KR20020089233A

KR20020089233A - 리보핵산분해효소 처리를 이용하여 활력있는 세균을검출하는 역전사효소-중합효소연쇄반응 방법

Info

Publication number: KR20020089233A
Application number: KR1020020059989A
Authority: KR
Inventors: 최석호
Original assignee: 최석호
Priority date: 2002-09-24
Filing date: 2002-09-24
Publication date: 2002-11-29

Abstract

본 발명은 살균처리된 식품 또는 물질에 2차오염된 세균을 신속히 검출하기 위한 방법이다. 구체적으로, 식품 또는 세균 시료를 리보핵산분해효소로 처리한 후 추출한 RNA를 사용한 역전사효소-중합효소연쇄반응을 이용함으로써 살균처리에 의해 사멸된 세균은 검출하지 않고 살균처리 후 2차오염에 의해 식품에 유입된 활력이 있는 세균을 선택적으로 검출하는 방법이다. 아래 글에서 역전사효소-중합효소연쇄반응, 활력이 있는 세균, 및 사멸된 세균은 각각 『RT-PCR』, 『생균』 및 『사균』으로 표기한다.

식품 또는 세균을 리보핵산분해효소로 처리할 때에 사균의 RNA가 분해되지만 생균의 RNA는 분해되지 않는 점을 이용한 방법이다. 생균의 RNA만을 추출하여 RT-PCR 반웅액의 시료로서 이용하여 증폭된 DNA를 검출함으로써 사균에 잔존해 있는 RNA 때문에 사균이 생균으로 검출되는 오류를 방지할 수 있는 RT-PCR을 이용한 신속한 검출방법이다.

PCR과 RT-PCR 방법에서 사용하는 primer의 핵산염기 서열은 검출할 수 있는 미생물을 결정할 수 있다. 본 발명은 Enterobacteriaceae와Escherichia coli0157:H7을 검출하는 RT-PCR과 PCR에 사용할 수 있는 primer의 핵산염기 서열과 이에 관련된 유전자들을 개발하였다.

Description

리보핵산분해효소 처리를 이용하여 활력있는 세균을 검출하는 역전사효소-중합효소연쇄반응 방법 {The method of RT-PCR to detect viable bacteria by using ribonuclease treatment}

식품가공의 중요 목적은 열처리 등을 이용하여 살균 처리함으로서 식중독으로부터의 안전성을 확보하며 저장성을 증진시키는 것이다. 따라서 가공식품의 미생물학적 기준이 법적으로 규정되어 있으며, 식품가공업자와 식품관련 공공기관은 식품의 안전성을 관리하고 원활한 생산과 유통을 위하여 미생물의 신속검출방법을 필요로 하고 있다.

가공 식품의 위생기준의 척도로서 전반적인 오염여부를 결정하는 총균수와 분변의 오염 여부를 결정하는 대장균군수가 이용되고 있다. 대장균군은 동물의 장에서 유래되는 세균 집단으로서 유당을 발효하여 개스를 형성하며 포자를 형성하지 않는 그람음성 간균 집단이다.Salmonella와Shigella와 같은 세균들은 공중보건에 대해 위해도가 높지만 유당을 발효하지 못하므로 대장균군에 포함되지 않는다. 반면에 Enterobacteriaceae는 동물의 장으로부터 유래되는 세균 집단으로서Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Yersinia등의 병원성 세균을 포함한다.따라서 Enterobacteriaceae는 가열처리 후 식품의 2차오염과 공중보건 위해도를 지시하는 미생물로서 대장균군을 대체할 수 있다.

Escherichia coli0157:H7은 병원성 세균으로서 Shiga 독소를 생산하는 대장균 중의 하나이다.Escherichia coli0157:H7는 건강한 소의 분변에서 발견되며 오염된 식품과 물을 통해 또는 감염된 사람과 동물과의 직접적인 접촉을 통해 인간에 전달된다. 감염 증상으로 설사, 출혈성 대장염, 용혈성 요독증 및 사망에 이른다. 살균처리가 안된 육제품 및 우유 등의 섭취가 주요 원인이다.

가공식품에 오염되어 있는 세균의 일반적인 검출법은 미생물배지에 식품시료의 회석액을 접종하여 배양하는 방법이다. 병원성 세균과 같은 특정 세균을 결정하기 하기 위하여 전통적으로 세균의 생리학적 특성을 이용한 추가적인 배양법을 사용하여야 한다. 이 방법들은 최소 2일-2주간 이상이 소요되어 식품의 신속한 품질관리방법으로서 적절하지 못하다.

신속한 검출 방법으로서 면역학적 방법 및 분자유전학적 방법이 이용되고 있다. 분자유전학적 방법 중 PCR 방법과 RT-PCR방법이 개발되고 있다. PCR방법과 RT-PCR 방법은 생물체마다 특이적으로 다른 핵산염기 서열을 가진 primer를 설계하여 DNA와 RNA를 각각 증폭하여 생물체의 존재 여부를 검출할 수 있는 방법이다. PCR은 세균의 특정 DNA를 증폭하여 유전자의 존재여부를 검출할 수 있어 세균의 존재여부를 알 수 있다. 그러나 죽은 세균의 DNA도 상당한 기간 분해되지 않고 잔존하여 존재함으로 가공식품의 세균오염 여부를 검출하기에는 PCR 방법에 문제점이 있다.

반면에 RT-PCR 방법은 RNA로터 DNA를 역전사하는 반응단계가 추가적으로 있는 방법이다. RNA는 DNA보다 상대적으로 분해가 잘되는 특성 때문에 활력이 있는 세균을 선택적으로 검출할 수 있는 방법으로 일반적으로 알려져 왔다. 그러나 65℃에서 30분과 72℃에서 5분과 같은 저온살균에 의해 열처리된 경우에 사멸된 세균의 RNA가 일부 분해되지 않고 잔류된다고 보고되었다. 따라서 RT-PCR 방법에 의해서도 사균이 검출될 가능성이 있다.

RT-PCR 방법에서 사용하는 primer의 핵산염기 서열은 검출하고자 하는 특정세균 또는 세균집단의 DNA가 갖고 있는 핵산염기 서열과 일치하여야 한다. 따라서 primer의 핵산염기 서열을 적절히 설계함으로서 특정 세균 또는 세균 집단을 검출할 수 있다. 또한 primer의 핵산염기 서열은 RT-PCR의 검출 민감도에 영향을 준다.

Escherichia coli0157:H7의 검출을 위한 PCR에서 사용할 수 있는 primer의 핵산염기 서열은 많이 보고되어 있으나 RT-PCR에 응용된 primer는 적다. 반면에 Enterobacteriaceae를 검출할 수 있는 primer는 보고된바 없다.

본 발명은 오류를 최소한으로 하여 생균 만을 검출하는 개선된 RT-PCR 방법을 개발하기 위하여 식품 시료의 처리과정 중에 리보핵산분해효소를 첨가하여 사균에 잔류하는 RNA를 제거하는 방법을 개발하였다. 또한 본 발명은 Enterobacteriaceae와Escherichia coli0157:H7을 RT-PCR 또는 PCR로 민감하게 검출할 수 있는 primer의 핵산염기 서열과 관련 유전자들을 포함한다.

본 발명의 구성은 생균을 검출하기위한 RT-PCR에 사용하는 식품시료를 전처리하기 위한 리보핵산분해효소 용액의 조성과 사용법이다. 또한 Enterobacteriaceae와Escherichia coli0157:H7를 검출하기 위한 RT-PCR과 PCR에서 사용하는 primer의 핵산염기 서열과 관련된 유전자들을 포함한다.

(1) 본 발명의 원리 및 실제

본 발명에서 사용하는 리보핵산분해효소 시약은 리보핵산분해효소를 완충용액 등 용매에 용해시킨 후 막여과하여 멸균시켜 제조한 것을 사용한다. 미생물배지 또는 완충용액에 희석된 리보핵산분해효소 시약을 식품 또는 농축된 세균에 첨가하여 혼합한 후 37℃에서 10분∼1시간 반응시킨다. 이 혼합액을 원심분리하여 세균을 침전시킨다. 침전된 세균으로부터 RNA를 분리한 다음에 RNase-free DNase를 이용하여 잔류하는 DNA를 제거한다. 추출된 RNA는 RT-PCR을 이용하여 DNA를 합성한 후 전기영동법으로 검출하던가 또는 real-time PCR 방법으로 측정한다.

(2) 리보핵산분해효소 시약

리보핵산분해효소로서 RNase A를 사용하여 0.1∼12mg/㎖의 농도가 되게 인산염완충생리염수용액에 용해시킨다. 0.45㎛ 이하의 막공을 가진 여과막에 리보핵산분해효소 용액을 통과시킨 후 멸균된 glycerol에 1:1 혼합하여 섞은 용액을 -20℃에서 저장하여 사용한다.

(3) 리보핵산분해효소 시약을 이용한 식품시료의 전처리 방법

우유와 같은 액상식품을 원심분리하여 세균을 침전시킨다. 크림층과 상등액을 제거하고 침전된 세균에 1㎖의 인산염완충생리염수 또는 미생물배지를 첨가한 다음에 리보핵산분해효소 시약 25㎕를 첨가한다. 고기와 같은 고체식품은 멸균된인산염완충생리염수 또는 미생물 배지를 첨가하여 여과막이 있는 stomacher bag에 넣어 교반시킨다. 1∼10㎖의 여과액에 25∼250㎕의 RNA 분해효소 용액을 첨가한다. 리보핵산분해효소가 첨가된 세균분산액을 37℃에서 10분∼1시간 반응시킨 다음에 Trireagent 방법을 이용하여 RNA를 추출한다. 추출된 RNA에 잔류하고 있는 DNA는 RNase-free DNase로 분해시킨다. 제조된 RNA를 주형으로하여 RT-PCR을 이용하여 검출하고자 하는 세균의 DNA를 합성한다. DNA의 합성여부를 전기영동을 이용하여 결정하거나 real-time PCR 등의 방법을 검출한다.

(4) RT-PCR과 PCR을 위한 primer

본 발명에서Escherichia coli0157:H7을 검출하기 위하여 4종의 primer들을사용하였다. Primer 1, primer 2, primer 3, 및 primer 4는 GeneBank accession number AE005429의Escherichia coli0157 antigen gene cluster에서부터 핵산염기서열을 결정하였다. Primer 1과 primer 2 는per유전자의 일부 핵산염기 서열을 가진 oligonucleotide이며 primer 3과 primer 4는wbdN유전자의 일부 핵산염기 서열을 가진 oligonucleotide이다. 각 primer의 핵산염기 서열은 다음과 같다 (Primer 1 : 5'-GGACCGCAGAGGAAAGAGAG-3', Primer 2 : 5'-TCCACGCCAACCAAGATCC-3', Primer 3 : 5'-CGTTTCAATAATTATGCCCGTTTAC-3', Primer 4 : 5'-TCCAGCCACATCAAATAATCCTC-3').

Primer 5 (5'-CCGTATAGCAGGCATTAACATTCC-3')와 Primer 6

(5'-GGAACCACCG/TGCTGTTGC-3')은 Enterobacteriaceae를 검출하기 위하여 사용하였으며 GeneBank accession number X02543, AL627282, AJ414141을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 각 염기서열 파일은Escherichia coli, Salmonella estericaserovartyphi, Yersinia pestis의 핵산염기 서열이며 Primer 5와 primer 6이 증폭하는 DNA는 alpha ribosomal protein operon의 리보솜 단백질 S11과 S13의 유전자의 일부이다.

(5) RT-PCR 방법에서Escherichia coli0157:H7의 검출에 대한 특이성과 민감도

E. coliATCC 43890에서 분리한 RNA 시료를 사용하여 primer 1과 primer 2를 사용한 RT-PCR과 primer 3과 primer 4를 사용한 RT-PCR의 특이성을 결정하였다. 각 RT-PCR에서 150bp와 570bp의 DNA가 합성됨을 확인하였다. 그러나 PCR반응에서는 DNA가 합성되지 않았다. 한편 대조구로서 RNase-free DNase로 처리하지 않은 RNA 시료는 RT-PCR과 PCR에 의해 DNA가 모두 합성되었다. 이상의 실험 결과 각 primer 쌍에 의해 합성되는 DNA의 길이가 유전자 내 primer의 위치로부터 계산한 DNA의 길이와 유사함을 알 수 있었으며 RNase-free DNase 처리된 RNA 시료에서는 PCR에 의해 DNA가 합성되지 않는 사실에서 DNA가 제거됐음을 알 수 있었다. 또한 RNase-free DNase로 처리하지 않은 RNA 시료에는 DNA가 잔류하고 있음을 확인하였다.

각 primer 쌍에 의한 RT-PCR 반응이E. coli0157:H7을 특이적으로 검출하는 여부를 확인하기 위하여 0157 혈청형을 가진 ATCC 43890, 43895, 43889, 43888, 43834인E, coli5 균주, 01 혈청형인E. coliKCTC 2441,Salmonella typhimuriumKCTC 2514,Shigella sonneiKCTC 2009,Enterobacter sakazakiiKCTC 2949,Yersinia enterocoliticaATCC 23715,Klebsiella pneumoniaeKCTC 2208,Citrobacter freundiiKCTC 2006,Enterococcous faecalisKCTC 3511,L. monocytogenesKCTC 3569,B. coagulansKCTC 1015에서 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. 두 RT-PCR 모두에서 0157 혈청형의Escherichia coli5 균주에서만 각각 DNA가 합성되었고 전기영동상에서 각 DNA의 band가 유사한 강도로 염색되었으며 다른 세균에서는 합성되지 않았다. 따라서 이들 primer 쌍들을 사용한 RT-PCR에서Escherichia coli0157:H7 5 균주들을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.

우유에 혼입된 세균을 RT-PCR 방법을 사용하여 검출할 수 있는 최소 세균수를 결정하기 위하여 10⁶∼10 세균수의E. coliATCC 43890을 1㎖의 우유에 첨가한 후에 RNA를 분리하여 RT-PCR을 실시하였다. Primer 1과 primer 2를 사용한 RT-PCR에서 10 세균수까지 검출할 수 있었으며 primer 3과 primer 4를 사용한 RT-PCR에서는 10³세균수까지 검출할 수 있었다.

(6) Real time RT-PCR 방법에서 Enterobacteriaceae의 검출에 대한 특이성과 민감도

Enterobacteriaceae의 검출을 위하여 SYBR Green PCR Master mix와 Multiscribe reverse transcriptase를 사용한 real time RT-PCR 방법을 사용하였다. PCR 단계에서 iCycler iQ(Bio-Rad)를 사용하여 DNA의 합성이 검출되기 시작하는 cycle인 threshold cycle(Ct)을 측정하였다. Primer 5와 primer 6을 사용한 real time RT-PCR의 특이성과 민감도를 조사하기 위하여E. coliATCC 43890의 RNA를 사용하였다.

Real time RT-PCR에 사용할 RNA를 조제하기 위하여Escherichia coliATCC 43890을 Trypticase soy broth에 3∼4시간 배양하여 대수성장기의 세균을 사용하였다. 10⁷세균을 Tri reagent 방법으로 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA 내에 잔류하는 DNA를 RNase-free DNase으로 분해하여 제거하였다. 이 단계에서 DNA가 제거됐는지 여부를 확인하기 위한 실험을 시행하기위하여 조제된 RNA시료를 real time RT-PCR과 SYBR Green PCR Master Mix 만을 사용한 real time PCR 방법으로 DNA를 합성하였다.

Primer 5과 primer 6를 사용한 real time RT-PCR에서 520bp의 DNA가 합성됨을 확인하였으며 Ct는 22.1士0.1이었다. Real time PCR반응에서는 DNA가 합성되지 않았다. 한편 대조구로서 RNase-free DNase로 처리하지 않은 RNA 시료는 real time RT-PCR과 real time PCR에 의해 DNA가 모두 합성되었으며 real time RT-PCR의 Ct가 21.9±0.1이었다. 위 실험 결과 Primer 5와 primer 6에 의해 합성되는 DNA의 길이가 primer의 위치로부터 계산한 518bp와 유사하여 특이적으로 DNA가 합성됨을 알 수 있었으며 RNase-free DNase 처리된 RNA 시료에서는 PCR에 의해 DNA가 합성되지 않는 사실에서 DNA가 제거됨을 알 수 있었다.

Primer 5와 primer 6을 이용한 real time RT-PCR 반응이 Enterobacteriaceae를 특이적으로 검출하는 여부를 확인하기 위하여E. coliATCC 43890,E. coliKCTC 2441,Salmonella cholerasuisKCTC 2932,Salmonella typhimuriumKCTC2514,Shigella sonneiKCTC 2009,Yersinia enterocoliticaATCC 23715,Enterobacter sakazakiiKCTC 2949,Klebsiella pneumoniaeKCTC2208,Citrobacter freundiiKCTC 2006,Serratia marcescensKCTC 2355 및Proteus mirabilisKCTC 2566의 Enterobacteriaceae에 속하는 11균주와 호기성 그람음성세균인Pseudomonas fluorescensKCTC 2344와Acinetobacter calcoaceticusKCTC 2357의 2균주 그리고 그람양성세균인Enterococcus faecalisKCTC 3512,Listeria monocytogenesKCTC 1945,Bacillus coagulansKCTC 1015의 3균주를 사용하였으며 10⁷의 세균으로부터 RNA를 분리하여 real time RT-PCR에 사용하였다. Real time RT-PCT에서 Enterobacteriaceae 11균주 모두에서 DNA가 합성되었으며 Ct 평균값은 22.7이었으며Enterobacter sakazakiiKCTC 2949이 24.6±O.1으로 가장 높았으며E. coliKCTC 2441이 21.5士0.0으로 가장 낮았다. 나머지 호기성 그람음성세균 2균주와 그람양성세균에서는 DNA가 합성되지 않았으며 Ct도 >40이었다. 전기영동에서 Enterobacteriaceae 11균주의 real time RT-PCR에 의해 합성된 DNA의 크기가 모두 52Obp이었다. 이상의 결과로 부터 Enterobacteriaceae 11균주를 검출할 수 있음을 알 수 있었으며 모든 균주에서 Ct가 22∼24가 되어 상당한 민감도를 가졌다.

Real time RT-PCR의 민감도를 측정하기 위하여Escherichia coliATCC 4389O의 세균수가 UHT-멸균우유 1㎖ 당 10⁸∼10²이 되게 첨가한 후 우유 1㎖로부터 RNA를

분리하여 real time RT-PCR로 Ct를 측정하였다. 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴,10³, 10²세균수에서 Ct 측정치가 각각 20.2±0.2, 23.9±O.1, 26.6±O.1, 31.8±0.8, 36.3±0.5, 35.2±2.4, >40 이었다. 이 결과 시료내 세균수가 적음에 따라 DNA의 검출이 가능한 Ct가 증가함을 볼 수 있었으며 10²의 세균수에 DNA가 합성되지 않음을 알 수 있었으며 전기영동에서도 확인되었다. 따라서 Real time RT-PCR에서 검출한계가 10³의 세균수임을 알 수 있었다.

(7) 리보핵산분해효소(RNase A) 처리가 세균 첨가 후 열처리한 우유의 RT-PCR에 미치는 영향

10⁶또는 10⁸세균수의E. coliATCC 43890을 시중에서 구입한 UHT-멸균우유에 첨가한 후 65℃에서 30분간 열처리하였다. 1㎖의 시료를 채취하여 원심분리한 후 침전된 세균에 1㎖의 PBS를 첨가하여 분산시킨 후에 RNase A를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. Primer 1과 primer 2를 사용한 RT-PCR에서는 10⁶세균을 사용하였으며 primer 3과 primer 4를 사용한 RT-PCR에서 10⁸세균을 사용하여 RT-PCR에서의 DNA 합성여부를 조사하였다. Primer 1과 primer 2를 사용한 RT-PCR에서는 RNase A로 처리한 열처리 시료에서 DNA의 합성이 매우 적었으며 RNase A로 처리하지 않은 열처리 시료에서 DNA가 합성되었다. Primer 3과 primer 4를 사용한 RT-PCR에서는 RNase A로 처리한 열처리 시료에서 DNA의 합성이 안되었으며 RNase A로 처리하지 않은 열처리 시료에서는 DNA가 합성되었다.

Primer 5와 primer 6을 사용한 real time RT-PCR에서 열처리 시료의 RNase A의 처리효과를 측정하였다.E. coliATCC 43890을 10⁷/㎖가 되게 UHT-멸균우유에 첨가한 후 65℃에서 30분간 열처리하였다. 1㎖의 시료를 채취하여 원심분리한 후 침전된 세균에 1㎖의 인산염완충생리염수 또는 Trypticase soy broth를 첨가하여 분산시킨 후에 RNase A를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. RNase A로 처리한 열처리시료에서는 Ct가 >40 이상이었으며 RNase A로 처리하지 않은 시료의 Ct가 37.3이었다. 반면에 비열처리 시료의 경우 RNase A로 처리한 시료와 처리하지 않은 시료간에 차이가 적었으며 Trypticase soy broth를 RNase A 반응용액에 첨가한 경우에는 Ct가 약간 감소하였다. 따라서 열처리된 우유에 함유된 세균을 RNase A로 처리하여 사멸된 세균 내에 잔존하는 RNA를 분해할 수 있음을 알 수 있었다.

우유의 살균에 사용되는 65℃ 30분의 열처리로 RNA가 충분히 파괴되지 않음을 RT-PCR을 통해 알 수 있었다. 따라서 RT-PCR 방법으로 사멸된 세균과 활력이 있는 세균을 정확히 구별할 수 없었다. RNase A와 같은 리보핵산분해효소를 이용하여 사멸된 세균에 잔존하는 RNA를 분해하여 제거함으로서 RT-PCR에 의해 사멸된 세균과 활력이 있는 세균을 분별하는 능력이 향상된다.

본 발명은 식품공장과 식품 관련 공공기관에서 식품의 위생적 품질관리 방법으로서 사용할 수 있다. 이 방법은 민감도가 높아 식품의 제조공정 중 일어나는 부패균 및 병원성세균의 오염을 특이적으로 신속하게 검출할 수 있다. 따라서 식품공장에서 정해진 살균 온도와 시간이 실제로 지켜지고 있는가 여부와 살균 처리된 식품에 세균의 오염 여부를 효율적으로 검출할 수 있다. 이 리보핵산분해효소 처리된 세균 시료로부터 분리한 RNA를 사용한 RT-PCR 방법을 이용함으로써 식품공장은 식품의 조기 부패를 방지하고 병원균의 오염에 의한 식중독을 예방할 수 있으며 HACCP의 검증수단으로서 사용할 수 있다. 또한 식품의 저장가능기간을 연장하므로서 유통기한을 연장할 수 있다. 또한 소비자의 신뢰감을 증진시킬 수 있으며 식품의 소비를 증대시킬 수 있다. 식품공장은 식품의 개선된 품질을 소비자에게 부각시킴으로서 타제품과 차별화된 고급 제품으로서 판매할 수 있다.

본 발명에서 개발된 리보핵산분해효소 처리를 사용한 RT-PCR방법은 활력이 있는E. coli0157:H7과 Enterobacteriaceae를 선택적으로 검출할 수 있는 신속한 방법이다. 사용하는 primer 염기서열에 따라 검출되는 세균의 종류가 결정되므로E. coli0157:H7과 Enterobacteriacea 외에도 다른 중요 병원성균이나 세균 집단에 응용이 가능하며 생균과 사균을 분별하여 검출할 수 있는 방법이다. 식품의 2차 오염이 검출이 된 경우에는 공장 기계의 작동 상태와 위생적 세척 및 살균 여부를 검사한다. 이를 위하여 공정 단계 마다 채취한 식품을 본 방법으로 조사하여 2차오염이 일어나는 기계를 확인할 수 있다.

Claims

식품 시료 또는 세균 시료에 리보핵산분해효소를 첨가하여 반응시킨 후 추출한 RNA를 사용한 RT-PCR 방법에서 DNA의 합성 여부를 결정함으로써 시료에 존재하는 활력이 있는 세균을 특이적으로 검출하는 방법
청구항 1에 있어서 리보핵산분해효소가 RNase A일 때에 시료에 존재하는 활력이 있는 세균을 특이적으로 검출하는 방법
청구항 1에 있어서 리보핵산분해효소와 함께 첨가된 물질이 미생물배지일 때에 시료에 존재하는 활력이 있는 세균을 특이적으로 검출하는 방법
DNA 서열이 5'-CGTTTCAATAATTATGCCCGTTTAC-3'와 5'-TCCAGCCACATCAAATAATCCTC-3'인 2개의 primer를 함께 사용한 RT-PCR 또는 PCR에서 DNA 합성 여부를 결정함으로써 시료 내에 존재하는Escherichia coli0157:H7을 특이적으로 검출하는 방법
Escherichia coli0157 antigen gene cluster에 존재하는 유전자wbdN(GeneBank accession number : AE005429)의 일부 핵산염기 서열을 가진 2개 이상의 primer들을 사용한 RT-PCR 또는 PCR에서 DNA 합성 여부를 결정함으로써 시료내에 존재하는Escherichia coli0157:H7을 특이적으로 검출하는 방법
핵산염기 서열이 5'-CCGTATAGCAGGCATTAACATTCC-3', 5'-GGAACCACCGGCTGTTGC-3' 및 5'-GGAACCACCTGCTGTTGC-3'인 3개의 primer들을 함께 사용한 RT-PCR 또는 PCR에서 DNA 합성 여부를 결정함으로써 시료 내에 존재하는 Enterobacteriaceae를 특이적으로 검출하는 방법
리보솜 단백질 S11과 S13의 유전자(GeneBank accession number : X02543, AL627282, AJ414141)의 일부 핵산염기 서열을 가진 2개 이상의 primer들을 사용한 RT-PCR 또는 PCR에서 DNA 합성 여부를 결정함으로써 시료 내에 존재하는 Enterobacteriaceae를 특이적으로 검출하는 방법