interkalierender fluoreszierender Farbstoffe. Derartige Farbstoffe sind
kommerziell erhältlich. Beispielsweise kann Hoechst 33258 (2'-[4-Hydroxyphenyl]-
5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1H-benzimidazol) (BioRad Laboratories GmbH,
München, Deutschland, Best. Nr.: 170-2480) oder PicoGreenTM (Molecular Probes,
MoBiTec, Göttingen, Deutschland, Best. Nr.: P7581) verwendet werden. Eine Alter
native ist die Quantifizierung mittels molecular beacons (Livak, K. J., Flood, S. J. A.,
Marmaro, J., Mullah, K. B. (1998), US5723591). Falls die DNA für ein Protein
kodiert (z. B. Luciferase, β-Galactosidase, alkalische Phosphatase etc.), so ist eine
weitere Alternative die in vitro-Transkription/Translation gefolgt von einer Be
stimmung der enzymatischen Aktivität.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung, zum Aufbau von
Screening-Assays zur Identifizierung von Inhibitoren essentieller DNA-modifizie
render Enzyme pathogener Organismen, ist dadurch gekennzeichnet, dass man den
Schritt (1) des erfindungsgemäßen Verfahrens in Gegenwart möglicher Inhibitoren
der besagten DNA-modifizierenden Enzyme (Proteine) durchführt, und anschließend
die Menge der verbliebenen DNA bestimmt. Mögliche Inhibitoren schließen bei
spielsweise Peptide, Antikörper, Proteine, Nukleinsäuren und bevorzugt nieder
molekulare chemische Substanzen natürlichen oder synthetischen Ursprungs ein. In
Anwesenheit von Inhibitoren der DNA-modifizierenden Enzyme erfolgt keine
Veränderung der Exonuklease-Sensitivität der DNA-Substratmoleküle, und dies lässt
sich durch die Bestimmung der Menge der verbliebenen DNA nachweisen, wie oben
beschrieben.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Auf
findung von Inhibitoren DNA-modifizierender Enzyme ist dadurch gekennzeichnet,
dass man eine doppelsträngige, circuläre DNA oder eine doppelsträngige lineare
DNA, deren Enden so modifiziert sind, dass sie durch eine Exonuclease nicht erkannt
werden können, und die jeweils eine oder mehrere Erkennungssequenzen oder
Bindungsstellen für das DNA-modifizierende Enzym aufweisen können, ein DNA-
Strang-spaltendes Enzym, einen potentiellen Inhibitor dieses Enzyms sowie eine
Exonuklease inkubiert und anschließend die verbleibende Menge der doppel
strängigen DNA nachweist. Als Exonuclease-insensitive Substrat-DNA ist dabei bei
spielsweise circulär geschlossene DNA einsetzbar (z. B. ein bakterielles Plasmid),
möglich ist aber auch der Einsatz linearer DNA, wenn die Enden vor Exonucleaseangriff
geschützt sind, was insbesondere durch Anwesenheit von Phosphorothioat-
Bindungen anstelle von Phosphorodiesterbindungen im DNA-Rückgrat erreicht
werden kann. Diese können z. B. mittels terminaler Transferase 3'-anpolymerisiert
werden, oder aber, falls die Substrat-DNA durch PCR amplifiziert wurde, durch die
Verwendung von phosphorothioathaltigen Primern terminal bereits chemisch synthe
tisch eingeführt sein.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Auffindung von Inhibitoren DNA-modifizierender Enzyme ist dadurch gekenn
zeichnet, dass man eine doppelsträngige, circuläre genickte DNA oder eine doppel
strängige lineare oder linearisierte DNA, ein DNA-Strang-ligierendes Enzym, einen
potentiellen Inhibitor dieses Enzyms inkubiert, anschließend eine Exonuklease zu
setzt, wiederum inkubiert und anschließend die verbleibende Menge der doppel
strängigen DNA nachweist. Als Exonuclease sensitive Substrat-DNA ist beispiels
weise Plasmid-DNA einsetzbar, welche zuvor mit Hilfe eines nur an einer be
stimmten Stelle schneidenden Restriktionsenzyms in an sich bekannter Weise lineari
siert wurde.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft vorliegende Erfindung die
Entwicklung eines Assays zur Identifizierung von Wirkstoffen gegen Herpesviren.
Zu der Familie der humanpathogenen Herpesviren gehören die Herpes Simplex
Viren Typ 1 und 2 (HSV-1, HHV-1 und HSV-2, HHV-2), Varizella Zoster Virus
(VZV, HHV-3), das Epstein-Barr Virus (EBV, HHV-4), das humane Cytomegalie
Virus (HCMV, HHV-5) sowie die humanen Herpesviren 6, 7, 8 (HHV-6, HHV-7,
HHV-8) (Fields, 1996, Virology Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia). Herpes
viren sind Auslöser für Krankheiten wie: Herpes labialis, Pharyngitis, Gingivosto
matitis, Herpes genitalis, Herpes gladiatorum, ocularem Herpes, welcher bis zur
Erblindung führen kann, Varicella (Windpocken), Herpes zoster (Gürtelrose), 3-
Tage-Fieber, Hepatitis, Pneumonie, Encephalitis, Mononucleose und Kaposi-
Sarkom. Herpesviren haben ein lineares, doppelsträngiges DNA-Genom von ca. 100-
270 Kilobasenpaaren. Nach Infektion der permissiven Zielzelle erfolgt die DNA-
Replikation vermutlich nach einem rolling circle Mechanismus ab, bei dem Konkate
mere der viralen DNA synthetisiert werden. Während der Virusreifung in der Zelle
werden die Konkatemere durch eine Nuclease/Terminase geschnitten und in die sich
selbst assemblierenden Viruscapside verpackt. Die Terminasereaktion ist dabei für
den Replikationszyklus der Herpesviren essentiell. Eine Methode zum Auffinden von
Terminaseinhibitoren würde daher antivirale Wirkstoffe identifizieren können. Da
die Terminasekomponenten über die verschiedenen Herpesvirenspezies relativ gut
konserviert sind besteht die Möglichkeit, mittels dieses Ansatzes ein Breitband
antiherpetikum zu identifizieren. Das HCMV Gen UL56 kodiert für ein Protein
(p130), welches Teil des Terminasekomplexes ist. P130 alleine besitzt in vitro eine
katalytische Nucleaseaktivität. Diese schneidet überwiegend nur einen der beiden
DNA-Stränge (nicking) eines supercoil-Plasmides, welches eine spezifische
Erkennungssequenz (pac1/pac2) trägt (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J.
Virol., 72: 2259-2264). Hierdurch resultiert in der Agarosegelelektrophorese eine
leicht verringerte Wanderungsgeschwindigkeit des genickten Plasmids im Vergleich
zur supercoil-Ausgangsform. Die Durchführung der zur Detektion nötigen, Agarose
gelelektrophorese ist nicht im high throughput screening (HTS)-Maßstab durch
führbar. Durch Anwendung der in diesem Patent beschriebenen Technologie ist die
Entwicklung eines HTS-Assays möglich. Diese Ausführungsform wird auch stell
vertretend in Beispiel 1 detailliert beschrieben. In diesem Fall wird die DNA-
nickende Aktivität von p130 kombiniert mit der Exonucleaseaktivität des Enzyms
T4-DNA-Polymerase (Fig. 1). Das Plasmidsubstratmolekül wird in einer Eintopf
reaktion zunächst von p130 genickt und dadurch für die Exonuclease (z. B. ExoIII
oder T4-DNA-Pol) angreifbar. Während die genickte DNA abgebaut wird, bleibt die
nicht-genickte supercoil-DNA erhalten (Fig. 2). Durch die Kombination der beiden
Enzymaktivitäten erfolgt somit eine Abnahme der DNA-Konzentration im Reak
tionsansatz. Würde die Terminasereaktion (p130-nicking) inhibiert (z. B. durch einen
niedermolekularen Inhibitor), so nähme auch die DNA-Menge im Reaktionsgefäß
nicht ab. Eine Quantifizierung der DNA nach abgeschlossener Reaktion kann mit
Hilfe von Hoechst 33258 (Fig. 3) durchgeführt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft vorliegende Erfindung die
Entwicklung eines Assays zur Auffindung von Wirkstoffen gegen das human
immunodeficiency virus (HIV). HIV-1 (so wie auch HIV-2) ist als Erreger der er
worbenen Immunschwäche AIDS (acquired immunodeficiency syndrome) bekannt.
Infektiöse Virionen enthalten zwei identische Kopien des einzelsträngigen 9,2 kb
RNA-Genoms. In frühen Stadien der Infektion wird das RNA-Genom in doppel
strängige lineare DNA revers transkribiert, dieser Prozess wird durch die virale
Reverse Transkriptase (RT) katalysiert, welche ein Produkt des viralen pol-Gens ist.
Für die Replikation essentiell ist aber auch die Integration dieser doppelsträngigen
viralen DNA ins Genom der infizierten Wirtszelle (CD4+-Zellen also T-Lympho
zyten, Makrophagen etc.). Die Integration läuft über zwei Veresterungsschritte ab
und wird katalysiert durch das virale 32-kDa-Enzym Integrase (IN), welches eben
falls ein Produkt des viralen pol-Gens ist. Da Mutationen in der für IN kodierenden
Region von pol zu replikationsdefizientem HIV führen, stellt die Integrase ein
interessantes Target für die antivirale Chemotherapie dar. Neben weiteren enzyma
tischen Reaktionen katalysiert IN in vitro unter anderem auch die Spaltung (Nicking
und Linearisierung) von supercoil-Plasmid-DNA (Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990),
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5119-5123). Hierdurch resultiert in der Agarosegel
elektrophorese eine leicht vernngerte Wanderungsgeschwindigkeit des genickten
Plasmids im Vergleich zur supercoil-Ausgangsform. Die Durchführung der zur
Detektion nötigen Agarosegelelektrophorese ist nicht im high throughput screening
(HTS)-Maßstab durchführbar. Durch Anwendung der in diesem Patent beschriebenen
Technologie ist die Entwicklung eines HTS-Assays möglich. Diese Ausführungs
form wird stellvertretend in Beispiel 2 detailliert beschrieben. In diesem Fall wird die
DNA-nickende Aktivität der HIV-Integrase kombiniert mit der Exonucleaseaktivität
z. B des Enzyms T4-DNA-Polymerase und/oder Exonuclease III (Fig. 4). Das
Plasmidsubstratmolekül (pUC18) wird in einer Eintopfreaktion zunächst von der
Integrase genickt und dadurch für die Exonucleaseaktivität der T4-DNA-Polymerase
oder ExonucleaseIII angreifbar. Während die genickte DNA abgebaut wird, bleibt die
nicht-genickte supercoil-DNA erhalten (Fig. 4). Durch die Kombination der beiden
oder aller drei Enzymaktivitäten erfolgt somit eine Abnahme der DNA-Konzentration
im Reaktionsansatz. Würde die Integraseaktivität (nicking) inhibiert (z. B.
durch einen niedermolekularen Inhibitor), so nähme auch die DNA-Menge im Reak
tionsgefäß nicht ab. Eine Quantifizierung der DNA nach abgeschlossener Reaktion
kann mit Hilfe von Hoechst 33258 (Fig. 5) durchgeführt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform betrifft vorliegende Erfindung die
Entwicklung eines Assays zur Auffindung von antibakteriellen Wirkstoffen. DNA
Ligasen katalysieren die Knüpfung einer Phosphodiesterbindung zwischen einer 5'-
Phosphat und einer 3'-Hydroxygruppe in genickter DNA. Ein wichtiger Schritt des
katalytischen Mechanismus ist die Bildung eines adenylierten DNA Intermediates.
Die Adenylgruppe stammt bei DNA-Ligasen der Eukaryonten und der Archae
bakterien von ATP, bei Eubakterien aber vom NAD. Die Ligationsreaktion ist für die
DNA-Replikation und für die Reparatur geschädigter DNA essentiell und ligasedefi
ziente Stämme sind nicht lebensfähig. Wegen des divergenten katalytischen Mecha
nismus und der Essentialität stellen bakterielle DNA-Ligasen ein interessantes Target
bei der Identifizierung antibiotisch wirksamer Substanzen dar. Von gram-positiven
Bakterien verursachte Krankheiten sind beispielsweise: Pneumonie (z. B.
Streptococcus pneumoniae), Abszess (z. B. Staphylococcus aureus), Pharyngitis,
Tonsillitis (z. B. Streptococcus pyogenes), Diphtherie (Corynebacterium
diphtheriae), Meningitis (z. B. Listeria monocytogenes), Anthrax (Bacillus
anthracis), Tetanus (Clostridium tetani). Gram-negative Bakterien lösen z. B.
folgende Krankheiten aus: Meningitis (z. B. Neisseria meningitidis, Haemophilus
influenzae), Gonorrhea (z. B. Neisseria gonorrhoeae), Urogenitalinfektionen (z. B.
Escherichia coli), Pneumonie (z. B. Klebsiella pneumoniae), Typhus (Salmonella
typhi), Epiglottitis (z. B. Haemophilus influenzae), Pertussis (Bordetella pertussis),
Pest (Yersinia pestis), Cholera (Vibrio cholerae). Wichtige Pathogene schließlich
sind noch die Mykobakterien, zu welchen beispielsweise die Erreger der
Tuberculose, Mycobakterium tuberculosis und der Lepra (Mycobacterium leprae)
gehören. Wird mit kompatiblen sticky ends versehene lineare DNA mit der Ligase
unter geeigneten enzymatischen Bedingungen inkubiert, so erfolgt die Bildung von
kovalent geschlossener DNA. Hierdurch resultiert in der Agarosegelelektrophorese
eine leicht erhöhte Wanderungsgeschwindigkeit im Vergleich zur Ausgangsform.
Die Durchführung der zur Detektion nötigen, Agarosegelelektrophorese ist nicht im
high throughput screening (HTS)-Maßstab durchführbar. Durch Anwendung der in
diesem Patent beschriebenen Technologie ist die Entwicklung eines HTS-Assays
möglich. Diese Ausführungsform wird stellvertretend in Beispiel 3 detailliert
beschrieben. In diesem Fall wird die DNA-Ligaseaktivität verbunden mit einer
nachfolgenden Exonucleasebehandlung (z. B. T4-DNA-Polymerase) (Fig. 6). Im
ersten Schritt erfolgt die Circularisierung des linearen DNA-Substratmoleküls durch
die Ligase. Danach wird Exonuclease zugesetzt und schließlich die verbleibende
DNA-Menge mittels PicoGreen (Molecular Probes, Best. Nr.: P7581) quantifiziert
(Fig. 8). Das ursprünglich vorliegende Substratmolekül (mittels Restriktionsverdau
linearisiertes pUC18) ist von der Exonuclease angreifbar (Fig. 7). Erfolgt durch die
katalytische Aktivität der Ligase eine kovalente Verknüpfung der Enden und damit
die Bildung eines circulären DNA-Moleküls, so ist Exonucleaseresistenz gegeben.
Würde die Ligaseaktivität inhibiert (z. B. durch einen kleinmolekularen Inhibitor), so
nähme auch die Exonucleasebehandlung verbleibende DNA-Menge im Reaktions
gefäß nicht zu.
Der mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens aufgefundenen Inhibitoren DNA-
modifizierender Enzyme können bei entsprechender Eignung als Wirkstoffe zur
Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten bei Säugetieren angewendet werden.
Dazu können diese Stoffe systemisch und/oder lokal wirken. Zu diesem Zweck kann
er auf geeignete Weise appliziert werden, wie z. B. oral, parenteral, pulmonal, nasal,
sublingual, lingual, buccal, rectal, transdermal, conjunctival, otisch oder als Im
plantat.
Für diese Applikationswege kann der Wirkstoff in geeigneten Applikationsformen
verabreicht werden. Gegebenenfalls kann es sinnvoll sein, die erfindungsgemäß
gefundenen Verbindungen mit anderen Wirkstoffen zu kombinieren.
Darüberhinaus ist das Verfahren auch zur Detektion von Mutationen (z. B. Punkt
mutationen) einsetzbar.
Zur Detektion von Punktmutationen gibt es zahlreiche Methoden (Review: Kwok,
Chen (1998), Genet. Eng. (NY) 20: 125-134). Beispielsweise sind hier zu nennen:
Restriction Fragment Length Polymerphism (RFLP), Denaturierende Gradientengel
elektrophorese, Heteroduplex Analyse, Single-strand Conformation Polymorphism
(SSCP) oder DNA-Sequenzierung. Ein Nachteil fast all dieser Methoden ist aber die
Tatsache, dass zur Analyse eine aufwendige und nicht im Hochdurchsatzverfahren
durchführbare gelelektrophoretische Trennung von DNA-Fragmenten oder die An
wendung von Hybridisierungsverfahren notwendig ist, was eine Automatisierung
und damit billige Testung sehr erschwert. Ausgehend von diesem Stand der Technik
sollte ein Verfahren bereitgestellt werden, welches in einer Eintopfreaktion im Hoch
durchsatzverfahren einfach durchzuführen ist.
Im Falle der Diagnostik zur Detektion von Mutationen (z. B. Punktmutationen) um
fasst das Verfahren die folgenden Schritte:
- a) Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
- b) die Behandlung mit Exonuklease, und
- c) der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA, gegebenenfalls Klonierung, Amplifizierung, Expression oder Sequenzierung der verbliebenen DNA.
Eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung betrifft ein Verfahren zur
Detektion von Mutationen im Hochdurchsatzverfahren. Hierbei wird DNA, ent
haltend eine Wildtyp-Sequenz und/oder eine Mutante besagter Wildtyp-Sequenz, die
sich durch die Anwesenheit oder Nicht-Anwesenheit einer Erkennungssequenz einer
spezifischen Endonuklease unterscheiden, wobei die genannte DNA gegebenenfalls
mit einer PCR amplifiziert wurde, mit einer für die Wildtyp-Sequenz oder die
Mutante besagter Wildtyp-Sequenz spezifischen Endonuklease umgesetzt, gleich
zeitig oder nachfolgend mit Exonuklease umgesetzt und anschließend die verbliebene
Menge der DNA gemessen oder die verbliebene DNA präparativ weiterverwendet.
Der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA erfolgt hier z. B.
mittels interkalierender fluoreszierender Farbstoffe. Die optional mögliche präpara
tive Umsetzung der resultierenden DNA-Spezies erfolgt mittels an sich bekannter
gentechnologischer Methoden (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989), 2nd
ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Möglich ist die Unterscheidung zwischen DNAs einer "Wildtyp-Sequenz" und einer
"Mutanten-Sequenz", wenn sich beide Sequenzen durch die Anwesenheit oder Nicht-
Anwesenheit einer Erkennungssequenz einer spezifischen Endonuklease unter
scheiden.
Zweckmäßigerweise wird hierzu zuvor die Substrat-DNA mittels einer PCR aus dem
zu analysierenden Genom spezifisch amplifiziert. Initiale Exonucleaseinsensitivität
wird mit der Hilfe von exonucleaseresistenten Primern oder durch Anpolymerisieren
von Phosphorothioatnucleotiden erreicht. Die mit Hilfe der erfindungsgemäßen
Technologie zu detektierenden Mutationen können beispielsweise sein: Punkt
mutationen mit einem oder mehreren Basenaustauschen, Insertionen, Deletionen etc..
Das Verfahren lässt sich in leicht abgewandelter Form auch dazu einsetzen, zu einer
bekannten Gensequenz verwandte Gensequenzen effizient zu isolieren.
Im Genom der Vertebraten treten Gene häufig in der Form von Genfamilien auf,
welche zahlreiche mehr oder weniger stark verwandte Mitglieder umfassen. Die
Identifizierung weiterer Mitglieder der Genfamilie im selben Genom oder aber auch
die Suche nach dem phylogenetischen Homolog in Genomen anderer evolutiv ent
fernter Spezies stellt sich dabei oft als sehr schwierig und aufwendig dar. Eine
Methode, um von einer bekannten Sequenz ausgehend weitere Mitglieder einer
Familie zu identifizieren, ist die Hybridisierung einer Genbibliothek mittels einer
vom bekannten Gen abgeleiteten markierten Gensonde unter Bedingungen mit
geringer Stringenz. Aufgrund zu großer Sequenzunterschiede ist eine Kreuzhybridi
sierung bei entfernt verwandten Mitgliedern aber oftmals nicht zu erreichen. Eine
weitere Methode zur Klonierung verwandter Gensequenzen beruht auf der Poly
merasekettenreaktion (PCR). Aus den bekannten Mitgliedern der zu untersuchenden
Genfamilie werden mittels eines Alignments konservierte Bereiche identifiziert und
mit deren Hilfe degenerierte Primer entwickelt. Diese Primer sind dann in der Lage,
zusätzlich zu den bereits bekannten Vertretern weitere Mitglieder der Genfamilie
oder aber homologe Gene in anderen Spezies zu amplifizieren. Ein Nachteil bei
dieser Methode, wenn sie zur Klonierung von neuen Genfamilienmitgliedern einge
setzt wird, ist aber, dass die bereits bekannten Sequenzen stark bevorzugt amplifiziert
werden, so dass eine Identifizierung von noch unbekannten und nur mit geringer
Effizienz amplifizierten Familienmitgliedern entweder gar nicht oder nur mit sehr
hohem Aufwand möglich ist.
Im Falle der Isolation homologer Gensequenzen umfasst das Verfahren die folgenden
Schritte:
- a) Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
- b) die Behandlung mit Exonuklease, und
- c) Klonierung, Amplifizierung, Expression oder Sequenzierung der DNA
Die präparative Umsetzung der resultierenden DNA-Spezies erfolgt mittels an sich
bekannter gentechnologischen Methoden (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T.
(1989), 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
Eine Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung betrifft ein zur Isolierung noch
unbekannter Gene einsetzbares Verfahren. Hierbei wird DNA, enthaltend eine
bekannte Sequenz und eine dazu verwandte Sequenz, die gegebenenfalls mit einer
PCR amplifiziert wurden, mit einer für die bekannte Sequenz oder dazu verwandte
Sequenz spezifischen Endonuklease umgesetzt, gleichzeitig oder nachfolgend mit
Exonuklease umgesetzt und anschließend die verbliebene DNA präparativ weiter
verwendet.
Ausgehend von DNA, enthaltend eine bekannte Sequenz und eine dazu verwandte
Sequenz (z. B. eine homologe Sequenz), erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die
selektive Anreicherung der verwandten Sequenz, wenn diese Varianten sich hin
sichtlich der Sensitivität gegenüber einer Restriktionsendonuclease unterscheiden.
Eine solche erfindungsgemäß einsetzbare DNA kann beispielsweise mit Hilfe einer
Polymerasekettenreaktion (PCR) hergestellt werden. Initiale Exonucleaseinsensi
tivität wird mit der Hilfe von exonucleaseresistenten Primern oder durch Anpoly
merisieren von Phosphorothioatnucleotiden erreicht. Unter anderem ist mit dem
erfindungsgemäßen Verfahren die Isolierung noch unbekannter Gene möglich,
welche zu einem bereits bekannten Gen verwandt (z. B. homolog) sind und diese bei
spielsweise während einer PCR zusammen mit der bereits bekannten Zielsequenz mit
sehr geringer Effizienz coamplifiziert wurden.
Ebenso möglich ist eine selektive Entfernung der verwandten Sequenzen mit Hilfe
des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Erfindung soll durch die Fig. 1 bis 10 im folgenden näher erläutert werden.
Fig. 1 zeigt den erfindungsgemäßen Fall, in dem eine Terminase (hier p130 = UL56
von HCMV) (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264)
als DNA-modifizierendes Enzym verwendet wird. Dadurch entsteht eine Exo
nuklease-Sensitivität, die in Gegenwart von Inhibitoren der Terminase ausbleibt.
Somit ergibt sich ein jeweils unterschiedliches Fluoreszenzsignal nach Zugabe von
Hoechst33258 (2'-[4-Hydroxyphenyl]-5-[4-methyl-1-piperazinyl]-2,5'-bi-1H-benz
imidazol) (BioRad, München, Best. Nr. 170-2480).
Fig. 2 die Substrat-DNA pUCaSeq (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J.
Virol., 72: 2259-2264) wurde mit den angegebenen Enzymkombinationen für 3 h bei
37°C inkubiert und anschließend einer Agarosegelelektrophorese unterzogen (siehe
Beispiel 1). Die Ethidiumbromid (2,7-Diamino-10-ethyl-9-phenyl-phenanthridinium
bromid)-färbung des Gels zeigt, dass die genickte Plasmidform, welche bei Inkuba
tion mit p130 (Protein wurde von Dr. E. Bogner zur Verfügung gestellt) (Bogner, E.,
Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264) entsteht, bei gleichzeitiger
Anwesenheit einer Exonuclease (ExoIII (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr.
779 709) oder T4-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals Best. Nr.
1004786)) vollständig abgebaut wird.
Fig. 3 die Substrat-DNA pUCaSeq wurde mit den angegebenen Enzymkombina
tionen für 3 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die verbleibende DNA-
Konzentration mittels Hoechst33258 bestimmt. Die gemessenen Fluoreszenzwerte
(Excitation 355 nm, Emission 460 nm) sind jeweils angegeben (Terminale = p130).
Fig. 4 zeigt den erfindungsgemäßen Fall in dem eine Integrase (hier HIV-Integrase)
(Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123) als
DNA-modifizierendes Enzym verwendet wird. Damit entsteht eine Exonuclease-
Sensitivität, die in Gegenwart von Inhibitoren der HIV-Integrase ausbleibt.
Die Substrat-DNA pUC18 (Amersham Pharmacia Best. Nr. 27494901) wurde mit
den angegebenen Enzymkombinationen für 3 h bei 37°C inkubiert und anschließend
einer Gelelektrophorese unterzogen (siehe Beispiel 2). Die Ethidiumbromid (2,7-
Diamino-10-ethyl-9-phenyl-phenanthridinium bromid)-färbung des Gels zeigt, dass
die genickte Plasmidform, welche bei Inkubation mit HIV-Integrase (Sherman, P. A.,
Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123) entsteht, bei gleich
zeitiger Anwesenheit einer oder mehrerer Exonucleasen (ExoIII (Roche Molecular
Biochemicals Best. Nr. 779 709) oder T4-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals
Best. Nr. 1004786)) partiell oder vollständig abgebaut wird, das ohne
Integrase vorliegende supercoil-Plasmid wird jedoch nicht angegriffen.
Fig. 5 die Substrat-DNA pUC18 wurde mit den angegebenen Enzymkombinationen
für 3 h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die verbleibende DNA-Konzentration
mittels Hoechst 33258 bestimmt. Die gemessenen Fluoreszenzwerte (Excitation
355 nm, Emission 460 nm) sind jeweils angegeben (Terminase = p130).
Fig. 6 zeigt den erfindungsgemäßen Fall, in dem eine Ligase als DNA-modifizie
rendes Enzym und eine zuvor mit einem Restriktionsenzym linearisierte Plasmid-
DNA als Substrat verwendet wird. Durch die Aktivität der Ligase wird die DNA-
Spezies für die Exonuklease desensibilisiert. In Gegenwart von Inhibitoren der
Ligase bleibt diese Desensibilisierung aus. Die Detektion der resultierenden kovalent
geschlossenen DNA erfolgt mit Hilfe von Pico GreenTM (Molecular Probes,
MoBiTec, Göttingen, Best. Nr. P7581).
Fig. 7 die linearisierte Substrat-DNA wurde mit den angegebenen Enzymkombina
tionen inkubiert (siehe Beispiel 3). Der Reaktionsansatz wurde einer Agarosegel
elektrophorese unterzogen und das Gel mit PicoGreen gefärbt. Es ist deutlich zu
sehen, dass ein Abbau der Substrat-DNA durch die Exonuclease T4-DNA-Poly
merase durch die Aktivität der E. coli Ligase (Roche Molecular Biochemicals) ver
hindert werden kann.
Fig. 8 linearisierte Substrat-DNA wurde mit den angegebenen Enzymkombina
tionen inkubiert (siehe Beispiel 3) und danach die resultierende DNA mit Hilfe von
PicoGreen quantifiziert. Die gemessenen Fluoreszenzwerte (Excitation 485 nm,
Emission 538 nm) sind jeweils angegeben. Die Aktivität der Ligase wird durch das
erfindungsgemäße Verfahren übersetzt in ein Fluoreszenzsignal.
Fig. 9 zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in der Diagnostik
von Mutationen unter Verwendung der PCR. Die Anwesenheit einer Restriktionsendonukleaseerkennungssequenz
wird durch das erfindungsgemäße Verfahren über
setzt in ein vorhandenes oder abwesendes Fluoreszenzsignal. PCR-Primer sind als
Rechtecke, der Bereich der Mutation als Dreieck dargestellt. Die 3' oder 5'-Enden
der amplifizierten DNA sind, falls wie im Text beschrieben exonucleaseresistent
gemacht, als dunkle Kreise markiert.
Fig. 10 zeigt die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Klonierung
verwandter Gensequenzen unter Verwendung der PCR. Entsteht bei einer PCR durch
ineffiziente Coamplifikation eines noch unbekannten verwandten Gens ein hetero
genes DNA-Gemisch, so kann durch das erfindungsgemäße Verfahren das neue
Genfragment angereichert werden.
Das Gen, welches für das Design der PCR-Primer zugrunde gelegt wurde, ist als
Balken, das verwandte, in der PCR ineffizient coamplifizierte Gen als Balken mit
Kreis dargestellt.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, ohne sie zu
beschränken:
Folgender Reaktionsansatz wurde zusammenpipettiert:
41 µl H2O dest.
5 µl Puffer M (Roche, Best. Nr. 1417983)
1 µl pUCASeq-Plasmid (2 µg/µl) (zur Verfügung gestellt von Dr. E. Bogner; (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264)
1 µl p130 (0,5 µg/µ1) (zur Verfügung gestellt von Dr. E. Bogner; (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264)
2 µl T4-DNA-Polymerase (1µ/gl) (Roche, Best. Nr. 1004786)
(zu Kontrollzwecken können einzelne Komponenten weggelassen werden)
41 µl H2O dest.
5 µl Puffer M (Roche, Best. Nr. 1417983)
1 µl pUCASeq-Plasmid (2 µg/µl) (zur Verfügung gestellt von Dr. E. Bogner; (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264)
1 µl p130 (0,5 µg/µ1) (zur Verfügung gestellt von Dr. E. Bogner; (Bogner, E., Radsak, K., Stinski, M. (1998), J. Virol., 72: 2259-2264)
2 µl T4-DNA-Polymerase (1µ/gl) (Roche, Best. Nr. 1004786)
(zu Kontrollzwecken können einzelne Komponenten weggelassen werden)
Wird die Reaktion als Assay gefahren, wird zusätzlich die Testsubstanz zugegeben.
Der Ansatz wurde gemischt und in einer 96er Mikrotiterplatte für 3 h bei 37°C
inkubiert,
Nach Ablauf der Reaktion wurde der Reaktionsansatz wie unter a) oder unter b)
beschrieben weiterverarbeitet:
- a) mittels einer Agarosegelelektrophorese in an sich bekannter Weise analysiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 2nd Ed.). In Fig. 2 sind darüber hinaus Kontrollreaktionen gezeigt, welche umfassen: unbehandeltes Plasmid, Verdau des Plasmids mit einem Restriktionsenzym, Inkubation des Plasmids mit T4- DNA-Polymerase, Inkubation des Plasmids mit ExoIII, Inkubation des Plasmids mit p130 und T4-DNA-Polymerase, wie oben beschrieben, sowie Inkubation des Plasmids mit p30 und ExoIII.
- b) Es wurden 50 µl 4 µg/ml Hoechst 33258 in 2 × TEN Assay Puffer (BioRAD, Best. Nr.: 170-2480) zupipettiert. Die Messung der Fluoreszenz (360 nm/455 nm) erfolgte mittels eines Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer (Labsystems). In einem typischen Experiment ergaben sich die in Fig. 3 dargestellten Meß werte.
Eine Unterscheidung zwischen Inhibitoren der Terminase (nicking-Aktivität) und
Inhibitoren der T4-DNA-Polymerase (Exonucleaseaktivität), welche im Primärassay
beide als Hit auffallen würden, ist durch Ersetzen der Terminase p130 durch ein
Restriktionsenzym möglich:
Hierzu wird folgender Reaktionsansatz zusammenpipettiert:
41 µl H2O dest.
5 µl Puffer M
1 µl pUCaSeq-Plasmid (2 µg/µl)
1 µl BamHI (10 U/gl) (Roche, Best. Nr. 220612)
2 µl T4-DNA-Polymerase (1 U/µl)
Testsubstanz
41 µl H2O dest.
5 µl Puffer M
1 µl pUCaSeq-Plasmid (2 µg/µl)
1 µl BamHI (10 U/gl) (Roche, Best. Nr. 220612)
2 µl T4-DNA-Polymerase (1 U/µl)
Testsubstanz
Der Ansatz wird gemischt und in verschlossenen Gefäßen für 3 h bei 37°C inkubiert.
Nach Ablauf der Inkubation werden wie oben 50 µl 4 µg/ml Hoechst 33258 in 2 ×
TEN Assay Puffer (BioRAD, Best. Nr.: 170-2480) zupipettiert und wiederum die
Fluoreszenz wie oben beschrieben gemessen.
Handelt es sich bei der zu testenden Substanz um einen echten Terminaseinhibitor, so
wird in diesem Kontrollassay ein Abbau der eingesetzten DNA erfolgen. Handelt es
sich bei der zu testenden Substanz um einen T4-DNA-Polymeraseinhibitor, so wird
auch in diesem Kontrollassay der Abbau der eingesetzten DNA inhibiert sein.
Dies wird schematisch in Fig. 1 dargestellt.
Folgender Reaktionsansatz wurde zusammenpipettiert:
32 µl H2O dest.
5 µl Puffer M (Roche, Best. Nr. 1417983)
1 µl pUC18-Plasmid (1 µg/µl) (Amersham-Pharmacia Best. Nr. 27494901)
10 µl HIV-Integrase (rekombinant, exprimiert in E.coli wie beschrieben in:
Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123)
1 µl T4-DNA-Polymerase (1 U/µ1) (Roche, Best. Nr. 1004786)
1 µl Exonucleaselll (100 U/µ1) (Roche, Best. Nr. 779709)
(zu Kontrollzwecken können einzelne Komponenten weggelassen werden)
32 µl H2O dest.
5 µl Puffer M (Roche, Best. Nr. 1417983)
1 µl pUC18-Plasmid (1 µg/µl) (Amersham-Pharmacia Best. Nr. 27494901)
10 µl HIV-Integrase (rekombinant, exprimiert in E.coli wie beschrieben in:
Sherman, P. A., Fyfe, J. A. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 5119-5123)
1 µl T4-DNA-Polymerase (1 U/µ1) (Roche, Best. Nr. 1004786)
1 µl Exonucleaselll (100 U/µ1) (Roche, Best. Nr. 779709)
(zu Kontrollzwecken können einzelne Komponenten weggelassen werden)
Wird die Reaktion als Assay gefahren, wird zusätzlich die Testsubstanz zugegeben.
Der Ansatz wurde gemischt und in einer 96er Mikrotiterplatte für 3 h bei 37°C
inkubiert.
Nach Ablauf der Reaktion wurde der Reaktionsansatz wie unter a) oder unter b)
beschrieben weiterverarbeitet:
- a) mittels einer Agarosegelelektrophorese in an sich bekannter Weise analysiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 2nd Ed.). In Fig. 4 sind darüber hinaus Kontrollreaktionen gezeigt: unbehandeltes Plasmid, Inkubation des Plasmids mit ExoIII, Inkubation des Plasmids mit T4-DNA-Polymerase, Inkubation des Plasmids mit Integrase, Inkubation des Plasmids mit Integrase und T4-DNA- Polymerase, Inkubation des Plasmids mit Integrase und ExoIII, Inkubation des Plasmids mit Integrase und T4-DNA-Polymerase und ExoIII.
- b) Es wurden 50 µl 4 µg/ml Hoechst 33258 in 2 × TEN Assay Puffer (BioRAD, Best. Nr.: 170-2480) zupipettiert. Die Messung der Fluoreszenz (360 nm/455 nm) erfolgte mittels eines Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer (Labsystems). In einem typischen Experiment ergaben sich die in Fig. 5 dargestellten Meß werte.
Das Prinzip ist analog zu Fig. 1.
Im Reaktionsansatz werden folgende Komponenten eingesetzt:
(30 mM Tris HCl, 10 mM (NH4
)2
SO4
, 10 mM MgCl2
, 1,2 mM EDTA, 1,0 mM DTE,
50 µg/ml BSA, 5% PEG8000)
NAD-Lösung (3,4 mg/ml in Ligasepuffer)
NAD-Lösung (3,4 mg/ml in Ligasepuffer)
pUC18-DNA linearisiert mit BamHI (100 ng/µl)
(5 µg pUCIS DNA wurden mit SOU BamHI in Puffer B (Roche Best Nr. 1417967) 3 h bei 37°C inkubiert.
Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits (QIAGEN Best. Nr. 28104) aufgereinigt und die DNA- Konzentration auf 100 ng/µl eingestellt.)
(5 µg pUCIS DNA wurden mit SOU BamHI in Puffer B (Roche Best Nr. 1417967) 3 h bei 37°C inkubiert.
Der Reaktionsansatz wurde mit Hilfe des QIAquick PCR Purification Kits (QIAGEN Best. Nr. 28104) aufgereinigt und die DNA- Konzentration auf 100 ng/µl eingestellt.)
Folgende Komponenten wurden zusammenpipettiert:
5 µl Substrat-DNA (500 ng)
2,5 µl NAD-Lösung
1-4 µl E.coli Ligase (0,25 U/µl)(Roche)
38,5-41,5 µl Ligasepuffer
5 µl Substrat-DNA (500 ng)
2,5 µl NAD-Lösung
1-4 µl E.coli Ligase (0,25 U/µl)(Roche)
38,5-41,5 µl Ligasepuffer
Der Ansatz wurde 30 min bei 12°C inkubiert. Danach wurde zu einigen Ansätzen 1 U
T4-DNA-Polymerase (Roche) zugegeben und für 1 h bei 37°C inkubiert.
Nach Ablauf der Reaktion wurde der Reaktionsansatz wie unter a) oder unter b)
beschrieben weiterverarbeitet:
- a) mittels einer Agarosegelelektrophorese in an sich bekannter Weise analysiert (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), 2nd Ed.). In Fig. 7 sind folgende Reaktionen gezeigt: unbehandeltes Plasmid, Inkubation des Plasmids mit Ligase, Inkubation des Plasmids mit Ligase + T4-DNA-Polymerase, Inkubation des Plasmids mit T4-DNA-Polymerase.
- b) Es wurden 50 µl einer 1 : 200 verdünnten PicoGreen-Lösung (PicoGreen Ex.. 485 nm, Em. 538 nm; (Molecular Probes, Best. Nr.: P7581)) zupipettiert. Die Messung der Fluoreszenz (Ex 485 nm/Em 538 nm) erfolgte mittels eines Fluoroskan Ascent Microplate Fluorometer (Labsystems). In einem typischen Experiment ergaben sich die in Fig. 8 dargestellten Meßwerte.
Dies wird schematisch in Fig. 6 dargestellt.
Wir stellen hier ein Verfahren vor, mit welchem unter Anwendung der in diesem
Patent beschriebenen Technologie eine Detektion von Punktmutationen im HTS-
Durchsatz durchführbar ist.
Der DNA-Bereich, welcher auf Vorhandensein der Punktmutation gescreent werden
soll, wird mittels spezifischer Primer in einer PCR amplifiziert. Die eingesetzten
Primer sind gegen den Angriff einer Exonuclease geschützt (z. B. Phosphothioate-
Modifikation) (Fall A). Alternativ wird mit exonuclease sensitiven Primern gear
beitet und nach Abschluss der PCR werden Phosphorthioatnucleotide mittels termi
naler Transferase an das PCR-Produkt 3'-anpolymerisiert (Fall B). Danach wird dem
Reaktionsansatz eine Restriktionsendonuklease zugesetzt, welche nur in der mu
tanten, nicht aber in der Wildtypsequenz schneidet (oder vice versa). Außerdem
zugesetzt wird in Fall A eine 5'-3'-Exonuclease (z. B. Bacteriophagen λ Exonuclease)
oder in Fall B eine 3'-5'-Exonuclease (z. B. T4-DNA-Polymerase). Da die ampli
fizierte DNA erst nach dem Schnitt der Endonuclease von der Exonuclease ange
griffen werden kann, erfolgt ein allelspezifischer Abbau. Die vorhandene Restmenge
DNA kann nun beispielsweise mittels Fluoreszenz eines Interkalators gemessen
werden. Ist nur das mutante Allel gegenüber der Endonuclease und somit auch
gegenüber der Exonuclease sensitiv, ergibt sich bei homozygot WT Individuen ein
intensives Signal, bei Anwesenheit der Mutation in heterozygoten Individuen ein
reduziertes Signal und bei homozygot mutanten Individuen kein Signal. Ist lediglich
das amplifizierte Wildtypallel für den Angriff der Restriktionsendonuclease und
damit auch der Exonuclease empfindlich, so würde man bei homozygot wildtyp-Individuen
kein Signal erhalten, bei Individuen mit einem mutanten und einem Wild
typallel ein reduziertes Signal sowie bei homozygot mutanten Individuen schließlich
ein intensives Signal.
Dies wird schematisch in Fig. 9 dargestellt.
Im Folgenden wird ein Verfahren vorgestellt, mit welchem unter Anwendung der in
diesem Patent beschriebenen Technologie zu einer bekannten Sequenz eine neue,
noch unbekannte verwandte Sequenz aus einem DNA-Pool (z. B. genomische DNA)
isoliert werden kann.
Zu Beginn wird eine PCR durchgeführt mit exonucleaseresistenten Primern (z. B.
Phosphorothioatmodifikation) (Fall A), welche in der Lage sind, die bekannte Ziel
sequenz zu amplifizieren. Alternativ wird mit exonuclease sensitiven Primern ge
arbeitet und nach Abschluss der PCR werden Phosphorthioatnucleotide mittels
terminaler Transferase an das PCR-Produkt 3'-anpolymerisiert (Fall B). Sind bereits
weitere verwandte Sequenzen bekannt (z. B. Homologe, Mitglieder der gleichen
Genfamilie etc.), so kann gegebenenfalls auf degenerierte Primer zurückgegriffen
werden. Die Reaktionsbedingungen der PCR können hinsichtlich Stringenz der
Amplifikation in an sich bekannter Weise frei variiert werden. Nach Beendigung der
PCR werden eine oder mehrere Restriktionsendonukleasen zugesetzt, welche die
bereits bekannten Zielsequenzen im amplifizierten Bereich schneiden. Da bei Ab
weichung bereits einer Base die Restriktionsendonuklease nicht mehr schneiden
kann, besteht die Wahrscheinlichkeit, dass zu isolierende, noch unbekannte ver
wandte Gensequenzen diese interne Restriktionsschnittstelle nicht aufweisen. Somit
erfolgt nach Zugabe einer 5'-3'-Exonuklease (Fall A) oder einer 3'-5'-Exonuclease
(Fall B) ein Abbau der DNA-Moleküle mit der bereits bekannten Zielsequenz,
wohingegen jedoch die noch unbekannten DNA-Sequenzen gegebenenfalls unangegriffen
bleiben. Somit resultiert im amplifizierten DNA-Pool eine Enfernung der
bereits bekannten Sequenzen und damit eine Anreicherung der bis dato noch unbe
kannten, aber bei der PCR coamplifizierten DNA-Sequenzen. Die verbleibende DNA
kann dann in entsprechende Klonierungsvektoren in an sich bekannter Weise ein
gebracht, weiter vermehrt und einer genaueren Charakterisierung (weitere Ampli
fikation, Expression, Klonierung, Sequenzeirung etc.) zugeführt werden. Unter Ver
wendung dieser Sequenz als Gensonde kann nun nachfolgend beispielsweise in einer
Genbibliothek bei Hybridisierung unter hoher Stringenz der entsprechende
genomische oder c-DNA Klon isoliert werden.
Dies wird schematisch in Fig. 10 dargestellt.
Claims (20)
1. Verfahren, das die Schritte umfasst:
- 1. Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
- 2. die Behandlung mit Exonuklease, und
- 3. der Nachweis der verbleibenden Menge der doppelsträngigen DNA.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der verbleibenden Menge
der doppelsträngigen DNA mit Fluoreszenzfarbstoff erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der verbleibenden Menge
der doppelsträngigen DNA mit molecular beacons erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Nachweis der verbleibenden Menge
der doppelsträngigen DNA mittels mittels in vitro Transkription/Translation
und Quantifizierung des kodierten Proteins erfolgt.
5. Verfahren, das die Schritte umfasst:
- a) Behandlung einer DNA-Spezies mit einem DNA-modifizierenden Enzym, das die Fähigkeit besitzt, die Exonuklease-Sensitivität besagter DNA-Spezies zu verändern,
- b) die Behandlung mit Exonuklease, und
- c) Klonierung, Amplifizierung, Expression oder Sequenzierung der DNA.
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4 zur Auffindung von Inhibitoren
DNA-modifizierender Enzyme, dadurch gekennzeichnet, dass man Schritt (1)
in Gegenwart möglicher Inhibitoren der DNA-modifizierenden Enzyme
durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine
doppelsträngige, circuläre DNA oder eine doppelsträngige lineare DNA,
deren Enden so modifiziert sind, dass sie durch eine Exonuclease nicht
erkannt werden können, und die jeweils eine oder mehrere Erkennungs
sequenzen oder Bindungsstellen für das DNA-modifizierende Enzym auf
weisen können, ein DNA-Strang-spaltendes Enzym, einen potentiellen Inhi
bitor dieses Enzyms sowie eine Exonuklease inkubiert und anschließend die
verbleibende Menge der doppelsträngigen DNA nachweist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine doppel
strängige, circuläre genickte DNA oder eine doppelsträngige lineare oder
linearisierte DNA, ein DNA-Strang-ligierendes Enzym, einen potentiellen
Inhibitor dieses Enzyms inkubiert, anschließend eine Exonuklease zusetzt,
wiederum inkubiert und anschließend die verbleibende Menge der doppel
strängigen DNA nachweist.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, worin DNA, enthaltend eine Wildtyp-
Sequenz und/oder eine Mutante besagter Wildtyp-Sequenz, die sich durch die
Anwesenheit oder Nicht-Anwesenheit einer Erkennungssequenz einer spezi
fischen Endonuklease unterscheiden, wobei die genannte DNA gegebenen
falls mit einer PCR amplifiziert wurde, mit einer für die Wildtyp-Sequenz
oder die Mutante besagter Wildtyp-Sequenz spezifischen Endonuklease um
gesetzt wird, gleichzeitig oder nachfolgend mit Exonuklease umgesetzt wird
und anschließend die verbliebene Menge der DNA gemessen wird oder die
verbliebene DNA präparativ weiterverwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9 zur Identifizierung und/oder Isolierung ver
wandter oder mutanter Gene.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10 zur Verwendung in der Diagnostik.
12. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass man eine hybridi
sierte Mischung eines modifizierten c-DNA oder RNA-Pools als DNA-
Spezies verwendet, um ein differentiell exprimiertes Gen zu isolieren.
13. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 6 als Basis für den Aufbau eines
Screeening-Assays oder eines Test-Kits.
14. Verwendung der Inhibitoren, die durch das Verfahren nach Anspruch 6
gefunden wurden, zur Herstellung eines Arzneimittels.
15. Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 14 zur Herstellung eines
Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe viraler oder bakterieller
Infektionen.
16. Inhibitor, identifiziert nach dem Verfahren nach Anspruch 6.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, die den Inhibitor nach Anspruch 16 in
Mischung mit mindestens einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder
Exzipienten umfasst.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
das DNA-modifizierende Enzym eine Terminase der Herpes-Viren ist
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
das DNA-modifizierende Enzym die Integrase von HIV-1 oder HIV-2 ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
das DNA-modifizierende Enzym eine bakterielle Ligase ist.
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