DE69629886T2

DE69629886T2 - Nachweis von Enterobakterien

Info

Publication number: DE69629886T2
Application number: DE69629886T
Authority: DE
Inventors: Claude Mabilat; Didier Raoult
Original assignee: Biomerieux SA; Universite de la Mediterranee Aix Marseille II
Current assignee: Biomerieux SA; Aix Marseille Universite
Priority date: 1995-09-18
Filing date: 1996-09-17
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2016-09-18
Also published as: EP0763602B1; CA2185738A1; EP0763602A3; US5786147A; DE69629886D1; ES2206551T3; EP0763602A2; FR2738827A1; ATE249521T1; FR2738827B1

Description

Die vorliegende Erfindung fällt in das Gebiet der Detektions- und/oder Amplifizierungstechniken mittels Oligonukleotidsonden oder Primern, und deren Anwendung in der Suche nach dem Vorhandensein oder der Identifizierung von Bakterien der Gattung Enterobacteriaceae.
Im Rahmen bestimmter Diagnostiktests, insbesondere bei der Suche nach einer septikämischen Infektion, oder im Bereich der Nahrungsmittel ist es oft notwendig, eine rasche Antwort über das Vorhandensein von Bakterien, insbesondere von gramnegativen Bakterien und genauer von Enterobakterien, in einer Probe zu erhalten. Allerdings erfordern die entwickelten geläufigen Techniken (Gramfärbung, biochemische Identifizierung, ...) in Anbetracht des geringen Anteils an in der Ausgangsprobe vorhandenen Bakterienpartikeln einen vorherigen Kultivierungsschritt, häufig unter sehr spezifischen Bedingungen (bspw. Hämokultur).
Eine mögliche Lösung beruht auf der Verwendung von Techniken betreffend Nukleinsäuren und genetisches Material, um so bei einem lebenden Organismus, einem Zellextrakt dieses Organismus oder einer Probe zu bestimmen, ob ein Gen, ein Teil eines Gens oder eine Nukleotidsequenz vorhanden ist. Da jedes Gen oder Teil eines Gens durch eine spezifische Sequenz von Nukleotidbasen charakterisiert ist, ist es folglich möglich, direkt nach dem Vorhandensein der gesamten oder eines Teils dieser spezifischen Sequenz in der eine Mischung von Polynukleotiden enthaltenden Probe zu suchen.
In der Literatur sind verschiedene Methoden zur Detektion von Nukleinsäuren beschrieben. Diese Methoden beruhen auf den Eigenschaften der Purin-Pyrimidin-Paarungen der komplementären Nukleinsäurestränge in den Duplexen DNA-DNA, DNA-RNA und RNA-RNA. Dieser Paarungsprozess erfolgt durch die Etablierung von Wasserstoffbindungen zwischen den Basen Adenin-Thymin (A-T) und Guanin-Cytosin (G-C) des DNA-Doppelstranges; in den Duplexen DNA-RNA oder RNA-RNA können sich ebenfalls durch Wasserstoffbindungen die Basenpaarungen Adenin-Uracil (A-U) ausbilden. Das Paaren von Nukleinsäuresträngen zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls wird im Allgemeinen „Hybridisierung von Nukleinsäuren" oder einfach „Hybridisierung" genannt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden neue genetische Marker identifiziert, die in jeder Probe die spezifische Detektion von zu der Familie der Enterobakterien gehörenden Bakterien ermöglichen, wobei kein vorheriger Schritt zur Bakterienkultivierung erforderlich ist. Die Erfindung beruht auf der Verwendung von spezifisch in dem Gen rpoB definierten Nukleinsequenzen, das für eines der Untereinheiten der bakteriellen RNAPolymerase kodiert.
Nach Lazcano et al., 1988, werden die RNA-Polymerasen gemäß ihrem Ursprung in zwei Gruppen eingeteilt, eine wird von den RNA- oder DNA-abhängigen viralen RNA-Polymerasen gebildet und die andere wird von den DNA-abhängigen RNA-Polymerasen eukaryotischen oder prokaryotischen (Archaebakterien und Eubakterien) Ursprungs gebildet. Die eubakteriellen DNA-abhängigen RNA-Polymerasen sind durch einen einfachen multimeren Aufbau charakterisiert und durchgehend als „Core-Enzym" bezeichnet und durch αββ' dargestellt oder als „Holoenzym" bezeichnet und durch αββ'α' dargestellt [Burgess et al., J. Biol. Chem. (1969) 244: 6168–6176; Chamberlin, Ann. Rev. Biochem. (1974) 43 721–775; Yura and Ishihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13: 59–97; Sentenax, CRC – Crit. Rev. Biochem. (1985) 18(1): 31–90]. Zahlreiche Arbeiten haben die funktionelle Rolle der β-Untereinheit der eubakteriellen RNA-Polymerase innerhalb des multimeren enzymatischen Komplexes nachgewiesen. Die archaebakteriellen und eukaryotischen RNA-Polymerasen weisen ihrerseits eine komplexere Struktur auf, die etwa zehn oder sogar dreißig Untereinheiten erreichen kann [Pühler et al. – Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86: 4569–4573; Sentenac, CRC – Crit. Rev. Biochem. (1985) 18(1): 31–90].
Die Gene, die für die verschiedenen Untereinheiten der DNA-abhängigen RNA-Polymerase bei Eubakterien kodieren, bzw. rpoA, rpoB, rpoC und rpoD für αββ'α', sind in verschiedenen Segmenten zusammengefasst, die Gene umfassen, die für Grundproteine der Ribosomenuntereinheiten oder für die in die Replikation und Reparatur des Genoms involvierten Enzyme kodieren [Yura und Yshihama, Ann. Rev. Genet. (1979) 13: 59–97]. Einige Autoren haben gezeigt, dass die Nukleinsequenzen der Gene rpoB und rpoC dazu verwendet werden können, um phylogenetische Bäume zu konstruieren [Lascano et al., J. Mol. Evol. (1988) 27: 365– 376; Zillig et al., Can. J. Microbiol. (1989) 35: 73–80; Row land et al., Biochem. Soc. Trans. (1992) 21: 40S], die es ermöglichen, die verschiedenen Zweige und Unterzweige aus dem Reich der Lebewesen voneinander zu trennen. Ferner ist bei den Eubakterien gezeigt worden, dass die β-Untereinheit das Zielmolekül der Rifamycine (darunter das Rifampicin), der Streptovaricine und des Streptolydigin bildet [Kumar und Chatterji, Biochemistry (1990) 29: 317–322; Kumar et al., Biochemistry (1992) 31: 7519–7526] und dass das Gen rpoB den genetischen Träger der Resistenz der Keime gegen diese Antibiotika darstellt [Ovchinnikov et al., Mol. Gen. Genet. (1983) 190: 344– 348; Lisitsyn et al., Mol. Gen. Genet. (1984) 196: 173–174]. Es wurden zahlreiche Mutationen des Gens rpoB beschrieben, die die Regulation der Expression und der Funktion der RNA-Polymerase betreffen [Landick et al., Genes Dev. (1990) 4: 1623–1636], wobei einige mit Mutationen in Zusammenhang stehen, die einen gegenüber Rifampicin resistenten Phänotyp verleihen [Jin and Gross, J. Biol. Chem. (1991) 266: 14478–14485; Jin and Turnbough, J. Mol. Biol. (1994) 236: 72–80]. Die Bestimmung der Resistenz der Stämme Mycobacterium tuberculosis gegenüber Rifampicin unter Verwendung des Gens rpoB war Gegenstand mehrerer Arbeiten [Hunt et al., 1994, Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 18, 219–227; Whelen et al., 1995, J. Cli. Microbiol. 33, 556–561; und Patentanmeldung Nr. WO 9322454].
Es wurden jetzt unter den Bakterienfamilien auf der DNA, die für die β-Untereinheit der bakteriellen RNA-Polymerase kodiert, variable Bereiche gefunden, die jedoch unter der Familie der Enterobacteriaceae konserviert zu sein scheinen, was es ermöglicht, diese Bakterienfamilie von den anderen Bakterienfamilien zu unterscheiden. Ferner existieren in diesen konservierten Bereichen zwischen bestimmten Enterobakterienarten kleinere Sequenzvariationen. Diese Ergebnisse haben es ermöglicht, entweder für die Enterobakterienfamilie oder für bestimmte besondere Spezies spezifische Nukleinsonden zu konzipieren.
Der Stand der Technik wird u. a. durch die folgenden Dokumente WO-A-94/24565, EP-0 473 268 und KANELLOPOULOS, et al., Journal of Experimental Medicine, Vol. 180, 1994, S. 861–872, gebildet. Wie nachfolgend erwähnt werden wird, beschreiben diese Dokumente Nukleotidsequenzen, die eine Folge von Nukleotidmotiven aufweisen, die mit einigen der Sequenzen identisch ist, die von der vorliegenden Erfindung zitiert werden, die aber deren Verwendung, um Enterobakterien zu detektieren, weder offenbaren noch vorschlagen.
So betrifft Dokument WO-A-94/24565 die Detektion von HCV-Antigenen in einer Probe mit Hilfe von Antikörpern, die spezifisch sind für HCV-Antigene, und beschreibt die in dem Dokument mit SEQ ID-Nr. 11 identifizierte und auf Seite 71 beschriebene Sequenz. Diese Sequenz ist in der vorliegenden Beschreibung mit SEQ ID-Nr. 77 identifiziert.
Dokument EP-0 473 268 lehrt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen Polypeptidwirkstoff aufweist und eine schrittweise Freisetzung des Polypeptidstoffes ermöglicht. Es beschreibt die Sequenz, die in diesem Dokument mit SEQ ID-Nr. 19, und in der vorliegenden Beschreibung mit SEQ ID-Nr. 78 identifiziert ist.
Der Artikel von KANELLOPOULOS et al. betrifft eine transgene Maus und beschreibt in Zeile 17 der Seite 866 die Sequenz, die in der vorliegenden Beschreibung mit SEQ ID-Nr. 79 identifiziert ist.
Bevor die Erfindung detaillierter dargestellt wird, werden nachfolgend verschiedene in der Beschreibung und den Patentansprüchen verwendete Begriffe definiert:

– Unter „aus Bakterien extrahierte Nukleinsäure" wird entweder Gesamtnukleinsäure, oder genomische DNA, oder die Messenger-RNA, oder auch die DNA, die durch reverse Transkription der Messenger-RNA erhalten wird, verstanden;
– „Nukleotidfragment" oder „Oligonukleotid" sind zwei synonyme Begriffe, die eine Abfolge von Nukleotidmotiven bezeichnen, die durch die Informationssequenz von natürlichen (oder ggf. modifizierten) Nukleinsäuren charakterisiert ist, und die, wie natürliche Nukleinsäuren, unter bestimmten Bedingungen mit einem komplementären oder im Wesentlichen komplementären Nukleotidfragment hybridisieren kann. Die Abfolge kann Nukleotidmotive einer Struktur enthalten, die sich von jener der natürlichen Nukleinsäuren unterscheidet. Ein Nukleotidfragment (oder Oligonukleotid) kann bspw. bis zu 100 Nukleotidmotive enthalten. Es enthält im Allgemeinen zumindest 10 und insbesondere zumindest 12 Nukleotidmotive und kann ausgehend von einem natürlichen Nukleinsäuremolekül und/oder durch genetische Rekombination und/oder durch chemische Synthese erhalten werden,
– ein Nukleotidmotiv leitet sich von einem Monomer ab, das ein natürliches Nukleinsäurenukleotid sein kann, dessen Grundbestandteile ein Zucker, eine Phosphatgruppe und eine stickstoffhaltige Base sind; in der DNA ist der Zucker die Deoxy-2-Ribose, in der RNA ist der Zucker die Ribose; je nach dem, ob es sich um DNA oder um RNA handelt, ist die stickstoffhaltige Base ausgewählt aus Adenin, Guanin, Uracil, Cytosin, Thymin; oder auch ist das Monomer ein Nukleotid, das in zumindest einem der drei Grundbestandteile modifiziert ist; bspw. kann die Modifizierung entweder im Bereich der Basen erfolgen, mit modifizierten Basen wie Inosin, Methyl-5-deoxycytidin, Deoxyuridin, Dimethylamino-5-deoxyuridin, Diamino-2,6-purin, Bromo-5-deoxyuridin oder jeder anderen der Hybridisierung fähigen modifizierten Base, oder im Bereich des Zuckers, bspw. das Ersetzen von zumindest einer Deoxyribose durch ein Polyamid [P. E. Nielsen et al., Science, 254, 1497–1500 (1991)], oder auch im Bereich der Phosphatgruppe, bspw. das Ersetzen durch Ester, insbesondere ausgewählt aus den Diphosphaten, Alkyl- und Arylphosphonaten und Phosphorothioaten,
– unter „Informationssequenz" wird jede geordnete Folge von Motiven vom Nukleotidtyp verstanden, deren chemische Natur und Reihenfolge im Sinne einer Referenz eine Information darstellen, die zu jener analog ist, die durch die Sequenz der natürlichen Nukleinsäuren wiedergegeben wird,
– unter „Hybridisierung" wird der Vorgang verstanden, bei dem sich unter geeigneten Bedingungen zwei Nukleotidfragmente mit ausreichend komplementären Sequenzen durch stabile und spezifische Wasserstoffbindungen miteinander verbinden können, um einen Doppelstrang auszubilden. Die Hybridisierungsbedingungen werden durch die „Stringenz" bestimmt, d. h. durch die Härte der Arbeitsbedingungen. Die Hybridisierung ist um so spezifischer, wenn sie unter höherer Stringenz stattfindet. Die Stringenz ist insbesondere von der Basenzusammensetzung eines Duplex aus Sonde und Ziel abhängig, sowie von dem Anteil von Misspaarungen zwischen den beiden Nukleinsäuren. Die Stringenz kann ebenfalls von den Parametern der Hybridisierungsreaktion abhängen, wie der Konzentration und dem Typ der in der Hybridisierungslösung vorhandenen Ionenspezies, der Natur und der Konzentration von denaturierenden Agenzien und/oder der Hybridisierungstemperatur. Die Stringenz der Bedingungen, unter denen eine Hybridisierungsreaktion zu erfolgen hat, hängt insbesondere von den verwendeten Sonden ab. Sämtliche dieser Angaben sind wohlbekannt und die geeigneten Bedingungen können ggf. in jedem Fall durch Routineexperimente bestimmt werden. Im Allgemeinen, je nach Länge der verwendeten Sonden, liegt die Temperatur für die Hybridisierungsreaktion in einer Salinelösung mit einer Konzentration von ungefähr 0,8 bis 1 M bei ungefähr 20 bis 65°C, insbesondere bei 35 bis 65°C,
– eine „Sonde" ist ein Nukleotidfragment, das bspw. 10 bis 100 Nukleotidmotive, insbesondere 12 bis 35 Nukleotidmotive aufweist, die unter bestimmten Bedingungen eine Hybridisierungsspezifität aufweisen, um mit einer Zielnukleinsäure einen Hybridisierungskomplex auszubilden, die, sofern sie vorhanden ist, eine Nukleotidsequenz aufweist, die entweder in einer Messenger-RNA oder in einer DNA, die durch reverse Transkription dieser Messenger-RNA erhalten wurde, oder auch in einer DNA enthalten ist, von der die Messenger-RNA das Transkriptionsprodukt ist; eine Sonde kann zum Zwecke der Diagnostik (insbesondere Fänger- oder Detektionssonden) oder zum Zweck der Therapie verwendet werden,
– eine „Fängersonde" ist durch jedes geeignete Mittel auf einem festen Träger immobilisiert oder auf diesen immobilisierbar, bspw. durch Kovalenz, durch Adsorption oder durch direkte Synthese auf einen festen Träger (siehe insbesondere Patentanmeldung WO 92 10092),
– eine „Detektionssonde" kann mittels eines Markers markiert werden, der bspw. ausgewählt ist aus den radioaktiven Isotopen, den Enzymen, insbesondere Enzymen, die auf ein chromogenes fluorigenes oder lumineszentes Substrat wirken können (insbesondere eine Peroxydase oder eine alkalische Phosphatase), den chemischen chromophoren Verbindungen, den chromogenen, fluorigenen oder lumineszenten Verbindungen, den Analogen der Nukleotidbasen, und den Liganden, wie dem Biotin,
– ein „Primer" ist eine Sonde, die bspw. 10 bis 100 Nukleotidmotive aufweist und unter Bedingungen, die für die Initiation der enzymatischen Polymerisation bestimmt sind, eine Hybridisierungsspezifität aufweist, bspw. in einer Amplifizierungstechnik wie der PCR (Polymerase Chain Reaction), in einem Sequenzierungsverfahren, in einer Methode zur reversen Transkription, etc.

Ein erster Gegenstand der vorliegende Erfindung ist ein einzelsträngiges Oligonukleotid, das ausgewählt ist aus den Oligonukleotiden, die eine Sequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven haben, die in einer der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 52 enthalten ist, und aus den zu diesen Oligonukleotiden komplementären Oligonukleotiden, mit Ausnahme der Oligonukleotide, die eine Sequenz haben, die aus gewählt ist aus den folgenden Sequenzen: SEQ ID-Nr. 28, SEQ ID-Nr. 77, SEQ ID-Nr. 78 und SEQ ID-Nr. 79.
Bevorzugte Oligonukleotide der Erfindung sind a) jene, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven, die in einer der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 4 enthalten ist, und deren komplementäre Sequenzen aufweisen, und b) jene, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven aufweisen, die enthalten ist in:
SEQ ID-Nr. 5 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 53 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 6 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 54 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 56 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 57 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 9 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 58 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 10 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 59 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 12 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 61 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 13 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 62 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 14 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 63 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 16 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 65 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 17 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 18 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 66 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 19 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 67 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 20 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 68 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 21 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 69 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 22 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 70 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 23 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 71 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 24 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 72 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 25 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 73 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 26 und, die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 74 enthalten sind,
SEQ ID-Nr. 27 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 75 enthalten sind,
oder die eine komplementäre Sequenz aufweisen.
Bevorzugte Oligonukleotide b) weisen eine Nukleotidsequenz auf oder bestehen aus dieser, die ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID-Nr. 29 bis SEQ ID-Nr. 52.
Ein zweiter Gegenstand der Erfindung ist eine Sonde zur Detektion von Bakterien, die zur Familie der Enterobakterien gehören, in einer biologischen Probe, wobei die Sonde aus einem Oligonukleotid der Erfindung gemäß a) besteht. In der folgenden Beschreibung wird eine solche Sonde der Erfindung als Gattungssonde bezeichnet.
Ein dritter Gegenstand der Erfindung ist eine Sonde zur Detektion von zumindest einer Enterobakterienspezies in einer biologischen Probe, wobei die Sonde aus einem Oligonukleotid der Erfindung gemäß b) besteht. Solche Sonden der Erfindung werden in der vorliegenden Beschreibung als Speziessonden bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Sonden können zum Zweck der Diagnostik, in der Suche nach dem Vorhandensein oder der Abwesenheit von Zielnukleinsäuren in einer Probe gemäß sämtlichen bekannten Hybridisierungstechniken, und insbesondere Techniken betreffend die punktuelle Ablagerung auf einem Filter, sog. „DOT-BLOT" (MANIATIS et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, 1982), Techniken zum Transfer von DNA, sog. „SOUTHERN BLOT" [SOUTHERN, E. M., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)], Techniken zum Transfer von RNA, sog. „NORTHERN BLOT" oder sog. „sandwich"-Techniken (DUNN A. R., HASSEL J. A., Cell, 12, 23 (1977)] verwendet werden; die Sandwich-Technik wird insbesondere mit einer Fängersonde und/oder einer Detektionssonde verwendet, wobei die Sonden mit zwei unterschiedlichen Regionen der Zielnukleinsäure hybridisieren können, und wenigstens eine dieser Sonden (im Allgemeinen die Detektionssonde) kann mit einer Region des Zieles hybridisieren, die spezifisch für die Spezies oder für die gesuchte Gruppe von Spezies spezifisch ist, wobei als vereinbart gilt, dass die Fängersonde und die Detektionssonde wenigstens teilweise unterschiedliche Nukleotidsequenzen aufweisen müssen.
Um die oben erwähnten Hybridisierungstechniken und insbesondere die „sandwich"-Techniken anzuwenden, wird eine Sonde der Erfindung auf einen festen Träger immobilisiert, wobei dies die Fängersonde sein wird, und eine andere Sonde der Erfindung wird mit einem Indikatoragens markiert, wobei dies die Detektionssonde sein wird.
Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendungen von Oligonukleotiden als Sonde und als Primer, die ausgewählt sind aus den Oligonukleotiden, die eine Sequenz von zumindest 12 aufein ander folgenden Nukleotidmotiven haben, die in einer der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 52 enthalten ist, und aus den zu diesen Oligonukleotiden komplementären Oligonukleotiden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von zumindest einem Enterobakterium in einer Probe, die Nukleinsäuren von zumindest einem solchen Bakterium enthält oder enthalten kann, das die Schritte aufweist, die in dem In-Kontakt-Bringen der Probe mit zumindest einem Oligonukleotid der Erfindung, wie bspw. in Verwendung als Gattungs- oder Speziessonde, der anschließenden Bestimmung der Ausbildung oder der Abwesenheit der Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen dem Oligonukleotid und der Nukleinsäure der Probe auf bekannte Art und Weise bestehen.
Gemäß einer besonderen Ausführung dieses Verfahrens zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer Enterobakterienspezies oder einer Gruppe von solchen Spezies, wird einerseits ein Oligonukleotid als erfindungsgemäße Gattungssonde und andererseits ein Oligonukleotid als erfindungsgemäße Speziessonde verwendet, wobei als vereinbart gilt, dass die Oligonukleotide mit nicht-überlappenden Regionen einer Nukleinsäure hybridisieren können, die dem Gen rpoB der Enterobakterien entspricht.
Vorteilhafterweise ist die Gattungssonde auf einem festen Träger immobilisiert, und die Speziessonde ist mit einem Indikatoragens markiert.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Anwendung des Verfahrens der Erfindung zur Bestimmung des Vorhandenseins einer bestimmten Enterobakterienspezies.
Somit betrifft die Erfindung:

– ein Verfahren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit Salmonella sofia zu bestimmen, nach dem eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 5 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 53 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 27 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 75 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen; vorzugsweise hat eine Salmonella sofia-Speziessonde eine Nukleotidsequenz, die aus der Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 29, SEQ ID-Nr. 51 und deren komplementären Sequenzen;
– ein Verfahren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit Salmonella typhimurium zu bestimmen, nach dem eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmo tiven aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 6 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 54 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 11 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 60 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 24 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 72 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 25 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 73 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen; vorzugsweise hat eine Salmonella thyphimurium-Speziessonde eine Nukleotidsequenz, die aus der Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 30, SEQ ID-Nr. 35, SEQ ID-Nr. 48, SEQ ID-Nr. 49, SEQ ID-Nr. 52 und deren komplementären Sequenzen;
– ein Verfahren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Shigella dysenteriae zu bestimmen, nach dem eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine in SEQ ID-Nr. 7 enthaltene Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven aufweisen, und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 55 und deren komplementärer Sequenz enthalten sind; vorzugsweise hat eine Shigella dysenteriae-Speziessonde eine Nukleotidsequenz, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 31 und deren komplementärer Sequenz;
– ein Verfahren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Escherichia fergussoni zu bestimmen, nach dem eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 56 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 57 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 19 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 67 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen; vorzugsweise hat eine Escherichia fergussoni-Speziessonde eine Nukleotidsequenz, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 32, SEQ ID-Nr. 43 und deren komplementären Sequenzen;
– ein Verfahren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Enterobacter cloacae zu bestimmen, nach dem eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleo tidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven aufweist, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 9 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 58 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 13 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 62 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 16 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 65 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 17 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 18 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 66 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 21 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 69 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 22 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 70 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen; vorzugsweise hat eine Enterobacter cloacae-Speziessonde eine Nukleotidsequenz, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 33, SEQ ID-Nr. 37, SEQ ID-Nr. 40, SEQ ID-Nr. 41, SEQ ID-Nr. 42, SEQ ID-Nr. 45, SEQ ID-Nr. 46 und deren komplementären Sequenzen;
– ein Verfahren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Klebsiella pneumoniae zu bestimmen, nach dem eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 10 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 59 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 14 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 63 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 15 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 20 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 68 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 23 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 71 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen; vorzugsweise hat eine Klebsiella pneumoniae-Speziessonde eine Nukleotidsequenz, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 34, SEQ ID-Nr. 38, SEQ ID-Nr. 39, SEQ ID-Nr. 44, SEQ ID-Nr. 47 und deren komplementären Sequenzen;
– ein Verfahren, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Escherichia coli zu bestimmen, nach dem eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 aufeinander folgenden Nukleotidmotiven aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 12 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 61 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 26 und die zumindest 5 aufeinander folgende Nukleotidmotive enthält, die in SEQ ID-Nr. 74 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen; vorzugsweise hat eine Escherichia coli-Speziessonde eine Nukleotidsequenz, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 36, SEQ ID-Nr. 50 und deren komplementären Sequenzen.

Gemäß einer besonderen Ausführung dieser Verfahren werden die ausgewählten Sonden in Kombination mit einer Gattungssonde der Erfindung verwendet.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Nukleotidprimer, der auf an sich bekannte Art und Weise in Gegenwart einer Polymerase für die Synthese einer Nukleinsäure und insbesondere in Amplifizierungsmethoden verwendbar ist, bei denen eine solche Synthese in Gegenwart einer Polymerase verwendet wird (PCR, RT-PCR, etc. ...), wobei der Primer ein wie zuvor definiertes Oligonukleotid aufweist. Insbesondere kann ein Primer der Erfindung zur spezifischen reversen Transkription einer Messenger-RNA-Sequenz von zumindest einer Enterobakterienspezies oder von zumindest einer Gruppe von solchen Spezies verwendet werden, um eine entsprechende komplementäre DNA-Sequenz zu erhalten. Eine solche reverse Transkription kann die erste Stufe einer RT-PCR darstellen, wobei die folgende Stufe in der Amplifizierung der erhaltenen komplementären DNA durch PCT besteht. Die Primer der Erfindung können auch zur spezifischen Amplifizierung der DNA-Sequenz des Gens rpoB von zumindest einer Enterobakterienspezies oder von zumindest einer Gruppe von solchen Spezies durch Polymerasekettenreaktion verwendet werden.
Gemäß einem besonderen Fall weist der Primer ein Oligonukleotid der Erfindung auf, das außerdem die Sinn- oder Gegensinn-Sequenz eines von der RNA-Polymerase (bspw. T7, T3, SP6) erkannten Promotors auf: solche Primer sind in Verfahren zur Amplifizierung von Nukleinsäure verwendbar, in die ein Transkriptionsschritt eingeschaltet werden kann, wie bspw. NASBA- oder 3SR-Techniken.
Schließlich ist ein letzter Gegenstand der Erfindung eine Sonde zur Therapie, um Infektionen zu behandeln, die von zumindest einer Enterobakterienspezies oder einer Gruppe von solchen Spezies verursacht wurde, wobei die Sonde ein wie zuvor definiertes Oligonukleotid aufweist. Diese Sonde zur Therapie, die an Messenger-RNA und/oder an genomische DNA dieser Bakterien hybridisieren kann, kann die Phänomene der Transduktion und/oder der Transkription und/oder der Replikation blockieren. Das Prinzip dieser Gentherapiemethoden ist bekannt und beruht insbesondere auf der Verwendung einer dem Gegensinnstrang entsprechenden Sonde: Die Ausbildung eines Hybrides zwischen der Sonde und dem Sinnstrang ist in der Lage, zumindest einen der Schritte der Entschlüsselung der genetischen Information zu stören. Die Sonden zur Therapie sind also als antibakterielle Medikamente verwendbar, indem sie es ermöglicheny die durch Enterobakterien verursachten Infektionen zu bekämpfen.
Unter Bedingungen, die in nachfolgendem Beispiel 1 präzisiert werden, wurde die DNA-Nukleotidsequenz, die dem Gen rpoB von zwei Enterobakterienspezies entspricht, sowie einer Art bestimmt, die zu einer Familie von ebenfalls gramnegativen Bakterien gehört. Diese Studie bezog sich auf die Spezies Escherichia coli, Shigella dysenteriae und Pseudomonas putida.
Es wurden Regionen gesucht, die allein für die Enterobakterienspezies stark konserviert sind, welche es ermöglichen, diese von anderen Bakteriengattungen zu unterscheiden. Es wurde folglich unter Bezugnahme auf die Nummerierung der Nukleotidsequenz des Gens rpoB von Escherichia coli ATCC 25290, eine interessante Region von 512 Basen ausgewählt, nämlich die Positionen 1498 bis 2009 des Gens rpoB. Für andere Entereobakterienspezies sowie für mehrere Spezies, die nicht zur Familie der Enterobakterien gehören, wurden die Sequenzen der gleichen Regionen bestimmt.
Die Ergebnisse dieser verschiedenen Sequenzierungen sind in den beigefügten 1 bis 9 zusammengefasst, in denen das Zeichen * eine unbesetzte Stelle repräsentiert, dessen Darstellung zur Ausrichtung in Anbetracht bestimmter Spezies erforderlich ist, die an dieser Stelle eine zusätzliches Nukleotidmotiv aufweisen.
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen, d. h. die Ausrichtungen der in den 1 bis 9 gezeigten Sequenzen, haben es ermöglicht, in den bei sämtlichen Enterobakterienspezies konservierten Regionen Sonden zu konzipieren, die es ermöglichen, das Vorhandensein oder die Abwesenheit von zumindest einem solchen Bakterium der Familie der Enterobakterien zu detektieren. Ferner macht die Verwendung von Sonden, die für eine besondere Spezies mutierte Bereiche enthält (hinsichtlich der Referenzspezies, hier E. coli), die direkte Detektion einer solchen Spezies möglich. In den Sandwich-Hybridisierungstechniken, bei denen zwei Sonden in Kombination (Fängersonde und Detektionssonde) verwendet werden, werden bspw. eine Sonde, die für die Familie der Enterobakterien spezifisch ist, und eine Sonde, die für die in Erwägung gezogene Spezies spezifisch ist, in Kombination verwendet. Es können ferner zwei für diese Spezies spezifische Sonden in Kombination verwendet werden, wenn diese vorhanden sind, wobei diese beiden Sonden komplementär zu nicht-überlappenden Regionen des Gens rpoB sind.
Wir zuvor angegeben, können die Nukleotidsonden der Erfindung in klassischen Hybridisierungsmethoden verwendet werden. Die zu detektierende Nukleinsäure (Ziel) kann DNA oder RNA sein (beides wird ggf. nach einer Amplifizierung erhalten). Im Falle eines doppelsträngigen Nukleinzieles empfiehlt sich dessen Denaturierung vor der Durchführung des Detektionsverfahrens. Die Zielnukleinsäure kann durch Extraktion aus einer zu untersuchenden Probe gemäß bekannter Nukleinsäuremethoden erhalten werden. Die Denaturierung einer doppelsträngigen Nukleinsäure kann nach bekannten chemischen, physikalischen oder enzymatischen Denaturierungsmethoden erfolgen, und insbesondere durch Erwärmung auf eine geeignete Temperatur oberhalb von 80°C.
In bestimmten Fällen erfordert der Nachweis des Vorhandenseins einer bestimmten Enterobakterienspezies die Verwendung von Sonden, die die Detektion einer Punktmutation ermöglichen. Dafür empfiehlt es sich, mit Sonden einer bestimmten Länge (Anzahl der Nukleotidmotive) unter Bedingungen zu arbeiten, die zuvor eigens bestimmt werden.
Weitere Einzelheiten werden nachfolgend gegeben, indem insbesondere auf die Sandwich-Hybridisierungsmethode Bezug genommen wird, die eine der gegenwärtig praktischsten Hybridisierungsmethoden darstellt. Diese Methode umfasst das In-Kontakt-Bringen einer ersten auf einem festen Träger fixierten Sonde mit einer die zu analysierende Nukleinsäure enthaltende Lösung, und das In-Kontakt-Bringen des Trägers mit der Detektionssonde, die Inkubation der erhaltenen Mischung, das Spülen des Trägers, um die Bestandteile zu entfernen, die durch nicht spezifische Hybridisierung auf dem Träger fixiert wurden, und der qualitativen oder quantitativen Detektion mittels einer Reaktion zum Nachweis des auf dem Träger fixierten Markers der fixierten Detektionssonde. Der Nachweis des Vorhandenseins des Markers kann bspw. durch Colorimetrie, Fluoreszenz oder Lumineszenz erfolgen.
Das In-Kontakt-Bringen der Fängersonde mit der Probe und mit der Detektionssonde kann hintereinander erfolgen, ggf. mit dazwischen erfolgendem Spülen des Trägers. Es kann ferner der art gearbeitet werden, dass die auf dem Träger fixierte Sonde gleichzeitig oder quasi gleichzeitig mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die die Probe und die Detektionssonde enthält, die in Form einer Mischung oder separat hinzugegeben werden können.
Die aufeinander folgenden Inkubations- und Spülphasen, die die Schlüsselschritte des Sanwich-Hybridisierungsverfahrens darstellen, werden jeweils bei einer konstanten Temperatur durchgeführt, die bspw, in dem weiter oben erwähnten Bereich (siehe „Definitionen") liegen kann. Es ist bekannt, dass die Nukleinsäurehybride eine Dissoziationstemperatur haben, die von der Anzahl der hybridisierten Basen abhängt (die Temperatur steigt mit der Größe des Hybrides), und die ferner von der Natur der hybridisierten Basen und, für jede hybridisierte Base, von der Natur der angrenzenden Basen abhängt. Die Dissoziation der Hybride erfolgt in einem Temperaturintervall von einigen Graden und kann einfach, bspw. mit der UV-Spektroskopie, bestimmt werden. Es ist möglich, mittels einfacher Routineexperimente experimentell die Temperatur zu bestimmen, bei der die Hybride, die sich zwischen einer bestimmten Sonde und der komplementären Zielsequenz bilden, semidissoziieren. Die Hybridisierungstemperatur, die in der Sandwich-Hybridisierung verwendet wird, muss selbstverständlich unterhalb der Temperatur liegen, bei der die Semidissoziation erfolgt. Genau genommen wird bei einer Temperatur gearbeitet, die niedriger als die Temperatur ist, bei der diejenigen Hybride semidissoziieren, die unter den beiden Hybriden am wenigsten stabil sind, die das Ziel einerseits mit der Fängersonde und andererseits mit der Detektionssonde ausbilden, damit die beiden Hybride bei der Arbeitstemperatur stabil sind. Eine Punktmutation, d. h. eine Mutation, die eine Misspaarung bewirkt, die nur ein Basenpaar in dem Hybrid betrifft, bewirkt eine Modifizierung, im Allgemeinen eine Erniedrigung, der Temperatur, bei der eine Semidissoziation erfolgt. Indem ausreichend kurze Sonden verwendet werden, kann eine solche einmalige Misspaarung eine relativ deutliche Erniedrigung der Semidissoziationstemperatur in der Größenordnung von einigen Graden bewirken. Folglich ist es möglich, indem mittels vorheriger Routineexperimente eine Sonde von ausreichender Länge ausgewählt und in einer bestimmten Pufferlösung gearbeitet wird, eine Temperatur zu bestimmen, bei der eine Hybridisierung nur in dem Fall beobachtet wird, in dem die Sonde exakt komplementär zu dem Ziel ist. Ferner ist es durch die Wahl kurzer Sonden von bestimmter Länge möglich, die Sandwich-Hybridisierungstechnik bei einer bestimmten einheitlichen Temperatur, bspw. 37°C, durchzuführen. Für eine detailliertere Diskussion der Sandwich-Hybridisierungstechnik mit der Verwendung von kurzen Sonden kann sich insbesondere auf die Patentanmeldung FR-2 663 040 bezogen werden.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.
BEISPIEL 1
Um den sequenzierten Teil zu amplifizieren, wurden konservierte Primer ausgewählt:
Die Koordinaten sind entsprechend der Kodierungssequenz für das rpoB Gen von E. coli (Genbank V00340) ausgedrückt.
Die Ziel-DNA wird von jedem Bakterium gemäß folgender Technik extrahiert. 1,5 ml Bakterienkultur werden zentrifugiert und das Pellet wird in 75 μl Trispuffer (25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Saccharose, pH 8) und 25 μl Lysozymlösung (1 mg/ml in Trispuffer) resuspendiert. Nach dreißigminütiger Inkubation bei 37°C werden 50 μl Phenol hinzugegeben und das Röhrchen wird für 30 Sekunden stark geschüttelt. Es werden 50 μl Chloroform hinzugegeben und erneut für 2 Sekunden geschüttelt. Nach einer fünfminütigen Zentrifugation wird die wässrige Phase zurückgewonnen.
Die DNA wird gemäß der PCR-Technik von Saiki et al. (Saiki et al., 1988, Science 239, 487–494) mittels einer PCR-480-Vorrichtung von Perkin-Elmer amplifiziert. Das Reaktionsmedium (100 μl) besteht aus 10 mmol/l Tris-HCl; 1,5 mmol/l MgCl₂; 50 mmol/l KCl; 1 mg/ml Gelatine; jeweils 0,5 mmol/l dATP, dCTP, dGTP, dTTP; pH 8,3; 25 pmol CM7-Oligonukleotid, 25 pm CM31-Oligonukleotid und 10 μl der Präparation der Bakterien-DNA. Nach der Denaturierung, 5 min, gefolgt von einer Zentrifugation, werden 1,5 U/Reaktion an Enzym hinzugegeben. Die PCR erfolgt mit 30 Zyklen mit den Parametern 96°C/60°C/74°C, für 1 min, 1 min bzw. 0,7 min.
Die amplifizierte DNA wird mittels Elektrophorese in 0,8%igem Agarosegel in TBE-Puffer (89 mM Tris-Base, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) analysiert. Die Banden werden mittels Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Die Sequenz der so amplifizierten Fragmente wurde gemäß klassischen Techniken ermittelt.
BEISPIEL 2: Verwendung einer spezifischen gegen das Gen rpoB gerichteten Sonde, um Escherichia coli zu identifizieren
Die an Nukleotid Nr. 4 beginnende und an Nukleotid Nr. 27 der Sequenz SEQ ID-Nr. 12 endende Sonde, die a priori spezifisch ist für E. coli-Stämme, wurde nach der Ausrichtung der Nukleotidsequenzen der Gene rpoB der 4 abgeleitet. Eine Sammlung von Bakterienstämmen wurde durch Hybridisierung an das Fragment getestet, das ausgehend von rpoB amplifiziert wurde, was es ermöglicht hat, die Spezifität dieser Sonde a priori festzustellen.
Die Hybridisierung des PCR-Produktes eines Bakterienziels erfolgte gemäß des nicht radioaktiven und halbautomatisierten Detektionsverfahrens, das in dem französischen Patent Nr. 90 07249 beschrieben ist. Es wurden eine S8L-Fängersonde, die einer eubakterienspezifischen Sonde entspricht (beschrieben in der Patentanmeldung FR Nr. 93 02127), und ein spezifisches Oligonukleotid(entsprechend der weiter oben definierten spezifischen Sonde)-Enzym-Konjugat zur Detektion verwendet. Die Handhabung erfolgte gemäß folgendem Protokoll.
In der Mikrotitationsplatte (Nunc 439454) wird eine Lösung von Fängeroligonukleotiden mit 1 ng/ml in 3 × PBS (0,45 M NaCl, 0,15 M Natriumphosphat, pH 7,0) gegeben, deren 5'-Enden mit dem Aminolink-2-Reagens (Applied Biosystems, Foster City, Californien) reagiert haben. Die Platte wird für 2 h bei 37°C inkubiert, anschließend dreimal mit 300 μl PBST (1 × PBS, Tween20: 0,5°/00 (Merck 822184)) gespült. Das Aminolink-2-Reagens ermöglicht es, am 5'-Ende der Sonde einen Arm anzufügen, der eine 6-Aminohexylgruppe trägt. Die Sonde, die so an einen Liganden gekoppelt wurde, der eine polare Gruppe (primäres Amin) trägt, und auf passive Art und Weise auf dem Träger fixiert ist, erzeugt ein verbessertes Signal; siehe Patentanmeldung FR 91 09057.
Das aus 4 μl des amplifizierenden Produktes bestehende Ziel wird mit 76 μl Lachs-PBS-Puffer (3 × PBS + 10 μg/ml DNA von Lachsspermien (Sigma D19562)) und 10 μl 2 N Natriumcarbonat vermischt. Der gesamte Ansatz wird durch Zugabe von 10 μl 2 N Essigsäure für 5 min neutralisiert. Der gesamte Ansatz wird in die Vertiefung gegeben, sowie zusätzlich 50 μl einer Lösung von Oligonukleotid-Peroxydase-Konjugat mit einer Konzentration von 0,1 ng/ml an Oligonukleotid in einem Pferde-PBS-Puffer (3 × PBS + 10% Pferdeserum (BioMerieux 55842)). Das Oligonukleotid-Peroxydase-Konjugat stellt die Detektionssonde dar. Die Platte wird für 1 h bei 37°C inkubiert und mit 3 × 300 μl PBST gespült. In jede Vertiefung werden 100 μl des Substrates OPD (ortho-Phenylendiamin, Cambridge Medical Biotechnology ref/456) in einem angepassten Puffer (0,055 M Zitronensäure, 0,1 M Na₂HP₂O₄, pH 4,93) mit einer Konzentration von 4 mg/ml zugegeben, zu dem unmittelbar zubereitetes H₂O₂ á 30 Volumina mit 1/1000 zugegeben wird. Nach 20 min der Reaktion der enzymatischen Aktivität wird mit 100 μl 1 N H₂SO₄ geblockt und die Auslesung erfolgt in einem Axia Microreader (BioMérieux) bei 492 nm.
Die Zielbakterien waren insbesondere Folgende:

– 22 E. coli-Isolate oder -Stämme (darunter ATCC 25290, 25922, 27165, 10536);
– verschiedene andere Escherichia (18 Isolate): E. fergussonii, E. hermanii, E. vulneris;
– 8 Shigella: S. boydii, S. dysenteriae (darunter ATCC 29027), S. flexneri, S. sonnei;
– 5 Salmonella: S. arizonae (ATCC 13314), S. choleraesuis (ATCC 13312), S. gallinarum, S. typhimurium (ATCC 14028) S. spp (ATCC 9712);
– 7 verschiedene Enterobakterien: Citrobacter amalonaticus (ATCC 25405), Enterobacter cloacae (ATCC 13047), Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, Kluivera ascorbata, Proteus mirabilis, Serratia marcenscens (ATCC8195);
– Pseudomonas aeruginosa (ATCC 35422), Pseudomonas putidia;
– Enterococcus faecalis.

Die erhaltenen Ergebnisse verdeutlichen, dass die Kombination der verwendeten Sonden, a posteriori, spezifisch für E. coli ist. Sie zeigen keine Kreuzreaktionen mit PCR-Produkten anderer Bakterienspezies.
Es erfolgte die Anpassung der spezifischen Kombination auf den VIDAS-Automaten (angemeldete Marke – vertrieben von der Firma BioMerieux-VITEK). Die Wand der Vertiefung der Mikroplat te wird hier durch SPR (Handelsmarke) („Solid Phase Receptacle") ersetzt, welches ein konischer Träger ist, der aus einem Material gefertigt wird, das unter der Bezeichnung K-Harz (Butadien-Styrol-Copolymer) verkauft wird und von der Firma BioMerieux-VITEK (USA) vertrieben wird. Verschiedene Reagenzien befinden sich in einer Anordnung mit mehreren Küvetten und verschiedene Schritte erfolgen in dem SPR, welches die Reagenzien aspirieren und ausstoßen kann und so eine Pipettenöffnung darstellt. Die in dem Protokoll unten beschriebene Sandwich-Hybridisierungsreaktion erfolgt auf der inneren Wand des Kegels.
Auf der inneren Oberfläche des SPR ist passiv das Fängeroligonukleotid fixiert, das an seinem 5'-Ende den Aminolink-2-Liganden (Applied Biosystems ref. 400808) mit einer Konzentration von 1 ng/μl in 315 μl einer 4 × PBS-Lösung (200 mM Natriumphosphat pH7,0, 600 mM NaCl) aufweist. Nach einer Nacht bei Raumtemperatur oder 2 h bei 37°C werden die Kegel zweimal mit einer PBS-Tween-Lösung gespült, anschließend im Vakuum getrocknet. Die Anordnung enthält in Küvetten die Reagenzien, die für die Detektion erforderlich sind, d. h.: 200 μl einer Lösung von einem alkalische Phosphatase-Oligonukleotid-Detektionskonjugat zu 0,1 ng/μl, 2 Mal 600 μl einer PBS-Tween-Spüllösung und eine Substratküvette.
In der ersten Vertiefung der Anordnung sind 10 μl des PCR-Produktes in dem gleichen Puffer, wie für das obige Mikroplattenprotokoll, abgelegt.
Nach 30minütiger Inkubation des Kegels mit der PCR-Zielmischung einschließlich Detektionssonde wird der Kegel zweimal mit einer PBS-Tween-Lösung gespült. 250 μl des sich in einem Diethanolaminpuffer in Lösung befindlichen MUP-Substrates (Methyl-4-umbelliferylphosphat) werden in den Kegel aspiriert, anschließend in eine Messküvette abgelassen. Die Vorrichtung misst das Fluoreszenzsignal, das in RFE (relative Fluoreszenzeinheit) der Küvette ausgedrückt wird.
Die mit diesem System erhaltenen Ergebnisse sind dieselben wie jene, die in der Mikroplatte erhalten wurden.

Claims

Oligonukleotid, ausgewählt aus den Oligonukleotiden, die eine Sequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in einer der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 52 enthalten ist, und aus den, zu diesen Oligonukleotiden komplementären Oligonukleotiden, mit Ausnahme der Oligonukleotide, die eine Sequenz haben, die ausgewählt ist aus den folgenden Sequenzen: SEQ ID-Nr. 28, SEQ ID-Nr. 77, SEQ ID-Nr. 78 und SEQ ID-Nr. 79.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweist, die in einer der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 4 enthalten ist.
Oligonukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweist, die enthalten ist in: SEQ ID-Nr. 5 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 53 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 6 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 54 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 56 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 57 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 9 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 58 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 10 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 59 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 12 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 61 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 13 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 62 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 14 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 63 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 16 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 65 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 17 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 18 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 66 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 19 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 67 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 20 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 68 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 21 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 69 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 22 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 70 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 23 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 71 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 24 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 72 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 25 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 73 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 26 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 74 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 27 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 75 enthalten sind.
Oligonukleotid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleotidsequenz aufweist oder aus dieser besteht, die ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID-Nr. 29 bis SEQ ID-Nr. 52.
Sonde, um in einer biologischen Probe Bakterien zu detektieren, die zur Familie der Enterobakterien gehören, bestehend aus einem Oligonukleotid nach Anspruch 2.
Sonde, um in einer biologischen Probe zumindest eine Enterobakterienspezies zu detektieren, bestehend aus einem Oligonukleotid nach Anspruch 3 oder 4.
Sonde nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass diese auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Sonde nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass diese mit einem Indikatoragens markiert ist.
Verwendung eines Oligonukleotids als Sonde, um in einer biologischen Probe Bakterien zu detektieren, die zu der Familie der Enterobakterien gehören, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus den Oligonukleotiden, die eine Sequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden haben, die in einer der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 52 enthalten ist, und aus den zu diesen Oligonukleotiden komplementären Oligonukleotiden.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweist, die in einer der Sequenzen SEQ ID-Nr. 1 bis SEQ ID-Nr. 4 enthalten ist, und deren komplementäre Sequenzen.
Verwendung nach Anspruch 9, um in einer biologischen Probe zumindest eine Enterobakterienspezies nachzuweisen.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweist, die enthalten ist in: SEQ ID-Nr. 5 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 53 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 6 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 54 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 7 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 55 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 56 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 57 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 9 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 58 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 10 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 59 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 11 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 60 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 12 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 61 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 13 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 62 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 14 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 63 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 15 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 16 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 65 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 17 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 18 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 66 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 19 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 67 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 20 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 68 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 21 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 69 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 22 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 70 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 23 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 71 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 24 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 72 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 25 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 73 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 26 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 74 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 27 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 75 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 28 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 76 enthalten sind, oder eine komplementäre Sequenz.
Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz aufweist oder aus dieser besteht, die ausgewählt ist aus den Sequenzen SEQ ID-Nr. 29 bis SEQ ID-Nr. 52.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde auf einem festen Träger immobilisiert ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde mit einem Indikatoragens markiert ist.
Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von zumindest einem Enterobakterium in einer Probe, die Nukleinsäuren von zumindest einem solchen Bakterium enthält oder enthalten kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit zumindest einer Sonde nach einem der Ansprüche 9 bis 13 in Kontakt gebracht wird, und anschließend auf an sich bekannte Art und Weise die Ausbildung oder die Abwesenheit der Ausbildung eines Hybridisierungskomplexes zwischen der Sonde und der Nukleinsäure der Probe bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 16, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer Enterobakterienspezies oder einer Gruppe von solchen Spezies zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass einerseits eine erste Sonde, wie in Anspruch 10 definiert, und andererseits eine zweite Sonde, wie in Anspruch 12 oder 13 definiert, verwendet wird, wobei als vereinbart gilt, dass die erste und die zweite Sonde in der Lage sind, mit den nicht- überlappenden Regionen einer Nukleinsäure zu hybridisieren, die dem Gen rpoB der Enterobakterien entspricht.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Sonde eine solche wie in Anspruch 14 definierte Sonde, und die zweite Sonde eine solche wie in Anspruch 15 definierte Sonde ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Salmonella sofia zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 5 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 53 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 27 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 75 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz hat, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 29, SEQ ID-Nr. 51, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Salmonella typhimurium zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind auss SEQ ID-Nr. 6 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 54 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 11 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 60 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 24 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 72 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 25 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 73 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz hat, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 30, SEQ ID-Nr. 35, SEQ ID-Nr. 48, SEQ ID-Nr. 49, SEQ ID-Nr. 52, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Shigella dysenteriae zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in SEQ ID-Nr. 7 enthalten ist, und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinan- der folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 55 und deren komplementärer Sequenz enthalten sind.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz hat, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 31 und deren komplementärer Sequenz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Escherichia fergussoni zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 56 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 8 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 57 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 19 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide aufweist, die in SEQ ID-Nr. 67 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz hat, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 32, SEQ ID-Nr. 43, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Enterobacter cloacae zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 9 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 58 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 13 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 62 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 16 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 65 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 17 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 18 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 66 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 21 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 69 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 22 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 70 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz hat, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 33, SEQ ID-Nr. 37, SEQ ID-Nr. 40, SEQ ID-Nr. 41, SEQ ID-Nr. 42, SEQ ID-Nr. 45, SEQ ID-Nr. 46, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Klebsiella pneumoniae zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 10 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 59 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 14 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 63 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 15 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 64 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 20 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 68 enthalten sind, SEQ ID-Nr. 23 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide aufweist, die in SEQ ID-Nr. 71 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz hat, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 34, SEQ ID-Nr. 38, SEQ ID-Nr. 39, SEQ ID-Nr. 44, SEQ ID-Nr. 47, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, um das Vorhandensein oder die Abwesenheit von Escherichia coli zu bestimmen, dadurch gekennzeichnet, dass eine Sonde verwendet wird, die ausgewählt ist aus jenen, die eine Nukleotidsequenz von zumindest 12 natürlichen oder modifizierten aufeinander folgenden Nukleotiden aufweisen, die in einer der Sequenzen enthalten ist, die ausgewählt sind aus: SEQ ID-Nr. 12 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID- Nr. 61 enthalten sind. SEQ ID-Nr. 26 und die zumindest 5 natürliche oder modifizierte aufeinander folgende Nukleotide enthält, die in SEQ ID-Nr. 74 enthalten sind, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde eine Nukleotidsequenz hat, die aus einer Sequenz besteht oder diese aufweist, die ausgewählt ist aus SEQ ID-Nr. 36, SEQ ID-Nr. 50, und deren komplementären Sequenzen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 20 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Sonde in Kombination mit einer in Anspruch 10 definierten Sonde verwendet wird.
Nukleotidprimer verwendbar für die Synthese einer Nukleinsäure in Gegenwart einer Polymerase, dadurch gekennzeichnet, dass diese aus einem in Anspruch 1 definierten Oligonukleotid besteht.
Sonde zur Therapie, dadurch gekennzeichnet, dass diese aus einem in Anspruch 1 definierten Oligonukleotid besteht.