DE60034878T2

DE60034878T2 - Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleinsäuresequenz unter Verwendung eines chimären Primers

Info

Publication number: DE60034878T2
Application number: DE60034878T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Moriyama-shi MUKAI; Junko Moriyama-shi YAMAMOTO; Osamu Hikone-shi TAKEDA; Kazue Uji-shi MIYAKE; Takashi Otsu-shi Uemori; Yoshimi Kurita-gun SATO; Mariko Otsu-shi MORIYAMA; Haruhisa Otsu-shi SAWARAGI; Michio Otsu-shi HAGIYA; Kiyozo Koka-gun ASADA; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1999-03-19
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2008-01-17
Anticipated expiration: 2020-03-15
Also published as: CA2365135A1; EP1167524B1; EA200100990A1; AU773536B2; ATE362532T1; CN1350581A; KR20010104720A; AU2944200A; EP1167524A1; TWI259204B; KR100682576B1; EA005577B1; EP1167524A4; WO2000056877A1; EA004327B1; EA200300991A1; CA2365135C; JP3433929B2; CN1227357C; DE60034878D1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNA-Synthese, das in dem Gebiet der genetischen Veränderung verwendbar ist. Sie betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren einer Nukleotidsequenz als Matrize und ein Verfahren zum Nachweis einer durch das Verfahren amplifizierten Nukleinsäure.
Hintergrund
Eine DNA-Synthese wird für verschiedene Zwecke in Untersuchungen eingesetzt, die das Gebiet der genetischen Veränderung betreffen. Mit Ausnahme einer Synthese einer kurzkettigen DNA wie eines Oligonukleotids erfolgt die DNA-Synthese größtenteils durch enzymatische Verfahren, bei denen DNA-Polymerase verwendet wird. Ein Beispiel für diese Verfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wie detailliert in den US-PSen 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben. Ein weiteres Beispiel ist das Verfahren einer reversen Transkription-PCR (RT-PCR), das eine Kombination des PCR-Verfahrens und einer Reaktion mit reverser Transkriptase darstellt, wie beschrieben in Trends in Biotechnology, 10:146-152 (1992). Die Entwicklung der vorstehend beschriebenen Verfahren ermöglichte die Amplifizierung eines interessierenden Bereiches in einer DNA oder einer RNA.
Die vorstehend beschriebenen DNA-Syntheseverfahren erfolgen beispielsweise unter Verwendung einer Reaktion, die aus drei Schritten besteht. Die drei Schritte sind ein Schritt einer Dissoziierung (Denaturierung) einer doppelsträngigen DNA in einzelsträngige DNA, ein Schritt eines Hybridisierens eines Primers an die einzelsträngige DNA und ein Schritt einer Synthese (Verlängerung) eines komplementären Stranges ausgehend von dem Primer, um eine interessierende DNA-Region zu amplifizieren. Alternativ erfolgen sie unter Verwendung einer Reaktion, die als „Shuttle- PCR" bezeichnet wird („PCR ho saizensen" (Recent advances in PCR methodology: Basic methodology and it's application), Tanpakushitsu Kakusan Kouso, Bessatsu, (Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Supplement), 41(5):425-428 (1996)), worin zwei der drei Schritte, d.h. der Schritt eines Hybridisierens des Primers und der Schritt einer Verlängerung, bei der gleichen Temperatur erfolgen.
Alternativ dazu kann das Verfahren einer Ligase-Kettenreaktion (LCR) wie beschrieben in der EP 320,308 , veröffentlicht am 14. Juni 1989, oder das Verfahren des Transkription-basierenden Amplifikationssystems (TAS) wie beschrieben in PCR Protocols, Academic Press Inc., 1990, Seiten 245-252, verwendet werden. Die vier Verfahren wie oben beschrieben erfordern das Wiederholen einer Reaktion bei einer hohen Temperatur und einer Reaktion bei geringer Temperatur mehrere Male, um ein einzelsträngiges Zielmolekül für den nächsten Amplifikationszyklus zu regenerieren. Das Reaktionssystem sollte unter Verwendung von diskontinuierlichen Phasen oder Zyklen durchgeführt werden, da die Reaktion durch die Temperatur wie vorstehend beschrieben eingeschränkt ist.
Somit erfordern die Verfahren die Verwendung einer teuren Thermozyklusvorrichtung, die einen großen Bereich von Temperaturen über die Zeit genau anpassen kann. Des Weiteren erfordert die Reaktion Zeit für ein Anpassen der Temperatur an die zwei oder drei vorbestimmten Temperaturen. Der Zeitverlust erhöht sich mit der Anzahl an Zyklen.
Um die Probleme zu lösen, wurden Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren entwickelt, die isotherm erfolgen können. Beispiele davon umfassen das Verfahren einer Strangverdrängung-Amplifikation (SDA) wie in der JP-B-7-114718 beschrieben, das Verfahren einer selbsterhaltenden Sequenzreplikation (3SR), das Verfahren einer Nukleinsäuresequenz-basierenden Amplifikation (NASBA) wie beschrieben in dem japanischen Patent Nr. 2650159 , das Verfahren einer Transkriptions-vermittelten Amplifikation (TMA), das Qβ-Replikase-Verfahren wie beschrieben in dem japanischen Patent Nr. 2710159 und die verschiedenen modifizierten SDA-Verfahren wie beschrieben in der US-PS 5,824,517 , der WO 99/09211 , der WO 95/25180 und der WO 99/49081 . Ein Verfahren einer isothermen enzymatischen Synthese eines Oligonukleotids ist in der US-PS 5,916,777 beschrieben. Eine Verlängerung ausgehend von einem Primer und/oder eine Hybridisierung eines Primers an ein einzelsträngiges Verlängerungsprodukt (oder an eine ursprüngliche Zielsequenz) gefolgt von einer Verlängerung des Primers findet parallel in einem Reaktionsgemisch statt, das bei einer konstanten Temperatur in der Umsetzung bei diesem Verfahren einer isothermen Nukleinsäure-Amplifikation oder Synthese eines Oligonukleotids inkubiert wird.
Unter den isothermen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren ist das SDA-Verfahren ein Beispiel für Systeme, bei denen eine DNA schlussendlich amplifiziert wird. Das SDA-Verfahren ist ein Verfahren zur Amplifikation einer Ziel-Nukleinsäuresequenz (und eines komplementären Strangs davon) in einer Probe durch Verdrängung von Doppelsträngen unter Verwendung einer DNA-Polymerase und einer Restriktionsendonuklease. Das Verfahren erfordert vier Primer, die für die Amplifikation verwendet werden, wobei zwei davon derart entworfen sein sollten, dass sie eine Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuklease tragen. Das Verfahren erfordert die Verwendung eines modifizierten Desoxyribonukleotidtriphosphats als ein Substrat für eine DNA-Synthese in großen Mengen. Ein Beispiel für die modifizierten Desoxyribonukleotidtriphosphate ist ein (α-S)-Desoxyribonukleotidtriphosphat, bei dem das Sauerstoffatom der Phosphatgruppe an der α-Position durch ein Schwefelatom (S) ersetzt ist. Das Problem von laufenden Kosten, die mit der Verwendung des modifizierten Desoxyribonukleotidtriphosphats verbunden sind, wird schwerwiegend, wenn die Reaktion routinemäßig erfolgt wie bei Gentests. Des Weiteren kann der Einbau des modifizierten Nukleotids wie des (α-S)-Desoxyribonukleotids in das amplifizierte DNA-Fragment in dem Verfahren die Spaltbarkeit des amplifizierten DNA-Fragments mit einem Restriktionsenzym beseitigen, wenn es beispielsweise einer Restriktionsenzym-Fragmentlängenpolymorphismus (RFLP)-Analyse unterzogen wird.
Das modifizierte SDA-Verfahren wie beschrieben in der US-PS 5,824,517 ist ein DNA-Amplifikationsverfahren, bei dem ein chimärer Primer verwendet wird, der aus RNA und DNA besteht und als wesentliches Element eine Struktur aufweist, in der DNA zumindest am 3'-Terminus liegt. Das modifizierte SDA-Verfahren wie beschrieben in der WO 99/09211 erfordert die Verwendung eines Restriktionsenzyms, das ein 5'-überstehendes Ende erzeugt. Das modifizierte SDA-Verfahren wie beschrieben in der WO 95/25180 erfordert die Verwendung von mindestens zwei Primerpaaren. Das modifizierte SDA-Verfahren wie beschrieben in der WO 99/49081 erfordert die Verwendung von mindestens zwei Primerpaaren und mindestens einem modifizierten Desoxyribonukleotidtriphosphat. Auf der anderen Seite umfasst das Verfahren einer Synthese eines Oligonukleotids, wie es in der US-PS 5,916,777 beschrieben ist, die Synthese von DNA unter Verwendung eines Primers mit einem Ri bonukleotid am 3'-Terminus, eine Vervollständigung der Reaktion unter Verwendung des Primers, ein Einbringen eines Nicks (Einzelstrangbruchs) zwischen dem Primer und einem verlängerten Strang in einem Primer-verlängerten Strang mit einer Endonuklease, um sie voneinander zu trennen, eine Spaltung einer Matrize, und ein Wiedergewinnen des Primers für eine erneute Verwendung. Es ist erforderlich, den Primer aus dem Reaktionssystem zu isolieren und sodann erneut mit der Matrize zu hybridisieren, um den Primer in dem Verfahren erneut verwenden zu können.
Wie vorstehend beschrieben, weisen die herkömmlichen isothermen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren nach wie vor verschiedene Probleme auf. Somit ist ein Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleotidsequenz bei geringen laufenden Kosten erforderlich, durch das ein DNA-Fragment erhalten wird, das weiter genetisch verändert werden kann.
Gegenstand der Erfindung
Der erfindungsgemäße hauptsächliche Gegenstand ist die Bereitstellung eines einfachen und wirksamen Verfahrens zur Amplifizierung einer Nukleotidsequenz, das dadurch charakterisiert ist, dass eine DNA-Synthesereaktion in Gegenwart eines Oligonukleotidprimers erfolgt, und ein Verfahren zur Herstellung eines amplifizierten DNA-Fragments in großen Mengen zu dessen Bereitstellung.
Zusammenfassung der Erfindung
Als ein Ergebnis intensiver Untersuchungen haben die Erfinder ein exzellentes System für eine Genamplifikationsreaktion erstellt. Dies wurde durch die Entwicklung eines Verfahrens erreicht, bei dem eine interessierende DNA-Region in Gegenwart eines chimären Oligonukleotid-Primers mit einem an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite gelegenen Ribonukleotid, einer Endonuklease und einer DNA-Polymerase wie in den Ansprüchen definiert amplifiziert wird. Auf diese Art und Weise wurde die Erfindung vervollständigt. Das erfindungsgemäße Verfahren wird als das Verfahren einer isothermen chimäre Primer-verwendeten Amplifikation einer Nukleinsäure (ICAN) bezeichnet, das ein Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleotidsequenz ist, in dem ein chimärer Oligonukleotidprimer unter isothermen Bedingungen verwendet wird.
In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Amplifizieren einer Nukleotidsequenz oder zum Erzeugen einer Nukleinsäure in großen Mengen, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst:

(a) ein Herstellen eines Reaktionsgemisches durch Mischen einer Nukleinsäure als einer Matrize, eines Desoxyribonukleotidtriphosphats, einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität, mindestens eines Primers und einer Endonuklease, die einen aus dem Primer erzeugten verlängerten Strang spaltet, wobei der Primer ein chimärer Oligonukleotidprimer ist, der im Wesentlichen komplementär zu der Basensequenz der Nukleinsäure als der Matrize ist und Desoxyribonukleotide und ein oder mehrere Ribonukleotide enthält, wobei das/die Ribonukleotid(e) an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des Primers gelegen ist/sind, wobei die Endonuklease bei einer Stelle spaltet, die das Ribonukleotid enthält, und
(b) ein Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine Zeit, die ausreicht, um ein Reaktionsprodukt unter Bedingungen zu erzeugen, bei denen ein spezifisches Anlagern des Primers an die Nukleinsäure als eine Matrize, eine Synthesereaktion eines verlängerten Strangs und eine Strangverdrängungsreaktion durch die DNA-Polymerase und eine Reaktion eines Spaltens des verlängerten Strangs durch die Endonuklease stattfinden.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren des ersten Aspekts:

(a) ein Behandeln einer Nukleinsäure als Matrize mit mindestens einem Primer, der im Wesentlichen zu der Nukleotidsequenz der Nukleinsäure komplementär ist, und einer DNA-Polymerase, um einen Primer-verlängerten Strang zu synthetisieren, der zu der Matrize komplementär ist, wobei der Primer ein chimärer Oligonukleotidprimer mit einem Desoxyribonukleotid und einem Ribonukleotid ist, wobei das Ribonukleotid an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des Primers für eine Spaltung mit einer Endonuklease liegt,
(b) ein Spalten des Primer-verlängerten Strangs einer in Schritt (a) erhaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure mit der Endonuklease an einer Stelle, die das Ribonukleotid enthält, und
c) ein Verlängern einer Nukleotidsequenz, die zu der Matrize komplementär ist, unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität ausgehend von dem 3'-Terminus des Primeranteils der doppelsträngigen Nukleinsäure, worin der Primer-verlängerte Strang in Schritt (b) gespalten wurde, um eine Strangverdrängung zu bewirken.

In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft das Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz unter Verwendung von mindestens zwei Primern, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst:

(a) ein Behandeln einer Nukleinsäure als Matrize mit mindestens einem Primer, der im Wesentlichen zu der Nukleotidsequenz der Nukleinsäure komplementär ist, und einer DNA-Polymerase, um einen Primer-verlängerten Strang zu synthetisieren, der zu der Matrize komplementär ist, wobei der Primer ein chimärer Oligonukleotidprimer mit einem Desoxyribonukleotid und einem Ribonukleotid ist, wobei das Ribonukleotid an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des Primers für eine Spaltung mit einer Endonuklease liegt,
(b) ein Spalten des Primer-verlängerten Strangs einer in Schritt (a) erhaltenen doppelsträngigen Nukleinsäure mit der Endonuklease an einer Stelle, die das Ribonukleotid enthält,
(c) ein Verlängern einer Nukleotidsequenz, die zu der Matrize komplementär ist, unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität ausgehend von dem 3'-Terminus des Primeranteils der doppelsträngigen Nukleinsäure, worin der Primer-verlängerte Strang in Schritt (b) gespalten wurde, um eine Strangverdrängung zu bewirken, wobei eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem regenerierten Primer-verlängerten Strang in Schritt (b) erneut verwendet wird,
(d) ein Behandeln eines freigesetzten verdrängten Strangs, der in Schritt (c) erhalten wurde, als einer Matrize mit mindestens einem Primer, der von demjenigen, der in Schritt (a) verwendet wurde, unterschiedlich ist, und einer DNA-Polymerase, um einen Primer-verlängerten Strang zu synthetisieren, der komplementär zu dem verdrängten Strang ist, wobei der Primer, der von dem in Schritt (a) verwendeten unterschiedlich ist, ein chimärer Oligonukleotid primer ist, der im Wesentlichen komplementär zu der Nukleotidsequenz des verdrängten Strangs ist und ein Desoxyribonukleotid und ein Ribonukleotid enthält, wobei das Ribonukleotid an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des Primers für eine Spaltung mit einer Endonuklease liegt,
(e) ein Spalten des Primer-verlängerten Strangs einer doppelsträngigen Nukleinsäure, die in Schritt (d) erhalten wurde, mit der Endonuklease bei einer Stelle, die das Ribonukleotid enthält, und
(f) ein Verlängern einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Matrize ist, unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität ausgehend von dem 3'-Terminus des Primeranteils der doppelsträngigen Nukleinsäure, in der der primerverlängerte Strang in Schritt (e) gespalten wurde, um eine Strangverdrängung zu bewirken, wobei eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem regenerierten Primer-verlängerten Strang in Schritt (e) wieder verwendet wird.

Das Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts kann isotherm erfolgen. Die Nukleotidsequenz als Matrize kann eine DNA-Sequenz sein. Vor Schritt (a) kann ein Schritt eines Herstellens einer einzelsträngigen cDNA durch reverse Transkription unter Verwendung von reverser Transkriptase und einer RNA als Matrize enthalten sein. Die einzelsträngige cDNA kann als die Matrizen-Nukleotidsequenz verwendet werden. Sowohl eine einzelsträngige DNA, als auch eine doppelsträngige DNA kann vorzugsweise als die Matrizen-DNA in dem Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts verwendet werden. Falls eine doppelsträngige DNA als die Matrize verwendet wird, kann das Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts nach einem Vorbehandlungsschritt eines Denaturierens der doppelsträngigen DNA in einzelsträngige DNA erfolgen.
In dem vorstehend beschriebenen Verfahren erfolgt die Verlängerung ausgehend von dem Primer unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität. Eine DNA-Polymerase, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aus Escherichia coli, Bst-DNA-Polymerase ohne 5'→3'-Exonuklease aus Bacillus stearothermophilus und Bca-DNA-Polymerase ohne 5'→3'-Exonuklease aus Bacillus caldotenax kann vorzugsweise erfindungsgemäß verwendet werden. Des Weiteren wird vorzugsweise eine Endoribonuklease als die Endonuklease verwendet. Die Endoribonuklease, die verwendet werden kann, umfasst in nicht begrenzender Weise beispielsweise RNase H.
Der Primer, der in dem Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts verwendet wird, ist ein chimärer Oligonukleotidprimer. Beispielsweise kann ein chimäres Oligonukleotid mit einer Struktur verwendet werden, in der mindestens ein, vorzugsweise zwei oder mehr aufeinander folgende Ribonukleotidreste an den 3'-Terminus oder an die 3'-terminale Seite des Primers angebracht sind.
Die in dem Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts verwendete Matrize kann eine Nukleinsäure sein, die zuvor durch ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren amplifiziert wurde. Beispielsweise kann das TAS-Verfahren, das 3SR-Verfahren, das NASBA-Verfahren, das TMA-Verfahren, das Qβ-Replikaseverfahren, das PCR-Verfahren, das LCR-Verfahren und das SDA-Verfahren als das Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet werden, obwohl ein jegliches Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleinsäure in nicht begrenzender Weise verwendet werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Kombination mit diesen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet werden.
Ein zufälliger Primer oder ein degenerierter Primer kann in der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion verwendet werden. Beispielsweise wird in nicht begrenzender Weise ein Primer mit einer zufälligen Sequenz oder einer degenerierten Sequenz zumindest an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite vorzugsweise verwendet.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Amplifizieren einer Zielnukleinsäure durch das vorstehende Verfahren einer Amplifizierung einer Nukleotidsequenz des ersten erfindungsgemäßen Aspekts und sodann ein Nachweisen der Nukleinsäure umfasst. Die Verfahren zum Nachweisen umfassen ein Verfahren, bei dem die Zielnukleinsäure unter Verwendung einer Ribonukleotid (RNA)-Sonde nachgewiesen wird, die mit zwei oder mehreren fluoreszierenden Farbstoffen markiert ist, die bei einem Abstand positioniert sind, der zu einem Löschungszustand führt.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit mit einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität, einer Endonuklease und dem chimären Primer, der in dem Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure des zweiten erfindungsgemäßen Aspekts verwendet wird.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Materials mit einer immobilisierten Nukleinsäure, worin die Nukleinsäure in einem vordefinierten Bereich angeordnet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Anordnen und Immobilisieren der Nukleinsäure, die durch das Verfahren zum Amplifizieren einer Nukleotidsequenz des ersten erfindungsgemäßen Aspekts amplifiziert wurde, in einem vorbestimmten Bereich auf einem Substrat umfasst. Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem eine einzelsträngige Nukleinsäure, die im Wesentlichen frei von einem dazu komplementären Strang ist, amplifiziert wird und in dem vorbestimmten Bereich angeordnet und immobilisiert wird.
Erfindungsgemäß wird eine Nukleinsäure, die eine zu amplifizierende Sequenz enthält, zuvor durch eine Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion amplifiziert. Das Amplifikationsprodukt wird sodann als eine Nukleinsäurematrize in dem Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts verwendet. Beispielsweise können das TAS-Verfahren, das 3SR-Verfahren, das NASBA-Verfahren, das TMA-Verfahren, das Qβ-Replikase-Verfahren, das PCR-Verfahren, das LCR-Verfahren und das SDA-Verfahren als Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet werden, das erfindungsgemäß verwendet wird, obwohl jegliche Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure in nicht begrenzender Weise verwendet werden können.
Ein zufälliger Primer oder ein degenerierter Primer kann in der Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion verwendet werden. Beispielsweise wird vorzugsweise in nicht begrenzender Weise ein Primer mit einer zufälligen Sequenz oder einer degenerierten Sequenz zumindest an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite verwendet.
In einem fünften Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Amplifizieren einer Nukleotidsequenz gemäß dem Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts umfasst.
In einem sechsten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Mutation einer Zielnukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein Amplifizieren einer Nukleotidsequenz gemäß dem Verfahren des ersten erfindungsgemäßen Aspekts umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Flussdiagramm, das ein Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt, bei dem eine einzelsträngige DNA verwendet wird. In der Figur dient der freigesetzte DNA-Strang, der mit dem geschlossenen Kreis markiert ist, als Matrizen-DNA in (6).
2 zeigt die Ergebnisse einer Agarose-Gel-Elektrophorese von DNA-Fragmenten, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung verschiedener Reaktionszeiten amplifiziert wurden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie hierin verwendet, betrifft ein Desoxyribonukleotid (auch als dN bezeichnet) ein Nukleotid, bei dem der Zuckeranteil aus D-2-Desoxyribose besteht. Die Desoxyribonukleotide umfassen beispielsweise solche mit Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin als den Basenanteil.
Wie hierin verwendet, betrifft ein Ribonukleotid (auch als N bezeichnet) ein Nukleotid, bei dem der Zuckeranteil aus D-Ribose besteht. Die Ribonukleotide umfassen solche mit Adenin, Cytosin, Guanin oder Uracil als dem Rasenanteil. Die Ribonukleotide umfassen auch modifizierte Ribonukleotide wie ein modifiziertes Ribonukleotid, bei dem das Sauerstoffatom der Phosphatgruppe an der α-Position durch ein Schwefelatom ersetzt ist (auch als (α-S)-Ribonukleotid oder (α-S)-N bezeichnet), oder andere Derivate.
Wie hierin verwendet, betrifft ein chimärer Oligonukleotidprimer einen Primer, der ein Desoxyribonukleotid und ein Ribonukleotid enthält. Der Primer kann ein nichtmodifiziertes Desoxyribonukleotid und/oder ein modifiziertes Desoxyribonukleotid enthalten. Alternativ dazu kann er ein nichtmodifiziertes Ribonukleotid und/oder ein modifiziertes Ribonukleotid enthalten.
Die erfindungsgemäß verwendeten chimären Oligonukleotidprimer umfassen jegliche chimäre Oligonukleotidprimer, die ein Ribonukleotid an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des Primers aufweisen, die verwendet werden können, um einen Nukleinsäurestrang in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verlängern, die mit einer Endonuklease gespalten werden können und die verwendet werden können, um eine Strangverdrängungsreaktion zu bewirken.
Wie hierin verwendet, betrifft eine 3'-terminale Seite einen Teil von dem Zentrum bis zu dem 3'-Terminus einer Nukleinsäure wie eines Primers. Gleichsam betrifft die 5'-terminale Seite einen Teil von dem Zentrum bis zu dem 5'-Terminus einer Nukleinsäure.
Wie hierin verwendet, kann eine Endonuklease eine jegliche Endonuklease sein, die auf doppelsträngige DNA einwirkt, die durch Verlängerung einer DNA ausgehend von dem chimären Oligonukleotidprimer, der an eine Nukleinsäure als Matrize hybridisiert wurde, erstellt wurde, und die spezifisch die DNA in einem Teil des Primers spaltet, der ein Ribonukleotid enthält.
Wie hierin verwendet, betrifft eine DNA-Polymerase ein Enzym, das einen DNA-Strang de novo unter Verwendung eines DNA-Strangs als Matrize synthetisiert. DNA-Polymerasen umfassen in nicht begrenzender Weise pol-I-Typ-DNA-Polymerasen (wie Escherichia coli-DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment und Taq-DNA-Polymerase), α-Typ-DNA-Polymerasen (wie eine DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Stratagene), VENT-DNA-Polymerase (New England Biolabs), KOD-DNA-Polymerase (Toyobo) und DEEP VENT-DNA-Polymerase (New England Biolabs)) und Nicht-α-, Nicht-pol I-Typ-DNA-Polymerasen (wie eine in der WO 97/24444 beschriebene DNA-Polymerase). DNA-Polymerasen mit einer Strangverdrängungsaktivität umfassen DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien der Gattung Bacillus wie Bacillus caldotenax (hier nachstehend als B. ca bezeichnet) und Bacillus stearothermophilus (hier nachstehend als B. st bezeichnet), sowie Varianten dieser DNA-Polymerasen, deren 5'→3'-Exonukleaseaktivitäten fehlen. Des Weiteren umfassen die DNA-Polymerasen des Strangverdrängungstyps DNA-Polymerasen, die eine Strangverdrängungsaktivität aufweisen und keine 5'→3'-Exonukleaseaktivität aufweisen, wie Klenow-Fragment. Des Weiteren kann die DNA-Polymerase ein Gemisch aus mehreren DNA-Polymerasen sein wie in nicht begrenzender Weise ein Gemisch aus einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität und einer DNA-Polymerase, die keine Strangverdrängungsaktivität aufweist.
Wie hierin verwendet, betrifft „Strangverdrängungsaktivität" eine Aktivität, die eine Strangverdrängung bewirken kann, d.h. die eine DNA-Duplikation auf der Basis der Nukleotidsequenz als Matrize unterstützen kann, während sie den DNA-Strang ver drängt, um den komplementären Strang, der an den Matrizenstrang hybridisiert war, freizusetzen. Des Weiteren wird ein DNA-Strang, der aus einer Nukleotidsequenz als Matrize als Ergebnis einer Strangverdrängung freigesetzt wurde, als „verdrängter Strang" hierin bezeichnet.
Hier nachstehend wird die Erfindung detailliert beschrieben.
(1) Chimärer Oligonukleotidprimer, der erfindungsgemäß verwendet wird.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Primer ist ein chimärer Oligonukleotidprimer, der ein Desoxyribonukleotid und ein Ribonukleotid enthält. Solche Primer umfassen einen Oligoribonukleotidprimer, der ein nicht modifiziertes Ribonukleotid und/oder ein modifiziertes Ribonukleotid enthält.
Ein chimärer Oligonukleotidprimer, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann ein jeglicher chimärer Oligonukleotidprimer sein, der eine Nukleotidsequenz aufweist, die im Wesentlichen zu einem Teil der Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure als Matrize komplementär ist, der verwendet werden kann, um einen DNA-Strang ausgehend von seinem 3'-Terminus zu verlängern, und der eine Stelle an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite aufweist, an der eine Endonuklease während einer DNA-Synthesereaktion spaltet. Beispielsweise kann ein chimärer Oligonukleotidprimer mit einem Ribonukleotid an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite verwendet werden. Der Primer ist gewöhnlich derart, dass er zu einem Teil, der stromaufwärts zu der zu amplifizierenden Region liegt, d.h. einem Teil 3' zu der Nukleotidsequenz, die einer zu amplifizierenden Region in einer Nukleinsäure als Matrize entspricht, komplementär ist. Wie hierin verwendet, betrifft „im Wesentlichen komplementäre Nukleotidsequenz" eine Nukleotidsequenz, die mit einer DNA als Matrize unter den verwendeten Reaktionsbedingungen hybridisieren kann. Ein solcher chimärer Oligonukleotidprimer oder ein Oligonukleotidprimer kann durch den Fachmann in an sich bekannter Weise unter Bezugnahme beispielsweise auf Labo Manual PCR (Takara Shuzo, Seiten 13-16, 1996) entworfen werden. Eine käuflich verfügbare Software für ein Entwerfen von Primern wie OLIGO^TM-Primeranalyse-Software (Takara Shuzo) kann verwendet werden.
Der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete chimäre Oligonukleotidprimer kann ein oder mehrere modifizierte Ribonukleotide enthalten. Wie hierin verwendet, kann ein Ribonukleotid entweder ein nicht-modifiziertes Ribonukleotid oder ein modifiziertes Ribonukleotid sein, das an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite eines chimären Oligonukeotidprimers liegen kann, und das durch eine Endonuklease erkannt oder gespalten wird. Die Ribonukleotide umfassen sowohl nicht-modifizierte Ribonukleotide als auch modifizierte Ribonukleotide wie vorstehend beschrieben. Ein nichtmodifiziertes Ribonukleotid, ein modifiziertes Ribonukleotid oder eine Kombination davon kann für den chimären Oligonukleotidprimer erfindungsgemäß verwendet werden, sofern die Funktion des Primers nicht beeinträchtigt wird. Beispiele für die modifizierten Ribonukleotide umfassen in nicht begrenzender Weise (α-S)-Ribonukleotide, bei denen das an die Phosphatgruppe gebundene Sauerstoffatom durch ein Schwefelatom ersetzt ist, und Ribonukleotide, bei denen die Hydroxygruppe an der 2-Position der Ribose durch eine Methoxygruppe ersetzt ist. Solche chimären Oligonukleotidprimer mit einem modifizierten Ribonukleotid können beispielsweise durch Verwendung eines (α-S)-Ribonukleotidtriphosphats hergestellt werden, das gemäß einem Verfahren wie es in der US-PS 5,003,097 beschrieben ist, unter Verwendung eines Sulfurierungsreagenzes (Glen Research) oder eines 2-OMe-RNA-CE-Phosphoramiditreagenzes (Glen Research) hergestellt wird.
Ein chimärer Oligonukleotidprimer, der in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren verwendbar ist, kann derart sein, dass er ein modifiziertes Ribonukleotid enthält, das Widerstandsfähigkeit gegenüber einer Spaltung mit einer Endonuklease verleiht. Ein solcher Primer ist derart verwendbar, dass er die Steuerung der Spaltstelle mit einer Endonuklease während den Amplifikationsreaktionsschritten ermöglicht.
Ein oder zwei chimäre Oligonukleotidprimer können in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, abhängig von der gewünschten Form eines DNA-Fragments nach einer Amplifikation (einzelsträngig oder doppelsträngig). Insbesondere wird ein chimärer Oligonukleotidprimer verwendet, wenn eine einzelsträngige DNA erwünscht ist, während zwei Primer verwendet werden, wenn eine doppelsträngige DNA erwünscht ist.
Die Länge des chimären Oligonukleotidprimers, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist nicht spezifisch begrenzt, jedoch ist er vorzugsweise etwa 12 Nukleotide bis etwa 100 Nukleotide, mehr bevorzugt etwa 15 Nukleotide bis etwa 40 Nukleotide lang. Vorzugsweise ist die Nukleotidsequenz des chimären Oligonukleotids im Wesentlichen zu einer Nukleinsäure als Matrize komplementär, so dass es an die Nukleinsäure als Matrize unter den verwendeten Reaktionsbedingungen hybridisiert. Der Primer enthält an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite eine Sequenz, die durch eine Endonuklease, die in einem wie vorstehend beschriebenen Schritt verwendet wird, erkannt wird.
Beispielsweise kann ein Oligonukleotid mit einer Struktur, die durch die nachstehende allgemeine Formel dargestellt ist, in dem erfindungsgemäßen DNA-Syntheseverfahren als Primer verwendet werden, obwohl die Erfindung nicht darauf beschränkt werden soll:
Allgemeine Formel: 5'-dN_a-N_b-dN_c-3'

(a: ganze Zahl von 11 oder mehr; b: ganze Zahl von 1 oder mehr; c: 0 oder eine ganze Zahl von 1 oder mehr; dN: Desoxyribonukleotid; N: nicht-modifiziertes Ribonukleotid und/oder modifiziertes Ribonukleotid).

Beispielsweise wird vorzugsweise ein chimärer Oligonukleotidprimer erfindungsgemäß verwendet, der der allgemeinen Formel entspricht, worin a eine ganze Zahl von 11 oder mehr ist; b den Wert 1 und c den Wert 0 aufweist, b den Wert 2 und c den Wert 0 aufweist, b den Wert 3-5 und c den Wert 0 aufweist oder b den Wert 2 und c den Wert 0 bis 5 aufweist. Die Länge der Ribonukleotide an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des chimären Oligonukleotidprimers, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist vorzugsweise ein 1-mer bis 15-mer, mehr bevorzugt ein 1-mer bis 10-mer, am meisten bevorzugt ein 1-mer bis 5-mer. Der Wert von c in der allgemeinen Formel ist nicht spezifisch begrenzt und es kann ein jeglicher Wert, der in dein erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist, ausgewählt werden. Gewöhnlich ist ein Wert von 5 oder weniger bevorzugt. Bessere Ergebnisse werden in einer Reaktion dadurch erhalten, dass c 3 im Gegensatz zu 4, 2 im Gegensatz zu 3 und 1 im Gegensatz zu 2 beträgt. Insbesondere kann die wirksamste Reaktion in dem Fall erreicht werden, in dem c den Wert 0 aufweist.
Der erfindungsgemäß verwendete chimäre Oligonukleotidprimer weist eine Struktur auf, in der eine Endonuklease einen DNA-Strang, der ausgehend von dem Primer unter Verwendung einer DNA-Polymerase verlängert wurde (ein Primer-verlängerter Strang), an einer Stelle, die ein Ribonukleotid enthält, spaltet. Anders gesagt, ein Ribonukleotid liegt an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des chimären Oligonukleotidprimers für eine Spaltung mit einer Endonuklease. Zum Beispiel wird, wenn RNase H auf eine doppelsträngige DNA einwirkt, die durch Verlängerung einer DNA ausgehend von einem chimären Oligonukleotidprimer der allgemeinen Formel, der an eine Nukleinsäure als eine Matrize hybridisiert wurde, erzeugt wurde, der chimäre Oligonukleotidprimer an dem Ribonukleotidteil gespalten. Eine doppelsträngige DNA, in der ein Nick zwischen dem Oligonukleotidprimer und einem DNA-Strang, der durch die Verlängerung hergestellt wurde, eingebracht ist, wird sodann erzeugt. Sodann schreitet eine Strangverdrängungsreaktion mit einer DNA-Polymerase ausgehend von der Spaltstelle voran. Somit kann ein jeglicher chimärer Oligonukleotidprimer, der für eine Verlängerung eines Nukleinsäurestrangs ausgehend von dem 3'-Terminus des Primers verwendbar ist, der mit einer Endonuklease spaltbar ist, und mit dem eine DNA-Polymerase eine Strangverdrängungsreaktion bewirken kann, in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Der chimäre Oligonukleotidprimer kann eine jegliche Nukleotidsequenz aufweisen und kann beispielsweise mit Hilfe des 394-Typ-DNA-Synthesegeräts von Applied Biosystems Inc. (ABI) gemäß einem Phosphoramidit-Verfahren synthetisiert werden. Alternativ kann ein jegliches Verfahren, einschließlich eines Phosphattriester-Verfahrens, eines H-Phosphonat-Verfahrens und eines Thiophosphonat-Verfahrens, verwendet werden, um den chimären Oligonukleotidprimer zu synthetisieren.
(2) Erfindungsgemäß verwendete Endonuklease.
Erfindungsgemäß kann eine jegliche Endonuklease verwendet werden, die auf eine doppelsträngige DNA einwirkt, die durch DNA-Verlängerung ausgehend von dem chimären Oligonukleotidprimer wie vorstehend in (1) beschrieben, der an eine Nukleinsäure als Matrize hybridisiert wurde, erzeugt wurde, und den verlängerten Strang spaltet, um eine Strangverdrängungsreaktion zu bewirken. Das bedeutet, die Endonuklease ist ein Enzym, das einen Nick in dem Anteil des chimären Oligonukleotidprimers der doppelsträngigen DNA erzeugt. Beispiele für Endonukleasen, die erfindungsgemäß verwendbar sind, umfassen in nicht begrenzender Weise Ribonukleasen. Unter diesen wird vorzugsweise Endoribonuklease H (RNase H), die auf einen RNA-Anteil einer aus DNA und RNA bestehenden doppelsträngigen Nukleinsäure einwirkt, verwendet. Eine jegliche Ribonuklease, die die vorstehend beschriebenen Aktivitäten aufweist, kann erfindungsgemäß verwendet werden, einschließlich der mesophilen und hitzeresistenten Ribonukleasen. Beispielsweise kann RNase H aus E. coli für eine Reaktion bei etwa 50°C bis etwa 70°C in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, wie nachstehend in den Beispielen be schrieben. Eine käuflich verfügbare hitzeresistente Ribonuklease, Hybridase^TM-thermostabile RNase H (Epicenter Technologies), kann auch verwendet werden. Des Weiteren kann die Ribonuklease eine natürlich vorkommende Ribonuklease oder eine Variante sein. Die enzymatische Einheit von RNase H wie hierin angegeben ist ein Wert, der gemäß einem Verfahren zur Messung der enzymatischen Einheit wie in den Referenzbeispielen beschrieben ausgedrückt ist.
Die Wirksamkeit der Spaltungsreaktion mit einer Endonuklease wie RNase H, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann von der Nukleotidsequenz um den 3'-Terminus des Primers abhängen und die Amplifikationswirksamkeit der gewünschten DNA beeinflussen. Daher ist es selbstredend, den optimalen Primer für die verwendete RNase H zu entwerfen.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Einbringen eines Nicks" oder „Nicken" eine Spaltung im Inneren von einem der zwei Stränge einer doppelsträngigen Nukleinsäure. Beispielsweise wirkt RNase H auf eine doppelsträngige Hybrid-Nukleinsäure ein, die aus DNA und einer Ribonukleotid-enthaltenden DNA besteht, um selektiv den Ribonukleotid-enthaltenden Strang der beiden Stränge bei dem Ribonukleotidanteil zu spalten, wodurch ein Nick in die doppelsträngige Hybrid-Nukleinsäure eingebracht wird.
(3) Erfindungsgemäß verwendete DNA-Polymerase.
Erfindungsgemäß kann eine DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität bezüglich einer DNA verwendet werden. Insbesondere wird vorzugsweise eine DNA-Polymerase verwendet, der im Wesentlichen 5'→3'-Exonukleaseaktivität fehlt.
Wie hierin verwendet, betrifft „Strangverdrängungsaktivität" eine Aktivität, die eine Strangverdrängung bewirken kann, d.h. die eine DNA-Duplikation auf der Basis einer Nukleotidsequenz als Matrize unterstützen kann, während ein DNA-Strang verdrängt wird, um einen komplementären Strang freizusetzen, der an den Matrizenstrang hybridisiert war. Des Weiteren wird ein DNA-Strang, der aus einer Nukleotidsequenz als Matrize als Ergebnis einer Strangverdrängung freigesetzt wurde, als „verdrängter Strang" hierin bezeichnet.
Jegliche DNA-Polymerasen mit der Strangverdrängungsaktivität können erfindungsgemäß verwendet werden. Beispiele davon umfassen Varianten von DNA-Po lymerasen ohne ihre 5'→3'-Exonukleaseaktivitäten, die von thermophilen Bakterien der Gattung Bacillus wie Bacillus caldotenax (hier nachstehend als B. ca bezeichnet) und Bacillus stearothermophilus (hier nachstehend als B. st bezeichnet) abgeleitet sind, sowie das große Fragment (Klenow-Fragment) von DNA-Polymerase I aus Escherichia coli (E. coli). Sowohl mesophile als auch hitzeresistente DNA-Polymerasen können erfindungsgemäß verwendet werden.
B. ca ist ein thermophiles Bakterium mit einer optimalen Wachstumstemperatur bei etwa 70°C. Bca-DNA-Polymerase aus diesem Bakterium weist bekanntlich DNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität, RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität (reverse Transkriptionsaktivität), 5'→3'-Exonukleaseaktivität und 3'→5'-Exonukleaseaktivität auf.
Das Enzym kann entweder ein aus seiner ursprünglichen Quelle aufgereinigtes Enzym oder ein rekombinantes Protein, das unter Verwendung von Genmanipulationstechniken hergestellt wurde, sein. Das Enzym kann einer Modifikation wie Substitution, Deletion, Addition oder Insertion durch genetische Veränderungstechniken oder andere Mittel unterzogen werden. Beispiele für modifizierte Enzyme umfassen Bca BEST-DNA-Polymerase (Takara Shuzo), die Bca-DNA-Polymerase ohne ihre 5'–>3'-Exonukleaseaktivität ist.
(4) Zusammensetzung des erfindungsgemäß verwendeten Reaktionspuffers.
Ein Reaktionspuffer, der eine Pufferkomponente, ein Magnesiumsalz und dNTPs enthält, wird erfindungsgemäß verwendet. Beispiele für die Pufferkomponenten, die vorzugsweise verendet werden, umfassen in nicht begrenzender Weise Tricin, Tris-Hydrochlorid und Phosphate (wie Natriumphosphat und Kaliumphosphat). Unter diesen wird vorzugsweise ein Puffer, der Tricin oder ein Phosphat als Pufferkomponente enthält, erfindungsgemäß verwendet. Die Endkonzentration der Pufferkomponente beträgt 5 bis 100 mM, vorzugsweise 20 bis 50 mM. Der pH-Wert reicht von 6,0 bis 9,5, vorzugsweise 7,0 bis 9,2. Beispielsweise wird vorzugsweise ein Puffer mit 22-46 mM Tricin bei einem pH-Wert von 7,5 bis 9,2 oder ein Puffer mit 25-50 mM Kaliumphosphat bei einem pH-Wert von 7,0 bis 8,0 verwendet. Beispiele für Magnesiumsalze, die vorzugsweise verwendet werden, umfassen in nicht begrenzender Weise Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat oder Magnesiumsulfat. Die Endkonzentration des Magnesiumsalzes reicht von 1-20 mM, vorzugsweise 2-10 mM. Die Endkonzentration an dNTPs (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) in einem Gemisch als Substrate für eine DNA-Verlängerungsreaktion reichen von 0,1 bis 3,0 mM, vorzugsweise 0,2 bis 1,2 mM. Die Menge der in einem Reaktionsvolumen von 50 μl verwendeten Primer reicht von 1-1000 pmol, vorzugsweise 10-100 pmol. Des Weiteren kann das Reaktionsgemisch einen Zusatzstoff enthalten, um die Amplifikationsreaktion beispielsweise zu stabilisieren. BSA bei einer Endkonzentration von 0,1% oder weniger, Dimethylsulfoxid bei einer Endkonzentration von 10% oder weniger, Putrescindihydrochlorid bei einer Endkonzentration von 4 mM oder weniger, oder Propylendiamin bei einer Konzentration von 0,01% oder weniger kann zugegeben werden. Alternativ können NMP (1-Methyl-2-pyrrolidinon), Glycerin, Poly(ethylenglykol), Dimethylsulfoxid und/oder Formamid enthalten sein. Man erwartet, dass die Zugabe eines solchen organischen Lösungsmittels die nichtspezifische Hybridisierung von Oligonukleotidprimern verringert.
Die Menge an RNase H aus E. coli als ein Beispiel für eine Endonuklease in einem Reaktionsvolumen von 50 μl reicht von vorzugsweise 3-200 U, mehr bevorzugt 15-60 U. Die Menge an Bca BEST-DNA-Polymerase als ein Beispiel für eine DNA-Polymerase in einem Reaktionsvolumen von 50 μl reicht von vorzugsweise 0,5-100 U, mehr bevorzugt 1-22 U. Die bevorzugte Anzahl an Einheiten für die Endonuklease kann darunter abhängig von dem jeweiligen Typus unterschiedlich sein. In einem solchen Fall werden die Zusammensetzung des Puffers und die Menge des Enzyms, das zugegeben werden soll, angepasst, so dass die Menge an Amplifikationsprodukt maximal wird. In jedem Fall ist es selbstredend, die Zusammensetzung des Reaktionspuffers und dergleichen zu optimieren, abhängig von dem Typus des verwendeten Enzyms.
(5) Erfindungsgemäßes Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann durch Verwendung mindestens eines Oligonukleotidprimers wie vorstehend in (1) beschrieben, in Kombination mit der Endonuklease wie vorstehend in (2) beschrieben und der DNA-Polymerase wie vorstehend in (3) beschrieben, durchgeführt werden. dNTPs, die für ein PCR-Verfahren oder dergleichen verwendet werden (ein Gemisch aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP), werden vorzugsweise als die Nukleotidtriphosphatsubstrate in einer Verlängerungsreaktion in dem Verfahren verwendet. Die dNTPs können ein dNTP-Analogon wie 7-Deaza-dGTP enthalten, sofern dieses als Substrat für die verwendete DNA-Polymerase fungiert. Ein chimärer Oligonukleotidprimer wird in dem Verfahren verwendet. Der Primer kann beispielsweise durch Verwendung eines DNA-Synthesegerätes ge mäß einem herkömmlichen Syntheseverfahren hergestellt werden. Eine Kombination des chimären Oligonukleotidprimers und eines normalen Oligonukleotidprimers kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die Nukleinsäure (DNA oder RNA), die als Matrize in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, kann anhand einer jeglichen Probe, die eine Nukleinsäure enthalten kann, hergestellt oder isoliert werden. Beispiele für die Proben, die die Nukleinsäure enthalten können, umfassen in nicht begrenzender Weise Proben aus Organismen wie Gesamtblut, Serum, Buffy Coat, Urin, Fezes, Cerebrospinalflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Speichel, Gewebe (z.B. Krebsgewebe oder Lymphknoten) und Zellkultur (wie Säugerzellkultur oder Bakterienzellkultur), Proben, die eine Nukleinsäure enthalten, z.B. Viroide, Viren, Bakterien, Pilze, Hefen, Pflanzen und Tiere, Proben, die in Verdacht stehen, mit einem Mikroorganismus wie einem Virus oder einem Bakterium kontaminiert oder infiziert zu sein (z.B. Nahrungsmittel oder biologische Formulierungen), und Proben, die einen Organismus enthalten können, z.B. Bodenproben und Abwässer. Die Probe kann eine Zubereitung mit einer Nukleinsäure sein, die durch Prozessieren der Proben wie vorstehend beschrieben gemäß einem bekannten Verfahren erhalten wurde. Beispiele für die Zubereitungen, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen ein Zellzerstörungsprodukt oder eine Probe, die durch Fraktionieren des Produkts, der Nukleinsäure in der Probe oder spezifischer Nukleinsäuremoleküle erhalten wird, wie eine Probe, in der mRNAs angereichert sind. Des Weiteren kann eine Nukleinsäure wie DNA oder RNA, die durch Amplifikation einer Nukleinsäure, die in der Probe enthalten ist, durch ein bekanntes Verfahren erhalten wird, verwendet werden.
Die Zubereitung mit einer Nukleinsäure kann aus den vorstehend beschriebenen Materialien beispielsweise durch Verwendung von Lyse mit einem Detergenz, Sonifizieren, Schütteln/Rühren unter Verwendung von Glaskügelchen oder einer French-Presse in nicht begrenzender Weise hergestellt werden. In manchen Fällen ist es vorteilhaft, die Zubereitung weiter zu behandeln, um die Nukleinsäure aufzureinigen (beispielsweise in dem Fall, in dem eine endogene Nuklease zugegen ist). In solchen Fällen wird die Nukleinsäure in an sich bekannter Weise wie durch Phenolextraktion, Chromatographie, Innenaustausch, Gel-Elektrophorese oder Dichtegradientenzentrifugation aufgereinigt.
Wenn eine Amplifikation einer Nukleinsäure mit einer von einer RNA abgeleiteten Sequenz erwünscht ist, kann das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einer cDNA als Matrize erfolgen, die durch eine reversen Transkriptionsreaktion synthetisiert wurde, die die RNA als Matrize nutzt. Eine jegliche RNA, für die eine Herstellung eines Primers für eine reverse Transkriptionsreaktion möglich ist, kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren Anwendung finden, einschließlich RNA-Moleküle wie Gesamt-RNA, mRNA, tRNA und rRNA in einer Probe, sowie spezifische RNA-Spezies.
Ein jeglicher Primer, der an eine RNA als Matrize unter den verwendeten Reaktionsbedingungen hybridisiert, kann in der reversen Transkriptionsreaktion verwendet werden. Der Primer kann ein Primer mit einer Nukleotidsequenz, die zu einer spezifischen RNA als Matrize komplementär ist (ein spezifischer Primer), ein Oligo-dT (Desoxythymin)-Primer und ein Primer mit einer zufälligen Sequenz (ein zufälliger Primer) sein. Im Hinblick auf eine spezifische Hybridisierung beträgt die Länge des Primers für eine reverse Transkription vorzugsweise 6 Nukleotide oder mehr, mehr bevorzugt 9 Nukleotide oder mehr. In Hinblick auf eine Oligonukleotidsynthese beträgt die Länge vorzugsweise 100 Nukleotide oder weniger, mehr bevorzugt 30 Nukleotide oder weniger.
Des Weiteren kann ein chimärer Oligonukleotidprimer als ein Primer für eine reverse Transkription verwendet werden. Der chimäre Oligonukleotidprimer kann auch als ein Primer für eine Strangverdrängungsreaktion in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz verwendet werden, wobei eine cDNA, die nach reverser Transkription erhalten wird, als Matrize verwendet wird. Ein solcher Primer kann ein jeglicher Primer sein, der die vorstehend in (1) beschriebenen Eigenschaften aufweist und der in einer reversen Transkriptionsreaktion aus einer RNA verwendet werden kann.
Ein jegliches Enzym, das eine Aktivität zur Synthese von cDNA unter Verwendung von RNA als Matrize aufweist, kann in der reversen Transkriptionsreaktion verwendet werden. Beispiele davon umfassen reverse Transkriptasen, die von verschiedenen Quellen abstammen, wie von aviärem Myeloblastosevirus abgeleitete reverse Transkriptase (AMV RTase), von Molony murinem Leukämievirus abgeleitete reverse Transkriptase (MMLV RTase) und reverse Transkriptase von Rous-assoziiertem Virus 2 (RAV-2 RTase). Des Weiteren kann eine DNA-Polymerase verwendet werden, die auch eine reverse Transkriptionsaktivität aufweist. Ein Enzym mit einer reversen Transkriptionsaktivität bei hoher Temperatur wie DNA-Polymerase aus einem Bakterium der Gattung Thermus (wie Tth-DNA-Polymerase) und eine DNA-Polyme rase aus einem thermophilen Bakterium der Gattung Bacillus ist erfindungsgemäß bevorzugt. Beispielsweise sind DNA-Polymerasen aus thermophilen Bakterien der Gattung Bacillus wie DNA-Polymerase aus B. st (Bst-DNA-Polymerase) und DNA-Polymerase aus B. ca (Bca-DNA-Polymerase) bevorzugt, obwohl die Erfindung nicht darauf beschränkt werden soll. Beispielsweise benötigt Bca-DNA-Polymerase kein Mangan-Ion für die reverse Transkriptionsreaktion. Des Weiteren kann sie cDNA synthetisieren, während die Bildung einer Sekundärstruktur einer RNA als Matrize unter Hochtemperatur-Bedingungen unterdrückt wird. Sowohl die natürlich auftretende Form, als auch eine Variante des Enzyms mit reverser Transkriptase-Aktivität können verwendet werden, sofern sie die Aktivität aufweisen.
Bei der Amplifikation einer Nukleinsäure durch das erfindungsgemäße Verfahren kann eine interessierende Nukleinsäure wirksamer durch vorherige Amplifizierung der Nukleinsäure als Matrize amplifiziert werden. Beispielsweise wird, wenn eine Nukleotidsequenz, die in einer Spurenmenge einer genomischen DNA vorhanden ist, amplifiziert wird, ein DNA-Fragment mit der interessierenden Nukleotidsequenz zuerst durch ein geeignetes Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren amplifiziert. Das so erhaltene amplifizierte DNA-Fragment wird sodann als eine Matrize verwendet, um das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren durchzuführen. Der erste Amplifikationsschritt kann durch das erfindungsgemäße Verfahren erfolgen. Alternativ kann er durch ein bekanntes Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren wie das PCR-Verfahren erfolgen. Ferner kann eine spezifische Nukleotidsequenz an die 5'-terminale Seite des zu verwendenden Primers bei dem Amplifikationsschritt angefügt werden. Wenn ein Fragment, das unter Verwendung eines solchen Primers amplifiziert wurde, als Matrize verwendet wird, kann das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren dadurch erfolgen, dass ein chimärer Oligonukleotidprimer mit der spezifischen Nukleotidsequenz, die an den vorstehend beschriebenen Primer angefügt wurde, verwendet wird. Anders gesagt, es ist möglich, den Nukleinsäure-Amplifikationsschritt in dem erfindungsgemäßen Verfahren, in dem ein durch PCR amplifiziertes DNA-Fragment als Matrize verwendet wird, dadurch durchzuführen, dass ein gemeinsamer chimärer Oligonukleotidprimer ungeachtet der Nukleotidsequenz der zu amplifizierenden Region verwendet wird. Dies wird dadurch erreicht, dass das erfindungsgemäße Verfahren und die PCR, wobei ein Primer mit einer an die 5'-terminale Seite angefügten spezifischen Nukleotidsequenz verwendet wird, wie vorstehend beschrieben, kombiniert werden.
Gewöhnlich sollte man ein Paar von Primern erzeugen, das für eine interessierende Nukleotidsequenz spezifisch ist, um die Sequenz in dem ersten Nukleinsäure-Amplifikationsschritt spezifisch zu amplifizieren. Jedoch kann eine Nukleinsäure als Matrize ohne die Verwendung eines Primers, der für die interessierende Nukleotidsequenz spezifisch ist, dadurch amplifiziert werden, dass ein zufälliger Primer, der nichtspezifisch Nukleinsäurefragmente amplifiziert, oder ein Paar von Primern, das aus einem Satz an fertigen degenerierten Primern ausgewählt ist, verwendet wird. Die Anzahl an für die Amplifikation von mehreren Nukleinsäuren erforderlichen Primerpaaren als Matrizen kann verringert werden. Die Verringerung erfolgt durch Verwendung von beispielsweise dem PCR-Verfahren, das einen zufälligen Primer mit einer Tag-Sequenz verwendet (Nucleic Acids Research, 24(19):3778-3783 (1996)), oder dem degeneriertes Oligonukleotid-geprimten PCR-Verfahren (DOP-PCR; Genomics, 13:718-725 (1992)), bei dem ein degenerierter Primer mit einer Tag-Sequenz verwendet wird. Ein jeder solcher Primer weist eine zufällige Sequenz oder eine degenerierte Sequenz an dem 3'-Terminus auf. Wenn das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren unter Verwendung einer Nukleinsäure erfolgt, die mit einem Primer mit einer Tag-Sequenz als Matrize amplifiziert wurde, kann das erfindungsgemäße Verfahren durch Verwendung eines chimären Oligonukleotidprimers erfolgen. Ein solcher chimärer Oligonukleotidprimer weist eine Nukleotidsequenz auf, die mit der der Tag-Sequenz identisch ist. Durch Verwendung eines solchen Primers werden alle Nukleinsäuren, die unter Verwendung eines Primers mit der gleichen Tag-Sequenz amplifiziert wurden, als Matrizen verwendet. Somit kann eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen bei sehr geringen Kosten und in großen Mengen dadurch bereitgestellt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit einem Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, das einen zufälligen Primer oder einen degenerierten Primer verwendet, kombiniert wird.
Eine jegliche DNA-Polymerase, die einen DNA-Strang de novo unter Verwendung eines DNA-Strangs als Matrize synthetisiert, kann in dem Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet werden. Solche DNA-Polymerasen umfassen Pol I-Typ-DNA-Polymersen (wie E. coli-DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment und Taq-DNA-Polymerase), α-Typ-DNA-Polymerasen (wie eine DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, VENT-DNA-Polymerase, KOD-DNA-Polymerase und DEEP VENT-DNA-Polymerase) und nicht-α-, nicht-pol I-Typ-DNA-Polymerasen (wie eine DNA-Polymerase wie sie in der WO 97/24444 beschrieben ist). Des Weiteren wird vorzugsweise ein Gemisch aus mindestens zwei DNA-Polymerasen wie TaKaRa Ex-Taq-DNA-Polymerase (Takara Shuzo) oder KOD dash-DNA-Polymerase (Toyobo) verwendet. Ferner werden vorzugsweise DNA-Polymerasen wie DNA-Polymerase aus B. ca, DNA-Polymerase aus B. st, Varianten dieser DNA-Polymerasen ohne ihre 5'→3'-Exonukleaseaktivitäten, 9°N-DNA-Polymerase, Pfu(exo-)-DNA-Polymerase (Stratagene), Tth-DNA-Polymerase (Toyobo) und Tfl-DNA-Polymerase (Promega) verwendet.
Wenn ein lineares DNA-Fragment (wie ein PCR-amplifiziertes Fragment) in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren als Matrize verwendet wird, kann das Einbringen einer Sequenz, die als Spaceranteil bezeichnet wird, die Amplifikationswirksamkeit erhöhen. Der Spaceranteil liegt zwischen dem 3'-Terminus des linearen DNA-Fragments als Matrize und der Hybridisierungsstelle am 5'-Terminus des für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Primers. Es ist beispielsweise bevorzugt, den für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren verwendeten Primer derart zu entwerfen, dass die Länge des Spaceranteils in nicht begrenzender Weise 1 bis etwa 70 Basen, mehr bevorzugt etwa 5 bis etwa 60 Basen beträgt. Die bevorzugte Anzahl an Basen des Spaceranteils kann abhängig von der Sequenz des Primers für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren variieren. Der optimale Spaceranteil kann unter Bezugnahme auf die Offenbarung in den hier beschriebenen Beispielen bestimmt werden. Ein Fragment, das zuvor beispielsweise durch PCR amplifiziert wurde, so dass der Spaceranteil 3' an die Hybridisierungsregion des erfindungsgemäßen Amplifikationsprimers angefügt wird, kann als Matrize in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren verwendet werden. In einer Ausführungsform wird eine Nukleinsäure als Matrize zuvor durch Verwendung eines Primers amplifiziert. Ein solcher Primer weist in 5'→3'-Richtung eine Region des Spaceranteils, eine Region des erfindungsgemäßen Amplifikationsprimers und eine Region eines weiteren Primers für ein Amplifizieren einer Nukleinsäure auf. Das so amplifizierte Fragment kann sodann als eine Matrize in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren verwendet werden. Die Region eines weiteren Primers für eine Amplifikation einer Nukleinsäure kann eine jegliche Region eines Primers für ein Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren wie das PCR-Verfahren sein. Alternativ kann die Region eines weiteren Primers für eine Amplifikation einer Nukleinsäure eine Region eines anderen erfindungsgemäßen Amplifikationsprimers sein.
Doppelsträngige DNA wie isolierte genomische DNA oder ein PCR-Fragment und einzelsträngige DNA wie cDNA, die durch reverse Transkription aus Gesamt-RNA oder mRNA hergestellt wurde, können als Matrizen-DNA erfindungsgemäß verwendet werden. Die doppelsträngige DNA wird vorzugsweise nach Denaturierung in einzelsträngige DNA verwendet.
Der Denaturierungsschritt kann in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren entfallen, wenn eine lineare doppelsträngige DNA wie ein PCR-Amplifikationsprodukt als Matrize verwendet wird. Dies kann dadurch erfolgen, dass die Hybridisierungsstelle für den erfindungsgemäßen Primer etwa 50 Basen innerhalb, ausgehend von dem Terminus der DNA, liegt. Wenn eine Nukleinsäure mit einer Sequenz aus einer RNA amplifiziert werden soll, kann eine reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung von RNA als Matrize und eine DNA-Amplifikationsreaktion unter Verwendung von cDNA, die durch die reverse Transkriptionsreaktion erzeugt wurde, als Matrize mit einer DNA-Polymerase in dem erfindungsgemäßen DNA-Syntheseverfahren erfolgen. Eine solche DNA-Polymerase weist reverse Transkriptase-Aktivität und Strangverdrängungsaktivität auf.
Die geeignete Länge der Matrize ist derart, dass eine ausreichende Bindung der Primersequenz aufgrund eines Vorhandenseins der gesamten Zielsequenz oder von zumindest einem ausreichenden Teil der Zielsequenz in dem Fragment bereitgestellt wird.
Wenn eine DNA als Matrize doppelsträngige DNA ist, wird die DNA in einzelsträngige DNA denaturiert, um zu ermöglichen, dass ein Primer an den DNA-Strang als Matrize in dem erfindungsgemäßen Verfahren bindet. Ein Halten der doppelsträngigen DNA auf einer Temperatur, bei der sie denaturiert wird (z.B. etwa 95°C), ist für die Denaturierung bevorzugt. Andere Möglichkeiten umfassen die Verwendung eines erhöhten pH-Werts. In diesem Fall sollte der pH-Wert gesenkt werden, um zu ermöglichen, dass ein Oligonukleotidprimer an ein Ziel in einer Amplifikationsreaktion bindet. Eine Nukleotidsequenz wird sukzessiv unter isothermen Bedingungen nach Denaturierung einer doppelsträngigen DNA in einzelsträngige DNA oder, wenn eine RNA als Matrize verwendet wird, Herstellen einer cDNA (einer einzelsträngigen DNA) durch reverse Transkriptionsreaktion amplifiziert.
„Sukzessiv" bedeutet, dass eine Reaktion voranschreitet, ohne dass die Reaktionstemperatur oder die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches verändert wird. Wie hierin verwendet, betrifft „isotherm" Bedingungen mit einer im Wesentlichen konstanten Temperatur, bei der ein Enzym und ein Nukleinsäurestrang bei jedem Schritt eine Funktion aufweisen.
Ohne auf eine Theorie beschränkt werden zu wollen, wird angenommen, dass die nachstehenden Schritte sukzessiv und wiederholt in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz parallel (z.B. unter isothermen Bedingungen) voranschreiten:

[1] ein Schritt eines Hybridisierens einer DNA als Matrize an mindestens einen Oligonukleotidprimer;
[2] ein Schritt eines Bewirkens einer Verlängerungsreaktion einer DNA, die zu der DNA als Matrize komplementär ist, ausgehend von dem 3'-Terminus des Primers;
[3] ein Schritt eines Spaltens des DNA-Strangs, der in Schritt [2] verlängert wurde, mit einer Endonuklease;
[4] ein Schritt eines Bewirkens einer Verlängerungsreaktion einer DNA ausgehend von dem 3'-Terminus der in Schritt [3] gespaltenen Stelle, während der in Schritt [2] verlängerte DNA-Strang freigesetzt wird, ohne dass er von der DNA als Matrize abgebaut wird, und
[5] ein Schritt einer Wiederholung von Schritt [3] und Schritt [4] unter Verwendung eines in Schritt [4] erhaltenen doppelsträngigen Polynukleotids.

Die vorstehend beschriebene Reaktion kann bei normaler Temperatur (wie 37°C) unter Verwendung einer mesophilen DNA-Polymerase wie Klenow-Fragment erfolgen. Sie kann auch bei hoher Temperatur (wie 50°C oder höher oder 60°C oder höher) durch Verwendung hitzeresistenter Enzyme (einer Endonuklease und einer DNA-Polymerase) erfolgen. In diesem Fall wird eine nicht-spezifische Hybridisierung eines Primers unterdrückt, was zu einer Zunahme hinsichtlich der Spezifität einer DNA-Amplifikation führt. Des Weiteren wird das Problem eines Ausbildens von Sekundärstrukturen der DNA als Matrize gelöst, was zu einer Zunahme der Verlängerungsfähigkeit einer DNA-Polymerase führt. In einer Ausführungsform können eine reverse Transkriptionsreaktion und die Nukleotidsequenzamplifikation in dem Verfahren sukzessiv erfolgen. In diesem Fall kann eine DNA mit einer von einer RNA abgeleiteten Sequenz durch eine Kombination der Verwendung einer reversen Transkriptase mit der vorstehend beschriebenen Reaktion oder durch Verwendung einer DNA-Polymerase mit reverser Transkriptionsaktivität amplifiziert werden.
Wie hierin verwendet, betrifft „regenerierter Primer-verlängerter Strang" einen DNA-Strang, der zu einer Nukleotidsequenz als Matrize komplementär ist und ausgehend von einem Oligonukleotidprimer, der für eine Duplikation neu verwendet wird, als Ergebnis einer Strangverdrängung verlängert wird.
Wie hierin verwendet, bedeutet „erneute Verwendung", dass eine doppelsträngige DNA, die aus einer Nukleotidsequenz als Matrize und einem regenerierten Primer-verlängerten Strang besteht, erneut in einem Schritt einer Strangverdrängung verwendet wird.
In jedem der vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Aspekte wird ein chimärer Oligonukleotidprimer, der zu einer einzelsträngigen DNA als Matrize komplementär ist, zuerst an die DNA hybridisiert. Eine DNA, die zu der DNA als Matrize komplementär ist (ein Primer-verlängerter Strang), wird sodann gemäß der verbleibenden Sequenz der DNA als Matrize ausgehend von dem 3'-Terminus des Primers durch Einwirkung einer DNA-Polymerase verlängert, um doppelsträngige DNA zu synthetisieren. Eine Endonuklease wirkt auf die doppelsträngige DNA ein, um sie an einer Stelle auf der 3'-terminalen Seite des Ribonukleotidanteils in dem chimären Oligonukleotidprimer zu spalten. Die Endonuklease spaltet die DNA nicht an anderen Stellen. Somit wirkt die Endonuklease als Spaltenzym, das einen Nick in die doppelsträngige DNA einbringt. Die Endonuklease kann die Struktur der doppelsträngigen DNA, die aus dem chimären Oligonukleotidprimer und der DNA als Matrize besteht, verändern, obwohl die Erfindung nicht durch eine Theorie beschränkt ist. Eine DNA-Polymerase mit Strangverdrängungsaktivität verlängert erneut einen DNA-Strang ausgehend von dem 3'-Terminus des Nicks, der in die doppelsträngige DNA eingebracht wurde, um einen neuen Primer-verlängerten Strang zu erzeugen, während die DNA stromabwärts von dem 3'-Terminus des Nicks freigesetzt wird. Somit ersetzt der neue Primer-verlängerte Strang den zuvor synthetisierten Primer-verlängerten Strang.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleotidsequenz kann unter Verwendung von zwei Primern, d.h. einem chimären Oligonukleotidprimer, der zu einer Nukleinsäure als Matrize komplementär ist, und einem weiteren chimären Oligonukleotidprimer, der zu einem verdrängten Strang komplementär ist, erfolgen. In diesem Fall bindet ein Primer an einen DNA-Strang als Matrize, um eine Strangverdrängungsreaktion zu bewirken, während ein anderer Primer an einen verdrängten Strang bindet, der als ein Ergebnis der Strangverdrängungsreaktion freigesetzt wurde, um eine weitere Strangverdrängungsreaktion einzuleiten. Es ist klar, dass ein Reaktionsprodukt mit einem Primer als Matrize für einen anderen Primer fungieren kann, wenn dieser Aspekt verwendet wird. Somit erhöht sich die Menge an Amplifikationsprodukt in einer nicht-linearen Weise mit der Zunahme der Menge der Matrize.
Wenn das erfindungsgemäße Verfabren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz unter Verwendung einer doppelsträngigen DNA als Matrize erfolgt, werden ein chimärer Oligonukleotidprimer, 4-Desoxyribonukleotidtriphosphate (dNTPs), eine DNA-Polymerase und eine Endonuklease zu einem Reaktionsgemisch vor oder nach Denaturierung der doppelsträngigen DNA gegeben. Wenn eine Hitzebehandlung für eine Denaturierung der doppelsträngigen DNA verwendet wird und kein Hitzeresistentes Enzym verwendet wird, ist es bevorzugt, das Enzym nach der Denaturierung zuzugeben.
Wie vorstehend in (2) beschrieben, sollte eine in dem Verfahren verwendete Endonuklease ausgewählt werden, so dass sie einen Strang in einem Ribonukleotidanteil eines Primers spaltet. Vorzugsweise wird der Strang an einer Stelle gespalten, die 3' zu dem Ribonukleotid liegt. Man sollte eine DNA-Polymerase auswählen, die einen gespaltenen DNA-Strang bei einer vernünftigen Geschwindigkeit dissoziiert.
Die erfindungsgemäß verwendete DNA-Polymerase sollte einen verlängerten Strang ausgehend von der Spaltstelle stromabwärts synthetisieren, wobei ein zuvor verlängerter DNA-Strang verdrängt wird. Es ist wichtig, dass die DNA-Polymerase keine 5'→3'-Exonukleaseaktivität aufweist, die den verdrängten Strang abbauen kann. Beispielsweise sind Klenow-Fragment, eine Exonuklease-defiziente Variante von DNA-Polymerase I aus E. coli, ein ähnliches Fragment, das aus Bst-DNA-Polymerase abgeleitet ist (New England Biolabs), und Bca BEST-DNA-Polymerase aus B.ca (Takara Shuzo) als derartige DNA-Polymerase verwendbar. Sequenase 1.0 und Sequenase 2.0 (United States Biochemical), T5-DNA-Polymerase und φ29-DNA-Polymerase wie beschrieben in Gene, 97:13-19 (1991) können auch verwendet werden. Eine Polymerase, die normalerweise eine Exonuklease-Aktivität aufweist, kann in dem erfindungsgemäßen DNA-Syntheseverfahren verwendet werden, wenn eine Zugabe eines geeigneten Inhibitors die Aktivität hemmen kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz kann bei unterschiedlichen Temperaturen erfolgen oder es kann isotherm erfolgen. Ein Variieren der Temperaturen bedeutet, dass die Reaktionstemperaturen für die jeweiligen Schritte verändert werden, so dass die Veränderung nicht mit den Reaktionen in den Schritten interferiert. Insbesondere betreffen unterschiedliche Tempera turen eine Veränderung der Temperatur, so dass dies beispielsweise für eine Hybridisierung eines Primers, eine Synthesereaktion eines komplementären Strangs, eine Spaltung eines komplementären Strangs und eine Verdrängungsreaktion geeignet ist.
Auf der anderen Seite bedeutet isotherm, dass die Reaktionstemperatur für jeden Schritt unverändert ist und jeder Schritt bei einer im Wesentlichen konstanten Temperatur erfolgt. Es ist selbstverständlich, die Temperatur derart auszuwählen, dass die Reaktionsbedingungen in beiden Fällen optimiert werden.
Ein Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz ist, dass das Verfahren nicht die Hoch- und Runterregulierung der Temperatur während der Nukleinsäuresynthese erfordert. Somit wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur isothermen Synthese einer Nukleotidsequenz bereitgestellt. Viele herkömmliche Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren erfordern ein Hoch- und Runterregulieren der Temperatur, um ein Ziel von einem synthetisierten Strang zu dissoziieren. Diese Verfahren erfordern eine spezielle Reaktionsausrüstung wie eine Temperaturzyklusvorrichtung für diesen Zweck. Jedoch kann das erfindungsgemäße Verfahren lediglich unter Verwendung einer Ausrüstung erfolgen, die eine konstante Temperatur beibehalten kann.
Wie vorstehend beschrieben, kann das erfindungsgemäße Verfahren bei einer einzigen Temperatur erfolgen. Vorzugsweise erfolgt es durch Auswahl der Reaktionstemperatur und des Stringenzgrades, so dass eine nichtspezifische Hybridisierung eines Primers verringert wird und der Primer spezifisch an eine Nukleotidsequenz als Matrize hybridisiert. Obwohl nicht beabsichtigt ist, die Erfindung darauf zu beschränken, kann das erfindungsgemäße Verfahren unter Hochtemperaturbedingungen durch Verwendung eines Hitze-resistenten Enzyms wie vorstehend beschrieben erfolgen. Des Weiteren ist es bevorzugt, das erfindungsgemäße Verfahren bei einer geeigneten Temperatur für ein ausreichendes Beibehalten der Aktivität des verwendeten Enzyms durchzuführen, um die Reaktionswirksamkeit bei einem hohen Grad zu halten. Somit beträgt die Reaktionstemperatur vorzugsweise etwa 20°C bis etwa 80°C, mehr bevorzugt etwa 30°C bis etwa 75°C, am meisten bevorzugt etwa 50°C bis etwa 70°C, obwohl sie abhängig von dem verwendeten Enzym unterschiedlich ist. Insbesondere, wenn die Reaktion unter Hochtemperaturbedingungen erfolgt, ist es bevorzugt, einen längeren Primer als bei einer Reaktion bei normaler Temperatur zu verwenden. Die Sequenz und die Länge des für die Reak tionstemperatur geeigneten Primers kann beispielsweise unter Bezugnahme auf dessen Tm-Wert bestimmt werden. Alternativ kann eine käuflich verfügbare Software für ein Entwerfen eines Primers wie OLIGO^TM-Primeranalysesoftware (Takara Shuzo) verwendet werden. Beispielsweise kann, wenn eine Reaktionstemperatur von 55°C bis 60°C oder 65°C verwendet wird, der für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Primer beispielsweise in nicht begrenzender Weise 12-100 Nukleotide, vorzugsweise 14-50 Nukleotide, mehr bevorzugt 15-40 Nukleotide lang sein. Ein Beispiel für Wirkungen, die durch die erhöhte Reaktionstemperatur erreicht werden, ist die Lösung des Problems einer Ausbildung von Sekundärstrukturen einer DNA als Matrize. Die erhöhte Reaktionstemperatur ermöglicht eine Amplifikation einer gewünschten Nukleinsäure, selbst wenn eine Nukleinsäure mit einem hohen GC-Gehalt als Matrize verwendet wird. Ferner ist sie ähnlich wirksam bei der Amplifikation eines Bereichs einer langen Kettenlange. Eine solche Wirkung wird in einem Bereich von etwa 100 bp bis etwa 20 kbp, insbesondere zwischen etwa 200 bp und etwa 4,3 kbp, insbesondere etwa 250 bp und etwa 1500 bp festgestellt.
Durch Verwendung einer DNA-Polymerase mit reverser Transkriptase-Aktivität (wie Bca BEST-DNA-Polymerase) in dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Amplifikation einer Nukleotidsequenz aus einer RNA, die einen Schritt eines Herstellens einer cDNA aus RNA (eine reverse Transkriptionsreaktion) umfasst, leicht durchführbar. Alternativ kann ein Produkt, das durch unabhängiges Durchführen eines Schritts eines Herstellens einer cDNA aus RNA, d.h. einer cDNA, in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Matrizen-DNA verwendet werden.
In jedem Fall wird die Reaktion in dem erfindungsgemäßen Verfahren wiederholt, bis sie durch geeignete Mittel wie Inaktivierung des Enzyms oder Absenken der Reaktionstemperatur beendet wird, oder bis die Reaktion einen Mangel an einem der Reagenzien aufweist.
1 zeigt eine Ausführungsform, bei der eine einzelsträngige DNA als Matrize und zwei Primer verwendet werden. Die jeweiligen Schritte, die sukzessiv in paralleler Weise erfolgen, sind nachstehend beschrieben:

(1) ein Schritt eines Hybridisierens einer einzelsträngigen DNA als Matrize an einen chimären Oligonukleotidprimer;
(2) ein Schritt eines Bewirkens einer DNA-Verlängerungsreaktion ausgehend von dem 3'-Terminus des Primers, um einen Primer-verlängerten Strang auszubilden;
(3) ein Schritt eines Spaltens an einer Stelle, die ein Ribonukleotid enthält, in dem Primer mit einer Endonuklease;
(4) ein Schritt eines Bewirkens einer Strangverdrängung unter Verwendung einer DNA-Polymerase ausgehend von der Spaltstelle in Schritt (3);
(5) ein Schritt eines erneuten Verwendens einer doppelsträngigen DNA, die aus einer in Schritt (4) erhaltenen Matrize und einem regenerierten Primer-verlängerten Strang besteht, in Schritt (3), während ein freigesetzter verdrängter Strang in einer Reaktion von Schritt (6) und den nachfolgenden Schritten verwendet wird;
(6) ein Schritt eines Hybridisierens eines Oligonukleotidprimers, der von dem in Schritt (1) unterschiedlich ist, an den freigesetzten verdrängten Strang in Schritt (5) als Matrize;
(7) ein Schritt eines Bewirkens einer DNA-Verlängerungsreaktion ausgehend von dem 3'-Terminus des Primers, um einen Primer-verlängerten Strang auszubilden;
(8) ein Schritt eines Spaltens an einer Stelle, die ein Ribonukleotid enthält, in dem Primer mit einer Endonuklease;
(9) ein Schritt eines Bewirkens einer Strangverdrängung unter Verwendung einer DNA-Polymerase ausgehend von der Spaltstelle in Schritt (8) und
(10) ein Schritt einer erneuten Verwendung einer in Schritt (9) erhaltenen Matrize und eines regenerierten Primer-verlängerten Strangs in Schritt (8).

Wenn doppelsträngige DNA als Matrize verwendet wird, dient eine jede einzelsträngige DNA, die nach Denaturierung der doppelsträngigen DNA erhalten wird, als Matrize in Schritt (1). Daher ist die Menge an Amplifikationsprodukt größer als diejenige, die mit einer einzelsträngigen DNA als Matrize erhalten wird. Des Weiteren kann ein Nachweis des Amplifikationsprodukts in einer kürzeren Zeitspanne im Vergleich zu der erfolgen, die erforderlich ist, wenn eine einzelsträngige DNA als Matrize verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz kann für verschiedene experimentelle Vorgänge verwendet werden, die eine Amplifikation einer Nukleotidsequenz verwenden, einschließlich Nachweis, Markierung und Sequenzierung einer Nukleinsäure.
Des Weiteren kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz für ein in situ-Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleinsäure auf einem festen Substrat wie einem DNA-Chip oder ein Multiplex-Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren, bei dem mehrere Regionen gleichzeitig amplifiziert werden, verwendet werden.
Eines der Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz ist dessen Fähigkeit, einzelsträngige DNA bereitzustellen. Ein oder zwei chimäre Oligonukleotidprimer können in dem Verfahren für diesen Zweck verwendet werden. Beispielsweise kann, wenn zwei Oligonukleotidprimer verwendet werden, das erfindungsgemäße Verfahren dadurch durchgeführt werden, dass ein Primerverhältnis verwendet wird, wie es für das so genannte asymmetrische PCR-Verfahren verwendet wird, bei dem eine Amplifikationsreaktion unter Verwendung einer Überschussmenge an einem Oligonukleotidprimer im Verhältnis zu dem anderen erfolgt. Als ein Ergebnis liegt die Menge des Ersatzprodukts von einem Strang in einem Überschuss zum Verhältnis zu dem des anderen vor.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz kann eine einzelsträngige DNA, die im Wesentlichen frei von einem dazu komplementären Strang ist, hergestellt werden. Beispielsweise kann eine einzelsträngige DNA zur Herstellung eines Materials mit einer immobilisierten Nukleinsäure wie ein DNA-Chip, eine einzelsträngige DNA-Sonde zum Nachweis einer Zielnukleinsäure oder ein Megaprimer für das Langketten-PCR-Verfahren leicht in einer kurzen Zeitspanne hergestellt werden. Nur eine Sense-Sequenz oder eine Antisensesequenz kann selektiv durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens amplifiziert werden. Somit ist die Erfindung als ein Verfahren für die Herstellung einer Nukleinsäure mit einer Sense-Sequenz oder einer Antisense-Sequenz einsetzbar.
Des Weiteren erfordert das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz keine Verwendung einer Reaktionsausrüstung, die die Temperatur mit der Zeit anpassen kann. Daher kann eine Amplifikationsreaktion in einem großen Volumen an Reaktionsgemisch durchgeführt werden. Eine Nukleinsäure (z.B. für eine medizinische Verwendung) kann deshalb in großen Mengen industriell hergestellt werden.
Die Verwendungswirksamkeit des in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz verwendeten Primers beträgt etwa 100%, was 5- bis 10-mal höher sein kann als die bei einem herkömmlichen Verfahren wie dem PCR-Verfahren.
(6) Kit für das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz.
Erfindungsgemäß wird ein Kit bereitgestellt, der für das Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz des ersten bis sechsten Aspekts wie vorstehend beschrieben verwendet wird. In einer Ausführungsform liegt der Kit in einer verpackten Form vor und enthält Anweisungen hinsichtlich der Verwendung einer DNA-Polymerase und einer Endonuklease in einer Strangverdrängungsreaktion. Ebenfalls wird ein Kit, der eine DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität, eine Endonuklease und einen Puffer für eine Strangverdrängungsreaktion enthält, vorzugsweise für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet. Alternativ kann eine käuflich verfügbare DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität und/oder eine Endonuklease gemäß den Anweisungen ausgewählt und verwendet werden. Des Weiteren kann der Kit ein Reagenz für eine reverse Transkriptionsreaktion enthalten, das verwendet wird, wenn eine RNA als eine Matrize verwendet wird. Die DNA-Polymerase kann aus den erfindungsgemäß zu verwendenden DNA-Polymerasen wie vorstehend in (3) beschrieben ausgewählt werden. Die Endonuklease kann aus den Endonukleasen wie vorstehend in (2) beschrieben ausgewählt werden. Ein Puffer mit der Reaktionspufferzusammensetzung wie vorstehend in (4) beschrieben wird vorzugsweise als der Puffer für die Strangverdrängungsreaktion verwendet.
„Anweisungen" ist etwas Gedrucktes, das ein Verfahren zur Verwendung des Kits wie ein Verfahren zur Herstellung einer Reagenzlösung für eine Strangverdrängungsreaktion, empfohlene Reaktionsbedingungen und dergleichen beschreibt. Die Anweisungen umfassen ein Anleitungshandbuch in Form einer Broschüre oder eines Handzettels, eine Aufschrift auf dem Kit und eine Beschreibung auf der Oberfläche der Verpackung, die den Kit enthält. Die Anweisungen umfassen auch Infor mation, die mittels elektronischer Medien wie Internet beschrieben oder bereitgestellt wird.
(7) Erfindungsgemäßes Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz und Kit für das Verfahren.
Eine Zielnukleinsäure in einer Probe kann durch Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz nachgewiesen werden. Das Nachweisverfahren umfasst:

(a) eine Amplifikation einer Zielnukleinsäure durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz wie vorstehend beschrieben und
(b) ein Nachweis der Zielnukleinsäure, die in dem vorstehenden Schritt amplifiziert wurde.

Das Verfahren kann für einen Nachweis oder eine Quantifizierung eines spezifischen Gens in einer Probe eingesetzt werden. Anders gesagt, ein spezifisches Gen kann in allen Proben, die in Verdacht stehen, eine Nukleinsäure wie DNA oder RNA zu enthalten, nachgewiesen oder quantifiziert werden. Beispiele für die Proben, in denen ein spezifisches Gen nachgewiesen oder quantifiziert werden kann, umfassen in nicht begrenzender Weise Proben aus Organismen wie Gesamtblut, Serum, Buffy Coat, Urin, Fezes, Cerebrospinalflüssigkeit, Samenflüssigkeit, Speichel, Gewebe (wie Krebsgewebe oder Lymphknoten) und Zellkultur (wie Säugerzellkultur oder Bakterienzellkultur), Proben, die eine Nukleinsäure enthalten, wie Viroide, Viren, Bakterien, Pilze, Hefen, Pflanzen und Tiere, Proben, die in Verdacht stehen, mit einem Mikroorganismus wie einem Virus oder Bakterium kontaminiert oder infiziert zu sein (wie Nahrungsmittel oder biologische Formulierungen), und Proben, die einen Organismus enthalten können wie Bodenproben und Abwasser. Beispielsweise können ein Viroid, ein Virus, ein Pilz, ein Bakterium oder andere Mikroorganismen in einer Probe auf der Basis des Vorhandenseins oder der Menge eines spezifischen Gens, das von dem Viroid, dem Virus, dem Pilz, dem Bakterium oder den anderen Mikroorganismen abgeleitet ist, als Ziel nachgewiesen oder quantifiziert werden. Ferner kann das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden, um den Genotyp eines Organismus zu unterscheiden oder die Expressionsmenge eines Gens zu bestimmen. Sowohl RNA als auch DNA können als die Nukleinsäurematrize in dem Nachweisverfahren verwendet werden.
Bekannte Verfahren zum Nachweis einer Nukleinsäure können für Schritt (b) verwendet werden. Beispiele für solche Verfahren umfassen einen Nachweis eines Reaktionsprodukts mit einer spezifischen Größe durch Elektrophorese und einen Nachweis durch Hybridisierung mit einer Sonde. Eine fluoreszierende Substanz wie Ethidiumbromid wird in dem Nachweis durch Elektrophorese verwendet. Die Hybridisierung mit einer Sonde kann mit dem Nachweis durch Elektrophorese kombiniert werden. Die Sonde kann mit einem Radioisotop oder mit einer nicht-radioaktiven Substanz wie Biotin oder einer fluoreszierenden Substanz markiert werden. Weiterhin kann die Verwendung eines markierten Nukleotids in Schritt (a) den Nachweis eines Amplifikationsprodukts erleichtern. Ein Fluoreszenzpolarisationsverfahren, eine Fluoreszenzenergietransition oder dergleichen können auch für den Nachweis eingesetzt werden. Die Zielnukleinsäure kann automatisch nachgewiesen werden oder kann durch Erstellen eines geeigneten Nachweissystems quantifiziert werden.
Eine Ribonukleotid (RNA)-Sonde, die mit zwei oder mehreren fluoreszierenden Substanzen markiert ist, die in einem Abstand zueinander liegen, so dass ein Löschungszustand erreicht wird, kann in dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwendet werden. Die Sonde sendet keine Fluoreszenz aus. Wenn sie an eine DNA hybridisiert, die anhand einer Zielnukleinsäure amplifiziert wurde, die zu der Sonde komplementär ist, spaltet RNase H die Sonde. Der Abstand zwischen den fluoreszierenden Substanzen auf der Sonde nimmt sodann zu, was zu der Aussendung von Fluoreszenz führt. Somit deckt das Aussenden das Vorhandensein der Zielnukleinsäure auf. Wenn RNase H in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz verwendet wird, kann eine Zielnukleinsäure lediglich durch Zugabe einer Sonde zu dem Reaktionsgemisch nachgewiesen werden. Beispielsweise wird eine Kombination aus fluoreszierenden Substanzen, 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) und N,N,N',N'-Tetramethyl-6-carboxyrhodamin (TAMRA), vorzugsweise für ein Markieren der Sonde verwendet.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz unter isothermen Bedingungen erfordert nicht die Verwendung einer Ausrüstung wie einer Thermozykusvorrichtung. Die Anzahl an Primern, die in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren verwendet werden, kann 1 oder 2 betragen, was weniger als die in einem herkömmlichen Verfahren verwendete Anzahl darstellt. Da Reagenzien wie dNTPs, die für PCR und dergleichen verwendet werden, in dem erfin dungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, können die laufenden Kosten im Vergleich zu einem herkömmlichen Verfahren gesenkt werden. Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren in Gebieten wie genetischen Tests erfolgen, in denen der Nachweis routinemäßig durchgeführt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt eine größere Menge eines Amplifikationsprodukts in einer kürzeren Zeitspanne als das PCR-Verfahren bereit. Daher kann das erfindungsgemäße Verfahren als ein einfaches, schnelles und sensitives Verfahren für den Nachweis eines Gens eingesetzt werden.
Die Erfindung stellt ferner einen Kit bereit, der für das Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäure verwendet wird. Der Kit für das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz wie vorstehend beschrieben kann als dieser Kit verwendet werden. Der Kit kann ferner einen chimären Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation der Zielnukleinsäure und ein Reagenz für einen Nachweis der amplifizierten Zielnukleinsäure wie eine Sonde enthalten.
(8) Erfindungsgemäßes Material mit einer immobilisierten Nukleinsäure, die in einem vorbestimmten Bereich angeordnet ist, und Verfahren zur Herstellung desselben.
Ein DNA-Chip (auch als DNA-Mikroarray oder DNA-Array bezeichnet) ist ein Material mit einer immobilisierten Nukleinsäure, worin verschiedene Fragmente von Genen oder DNA in einem vorbestimmten Bereich oder an einer vorbestimmten Position auf einem festen Substrat wie einem Glasobjektträger angeordnet und immobilisiert sind. Der DNA-Chip wird für eine Untersuchung des Vorliegens einer Nukleinsäure in einer Nukleinsäureprobe, die eine Sequenz aufweist, die zu einer angeordneten und immobilisierten DNA in einem vorbestimmten Bereich auf dem DNA-Chip komplementär ist, verwendet. Die Untersuchung erfolgt durch In-Kontakt-Bringen des DNA-Chips mit der Nukleinsäureprobe, die anhand einer Probe hergestellt wurde, vorzugsweise einer markierten Nukleinsäureprobe, für eine Hybridisierung. Da der DNA-Chip verwendet werden kann, um eine Reihe von Nukleinsäuren in einer Probe in einem Vorgang nachzuweisen oder zu quantifizieren, ist er ein sehr hilfreiches Mittel, das die Analyse einer Genexpression oder die Analyse einer Mutation oder eines Polymorphismus drastisch beschleunigt. Ein DNA-Chip, bei dem eine doppelsträngige Nukleinsäure in einem vorbestimmten Bereich angeordnet und immobilisiert ist, wird für eine Hybridisierung verwendet, nachdem er einer angemessenen Denaturierung unterzogen wurde. Ein DNA-Chip, bei dem eine ein zelsträngige DNA, die zu einer nachzuweisenden Zielnukleinsäure komplementär ist, in einem vorbestimmten Bereich angeordnet und immobilisiert ist, ist besonders für den Nachweis einer Zielnukleinsäure bevorzugt.
Wie vorstehend beschrieben kann eine gewünschte DNA in einzelsträngiger Form durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifiziert werden. Obwohl ein jegliches Verfahren zur Aufreinigung eines Amplifikationsprodukts verwendet werden kann, ist eine Aufreinigung unter Verwendung von Isopropanolausfällung bevorzugt. Die so erhaltene DNA, vorzugsweise einzelsträngige DNA, die im Wesentlichen frei von einem dazu komplementären Strang ist, wird vorzugsweise als DNA-Fragment verwendet, das auf einen DNA-Chip immobilisiert werden soll. Somit wird das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise als ein Verfahren zur Herstellung einer DNA verwendet, die in einem vorbestimmten Bereich für die Herstellung eines DNA-Chips angeordnet und immobilisiert werden soll. Ein jegliches unlösliches Substrat kann als Substrat verwendet werden, auf das die so erhaltene DNA in einem vorbestimmten Bereich angeordnet und immobilisiert wird, jedoch wird ein plattenförmiges Substrat aus Glas oder Plastik und ein Membran-förmiges Substrat aus Nitrocellulose oder Nylon vorzugsweise verwendet. Ein bekanntes Verfahren zur Immobilisierung einer Nukleinsäure kann für die Immobilisierung verwendet werden. Die DNA kann als solches auf ein Substrat immobilisiert werden. Alternativ kann die DNA über einen geeigneten Linker oder nach Ligation mehrerer DNA-Moleküle immobilisiert werden.
Eine Zielnukleinsäure, die mit einer Nukleinsäure auf einem Material mit einer immobilisierten Nukleinsäure hybridisiert, worin eine durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierte DNA in einem vorbestimmten Bereich angeordnet und immobilisiert ist (z.B. ein DNA-Chip), kann nachgewiesen oder quantifiziert werden. Ein solcher Nachweis oder eine solche Quantifizierung kann durch In-Kontakt-Bringen des Materials mit einer Nukleinsäureprobe, die aus einer Probe hergestellt wurde, die in Verdacht steht, die Zielnukleinsäure zu enthalten, für eine Hybridisierung erfolgen. Darunter ermöglicht ein DNA-Chip, bei dem eine durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifizierte einzelsträngige DNA in einem vorbestimmten Bereich angeordnet und immobilisiert ist, den Nachweis einer Zielnukleinsäure bei einfacherer Handhabung, höherer Empfindlichkeit und höherer Reproduzierbarkeit im Vergleich zu einem herkömmlichen Material.
(9) Erfindungsgemäßes Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure in großen Mengen.
Wie vorstehend beschrieben, wird gemäß einem erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz, das unter isothermen Bedingungen erfolgen kann, bereitgestellt. Eine gewünschte Nukleinsäure kann in dem Verfahren durch Mischen einer Nukleinsäure als Matrize für die zu amplifizierende Nukleinsäure und verschiedenen Bestandteilen, die für eine Reaktion erforderlich sind, und Umsetzen des Gemisches unter isothermen Bedingungen hergestellt werden. Da das PCR-Verfahren eine Veränderung der Temperatur des Reaktionsgemisches über die Zeit erfordert, ist das Reaktionsvolumen auf ein Volumen begrenzt, bei dem die Temperatur gesteuert werden kann (gewöhnlich 200 μl oder weniger). Daher ist es schwierig, das Volumen maßstäblich zu vergrößern. Auf der anderen Seite gibt es keine derartige Begrenzung in dem erfindungsgemäßen Verfahren. Eine große Menge an Nukleinsäure kann durch Erhöhung des Volumens des Reaktionsgemisches hergestellt werden. In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird eine Reihe von Molekülen des komplementären Strangs ausgehend von einem Matrizenmolekül synthetisiert. Ferner können Nukleinsäuren unter Verwendung dieser Moleküle des komplementären Strangs als Matrizen synthetisiert werden. Somit kann eine gewünschte Nukleinsäure wirksam in großen Mengen dadurch hergestellt werden, dass die Matrize und der Primer in geeigneter Weise ausgewählt werden. Des Weiteren macht die Tatsache, dass das erfindungsgemäße Verfahren im Gegensatz zu dem PCR-Verfahren keine spezielle Ausrüstung oder komplizierte Temperaturveränderung erfordert, dieses in Hinblick auf Ausrüstungs- und Energiekosten vorteilhaft. Daher ist das Verfahren ein exzellentes industrielles Verfahren für die Herstellung einer Nukleinsäure in großen Mengen.
Des Weiteren ist das erfindungsgemäße Verfahren als ein Verfahren zur Bereitstellung einer Vielzahl von DNA-Fragmenten in großen Mengen, z.B. derjenigen, die auf dem DNA-Chip immobilisiert werden sollen, verwendbar. Insbesondere können DNA-Fragmente in großen Mengen durch einfache Reaktionsschritte in einer Ausführungsform erhalten werden. In einer weiteren Ausführungsform kann eine begrenzte Anzahl an Primern verwendet werden, um eine Vielzahl von DNA-Fragmenten zu erhalten. Ein Schritt einer vorherigen Amplifizierung der Nukleinsäure, die als Matrize in dem erfindungsgemäßen Verfahren dient, durch ein bekanntes Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren wie das PCR-Verfahren kann in die letztere Ausführungsform eingebaut werden. Alle Arten von Nukleinsäuren als Matrizen können unter Verwendung einer begrenzten Anzahl an Primern beispielsweise basierend auf dem Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleinsäure unter Verwendung eines zufälligen Primers mit einer Tag-Sequenz (Nucleic Acids Research, 24(19):3778-3783 (1996)) oder der degeneriertes Oligonukleotid-geprimten PCR (DOP-PCR; Genomics, 13:718-725 (1992)), bei der ein degenerierter Primer verwendet wird, amplifiziert werden. Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren kann unter Verwendung eines oder mehrerer Primer für alle Nukleinsäuren als Matrizen, die in dem vorstehend beschriebenen Schritt erzeugt wurden, erfolgen. Dies kann durch Entwerfen des in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren verwendeten Primers derart erfolgen, dass dieser der Tag-Sequenz entspricht, die an den zufälligen oder degenerierten Primer angefügt wurde. Somit kann eine Kombination eines geeigneten Schritts zur Herstellung einer Nukleinsäure als Matrize und des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Vielzahl von DNA-Fragmenten in größeren Mengen und bei geringeren Kosten im Vergleich zu einem herkömmlichen Verfahren bereitstellen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure enthält, kann eine doppelsträngige DNA für eine Expression eines nützlichen Polypeptids in einer Zelle oder eine einzelsträngige Antisense-DNA für eine Suppression der Expression eines interessierenden Gens enthalten. Eine solche Nukleinsäure wird an einen Organismus unter Verwendung geeigneter Mittel wie eines Trägers für einen Gentransfer wie Liposomen verabreicht. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure ist für eine Herstellung einer einzelsträngigen oder doppelsträngigen Nukleinsäure für eine medizinische Verwendung in großen Mengen bevorzugt. Des Weiteren kann eine Nukleinsäure, die ein dNTP-Analogon enthält, das beispielsweise den Abbau der Nukleinsäure in vivo unterdrückt, einfach durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellt werden.
Da das erfindungsgemäß amplifizierte DNA-Fragment aus normalen Nukleotiden besteht, kann die amplifizierte DNA in einen geeigneten Vektor unter Verwendung einer Restriktionsenzymstelle in der DNA subkloniert werden. Ferner kann die DNA beispielsweise mit einem Restriktionsenzym für RFLP in unproblematischer Weise behandelt werden. Daher kann die DNA ausgedehnt in dem Gebiet der genetischen Tests verwendet werden. Da das DNA-Fragment, das erfindungsgemäß amplifiziert wurde, aus normalen Nukleotiden besteht, kann eine Promotorsequenz für eine RNA-Polymerase in das amplifizierte Fragment eingebaut werden. Das amplifizierte Fragment kann als Matrize für eine Synthese von RNA verwendet werden, die beispielsweise als Sonde verwendet werden kann. Natürlich kann eine Fluoreszenz- markierte DNA-Sonde dadurch hergestellt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz unter Verwendung eines Fluoreszenz-markierten dNTPs anstelle eines normalen dNTPs durchgeführt wird.
Da das in dem erfindungsgemäßen Verfahren abschließend amplifizierte Fragment an beiden Enden keine Nukleotidsequenz aufweist, die zu einem Primer für eine Amplifikation komplementär ist, kann eine Kontamination aufgrund des Übertrags eines Amplifikationsprodukts verringert werden. Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren in genetischen Tests und dergleichen verwendbar, in denen die gleiche Region routinemäßig amplifiziert wird.
Merkmale des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz sind nachstehend aufgeführt.

1. Es kann eine große Menge einer Nukleinsäure anhand einer kleinen Menge an Matrize amplifizieren. Das Amplifikationsprodukt nimmt quadratisch zu, wenn zwei Primer verwendet werden.
2. Es kann isotherm durchgeführt werden. In diesem Fall erfordert es keine Verwendung einer Ausrüstung wie einer Thermozyklusvorrichtung. Daher kann das Reaktionsvolumen einfach maßstäblich vergrößert werden.
3. Gewöhnlich erfolgt die Amplifikationsreaktion unter Verwendung eines oder zweier chimärer Oligonukleotidprimer und zweier Enzyme (eine DNA-Polymerase und eine Endonuklease).
4. Da eine Reihe von DNA-Strängen anhand eines Moleküls eines Primers synthetisiert wird, begrenzt die Menge an Primer nicht die Menge an Amplifikationsprodukt. Ferner beträgt die Primerverwendungswirksamkeit etwa 100%, was sehr viel höher ist als diejenige des PCR-Verfahrens.
5. Eine einzelsträngige oder doppelsträngige DNA kann selektiv abhängig von dem Zweck amplifiziert werden.
6. Da es kein dNTP-Analogon wie ein (α-S)-dNTP für die Amplifikationsreaktion erforderlich macht, sind die Kosten für die Reagenzien gering. Ferner kann eine Nukleinsäure in einer natürlichen Form ohne ein dNTP-Analogon erhalten werden.
7. Es kann ein amplifiziertes DNA-Fragment bei geringen Kosten und in großen Mengen dadurch bereitstellen, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit einem anderen Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren kombiniert wird.

Wie vorstehend beschrieben, ist das erfindungsgemäße Verfahren für eine Herstellung einer Nukleinsäure im industriellen Maßstab geeignet.
Beispiele
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung in detaillierterer Form, sind jedoch nicht begrenzend zu verstehen.
Referenzbeispiel
Der Einheitswert von RNase H, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wurde, wurde gemäß dem nachstehenden Verfahren bestimmt.
(1) Herstellung von verwendeten Reagenzlösungen
Reaktionsgemische für eine Bestimmung der Aktivität: Die nachstehenden Substanzen bei den angegebenen Endkonzentrationen waren in sterilem Wasser enthalten: 40 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,7 bei 37°C), 4 mM Magnesiumchlorid, 1 mM DTT, 0,003% BSA, 4% Glycerin und 24 μM poly(dT).
Poly[8-³H]adenylsäurelösung: 370 kBq einer Poly[8-³H]adenylsäurelösung wurden in 200 μl sterilem Wasser gelöst.
Polyadenylsäurelösung: Polyadenylsäure wurde auf eine Konzentration von 3 mM mit sterilem ultrareinem Wasser verdünnt.
Enzymverdünnungslösung: Die nachstehenden Substanzen bei den angegebenen Endkonzentrationen waren in sterilem Wasser enthalten: 25 mM Tris-Hydrochlorid (pH 7,5 bei 37°C), 5 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 mM EDTA (pH 7,5 bei 37°C), 30 mM Natriumchlorid und 50% Glycerin.
Herstellung von hitzedenaturierter Kalbsthymus-DNA: 200 mg Kalbsthymus-DNA wurden in 100 ml TE-Puffer suspendiert und gequollen. Die Lösung wurde auf eine Konzentration von 1 mg/ml mit sterilem ultrareinem Wasser basierend auf der Absorption bei UV 260 nm verdünnt. Die verdünnte Lösung wurde bei 100°C 10 Minuten erhitzt und sodann schnell auf einem Eisbad abgekühlt.
(2) Verfahren zur Messung von Aktivität
7 μl der Poly[8-³H]adenylsäurelösung wurden zu 985 μl des Reaktionsgemisches, wie vorstehend in (1) hergestellt, für eine Bestimmung der Aktivität gegeben. Das Gemisch wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert. 8 μl Polyadenylsäure wurden zu dem Gemisch gegeben, um die Endkonzentration auf 24 μM einzustellen. Das Gemisch wurde weiter bei 37°C 5 Minuten inkubiert. Somit wurden 1000 μl Poly[8-³H]A-poly-dT-Reaktionsgemisch hergestellt. 200 μl Reaktionsgemisch wurden sodann 5 Minuten bei 30°C inkubiert. 1 μl einer geeigneten seriellen Verdünnung einer Enzymlösung wurde dazugegeben. 50 μl einer jeden Probe wurden aus dem Reaktionsgemisch über die Zeit für eine Verwendung in einer darauf folgenden Messung entnommen. Die Zeitspanne in Minuten von der Zugabe des Enzyms bis zu der Probenentnahme ist als Y definiert. 50 μl eines Reaktionsgemisches für eine Bestimmung des Gesamt-CPM-Werts oder für eine Leermessung wurden durch Zugabe von 1 μl der Enzymverdünnungslösung anstelle von Enzymlösung hergestellt. 100 μl an 100 mM Natriumpyrophosphat, 50 μl der Lösung an hitzedenaturierter Kalbsthymus-DNA und 300 μl an 10% Trichloressigsäure (300 μl ultrareines Wasser für eine Messung des Gesamt-CPM-Werts) wurden zu der Probe gegeben. Das Gemisch wurde 5 Minuten bei 0°C inkubiert und sodann 10 Minuten bei 10000 UpM abzentrifugiert. Nach Zentrifugation wurden 250 μl des sich ergebenden Überstands in ein Gefäß gegeben. 10 ml Aquasol-2 (NEN Life Science Products) wurden dazugegeben. Der CPM-Wert wurde in einem Flüssigszintillationszähler gemessen.
(3) Berechnung der Einheiten
Der Einheitswert für jedes Enzym wurde gemäß der nachstehenden Gleichung berechnet. Unit/ml = {(gemessener CPM-Wert – CPM-Leerwert) × 1,2* × 20 × 1000 × Verdünnungsrate} 200 (μl)/(Gesamt-CPM-Wert × Y (Min.) × 50 (μl) × 9**)

1,2*:: Menge in nmol an Poly[8-³H]rA-poly-dT, die in dem Gesamt-CPM-Wert pro 50 μl enthalten ist.
9**:: Berichtigungskoeffizient.

Beispiel 1
(1) Synthese von Matrizen-DNA und Primern
Eine einzelsträngige DNA aus 99 Basen als Matrize und Primer, die in diesem Beispiel verwendet wurden, wurden unter Verwendung eines DNA-Synthesegerätes (Applied Biosystems) synthetisiert. Die Nukleotidsequenz der einzelsträngigen DNA aus 99 Basen ist in SEQ ID NO: 1 des Sequenzprotokolls gezeigt. Die grundsätzlichen Nukleotidsequenzen eines Stromaufwärts-Primers und eines Stromabwärts-Primers sind in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 3 des Sequenzprotokolls gezeigt. Die Strukturen der in diesem Beispiel verwendeten Primer sind detailliert nachstehend beschrieben:

Primerpaar 1: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz, wie sie in SEQ ID NO: 2 oder 3 des Sequenzprotokolls gezeigt ist, und die vollständig aus Desoxyribonukleotiden bestehen;
Primerpaar 2: Eine Kombination von Primern, in denen die ersten und zweiten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind und die Phosphatbindung auf der 5'-terminalen Seite des zweiten Ribonukleotids ausgehend von dem 3'-Terminus durch eine Phosphorothioatbindung in jedem der Primer des Primerpaars 1 ersetzt ist;
Primerpaar 3: Eine Kombination von Primern, in denen das Desoxyribonukleotid an dem 3'-Terminus durch ein Ribonukleotid ersetzt ist und die Phosphatbindung auf der 5'-terminalen Seite des Ribonukleotids durch eine Phosphorothioatbindung in jedem der Primer des Primerpaars 1 ersetzt ist;
Primerpaar 4: Eine Kombination von Primern, in denen die ersten und zweiten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide in jedem der Primer des Primerpaars 1 ersetzt sind; und
Primerpaar 5: Eine Kombination von Primern, in denen die dritten und vierten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind und die Phosphatbindung auf der 5'-terminalen Seite des vierten Ribonukleotids ausgehend von dem 3'-Terminus durch eine Phosphorothioatbindung in jedem der Primer des Primerpaars 1 ersetzt ist.

(2) Amplifikationsreaktion
Bca BEST-DNA-Polymerase (Takara Shuzo), die eine DNA-Polymerase ohne 5'→3'-Exonukleaseaktivität aus Bacillus caldotenax ist, und klonierte Ribonuklease H (Takara Shuzo), die RNase H aus E. coli ist, wurden verwendet, um die Reaktionssysteme der Modelle 1-7 wie nachstehend beschrieben zu untersuchen.
Ein Reaktionsgemisch wurde wie folgt hergestellt.
35 mM Tris-Hydrochlorid-Puffer (pH 7,5), 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 2,7% Glycerin, 5% Dimethylsulfoxid, 1,4 mM eines jeden dNTPs, 10 mM Magnesiumchlorid, 20 pmol von einem oder beiden der Primer eines der Primerpaare wie vorstehend in (1) beschrieben, 0,6 ng der synthetischen einzelsträngigen DNA als Matrize, 5 U Bca-BEST-DNA-Polymerase und 60 U klonierte Ribonuklease H waren in einem abschließenden Reaktionsvolumen von 50 μl vorhanden. Das Reaktionsgemisch wurde zur Homogenität gemischt, bei 55°C 60 Minuten inkubiert und sodann bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. 8 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen. Die Primer, die in den jeweiligen Modellen verwendet wurden, sind nachstehend beschrieben:

Modelle 1-5: Eines der Primerpaare 1-5 wurde verwendet;
Modell 6: Nur der Stromabwärts-Primer des Primerpaars 2 wurde verwendet; und
Modell 7: Das Primerpaar 4 wurde ohne Zugabe von RNase H verwendet.

Als ein Ergebnis wurden amplifizierte Fragmente mit einer interessierenden Größe von etwa 40 Basenpaaren (bp) bis etwa 90 bp festgestellt, wenn die Reaktionsgemische der Modelle 2-5 verwendet wurden, was zeigt, dass DNA unter Verwendung dieser Reaktionssysteme amplifiziert wird. Ein amplifiziertes Fragment mit einer erwarteten Größe von etwa 70 Basen (b) (ein einzelsträngiges DNA-Fragment) wurde für das Modell 6 festgestellt, in dem lediglich einer der zwei Primer verwendet wur de. Keine DNA-Amplifikation wurde für die Reaktion des Modells 1 oder 7 festgestellt.
(3) Bestätigung von Amplifikationsprodukten
Das Reaktionsgemisch, das durch die Reaktion des Modells 4 wie in (2) beschrieben erhalten wurde, wurde unter Verwendung von Microcon-100 (Takara Shuzo) filtriert, um ein amplifiziertes DNA-Fragment wiederzugewinnen, was auf dem Filter gesammelt wurde. Die Nukleotidsequenz des DNA-Fragments wurde durch das Didesoxyverfahren bestimmt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass das durch die vorstehend beschriebene Reaktion amplifizierte Fragment eine DNA mit der gleichen Nukleotidsequenz wie derjenigen der DNA als Matrize ist.
(4) Untersuchung der Reaktionszeit
Das Reaktionsgemisch des Modells 2 wie vorstehend in (2) beschrieben wurde hergestellt, um die Veränderung hinsichtlich der Menge des Amplifikationsprodukts zu untersuchen, wenn es für unterschiedliche Zeitspannen umgesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde 0, 15, 30, 60, 90 oder 120 Minuten bei 55°C inkubiert. Das Gemisch wurde sodann bei 90°C zwei Minuten behandelt, um die Enzyme zu inaktivieren. 8 μl des Reaktionsgemisches wurden durch Elektrophorese auf 3% NuSieve 3:1-Agarosegel analysiert. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in 2 gezeigt. Die Bezeichnungen 1-6 in der Figur stellen Spuren dar, auf die das Reaktionsgemisch aufgetragen worden war, das 0, 15, 30, 60, 90 bzw. 120 Minuten umgesetzt wurde. M stellt eine Spur dar, auf die ein Marker einer 100 bp DNA-Leiter (Takara Shuzo) als Molekulargewichtsmarker aufgetragen worden war.
Wie in 2 gezeigt, wurde kein Amplifikationsprodukt für eine Reaktionszeit von 0 Minuten festgestellt. Es wurde bestätigt, dass die Menge des Amplifikationsprodukts zunahm, wenn die Reaktionszeit von 15 Minuten auf 30 oder 60 Minuten verlängert wurde. Jedoch war die Menge des Amplifikationsprodukts wie durch Elektrophorese festgestellt für eine Reaktionszeit von 60 Minuten oder länger nahezu unverändert, was zeigt, dass die Amplifikation in dem verwendeten Reaktionssystem das Maximum bei etwa 60 Minuten erreichte.
Beispiel 2
(1) Herstellung von RNA
Eine als Matrize in diesem Beispiel verwendete RNA wurde aus der humanen Zellkultur HT29 (ATCC HTB-38) (Dainippon Pharmaceutical) unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Life Technologies) hergestellt. Die Konzentration der sich ergebenden Gesamt-RNA wurde auf 1 μg/μl eingestellt. Der OD260/OD280-Wert betrug 1,8, was die spektrophotometrische Reinheit der RNA anzeigt.
(2) Amplifikationsreaktion
Bca BEST-DNA-Polymerase, die eine reverse Transkriptionsaktivität und eine DNA-Polymeraseaktivität aufweist, sowie RNase H-Endonuklease wurden verwendet, um zu bestimmen, ob eine cDNA aus einer RNA amplifiziert wird.
Ein Reaktionsgemisch mit der in Beispiel 2 beschriebenen Zusammensetzung wurde unter Zugabe von 1 μg der vorstehend beschriebenen Gesamt-RNA hergestellt. Eine Zielregion, die für humanen Transferrinrezeptor kodiert (GenBank-Zugangsnummer X01060), wurde unter Verwendung des Primerpaars 2 in Beispiel 1 als Primer amplifiziert.
Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C 60 Minuten inkubiert und sodann bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. Wenn 8 μl des Reaktionsgemisches einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve 3:1-Agarosegel unterzogen wurden, wurde ein amplifiziertes Fragment mit einer erwarteten Größe von 56 bp festgestellt. Ferner erfolgte eine Southern-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde mit der Zielnukleotidsequenz. Eine DNA-Sonde mit der in SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls gezeigten Nukleotidsequenz, die an dem 5'-Terminus mit Biotin markiert war, wurde verwendet, um die Southern-Hybridisierung durchzuführen. Als ein Ergebnis hybridisierte die Sonde mit dem vorstehend beschriebenen amplifizierten Fragment, was bestätigte, dass die Zielregion richtig durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifiziert worden war.
Beispiel 3
(1) Synthese von Primern
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde unter Verwendung einer doppelsträngigen DNA als Matrize untersucht. Verwendete Primer wurden unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems) synthetisiert. Die grundsätzlichen Nukleotidsequenzen der Primer sind in SEQ ID NOs: 5-13 des Sequenzprotokolls gezeigt. Die Strukturen der Primer, die in diesem Beispiel verwendet wurden, sind nachstehend detailliert beschrieben. pUC19-DNA (Takara Shuzo) wurde als Matrize für die Primerpaare A-F verwendet. Die Nukleotidsequenz von pUC19 ist von einer Datenbank (GenBank-Zugangsnummer L09137) erhältlich. Ein amplifiziertes doppelsträngiges DNA-Fragment wurde als Matrize für das Primerpaar G verwendet. Das Fragment wurde von der in Beispiel 2 erhaltenen humanen Gesamt-RNA unter Verwendung von Primern mit einer Sequenz wie in SEQ ID NOs: 14 oder 15 des Sequenzprotokolls gezeigt und des TaKaRa-RNA-PCR-Kits (AMV) Ver. 2.1 (Takara Shuzo) gemäß dem beigefügten Standardprotokoll hergestellt.

Primerpaar A (amplifizierte Fragmentlänge: etwa 450 bp): Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 5 oder 6 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar B (amplifizierte Fragmentlänge: etwa 250 bp): Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 5 oder 7 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar C (amplifizierte Fragmentlänge: etwa 520 bp): Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 5 oder 8 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar D (amplifizierte Fragmentlänge: etwa 890 bp): Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 5 oder 9 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar E (amplifizierte Fragmentlänge: etwa 130 bp) : Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 10 oder 6 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar F (amplifizierte Fragmentlänge: etwa 220 bp): Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 11 oder 6 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind; und
Primerpaar G (amplifizierte Fragmentlänge: etwa 320 bp): Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 12 oder 13 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind.

(2) Amplifikationsreaktion
Ein Reaktionsgemisch wurde wie folgt hergestellt.
35 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), 0,1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 5% Dimethylsulfoxid, 1,4 mM von jedem dNTP, 10 mM Magnesiumchlorid, 60 pmol eines jeden der Primer eines vorstehend in (1) beschriebenen Primerpaars, 100 ng pUC19-DNA als Matrize, 5,5 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 60 U RNase H wurden auf ein Endreaktionsvolumen von 50 μl gebracht.
Die Reaktionsbedingungen waren wie folgt. Das Reaktionsgemisch ohne die DNA-Polymerase oder RNase H wurde bei 98°C eine Minute hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. Die DNA-Polymerase und RNase H wurden sodann zugegeben und das Gemisch bei 55°C 60 Minuten inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch auf 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktiveren. 8 μl des Reaktionsgemisches wurden sodann einer Elektrophorese auf 3% NuSieve 3:1-Agarosegel unterzogen.
Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass ein interessierendes amplifiziertes Fragment unter Verwendung eines der Primerpaare erhalten wurde. Somit wurde bestätigt, dass eine doppelsträngige DNA als Matrize verwendet werden kann, um eine Ampli fikationsreaktion in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren durchzuführen.
(3) Spaltung des Amplifikationsprodukts mit Restriktionsenzym
Eine Spaltung eines amplifizierten Fragments, das unter Verwendung des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens erhalten wurde, mit Restriktionsenzym wurde untersucht. pUC19-Plasmid-DNA wurde als Matrizen-DNA verwendet. Der obere pUC19 (2) NN-Primer und der untere pUC19 NN-Primer wie in SEQ ID NOs: 5 bzw. 6 des Sequenzprotokolls gezeigt wurden verwendet. In den Primern sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
Reaktionsgemisch A: 35 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid, 1,4 mM von jedem dNTP, 0,01% BSA, 5% DMSO, 2,7% Glycerin, 100 pmol von jeweils dem oberen pUC19 (2) NN-Primer und dem unteren pUC19 NN-Primer, 500 ng pUC19-DNA und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 48 μl eingestellt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei 98°C eine Minute hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. 60 U E. coli-RNase H und 5,5 U Bca BEST wurden sodann dazugegeben, um das Reaktionsvolumen auf 50 μl aufzufüllen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. Das Reaktionsgemisch wurde einer Elektrophorese auf 3% Agarosegel unterzogen, um das sich ergebende Amplifikationsprodukt aufzureinigen. Das wiedergewonnene Amplifikationsprodukt wurde in 100 μl sterilem destilliertem Wasser resuspendiert.
Die so erhaltene DNA-Lösung wurde für eine Restriktionsenzymspaltung verwendet. Verwendete Restriktionsenzyme waren AccII (Takara Shuzo) und BcnI (Takara Shuzo). Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
3 μl der DNA-Lösung, 1 μl 10 × AccII-Puffer oder 10 × BcnI-Puffer, der jedem der Enzyme beigefügt war, 1 μl des Restriktionsenzyms AccII oder BcnI und steriles Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 10 μl eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 37°C 30 Minuten umgesetzt. 1,5 μl 10 × Ladepuffer wurden dazu gegeben. 6 μl des Gemisches wurden einer Elektrophorese auf 3% NuSieve-Agarosegel unterzogen.
Als Ergebnis wurden bei Verwendung beider Restriktionsenzyme, AccII und BcnI, mit Restriktionsenzym gespaltene interessierende DNA-Fragmente erhalten.
(4) Nachweis von Mutation
Ein Nachweis einer Mutation unter Verwendung des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens wurde untersucht. pUC19 wurde als Matrize verwendet. Die grundsätzlichen Nukleotidsequenzen des oberen pUC19 (2) NN-Primers und des unteren pUC19 NN-Primers sind in SEQ ID NO: 5 bzw. 6 des Sequenzprotokolls gezeigt. Beide dieser Primer sind chimäre Oligonukleotidprimer, in denen die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleinsäuren ersetzt sind. Des Weiteren wurden vier Primer hergestellt, in denen die Base an dem 3'-Terminus des oberen pUC19 (2) NN-Primers durch U (das zu der entsprechenden Base in der Matrize komplementär ist) oder A, C oder G (die Mismatch-Basen darstellen) ersetzt sind, bezeichnet als oberer pUC19 (2) NN-U, oberer pUC19 (2) NN-A, oberer pUC19 (2) NN-C oder oberer pUC19 (2) NN-G. Die Kombinationen dieser Primer waren wie folgt:

Primerpaar 1: oberer pUC19 (2) NN-U und unterer pUC19 NN;
Primerpaar 2: oberer pUC19 (2) NN-A und unterer pUC19 NN;
Primerpaar 3: oberer pUC19 (2) NN-C und unterer pUC19 NN;
Primerpaar 4: oberer pUC19 (2) NN-G und unterer pUC19 NN.

Ein Reaktionsgemisch wurde wie folgt hergestellt.
30 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,3), 0,01% Rinderserumalbumin (BSA), 5% DMSO, 1 mM von jedem dNTP, 8 mM Magnesiumacetat, 60 pmol eines jeden der Primer, 50 ng der DNA als Matrize und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 48 μl eingestellt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei 98°C eine Minute hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. 5,5 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 60 U E. coli-RNase H wurden sodann dazugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C 60 Minuten inkubiert. Das Gemisch wurde sodann bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. 8 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf 4% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen. Als Ergebnis wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment von etwa 450 bp lediglich dann festgestellt, wenn die Kombination von Primern, die den Primer mit einer komplementären Base an dem 3'-Terminus des oberen pUC19 (2) NN enthielt, verwendet wurde. Auf der anderen Seite wurde kein amplifiziertes Fragment für die Kombinationen festgestellt, die den Primer mit einer Mismatch-Base an dem 3'-Terminus des oberen pUC19 (2) NN enthielten.
Beispiel 4
(1) Reaktion in einem Mikroröhrchen
Das Reaktionsvolumen für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde untersucht. Eine Region, die für humanen Transferrinrezeptor kodiert, wurde als zu amplifizierende Region ausgewählt. Primer mit der in SEQ ID NO: 12 oder 13 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz wurden verwendet. In den Primern sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Ein Fragment mit etwa 57 bp, das durch RT-PCR amplifiziert wurde, wurde als Matrizen-DNA verwendet. Das Reaktionsvolumen wurde auf 50, 100, 300 oder 500 μl eingestellt. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.

Reaktionsgemisch A: 10 μl 5 × Spezialpuffer (135 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), 0,5 mg/ml BSA, 2,5% DMSO), 4 μl 100 mM Magnesiumacetat, 5 μl 10 mM dNTPs, 10 μl 10 μM ATP, 1 μl Bca BEST-DNA-Polymerase (22 U/μl), 1 μl RNase H (60 U/μl) und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Volumen von 39 μl eingestellt.
Reaktionsgemisch B: 3 μl von jeweils 20 μM humanem Transferrinrezeptor S-Primer (SEQ ID NO: 12) und 20 μM humanem Transferrinrezeptor-Primer (SEQ ID NO: 13), etwa 100 ng der DNA als Matrize und steriles Wasser wurden auf ein Volumen von 11 μl eingestellt. Wenn das Volumen 50 μl oder mehr betrug, wurde es maßstäblich vergrößert, um die vorstehend beschriebene Zusammensetzung aufzuweisen.

Für eine Amplifikationsreaktion wurde das Reaktionsgemisch B bei 98°C zwei Minuten behandelt und sodann bei 55°C 3 Minuten inkubiert. Das Reaktionsgemisch B wurde zu dem Reaktionsgemisch A, das in einem 1500 μl-Mikroröhrchen bei 55°C vorinkubiert worden war, gegeben. Nach Mischen wurde das Reaktionsgemisch bei 55°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch in ein Eisbad überführt. 8 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 3% Agarosegel unterzogen.
Als ein Ergebnis wurde ein interessierendes Fragment von etwa 300 bp wirksam unter Verwendung eines jeden der Reaktionsvolumina amplifiziert. Des Weiteren wurde bestätigt, dass ein interessierendes amplifiziertes Fragment unter Verwendung eines PCR-amplifizierten Fragments als Matrizen-DNA unproblematisch erhalten werden kann.
(2) Reaktion in Petrischalen
Die Verwendung einer Petrischale für eine Verhinderung der heterogenen Temperatur in einem Reaktionsgemisch aufgrund eines erhöhten Reaktionsvolumens wurde untersucht. Eine Region, die für humanen Transferrinrezeptor kodiert, wurde als zu amplifizierende Region ausgewählt. Primer mit der in SEQ ID NO: 12 oder 13 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz wurden verwendet. In den Primern sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Ein Fragment mit etwa 750 bp, das durch RT-PCR amplifiziert worden war, wurde als Matrizen-DNA verwendet. Das Reaktionsvolumen wurde auf 10 ml eingestellt. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.

Reaktionsgemisch A: 2000 μl 5 × Spezialpuffer (135 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), 0,5 mg/ml BSA, 2,5% DMSO), 800 μl 100 mM Magnesiumacetat, 1000 μl 10 mM dNTPs und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Volumen von 9,1 ml eingestellt.
Reaktionsgemisch B: 200 μl von jeweils 60 μM humanem Transferrinrezeptor S-Primer (SEQ ID NO: 12) und 60 μM humanem Transferrinrezeptor-Primer (SEQ ID NO: 13), etwa 10 μg der DNA als Matrize und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Volumen von 500 μl eingestellt.
Reaktionsgemisch C: 200 μl Bca BEST-DNA-Polymerase (22 U/μl) und 200 pl RNase H (60 U/μl).

Für eine Amplifikationsreaktion wurde das Reaktionsgemisch B bei 98°C eine Minute behandelt und sodann bei 55°C drei Minuten inkubiert. Das Reaktionsge misch B wurde zu dem Reaktionsgemisch A, das in einer 60 mm (Durchmesser) Plastikpetrischale bei 55°C vorinkubiert worden war, gegeben. Das Reaktionsgemisch C wurde weiter dazugegeben. Nach Mischen wurde das Reaktionsgemisch bei 55°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch in ein Eisbad überführt. 8 μl des Reaktionsgemisches wurden sodann einer Elektrophorese auf einem 3% Agarosegel unterzogen.
Als Ergebnis wurde ein interessierendes Fragment mit etwa 300 bp wirksam amplifiziert, selbst wenn ein Reaktionsvolumen von 10 ml verwendet wurde. Des Weiteren wurde bestätigt, dass ein interessierendes amplifiziertes Fragment unter Verwendung eines PCR-amplifizierten Fragments als Matrizen-DNA unproblematisch erhalten werden kann. Somit wurde bestätigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zu dem herkömmlichen PCR-Verfahren geeigneter für die Herstellung eines DNA-Chips ist, die eine große Menge eines DNA-Fragments benötigt.
Beispiel 5
(1) Beziehung zwischen Puffertyp und verwendeter Menge an RNase H
Die Beziehung zwischen dem Puffertyp und der verwendeten Menge an RNase H wurde untersucht. Plasmid-DNA, bei der ein Fragment von 249 bp oder 911 bp in den pUCl9-Vektor kloniert worden war (bezeichnet als pUC19-249 und pUC19-911), wurde als Matrize verwendet. Chimäre Oligonukleotidprimer, in denen die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus des MF2N3 (24)-Primers oder MR1N3 (24)-Primers mit der in SEQ ID NO: 16 oder 17 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz durch Ribonukleotide ersetzt sind, wurden als Primer verwendet. Durch Verwendung der Kombination dieser Primer wurden für pUC19-249 bzw. pUC19-911 amplifizierte Fragmente mit etwa 450 bp bzw. etwa 1100 bp erhalten.
Tris-Hydrochlorid-Puffer, Kaliumphosphat-Puffer und Tricin-Puffer wurden als Puffersysteme für eine Untersuchung ausgewählt. Die untersuchten Mengen an RNase H waren keine Zugabe und eine Endkonzentration von 0,3 bis 1,2 U/μl. Das Tris-Hydrochlorid-Puffersystem wurde wie in Beispiel 1 (2) beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, dass 10 ng pUC19-249 oder 200 ng pUC19-911, 60 pmol eines jeden der Primer und 10 U/50 μl Reaktionsvolumen Bca BEST-DNA-Polymerase verwendet wurden. Das Kaliumphosphat-Puffersystem wurde derart hergestellt, dass es eine ähnliche Zusammensetzung aufwies. Das Tricin-Puffersystem wurde derart hergestellt, dass es die nachstehenden Bestandteile bei den angegebenen Endkon zentrationen aufwies: 34 mM Tricin-Puffer (pH 8,7), 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,01% BSA, 1% DMSO, 4 mM Magnesiumacetat und 0,5 mM jeden dNTPs. 10 ng/50 μl Reaktionsvolumen des pUC19-249-Plasmids oder 200 ng/50 μl Reaktionsvolumen des pUC19-911-Plasmids, 60 pmol/50 μl Reaktionsvolumen eines jeden der Primer, RNase H bei einer vorbestimmten Konzentration und 11 U/50 μl Reaktionsvolumen Bca BEST-DNA-Polymerase wurden zu dem Puffersystem gegeben.
Für eine Amplifikationsreaktion wurde ein Gemisch von pUC19-249 oder pUC19-911 als Matrize und den jeweiligen Primern bei 98°C eine Minute hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. Ein Gemisch der verbleibenden Reaktionskomponenten wurde zugegeben. Das Gemisch wurde bei 55°C 60 Minuten umgesetzt. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch auf 4°C abgekühlt und 1/10 Volumen 0,5 M EDTA wurde zugegeben, um die Reaktion zu beenden. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen.
Als Ergebnis wurde bei einer Verwendung von pUC19-249 als Matrize eine Zunahme der Amplifikationswirksamkeit abhängig von dem verwendeten Puffersystem in der folgenden Reihenfolge festgestellt: Tris-Hydrochlorid < Kaliumphosphat < Tricin. Wenn pUC19-911 als Matrize verwendet wurde, wurde eine Zunahme der Amplifikationswirksamkeit in Abhängigkeit von dem verwendeten Puffersystem in der nachstehenden Reihenfolge festgestellt: Tris-Hydrochlorid < Tricin < Kaliumphosphat. Die Verwendung von RNase H bei einer Endkonzentration von 0,3 bis 1,2 U/μl führte zu dem interessierenden amplifizierten Fragment, obwohl kein interessierendes amplifiziertes Fragment im Fall ohne Zugabe festgestellt wurde.
(2) Untersuchung der Primermenge
Die Wirkung der verwendeten Primermenge auf das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde untersucht. Ein Reaktionsgemischsystem mit einer Zusammensetzung, bei der pUC19-249 als Matrize in den vorstehend in (1) beschriebenen Zusammensetzungen verwendet wurde, wurde eingesetzt. 60 U/50 μl Reaktionsvolumen von RNase H wurden für das Kaliumphosphatpuffersystem verwendet, während 30 U/50 μl Reaktionsvolumen von RNase H für das Tris-Hydrochlorid- oder Tricin-Puffersystem verwendet wurden. Die untersuchte Konzentration des Primers betrug 10 bis 100 pmol/50 μl. Reaktionsbedingungen und eine Bestätigung der Amplifikation waren wie vorstehend in (1) beschrieben.
Als Ergebnis wurde bei Verwendung eines jeden der Reaktionspuffersysteme mit dem Primer bei einer Konzentration von 10 bis 100 pmol/50 μl ein interessierendes amplifiziertes Fragment festgestellt.
(3) Wirkung des pH-Werts des Reaktionspuffers
Die Wirkung des pH-Werts eines Reaktionsgemisches auf das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde untersucht. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie vorstehend in (2) beschrieben. Der untersuchte pH-Wert betrug 7,0 bis 8,0 für das Kaliumphosphat-Puffersystem, 7,5 bis 9,2 für das Tricin-Puffersystem und 7,5 bis 9,0 für das Tris-Hydrochlorid-Puffersystem. Reaktionsbedingungen und eine Bestätigung der Amplifikation waren wie vorstehend in (1) beschrieben.
Als Ergebnis wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment bei den pH-Werten innerhalb des für die jeweiligen Puffersysteme verwendeten Bereichs festgestellt.
(4) Wirkung eines Zusatzes
Die Wirkung einer Zugabe von Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde unter Verwendung der Reaktionsgemischzusammensetzung des Phosphatpuffersystems (pH 7,5) wie vorstehend in (3) beschrieben untersucht. Des Weiteren wurde die Wirkung einer Zugabe eines Polyamins ebenfalls untersucht. Die untersuchte Menge des zugegebenen DMSO reichte von keiner Zugabe bis 10%. Auf der anderen Seite wurden Spermintetrahydrochlorid (Sigma), Spermidintrihydrochlorid (Sigma), Acetylputrescin (Nacalai Tesque), Putrescindihydrochlorid (Nacalai Tesque), Trimethylendiamin (Nacalai Tesque), Propylendiamin (Nacalai Tesque) und Diaminomethandihydrochlorid (Nacalai Tesque) als Polyamin verwendet. Die Mengen von Propylendiamin und Trimethylendiamin, die zugegeben wurden, waren innerhalb eines Bereichs von keiner Zugabe bis 2%. Andere Polyamine wurden innerhalb des Bereichs zwischen keiner Zugabe und 5 mM verwendet. Reaktionsbedingungen und eine Bestätigung einer Amplifikation waren wie vorstehend in (1) beschrieben.
Als Ergebnis wurde ein interessierendes DNA-Fragment unter Verwendung des Zusatzes bei einer Konzentration innerhalb des angegebenen Bereichs wirksam amplifiziert: keine Zugabe bis 5% DMSO; keine Zugabe bis 200 μM Spermintetrahydrochlorid oder Spermidin; 40 μM bis 40 mM Acetylputrescin oder Putrescindihydrochlorid; 0,002% bis 0,02% Trimethylendiamin; 0,0001% bis 0,01% Propylendiamin und 0,1 μM bis 10 μM Diaminomethandihydrochlorid.
(5) Untersuchung des Magnesiumsalztyps
Die Wirkung des Typs an Magnesiumsalz auf das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde untersucht. pUC19-DNA wurde als Matrize verwendet. Der obere pUC19 NN 249-Primer und der untere pUC19 NN-Primer mit den in SEQ ID NOs: 11 bzw. 6 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen wurden als Primer verwendet. Ein amplifiziertes Fragment mit etwa 225 bp wird unter Verwendung eines Paares dieser Primer erhalten. Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat und Magnesiumsulfat wurden als Magnesiumsalze verwendet. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
35 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,3), 8 mM (Endkonzentration) Magnesiumchlorid, Magnesiumacetat oder Magnesiumsulfat, 1,0 mM (Endkonzentration) jeden dNTPs, 50 ng pUC19-DNA, 60 pmol eines jeden der Primer, 60 U RNase H, 5,5 U Bca BEST-DNA-Polymerase und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 50 μl eingestellt. Reaktionsbedingungen und eine Bestätigung der Amplifikation waren wie vorstehend in (3) beschrieben.
Als ein Ergebnis wurde bei Verwendung eines jeden der Magnesiumsalze ein interessierendes amplifiziertes Fragment festgestellt.
(6) Untersuchung der Konzentrationen an Magnesium und dNTPs
Die Wirkungen der Konzentration an Magnesium und dNTPs auf das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurden untersucht. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie vorstehend in (5) beschrieben, mit der Ausnahme, dass 25 ng pUC19-DNA, Magnesium und dNTPs bei veränderlichen Konzentrationen verwendet wurden. Reaktionsbedingungen und eine Bestätigung der Amplifikation waren wie vorstehend in (1) beschrieben.
In einem Reaktionssystem, in dem die Endkonzentration eines jeden dNTPs 1 mM betrug, wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment erhalten, wenn eine Magnesium-Endkonzentration von 6 mM bis 10 mM eingesetzt wurde. In einem Reaktionssystem, in dem die Magnesium-Endkonzentration 8 mM betrug, wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment erhalten, wenn eine Endkonzentration eines jeden dNTPs von 0,6 mM bis 1,2 mM verwendet wurde. Des Weiteren wurde in einem Reaktionssystem, in dem die Endkonzentration eines jeden dNTPs 0,5 mM betrug, ein interessierendes amplifiziertes Fragment erhalten, wenn eine Magnesium-Endkonzentration von 2 mM bis 6 mM verwendet wurde. In einem Reaktionssystem, in dem die Magnesium-Endkonzentration 4 mM betrug, wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment erhalten, wenn eine Endkonzentration eines jeden dNTPs von 0,2 mM bis 0,8 mM verwendet wurde.
(7) Untersuchung einer Veränderung der Konzentration von Kaliumphosphat-Puffer oder Tricin-Puffer und Reaktivität
Die Wirkung der Konzentration von Kaliumphosphat-Puffer oder Tricin-Puffer auf das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde untersucht. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie vorstehend in (1) für den Fall, in dem pUC19-249 als Matrize verwendet wurde, beschrieben, mit der Ausnahme, dass Kaliumphosphat-Puffer bei einer Endkonzentration von 20 bis 50 mM oder Tricin-Puffer bei einer Endkonzentration von 22 bis 46 mM verwendet wurde. Reaktionsbedingungen und eine Bestätigung der Amplifikation waren wie vorstehend in (1) beschrieben.
Als Ergebnis wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment erhalten, wenn der Kaliumphosphat-Puffer bei einer Endkonzentration von 20 bis 50 mM oder der Tricin-Puffer bei einer Endkonzentration von 22 bis 46 mM verwendet wurde.
(8) Untersuchung der Konzentration von Bca BEST-DNA-Polymerase
Die Wirkung der Konzentration von Bca BEST-DNA-Polymerase auf das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde untersucht. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie vorstehend in (1) für den Fall, in dem pUC19-249 als Matrize verwendet wurde, beschrieben, mit der Ausnahme, dass ein Kaliumphosphat-Puffersystem oder ein Tricin-Puffersystem und Bca BEST-DNA-Polymerase bei einer Konzentration von 1 bis 22 U/50 μl Reaktionsvolumen verwendet wurden. Reak tionsbedingungen und die Bestätigung einer Amplifikation waren wie vorstehend in (1) beschrieben.
Als Ergebnis wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment erhalten, wenn Bca BEST-DNA-Polymerase bei einer Konzentration von 1 bis 22 U/50 μl verwendet wurde.
Beispiel 6
Vergleich mit dem PCR-Verfahren
Das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde mit dem PCR-Verfahren verglichen. pUC19-Plasmid-DNA mit einem in die multiple Klonierungsstelle einklonierten DNA-Fragment von etwa 150 bp oder etwa 250 bp wurde als Matrize verwendet. Die Matrize wurde wie folgt hergestellt.
Der obere pUC19 150-Primer, der obere pUC19 249-Primer und der untere pUC19 NN-Primer mit den in SEQ ID NOs: 10, 11 bzw. 6 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen wurden für die Durchführung einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 100 pg pUC19-Plasmid-DNA als Matrize verwendet. Ein amplifiziertes Fragment mit etwa 150 bp wurde durch Verwendung einer Kombination des oberen pUC19 150-Primers und des unteren pUC19 NN-Primers erhalten. Ein amplifiziertes Fragment mit etwa 250 bp wurde durch Verwendung einer Kombination des oberen pUC19 249-Primers und des unteren pUC19 NN-Primers erhalten. Ein jedes dieser amplifizierten Fragmente wurde unter Verwendung von Microcon-100 aufgereinigt, unter Verwendung des DNA-Blunting-Kits (Takara Shuzo) mit stumpfen Enden versehen und sodann in eine HincII-Stelle in dem pUC19-Plasmid subkloniert. Plasmide, in die eines der amplifizierten Fragmente inseriert worden war, wurden für eine Transformation von E. coli JM 109 verwendet. Die sich ergebenden Transformanten wurden kultiviert und Plasmide mit inserierter DNA aus den Zellen unter Verwendung des QIAGEN-Plasmid-Mini-Kits (Qiagen) aufgereinigt. Die Plasmide mit inserierter DNA wurden als Matrizen verwendet.
Die Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten Primer sind in SEQ ID NOs: 18 und 19 des Sequenzprotokolls gezeigt. Primer, in denen die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind, wurden für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren verwendet. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
27 mM Phosphat-Puffer (pH 7,3), 0,01% Rinderserumalbumin (BSA), 5% DMSO, 1 mM jeden dNTPs, 8 mM Magnesiumacetat, 60 pmol eines jeden der Primer, 1 ng der DNA als Matrize und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 48 μl eingestellt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei 98°C eine Minute hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. 5,5 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 60 U E. coli-RNase H wurden dazugegeben und das Gemisch bei 55°C 60 Minuten inkubiert. Sodann wurde das Gemisch bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 4% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen.
Auf der anderen Seite wurde eine Amplifikation unter Verwendung des PCR-Verfahrens als Kontrolle durchgeführt. Ein PCR-Amplifikationskit (Takara Shuzo), 10 pmol eines jeden der Primer mit der in SEQ ID NO: 18 oder 19 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz ohne ein Ribonukleotid, 1 ng der DNA als Matrize und steriles destilliertes Wasser bis zu einem Reaktionsvolumen von 50 μl wurden für die Reaktion verwendet. Die Reaktionsbedingungen waren 25 Zyklen bei 94°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 40 Sekunden. Nach Abschluss der Reaktion wurden 3 μl des Reaktionsgemisches einer Elektrophorese auf einem 4% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen.
Als Ergebnis wurde in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren im Vergleich zu dem PCR-Verfahren eine größere Menge eines interessierenden Fragments anhand eines jeden der Plasmide mit einem Insert von 150 bp oder 249 bp als Matrize amplifiziert. 20 μl des Reaktionsgemisches wurden unter Verwendung von Microcon-100 aufgereinigt und die Menge des Amplifikationsprodukts wurde unter Verwendung eines Beckman DU-640-Spektrophotometers (Beckman) quantifiziert, um numerisch die Menge des Amplifikationsprodukts auszudrücken. Es wurde festgestellt, dass die Menge des in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren anhand des Plasmids mit einem Insert von 150 bp als Matrize amplifizierten Fragments etwa 60-fach höher war als die in dem PCR-Verfahren. Es wurde bestätigt, dass die Menge des in dem erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahren anhand des Plasmids mit einem Insert von 250 bp als Matrize amplifizierten Fragments etwa 40-fach höher war als die in den PCR-Verfahren. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber dem her kömmlichen PCR-Verfahren für die Herstellung eines DNA-Chips bevorzugt ist, für die eine große Menge eines DNA-Fragments erforderlich ist.
Beispiel 7
(1) Herstellung einer RNA-Sonde
Ein Verfahren zum Nachweis eines amplifizierten Fragments, das durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren erhalten wurde, wurde untersucht. Eine Sonde für einen Nachweis, die aus Ribonukleotiden bestand und in der zwei unterschiedliche fluoreszierende Substanzen an die Ribonukleotide an beiden Enden der Sonde angebracht waren, wurde hergestellt. Die RNA-Sonde für einen Nachweis wurde unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts (Applied Biosystems) synthetisiert. Die Nukleotidsequenz der Sonde ist in SEQ ID NO: 20 des Sequenzprotokolls gezeigt. 6-FAM (Glen Research) und TAMRA (Glen Research) wurden als fluoreszierende Substanzen verwendet, um die Sonde an dem 5'-Terminus bzw. dem 3'-Terminus zu markieren.
(2) Amplifikationsreaktion und Nachweis
0,1 oder 1 ng pUC19-DNA wurden als Matrize verwendet. Der obere pUC19 150-Primer und der untere pUC19 542-Primer mit den in SEQ ID NOs: 10 bzw. 8 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen, in denen die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus des Primers durch Ribonukleotide ersetzt sind, wurden als Primer verwendet. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
27 mM Phosphat-Puffer (pH 7,3), 0,01% BSA, 5% DMSO, 1 mM jeden dNTPs, 8 mM Magnesiumacetat, 60 pmol eines jeden der Primer, 0,1 oder 1 ng der DNA als Matrize, 0,1 g der RNA-Sonde und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 48 μl gebracht. Ein Ansatz ohne DNA als Matrize wurde auch als Kontrolle hergestellt.
Das Reaktionsgemisch wurde bei 98°C für eine Minute hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. 22 U Bca BEST-DNA-Polymerase oder steriles Wasser und 60 U E. coli-RNase H wurden dazugegeben und das Gemisch bei 55°C 60 Minuten inkubiert. Sodann wurden 5 μl 10% Natriumdodecylsulfat (SDS; Nacalai Tesque) zu dem Gemisch gegeben, um die Enzyme zu inaktivieren. 50 μl des Reaktionsgemi sches wurden mit einem gleichen Volumen an sterilem Wasser verdünnt und auf eine Mikroplatte überführt. Ein Bildanalysegerät, FM BIO II Multi-View (Takara Shuzo), wurde für einen Nachweis bei einer Anregungswellenlänge von 505 nm eingesetzt.
Als Ergebnis wurde kein Fluoreszenzsignal bei Verwendung einer der Matrizen festgestellt, wenn Bca BEST-DNA-Polymerase nicht zugegeben wurde. Ebenfalls wurde kein Fluoreszenzsignal für das Reaktionsgemisch mit Bca BEST-DNA-Polymerase nachgewiesen, wenn die DNA als Matrize nicht zugegeben worden war. Auf der anderen Seite wurde ein Fluoreszenzsignal nachgewiesen, wenn 0,1 oder 1 ng der DNA als Matrize hinzugegeben worden waren. Ein interessierendes amplifiziertes Fragment mit etwa 190 bp wurde auch durch Elektrophorese auf einem 3% Agarosegel mit 0,00003% Ethidiumbromid lediglich dann festgestellt, wenn 0,1 oder 1 ng der DNA als Matrize in Gegenwart von Bca BEST-DNA-Polymerase zugegeben worden waren. Das heißt, die gleichen Ergebnisse wurden bei dem Nachweisverfahren unter Verwendung einer RNA-Sonde und bei dem herkömmlichen elektrophoretischen Nachweisverfahren erhalten. Somit wurde ein Verfahren zum Nachweis eines durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren erhaltenen amplifizierten Fragments unter Verwendung einer RNA-Sonde etabliert.
Beispiel 8
Die Verwendung eines Primers, der aus Desoxyribonukleotiden besteht, als einem der zwei Primer in dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde untersucht. MR1N3 (30) mit der in SEQ ID NO: 19 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz und der M4-Primer (Takara Shuzo) mit der in SEQ ID NO: 58 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz wurden als Primer verwendet. Bei dem MR1N3-Primer sind die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
27 mM Phosphat-Puffer (pH 7,3), 0,01% Rinderserumalbumin (BSA), 5% DMSO, 1 mM jeden dNTPs, 8 mM Magnesiumacetat, 30 pmol eines jeden der Primer, 1 ng der DNA als Matrize und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 24 μl gebracht.
Das Reaktionsgemisch wurde bei 98°C zwei Minuten hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. 11 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 30 U E. coli-RNase H wurden zugegeben, um das Reaktionsvolumen auf 25 μl einzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C 60 Minuten inkubiert. Sodann wurde das Gemisch bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. 5 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 4% NuSieve 3:1-Agarosegel unterzogen. Als Ergebnis wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment festgestellt.
Beispiel 9
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde verwendet, um hämorrhagisches E. coli O-157 nachzuweisen.
Die Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten Primer sind in SEQ ID NOs: 21-24 des Sequenzprotokolls gezeigt. Eine Kombination von Primern mit der in SEQ ID NO: 21 oder 22 gezeigten Sequenz und eine Kombination von Primern mit der in SEQ ID NO: 23 oder 24 gezeigten Sequenz wurden für einen Nachweis einer Sequenz, die gemäß Rinsho To Biseibutsu (Clinical Microbiology, 18(4):507-513 (1991)) Verotoxin 1 oder Verotoxin 2 von O-157 kodiert, erstellt. Primer, in denen die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind, wurden für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren verwendet. Ein Hitzeextrakt, der durch Abernten einer Kultur von hämorrhagischem E. coli O-157 (ATCC-Zugangsnummer 43895), Suspendieren in sterilem Wasser bei einer geeigneten Zelldichte und Behandeln bei 98°C für 10 Minuten hergestellt worden war, wurde als Matrize verwendet. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
27 mM Phosphat-Puffer (pH 7,3), 0,01% Rinderserumalbumin (BSA), 5% DMSO, 1 mM jeden dNTPs, 8 mM Magnesiumacetat, 60 pmol eines jeden Primers, die DNA als Matrize (Hitzeextrakt), entsprechend 104-106 Zellen, und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Reaktionsvolumen von 48 μl gebracht.
Das Reaktionsgemisch wurde bei 98°C eine Minute hitzedenaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. 5,5 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 60 U E. coli-RNase H wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C 60 Minuten inkubiert. Sodann wurde das Gemisch bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 4% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen.
Als Ergebnis konnten O-157 Verotoxin 1 und 2 unter Verwendung eines der Primerpaare und der DNA als Matrize, entsprechend 104 Zellen, nachgewiesen werden, was bestätigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren als Verfahren zum Nachweis eines virulenten Bakteriums verwendet werden kann.
Beispiel 10
Eine Amplifikation eines langkettigen DNA-Fragments durch das erfindungsgemäße Verfahren wurde untersucht. Eine doppelsträngige DNA als Matrize wurde wie folgt hergestellt. Zuerst wurde eine Bibliothek von aus normalem Magengewebe abgeleiteter mRNA unter Verwendung des Uni-ZAP XR-Vektors (Stratagene) gemäß einem herkömmlichen Verfahren hergestellt. Die Bibliothek wurde auf Klone mit einem Insert von etwa 2,1 kbp oder etwa 4,3 kbp selektiert. Die Klone wurden verwendet, um pBluescript SK (-)-Phagenvektoren durch in vitro-Exzision zu erhalten. Amplifizierte Fragmente mit etwa 2,2 kbp und etwa 4,4 kbp wurden unter Verwendung der Plasmide als Matrizen, des MCR-F-Primers und des MCR-R-Primers mit den in SEQ ID NOs: 25 bzw. 26 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen und des PCR-Amplifikationskits (Takara Shuzo) erhalten. Diese PCR-Fragmente wurden als Matrizen für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren verwendet. MF2N3 (24)-Primer und MR1N3 (24)-Primer mit den in SEQ ID NOs: 27 bzw. 28 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen, in denen die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind, wurden als Primer verwendet. Die Zusammensetzung des Reaktionsgemisches war wie folgt.
28 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5), 0,01% Rinderserumalbumin (BSA), 1% DMSO, 0,5 mM jeden dNTPs, 4 mM Magnesiumacetat, 30 pmol eines jeden der Primer, 0,2 mM Putrescin und steriles destilliertes Wasser wurden auf ein Volumen von 24,25 μl eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde bei 92°C zwei Minuten behandelt und sodann auf 55°C abgekühlt. 30 U RNase H und 5,5 U Bca BEST-DNA-Polymerase wurden zugegeben, um das Reaktionsvolumen auf 25 μl einzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch bei 4°C abgekühlt und 2,5 μl einer 0,5 M EDTA-Lösung wurden zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. 5 μl des Gemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 1% Agarosegel unterzogen.
Als Ergebnis wurde durch das erfindungsgemäße Verfahren ein amplifiziertes Fragment von etwa 2,2 kbp oder etwa 4,4 kbp erhalten, was bestätigt, dass das erfin dungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, um ein langkettiges DNA-Fragment zu amplifizieren.
Beispiel 11
Ein DNA-Mikroarray, auf den ein λ-DNA-Fragment mit etwa 400 bp, das durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren amplifiziert worden war, und λ-DNA-Fragmente mit 300 bp und 1000 bp, die durch PCR amplifiziert worden waren, punktförmig aufgetragen worden waren, wurde hergestellt. Die Nukleotidsequenz der λ-DNA ist von GenBank unter den Zugangsnummern V00636, J02459, M17233 und X00906 verfügbar. Die Sequenzen der in diesem Beispiel verwendeten Primer sind in SEQ ID NOs: 25 bis 26 und 29 bis 35 des Sequenzprotokolls gezeigt. Ein Reaktionsgemisch für das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren wurde wie folgt hergestellt.
34 mM Tricin-Hydrochlorid-Puffer (pH 8,7), 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,01% Rinderserumalbumin (BSA), 1% Dimethylsulfoxid, 4 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM jeden dNTPs, 500 pmol eines jeden der Primer, 100 ng des PCR-Amplifikationsprodukts als Matrize, 110 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 300 U klonierte RNase H wurden in einem Endreaktionsvolumen von 500 μl angesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde zur Homogenität gemischt, bei 55°C 60 Minuten inkubiert und sodann bei 90°C zwei Minuten erhitzt, um die Enzyme zu inaktivieren. Diese Lösung wurde in den darauffolgenden Schritten verwendet. Die punktförmig aufgetragenen DNA-Fragmente waren wie folgt.

1. Probe: Ein PCR-Amplifikationsprodukt (300 bp), das durch Verwendung einer λ-DNA als Matrize und einer Kombination von Primern mit der in SEQ ID NO: 29 oder 30 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz erhalten worden war, wurde in den pUC19-Vektor subkloniert. Das subklonierte Produkt wurde sodann unter Verwendung von Primern mit der in SEQ ID NO: 25 oder 26 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz PCR-amplifiziert. Das so erhaltene Produkt als Matrize und chimäre Oligonukleotidprimer mit der in SEQ ID NO: 31 oder 32 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz, in denen die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus des Primers durch Ribonukleotide ersetzt sind, wurden verwendet, um ein Produkt mit etwa 400 bp durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren zu amplifizieren, um die Probe zu erhalten. Fünf DNA-Lösungen, d.h. das Reaktionsgemisch bei seiner ursprünglichen Konzentration oder 2-, 4-, 8- oder 16-fache Ver dünnungen des Reaktionsgemisches mit einem Carbonat-Puffer (ein Carbonat-Puffer bei einer Konzentration von 50 mM wurde in jedem Fall für eine Verdünnung verwendet) wurden für ein punktförmiges Auftragen verwendet.
2. Probe: Das vorstehend in 1 amplifizierte DNA-Fragment wurde mit Microcon-100 (Takara Shuzo) behandelt. Sodann wurden fünf DNA-Lösungen durch Anpassen der Konzentrationen auf 0,125 μg/l, 0,25 μg/μl, 0,5 μg/μl, 1,0 μg/μl und 2,0 μg/μl mit dem 50 mM Carbonat-Puffer hergestellt.
3. Positivkontrolle: Ein PCR-Amplifikationsprodukt (300 bp), das durch Verwendung der λ-DNA als Matrize und einer Kombination von Primern mit der in SEQ ID NO: 29 oder 30 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz erhalten worden war, wurde mit Microcon-100 behandelt. Sodann wurden fünf DNA-Lösungen durch Anpassen der Konzentrationen auf 0,125 μg/μl, 0,25 μg/μl, 0,5 μg/μl, 1,0 μg/μl und 2,0 μg/μl mit dem 50 mM Carbonat-Puffer hergestellt.
4. Positivkontrolle: Ein PCR-Amplifikationsprodukt (1000 bp), das durch Verwendung der λ-DNA als Matrize und einer Kombination von Primern mit der in SEQ ID NO: 33 oder 34 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz erhalten worden war, wurde mit Microcon-100 behandelt. Sodann wurden vier DNA-Lösungen durch Anpassen der Konzentrationen auf 0,125 μg/μl, 0,25 μg/μl, 0,5 μg/μl und 1,0 μg/μl mit dem 50 mM Carbonat-Puffer hergestellt.
5. Negativkontrolle: Ein PCR-Amplifikationsprodukt (300 bp), das durch Verwendung der λ-DNA als Matrize und einer Kombination von Primern mit der in SEQ ID NO: 33 oder 35 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz erhalten worden war, wurde in den pUC19-Vektor subkloniert. Das subklonierte Produkt wurde sodann unter Verwendung von Primern mit der in SEQ ID NO: 25 oder 26 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz PCR-amplifiziert. Das so erhaltene Produkt als Matrize und Primer mit der in SEQ ID NO: 31 oder 32 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz als Primer wurden verwendet, um ein Produkt mit etwa 400 bp durch das erfindungsgemäße Amplifikationsverfahren zu amplifizieren, um die Negativkontrolle zu erhalten. Fünf DNA-Lösungen, d.h. das Reaktionsgemisch bei seiner ursprünglichen Konzentration oder 2-, 4-, 8- oder 16-fache Verdünnungen des Reaktionsgemisches mit einem Carbonat-Puffer (ein Carbonat-Puffer bei einer Konzentration von 50 mM wurde für eine Verdünnung in jedem Fall verwendet), wurden für ein punktförmiges Auftragen verwendet.
6. Negativkontrolle: Das vorstehend in 5 erhaltene DNA-Fragment wurde mit Microcon-100 behandelt. Sodann wurden fünf DNA-Lösungen durch Anpassen der Konzentrationen auf 0,125 μg/μl, 0,25 μg/μl, 0,5 μg/μl, 1,0 μg/μl und 2,0 μg/μl mit dem 50 mM Carbonat-Puffer hergestellt.

Die so hergestellten entsprechenden DNA-Lösungen wurden auf einen Glasobjektträger punktförmig aufgetragen, auf den Aminogruppen unter Verwendung einer Ausrüstung für eine Herstellung von DNA-Chips (Genetic Microsystems (GMS)) eingebracht worden waren (Matsunami Glass), und diese wurden unter Verwendung von UV-Strahlung immobilisiert. Der Objektträger wurde mit 0,2% SDS, gefolgt von destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet und sodann als DNA-Array verwendet.
Ein PCR-Amplifikationsprodukt (300 bp), das durch Verwendung einer Kombination von Primern mit der in SEQ ID NO: 29 oder 30 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz erhalten worden war, wurde mit Cy5 unter Verwendung des Label IT Cy5R-Markierungskits (Takara Shuzo) für eine Verwendung als Sonde markiert. Eine Hybridisierung erfolgte unter Verwendung einer Vorhybridisierungslösung und einer Hybridisierungslösung wie in den Anweisungen zu IntelliGene (Takara Shuzo) beschrieben. Zuerst wurde der DNA-Array einer Vorhybridisierung bei Raumtemperatur für zwei Stunden unterzogen. Die Hybridisierungslösung mit der denaturierten Cy5-markierten Sonde wurde auf den DNA-Array getropft. Ein Deckglas wurde darüber gelegt. Die Seiten des Deckglases wurden mit einem Film verschlossen. Der verschlossene DNA-Array wurde bei 65°C 13 Stunden inkubiert. Nach Entfernung des Deckglases wurde der DNA-Array in 2 × SSC bei 65°C 5 Minuten, in einer Lösung mit 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 65°C 5 Minuten und schlussendlich in 0,2 × SSC bei Raumtemperatur 5 Minuten gewaschen und an der Luft getrocknet. Der DNA-Array wurde sodann einem Mikroarray-Scanner (GMS) für eine Analyse der Fluoreszenzsignale aus den jeweiligen Spots unterzogen.
Als Ergebnis wurde ein Fluoreszenzsignal an jeder der Positionen festgestellt, auf die Fragmente, die durch das PCR-Verfahren (die Positivkontrollen wie vorstehend in 3 und 4 beschrieben) und das erfindungsgemäße Verfahren (die Proben wie vorstehend in 1 und 2 beschrieben) amplifiziert worden waren, punktförmig aufgetragen worden waren. Die Intensitäten der Signale waren wie folgt: Probe 2 > Positivkontrolle 4 > Probe 1 > Positivkontrolle 3. Auf der anderen Seite wurde kein Signal bezüglich aller Negativkontrollen 5 und 6 festgestellt. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde bestätigt, dass ein nicht-aufgereinigtes oder aufgereinigtes DNA-Fragment, das durch das erfindungsgemäße Verfahren amplifiziert wurde, als DNA-Fragment für eine Immobilisierung bei der Herstellung eines DNA-Chips günstig verwendet werden kann.
Beispiel 12

(1) Der Aufbau eines Primers, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren bei Verwendung eines PCR-amplifizierten Fragments als Matrize verwendet wurde, wurde untersucht. Zunächst wurden Primer mit einer der in SEQ ID NOs: 36-41 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen in herkömmlicher Weise synthetisiert. Die Strukturen der jeweiligen Primer sind wie folgt.
(i) R1-S1-Primer: Ausgehend von dem 5'-Terminus, 7 Basen einer Spacersequenz, 17 Basen einer M13RV-Sequenz (oder RV-Sequenz; die Nukleotidsequenz des M13RV-Primers (Takara Shuzo)) und 20 Basen einer Sense-Primer-Sequenz für eine λ-DNA-spezifische PCR;
(ii) R1-A3-Primer: Ausgehend von dem 5'-Terminus, 7 Basen einer Spacersequenz, 17 Basen der M13RV-Sequenz und 20 Basen einer Antisense-Primer-Sequenz für eine λ-DNA-spezifische PCR;
(iii) R2-S1-Primer: Ausgehend von dem 5'-Terminus, 25 Basen einer Spacersequenz, 17 Basen der M13RV-Sequenz und 20 Basen einer Sense-Primer-Sequenz für eine λ-DNA-spezifische PCR;
(iv) R2-A3-Primer: Ausgehend von dem 5'-Terminus, 25 Basen einer Spacersequenz, 17 Basen der M13RV-Sequenz und 20 Basen einer Antisense-Primer-Sequenz für eine λ-DNA-spezifische PCR;
(v) R3-S1-Primer: Ausgehend von dem 5'-Terminus, 58 Basen einer Spacersequenz, 17 Basen der M13RV-Sequenz und 20 Basen einer Sense-Primer-Sequenz für eine λ-DNA-spezifische PCR; und
(vi) R3-A3-Primer: Ausgehend von dem 5'-Terminus, 58 Basen einer Spacersequenz, 17 Basen der M13RV-Sequenz und 20 Basen einer Antisense-Primer-Sequenz für eine λ-DNA-spezifische PCR.

Das M13RV-20mer weist eine Sequenz mit insgesamt 20 Basen auf, die aus 17 Basen der M13RV-Sequenz und drei Basen an dem 5'-Terminus besteht. Daher wird, wenn M13RV-20mer in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, die Länge der Spacersequenzen in den vorstehend beschriebenen Primern 4 Basen, 22 Basen bzw. 55 Basen. Primer ohne eine Spacersequenz wurden auch als Kontrollen für die vorstehend beschriebenen Primer hergestellt.
Beispielsweise wird, wenn das Primerpaar R1-S1-Primer/R1-A3-Primer verwendet wird, ein amplifiziertes Fragment mit 348 bp erhalten. 7 Basen an beiden Enden des amplifizierten Fragments entsprechen den Spaceranteilen. Die RV-Sequenzen liegen innerhalb der Spaceranteile. Die λ-DNA-Sequenzen liegen innerhalb der RV-Sequenzen.
In ähnlicher Weise wird, wenn das Primerpaar R2-S1-Primer/R2-A3-Primer verwendet wird, ein amplifiziertes Fragment mit 384 bp erhalten, in dem 25 Basen an beiden Enden des amplifizierten Fragments den Spaceranteilen entsprechen. Des Weiteren wird, wenn das Primerpaar R3-S1-Primer/R3-A3-Primer verwendet wird, ein amplifiziertes Fragment mit 450 bp erhalten, in dem 58 Basen an beiden Enden des amplifizierten Fragments den Spaceranteilen entsprechen. Auf der anderen Seite weist ein Fragment, das unter Verwendung von Kontrollprimern amplifiziert wurde, keinen Spaceranteil auf. Diese PCR-amplifizierten Fragmente wurden als Matrizen für die nachstehende Untersuchung verwendet.
Einer der zwei Primer, M13RV-2N-17mer-Primer oder M13RV-2N-20mer mit der in SEQ ID NO: 42 oder 43 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz, wurde in diesem Beispiel verwendet. In den Primern sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt. 5 μl eines Gemisches aus 20 μM des Primers, etwa 20 ng der Matrize und 0,01% Propylendiamin wurden bei 98°C zwei Minuten denaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. Sodann wurden 34 mM Tricin-Puffer (pH 8,7), 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,01% BSA, 1% DMSO, 4 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM jeden dNTPs, 1 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 15 U RNase H zugegeben, um das Endreaktionsvolumen auf 25 μl einzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch auf 4°C abgekühlt und sodann wurden 2,5 μl einer 0,5 M EDTA-Lösung zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen. Als Ergebnis wurde, wenn M13RV-2N-17mer verwendet wurde, eine Zunahme der Amplifikationswirksamkeit in Abhängigkeit von der Länge der Spacersequenz in der nachstehenden Reihenfolge festgestellt: 25mer > 7mer > 58mer > keine Spacersequenz. Wenn M13RV-2N-20mer verwendet wurde, wurde eine Zunahme der Amplifikationswirksamkeit in Abhängigkeit von der Länge der Spacersequenz in der nachstehenden Reihenfolge festgestellt: 22mer > 4mer > 55mer > keine Spacersequenz. Ferner wurde, wenn die M13RV-Sequenzen in den vorstehend in (i) bis (vi) beschrieben Primern durch M13M4-Sequenzen ersetzt wurden, eine ähnliche Tendenz bezüglich der Beziehung zwischen der Spacersequenz und der Amplifikationswirksamkeit festgestellt. Somit wurde bestätigt, dass, wenn ein lineares DNA-Fragment wie ein PCR-amplifiziertes Fragment als Matrize verwendet wird, das Vorsehen einer Spacersequenz (Anteil) bei einem Entwerfen der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Primer zu einer erhöhten Amplifikationswirksamkeit führt.

(2) Die Amplifikation einer Matrize mit hohem GC-Gehalt in dem Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz wurde unter Verwendung einer erhöhten Reaktionstemperatur untersucht. Zuerst wurden Primer mit der in SEQ ID NO: 44 oder 45 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz für eine PCR-Amplifikation einer 307 bp-Region (GC-Gehalt: 62,5%) des CDC2-verwandten Proteinkinase PISSLRE-Gens (GenBank-Zugangsnummer AA789328) hergestellt. Des Weiteren wurden Primer mit der in SEQ ID NO: 46 oder 47 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz für eine PCR-Amplifikation einer 284 bp-Region (GC-Gehalt: 61,3%) des Typ II Cytoskelett 1-Keratin-Gens (GenBank-Zugangsnummer AA706022) hergestellt. Eine PCR-Amplifikation erfolgte unter Verwendung dieser Primer und käuflich verfügbarer DNA-Fragmente (Research Genetics) als Matrizen. Die jeweiligen PCR-amplifizierten Fragmente, die durch Verwendung der vorstehend beschriebenen Primerpaare erhalten worden waren, weisen Spacersequenzen und die M13RV-Sequenzen an beiden Enden auf. Die Fragmente wurden als Matrizen für die Erfindung verwendet.

M13RV-2N-17mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 42 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz oder M13RV-2N-20mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 43 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz wurde in diesem Beispiel verwendet. In den Primern sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt. 10 μl eines Gemisches von 100 pmol des Primers, 20 ng der Matrize und 0,01% Propylendiamin wurden bei 98°C zwei Minuten denaturiert und sodann auf 55°C oder 60°C abge kühlt. Sodann wurden 34 mM Tricin-Puffer (pH 8,7), 10 mM KCl, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,01% BSA, 1% DMSO, 4 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM jeden dNTPs, 11 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 30 U RNase H zugegeben, um das Endreaktionsvolumen auf 50 μl einzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C oder 60°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch auf 4°C abgekühlt. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf 3% Agarosegel unterzogen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Reaktionstemperatur	Verwendete Primer	Gen und Ergebnisse einer Amplifikation
Reaktionstemperatur	Verwendete Primer	CDC2-verwandt	Typ II-Cytoskelett
55°C	M13RV-2N-17mer	++	++
55°C	M13RV-2N-20mer	++	++
60°C	M13RV-2N-17mer	+	+
60°C	M13RV-2N-20mer	++++	++++

+ bis ++++: Der Amplifikationsgrad wurde in vier Stufen aufgenommen.
-: Keine Amplifikation wurde festgestellt.

Wie in Tabelle 1 gezeigt, wurde die interessierende Region wirksam selbst dann amplifiziert, wenn eine Matrize mit einem hohen GC-Gehalt verwendet wurde. Diese Amplifikation wurde durch Erhöhen der Reaktionstemperatur (von 55°C auf 60°C) und durch Verwendung eines Primers mit einem höheren Tm-Wert im Vergleich zu einem optimalen Primer für eine Reaktion bei 55°C erreicht, wenn die Reaktion bei 60°C erfolgte.

(3) Die Beziehung zwischen der Länge eines amplifizierten Fragments und der Menge des Amplifikationsprodukts in dem Verfahren zur Amplifizierung einer Nukleotidsequenz unter hohen Reaktionstemperaturbedingungen wurde untersucht. Zuerst wurde ein Paar von Primern mit der in SEQ ID NO: 48 oder 49 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz für eine Amplifikation einer 800 bp-Region der lambda-DNA (Takara Shuzo) und einem Paar von Primern mit der in SEQ ID NO: 50 oder 51 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz für eine Amplifikation einer 400 bp-Region der lambda-DNA gemäß einem herkömmlichen Verfahren synthetisiert. Eine PCR unter Verwendung eines dieser Primerpaare und der λ-DNA als Matrize wurde durchgeführt, um ein amplifiziertes Fragment zu erhalten. Ein amplifiziertes Fragment mit etwa 1,1 kbp wurde auch unter Verwendung des pUC19-911-Plasmids wie in Beispiel 5 (1) beschrieben als Matrize und MF2 (24)-Primer und MR1 (24)-Primer, die die in SEQ ID NO: 16 bzw. 17 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen aufweisen, hergestellt. Die PCR-amplifizierten Fragmente, die unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Primerpaare erhalten wurden, weisen Spacersequenzen und die M13RV- oder M4-Sequenzen an beiden Enden auf. Diese Fragmente wurden als Matrizen für die Erfindung verwendet.

M13RV-2N-17mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 42 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz oder M13-RV-2N-20mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 43 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz wurde als Primer in diesem Beispiel verwendet. In den Primern sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Eine Kombination von M13M4-3N-20mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 55 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz und M13RV-3N-20mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 43 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz und eine Kombination von M13M4-3N-24mer-Primer und M13RV-3N-24mer-Primer mit den in SEQ ID NO: 56 bzw. 57 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen wurden für eine Amplifikation einer Region mit etwa 1 kbp verwendet. In den Primern sind die ersten bis dritten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Die Reaktion erfolgte wie folgt. 10 μl eines Gemisches aus 10 pmol des Primers, etwa 20 ng der Matrize und 0,01% Propylendiamin wurden bei 98°C zwei Minuten denaturiert und sodann auf 55°C oder 60°C abgekühlt. Sodann wurden 34 mM Tricin-Puffer (pH 8,7), 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,01% BSA, 1% DMSO, 4 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM jeden dNTPs, 11 U Bca BEST-DNA-Polymerase und 30 U RNase H zugegeben, um das Endreaktionsvolumen auf 50 μl einzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C oder 60°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch auf 4°C abgekühlt und sodann wurden 5 μl einer 0,5 M EDTA-Lösung zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen. Die Ergebnisse sind nachstehend in den Tabellen 2 und 3 gezeigt. Tabelle 2

Reaktionstemperatur	Verwendete Primer	Länge des amplifizierten Fragments und Ergebnisse
Reaktionstemperatur	Verwendete Primer	400 bp	800 bp
55°C	M13RV-2N-17mer	++	++
55°C	M13RV-2N-20mer	++	++
60°C	M13RV-2N-17mer	+	+
60°C	M13RV-2N-20mer	++++	++++

Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurden Fragmente für Regionen von 400 bp und 800 bp wirksam durch Einstellen der Länge des Primers für eine Amplifikation von einem 17mer auf ein 20mer und durch Erhöhung der Reaktionstemperatur von 55°C auf 60°C amplifiziert. Tabelle 3

Reaktions temperatur	Verwendete Primer	Länge des amplifizierten Fragments und Ergebnisse 1034 bp
55°C	M13RV-3N-20mer & M13M4-3N-20mer	++
55°C	M13RV-3N-24mer & M13M4-3N-24mer	++
65°C	M13RV-3N-20mer & M13M4-3N-20mer	+
65°C	M13RV-3N-24mer & M13M4-3N-24mer	++++

Ferner wurde, wie in Tabelle 3 gezeigt, ein Fragment für eine Region von etwa 1 kbp wirksam durch Einstellen der Länge des Primers für eine Amplifikation von einem 20mer auf ein 24mer und durch Erhöhung der Reaktionstemperatur von 55°C auf 65°C amplifiziert. Des Weiteren wurden ähnliche Ergebnisse für eine Amplifikation eines langkettigen DNA-Fragments wie in Beispiel 10 beschrieben durch Verwendung längerer Primer und einer erhöhten Reaktionstemperatur erhalten. Eine Erhöhung der Amplifikationswirksamkeit wurde festgestellt, wenn eine Region von etwa 2 kbp oder länger amplifiziert wurde.
Beispiel 13

(1) Die Verwendung einer zu Bca BEST-DNA-Polymerase unterschiedlichen hitzeresistenten DNA-Polymerase in dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde untersucht. Bst-DNA-Polymerase (New England Biolabs) wurde als hitzeresistente DNA-Polymerase verwendet. Ein Paar von Primern, 5'-ID-Primer und 3'-ID-Primer mit den in SEQ ID NO: 52 bzw. 53 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenzen, wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren synthetisiert. Eine PCR wurde unter Verwendung des Primerpaars und eines käuflich verfügbaren DNA-Fragments für das Cyclin A-Gen (Research Genetics) als Matrize durchgeführt, was in einem amplifizierten Fragment von etwa 300 bp resultierte. Das durch Verwendung des Primerpaars erhaltene PCR-amplifizierte Fragment weist die M13RV-Sequenzen an beiden Enden auf. Das Fragment wurde als Matrize für die Erfindung verwendet.

M13RV-2N-17mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 42 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz wurde als Primer in diesem Beispiel verwendet. In dem Primer sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Die Reaktion wurde wie folgt durchgeführt. 10 μl eines Gemisches von 20 μM des Primers, etwa 20 ng der Matrize und 0,01% Propylendiamin wurden bei 98°C zwei Minuten denaturiert und sodann auf 55°C abgekühlt. Sodann wurden 34 mM Tricin-Puffer (pH 8,7), 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,01% BSA, 1% DMSO, 4 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM jeden dNTPs, 4, 8, 12 oder 16 U Bst DNA-Polymerase und 30 U RNase H zugegeben, um das Endreaktionsvolumen auf 50 μl einzustellen. Als Kontrolle wurde ein Reaktionsgemisch mit einer zu der vorstehend beschriebenen Zusammensetzung identischen Zusammensetzung hergestellt, mit der Ausnahme, dass 11 U Bca BEST-DNA-Polymerase verwendet wurden. Das Reaktionsgemisch wurde bei 55°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch auf 4°C abgekühlt und sodann wurden 5 μl einer 0,5 M EDTA-Lösung zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen. Als Ergebnis wurde bei Verwendung einer jeden der verschiedenen Einheiten an Bst-DNA-Polymerase ein interessierendes amplifiziertes Fragment erhalten. Somit wurde bestätigt, dass hitzeresistente DNA-Polymerasen in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können.

(2) Die Verwendung einer mesophilen DNA-Polymerase in dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde untersucht. 5'→3'Exo-Aktivität (-)-Klenow-Fragment (Takara Shu zo) wurde als mesophile DNA-Polymerase verwendet. Die vorstehend in (1) hergestellte DNA wurde als Matrizen-DNA für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet.

Der M13RV-2N-16mer-Primer mit der in SEQ ID NO: 54 des Sequenzprotokolls gezeigten Sequenz wurde als Primer in diesem Beispiel verwendet. In dem Primer sind die ersten und zweiten Basen ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt. Die Reaktion erfolgte wie folgt. 10 μl eines Gemisches aus 20 μM des Primers, etwa 20 ng Matrize und 0,01% Propylendiamin wurden bei 98°C zwei Minuten denaturiert und sodann auf 40°C abgekühlt. Sodann wurden 34 mM Tricin-Puffer (pH 8,7), 10 mM Kaliumchlorid, 10 mM Ammoniumsulfat, 0,01% BSA, 1% DMSO, 4 mM Magnesiumacetat, 0,5 mM jeden dNTPs, 0, 2, 4, 6 oder 8 U Klenow-Fragment und 30 U RNase H zugegeben, um das Endreaktionsvolumen auf 50 μl einzustellen. Das Reaktionsgemisch wurde bei 40°C eine Stunde inkubiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde das Gemisch auf 4°C abgekühlt und sodann 5 μl einer 0,5 M EDTA-Lösung zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. 3 μl des Reaktionsgemisches wurden einer Elektrophorese auf einem 3% NuSieve 3:1-Agarosegel (Takara Shuzo) unterzogen. Als Ergebnis wurde ein interessierendes amplifiziertes Fragment in Fällen erhalten, in denen die verschiedenen Einheiten des Klenow-Fragments verwendet wurden, außer in dem Fall, in dem kein Klenow-Fragment zugegeben wurde. Somit wurde bestätigt, dass mesophile DNA-Polymerasen in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können.
Beispiel 14
Chimäre Oligonukleotidprimer wurden für eine Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren untersucht. Eine DNA als Matrize und Primer wurden wie in Beispiel 1 (1) beschrieben synthetisiert. Die Strukturen der Primer, die in diesem Beispiel verwendet wurden, sind nachstehend im Detail beschrieben:

Primerpaar 1: Eine Kombination von Primer mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 2 oder 3 des Sequenzprotokolls gezeigt, die vollständig aus Desoxyribonukleotiden bestehen;
Primerpaar 2: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 59 oder 60 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die sechsten und siebten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar 3: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 61 oder 62 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die fünften und sechsten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar 4: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 63 oder 64 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die vierten und fünften Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar 5: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 65 oder 66 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die dritten und vierten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar 6: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 67 oder 68 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die zweiten und dritten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind;
Primerpaar 7: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 2 oder 3 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die ersten und zweiten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind; und
Primerpaar 8: Eine Kombination von Primern mit einer Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 67 oder 68 des Sequenzprotokolls gezeigt, in denen die zweiten und dritten Desoxyribonukleotide ausgehend von dem 3'-Terminus durch Ribonukleotide ersetzt sind und die Phosphatbindung auf der 5'-terminalen Seite des dritten Ribonukleotids ausgehend von dem 3'-Terminus durch eine Phosphorothioatbindung ersetzt ist.

Amplifikationsbedingungen und das Nachweisverfahren waren wie in Beispiel 1 (2) und (3) beschrieben. Als Ergebnis wurde ein amplifiziertes Fragment mit einer in teressierenden Länge für jedes der Primerpaare 2-8 festgestellt. Bezüglich der Primerpaare 2-7 nahm die Menge des Amplifikationsprodukts mit Abnahme der Anzahl an Desoxyribonukleotiden an dem 3'-Terminus zu. Insbesondere wurde das meiste Amplifikationsprodukt für das Primerpaar 7 ohne Desoxyribonukleotid an dem 3'-Terminus festgestellt. Auf der anderen Seite wurde kein amplifiziertes Fragment für das Primerpaar 1 festgestellt. Ferner bestätigt die Tatsache, dass interessierende amplifizierte Fragmente für die Primerpaare 6 und 8 festgestellt wurden, das sowohl ein modifiziertes Ribonukleotid als auch ein nicht-modifiziertes Ribonukleotid als Ribonukleotid in einem Primer in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist.
Industrielle Anwendbarkeit
Erfindungsgemäß wird ein einfaches und wirksames Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass eine DNA-Synthesereaktion in Gegenwart eines chimären Oligonukleotidprimers erfolgt. Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Bereitstellung eines amplifizierten DNA-Fragments in großen Mengen bereitgestellt. Ein wirksames Verfahren zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz wird ebenfalls durch Kombination des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Amplifikation einer Nukleotidsequenz mit einem weiteren Nukleinsäure-Amplifikationsverfahren bereitgestellt. Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Nachweis einer Nukleotidsequenz zum Nachweisen oder Quantifizieren eines Mikroorganismus wie eines Virus, eines Bakteriums, eines Pilzes und einer Hefe, sowie ein Verfahren zum Echtzeitnachweis des amplifizierten DNA-Fragments, das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten wird, bereitgestellt. Des Weiteren wird erfindungsgemäß ein Gensequenzierverfahren im großen Maßstab bereitgestellt.
Freier Text für das Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 1: Synthetische DNA, die einem Teil der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz entspricht und als Matrize verwendet wurde.
SEQ ID NO: 2: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 3: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 4: Entworfenes Oligonukleotid, das als Sonde für einen Nachweis eines amplifizierten Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz verwendet wurde.
SEQ ID NO: 5: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als oberer pUC19 (2) NN für eine Amplifikation eines Teils des Plasmid pUC19.
SEQ ID NO: 6: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als unterer pUC19 NN für eine Amplifikation eines Teils des Plasmid pUC19.
SEQ ID NO: 7: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19.
SEQ ID NO: 8: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als unterer pUC19 542, für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19.
SEQ ID NO: 9: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19.
SEQ ID NO: 10: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als unterer pUC19 150, für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19.
SEQ ID NO: 11: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als oberer pUC19 249, für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19.
SEQ ID NO: 12: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 13: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 14: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 15: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 16: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als MF2N3 (24), für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19-249 oder des Plasmids pUC19-911.
SEQ ID NO: 17: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als MR1N3 (24), für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19-249 oder des Plasmids pUC19-911.
SEQ ID NO: 18: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19.
SEQ ID NO: 19: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als MR1N3, für eine Amplifikation eines Teils des Plasmids pUC19.
SEQ ID NO: 20: Synthetische RNA, die als Sonde für einen Nachweis eines amplifizierten Teils des Plasmids pUC19 verwendet wurde.
SEQ ID NO: 21: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Verotoxin 1-kodierenden Sequenz aus hämorrhagischem Escherichia coli O-157.
SEQ ID NO: 22: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Verotoxin 1-kodierenden Sequenz aus hämorrhagischem Escherichia coli O-157.
SEQ ID NO: 23: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Verotoxin 2-kodierenden Sequenz aus hämorrhagischem Escherichia coli O-157.
SEQ ID NO: 24: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Verotoxin 2-kodierenden Sequenz aus hämorrhagischem Escherichia coli O-157.
SEQ ID NO: 25: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als MCR-F, für eine Amplifikation eines langen DNA-Fragments.
SEQ ID NO: 26: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als MCR-R, für eine Amplifikation eines langen DNA-Fragments.
SEQ ID NO: 27: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als MF2N3 (24), für eine Amplifikation eines langen DNA-Fragments.
SEQ ID NO: 28: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als MR1N3 (24), für eine Amplifikation eines langen DNA-Fragments.
SEQ ID NO: 29: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 30: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 31: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 32: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 33: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 34: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 35: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 36: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als R1-S1, für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 37: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als R1-A3, für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 38: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als R2-S1, für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 39: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als R2-A3, für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 40: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als R3-S1, für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 41: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als R3-A3, für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 42: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als M13RV-2N-17mer.
SEQ ID NO: 43: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als M13RV-2N-20mer.
SEQ ID NO: 44: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils des CDC2-verwandten Proteinkinase PISSLRE-Gens.
SEQ ID NO: 45: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils des CDC2-verwandten Proteinkinase PISSLRE-Gens.
SEQ ID NO: 46: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils des Typ II Cytoskelett 11-Keratin-Gens.
SEQ ID NO: 47: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils des Typ II Cytoskelett 11-Keratin-Gens.
SEQ ID NO: 48: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 49: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 50: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 51: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der Bakteriophage lambda-DNA.
SEQ ID NO: 52: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als 5'ID, für eine Amplifikation eines Teils der Cyclin A-DNA.
SEQ ID NO: 53: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als 3'ID, für eine Amplifikation eines Teils der Cyclin A-DNA.
SEQ ID NO: 54: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als M13RV-2N-16mer.
SEQ ID NO: 55: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als M13M4-3N-16mer.
SEQ ID NO: 56: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als M13M4-3N-24mer.
SEQ ID NO: 57: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als M13RV-3N-24mer.
SEQ ID NO: 58: Entworfener Oligonukleotidprimer, bezeichnet als M13M4-17mer.
SEQ ID NO: 59: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 60: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 61: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 62: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 63: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 64: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 65: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 66: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 67: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.
SEQ ID NO: 68: Entworfener Oligonukleotidprimer für eine Amplifikation eines Teils der humanen Transferrinrezeptor-kodierenden Sequenz.

Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zum Amplifizieren einer Nukleotidsequenz oder zum Erzeugen einer Nukleinsäure in großen Mengen, dadurch charakterisiert, dass das Verfahren umfasst: (a) Herstellen eines Reaktionsgemisches durch Mischen einer Nukleinsäure als einer Matrize, eines Desoxyribonukleotidtriphosphats, einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität, mindestens eines Primers und einer Endonuklease, die einen aus dem Primer erzeugten verlängerten Strang spaltet, wobei der Primer ein chimärer Oligonukleotidprimer ist, der im Wesentlichen komplementär zu der Basensequenz der Nukleinsäure als der Matrize ist und Desoxyribonukleotide und ein oder mehrere Ribonukleotid(e) enthält, wobei das/die Ribonukleotid(e) an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des Primers gelegen ist/sind, wobei die Endonuklease bei einer Stelle spaltet, die das Ribonukleotid enthält, und (b) Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine Zeitspanne, die ausreicht, um ein Reaktionsprodukt unter Bedingungen zu erzeugen, bei denen ein spezifisches Anlagern des Primers an die Nukleinsäure als eine Matrize, eine Synthesereaktion eines verlängerten Strangs und eine Strangverdrängungsreaktion durch die DNA-Polymerase und eine Reaktion eines Spaltens des verlängerten Strangs durch die Endonuklease stattfinden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Reaktionsgemisch isotherm inkubiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Reaktionsgemisch ferner einen chimären Oligonukleotidprimer mit einer Sequenz enthält, die im Wesentlichen homolog zu der Basensequenz der Matrize ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch charakterisiert, dass das Verfahren umfasst: (a) Behandeln einer Nukleinsäure als einer Matrize mit mindestens einem Primer, der im Wesentlichen komplementär zu der Basensequenz der Nukleinsäure ist, und einer DNA-Polymerase, um einen Primer-verlängerten Strang zu synthetisieren, der komplementär zu der Matrize ist, wobei der Primer ein chimärer Oligonukleotidprimer mit Desoxyribonukleotiden und einem oder mehreren Ribonukleotid(en) ist, wobei das/die Ribonukleotid(e) an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite des Primers gelegen ist/sind, wobei die Endonuklease bei einer Stelle spaltet, die das Ribonukleotid enthält, (b) Spalten des Primer-verlängerten Strangs einer doppelsträngigen Nukleinsäure, die in Schritt (a) erhalten wurde, mit der Endonuklease bei einer Stelle, die das Ribonukleotid enthält, und (c) Verlängern einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Matrize ist, unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität von dem 3'-Terminus des Primeranteils der doppelsträngigen Nukleinsäure, die in Schritt (b) gespalten wurde, um eine Strangverdrängung zu bewirken.
Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei der Schritt (b) und der Schritt (c) sequenziell wiederholt werden.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem regenerierten Primer-verlängerten Strang in Schritt (b) wieder verwendet wird und das Verfahren ferner die Schritte umfasst: (d) Behandeln eines freigesetzten verdrängten Strangs, der in Schritt (c) erhalten wurde, als einer Matrize mit mindestens einem Primer, der zu demjenigen, der in Schritt (a) verwendet wurde, unterschiedlich ist, und einer DNA-Polymerase, um einen Primer-verlängerten Strang zu synthetisieren, der komplementär zu dem verdrängten Strang ist, wobei der Primer, der zu dem in Schritt (a) verwendeten unterschiedlich ist, ein chimärer Oligonukleotidprimer ist, der im Wesentlichen komplementär zu der Basensequenz des verdrängten Strangs ist und ein Desoxyribonukleotid und ein Ribonukleotid enthält, wobei das Ribonukleotid an dem 3'-Terminus oder an der 3'- terminalen Seite des Primers gelegen ist, wobei die Endonuklease bei einer Stelle spaltet, die das Ribonukleotid enthält, (e) Spalten des Primer-verlängerten Strangs einer doppelsträngigen Nukleinsäure, die in Schritt (d) erhalten wurde, mit der Endonuklease bei einer Stelle, die das Ribonukleotid enthält, und (f) Verlängern einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu der Matrize ist, unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität von dem 3'-Terminus des Primeranteils der doppelsträngigen Nukleinsäure, die in Schritt (e) gespalten wurde, um eine Strangverdrängung zu bewirken, wobei eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem regenerierten Primer-verlängerten Strang in Schritt (e) wieder verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die entsprechenden Schritte isotherm durchgeführt werden.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Endonuklease eine Endoribonuklease ist.
Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Endoribonuklease RNase H ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der chimäre Oligonukleotidprimer zwei oder mehrere aufeinander folgende Ribonukleotidreste aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der chimäre Oligonukleotidprimer ein oder mehrere modifizierte Ribonukleotide enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei der chimäre Oligonukleotidprimer ein (α-S)-Ribonukleotid enthält, worin das Sauerstoffatom, das an das Phosphoratom an der α-Position des Ribonukleotids gebunden ist, durch ein Schwefelatom ersetzt ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Nukleinsäure, die als die Matrize verwendet wird, eine einzelsträngige DNA oder eine doppelsträngige DNA ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, das nach Umwandeln einer doppelsträngigen DNA als der Matrize in einzelsträngige DNAs durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die Nukleinsäure, die als die Matrize verwendet wird, cDNA ist, die aus einer RNA durch eine reverse Transkriptionsreaktion erhalten wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 15, das nach Synthetisieren der cDNA durch eine reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung von RNA als einer Matrize durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei ein Primer, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Oligo-dT-Primer, einem zufälligen Primer und einem spezifischen Primer, als ein Primer für die reverse Transkriptionsreaktion verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 15 oder 16, wobei ein chimärer Oligonukleotidprimer als ein Primer für die reverse Transkriptionsreaktion verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 18, wobei eine DNA-Polymerase mit einer reversen Transkriptaseaktivität als eine reverse Transkriptase verwendet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 15 bis 19, wobei die reverse Transkriptionsreaktion und die Synthese des verlängerten Strangs, der komplementär zu der Matrize ist, unter Verwendung einer DNA-Polymerase erfolgen, die eine reverse Transkriptaseaktivität und eine Strangverdrängungsaktivität aufweist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 19, wobei die DNA-Polymerase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Klenow-Fragment einer DNA-Polymerase I aus Escherichia coli, Bst-DNA-Polymerase, der die 5'-3'-Exonuklease fehlt, aus Bacillus stearothermophilus und Bca-DNA-Polymerase, der die 5'→3'-Exonuklease fehlt, aus Bacillus caldotenax.
Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei die DNA-Polymerase Bst-DNA-Polymerase, der die 5'→3'-Exonuklease fehlt, aus Bacillus stearothermophilus oder Bca-DNA-Polymerase, der die 5'→3'-Exonuklease fehlt, aus Bacillus caldotenax ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 16 bis 22, wobei die RNA als die Matrize in der reversen Transkriptionsreaktion eine RNA ist, die durch eine Nukleinsäureamplifizierungsreaktion amplifiziert wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 23, das nach Synthetisieren eines amplifizierten RNA-Fragments durch eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion unter Verwendung einer RNA als einer Matrize durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 23 oder 24, wobei die Nukleinsäureamplifikationsreaktion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem Verfahren eines Transkriptions-basierenden Amplifikationssystems (TAS), dem Verfahren einer selbst erhaltenden Sequenzreplikation (3SR), dem Verfahren einer Nukleinsäuresequenz-basierenden Amplifikation (NASBA), dem Verfahren einer Transkriptions-vermittelten Amplifikation (TMA) und dem Qβ-Replikase-Verfahren.
Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, wobei die Nukleinsäure als die Matrize eine DNA ist, die durch eine Nukleinsäureanzplifikationsreaktion erhalten wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 26, das nach Synthetisieren eines amplifizierten DNA-Fragments durch eine Nukleinsäureamplifikationsreaktion unter Verwendung einer DNA als einer Matrize durchgeführt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei die Nukleinsäureamplifikationsreaktion ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus dem Verfahren einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), dem Verfahren einer Ligase-Kettenreaktion (LCR) und dem Verfahren einer Strangverdrängungsamplifikation (SDA).
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 23 bis 28, wobei ein zufälliger Primer oder ein degenerierter Primer für die Nukleinsäureamplifikationsreaktion verwendet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 29, wobei der zufällige Primer oder der degenerierte Primer ein Primer ist, der eine zufällige Sequenz oder eine degenerierte Sequenz mindestens an dem 3'-Terminus oder an der 3'-terminalen Seite aufweist.
Verfahren zum Nachweisen einer Zielnukleinsäure in einer Probe, dadurch charakterisiert, dass das Verfahren umfasst: (a) Amplifizieren einer Zielnukleinsäure durch das Verfahren zum Amplifizieren einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 30 und (b) Nachweisen der in Schritt (a) amplifizierten Zielnukleinsäure.
Verfahren gemäß Anspruch 31, wobei die amplifizierte Zielnukleinsäure unter Verwendung einer Ribonukleotid (RNA)-Sonde nachgewiesen wird, die mit zwei oder mehreren fluoreszierenden Substanzen markiert ist, die bei einem Abstand positioniert sind, der zu einem Löschungszustand führt.
Kit für das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32, der enthält: (a) eine DNA-Polymerase mit einer Strangverdrängungsaktivität, (b) eine Endonuklease und (c) einen chimären Oligonukleotidprimer, der ein Desoxyribonukleotid und ein Ribonukleotid enthält, wobei das Ribonukleotid an dem 3'-Terminus positioniert ist.
Kit gemäß Anspruch 33, der eine DNA-Polymerase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus Escherichia coli, Bst-DNA-Polymerase, der die 5'→3'-Exonuklease fehlt, aus Bacillus stearothermophilus und Bca-DNA-Polymerase, der die 5→3'-Exonuklease fehlt, aus Bacillus caldotenax, als die DNA-Polymerase, enthält.
Kit gemäß Anspruch 33, der RNase H als die Endonuklease enthält.
Verfahren zum Herstellen eines Materials mit einer immobilisierten Nukleinsäure, worin die Nukleinsäure in einem vordefinierten Bereich angeordnet ist, dadurch charakterisiert, dass das Verfahren umfasst: (a) Amplifizieren einer zu immobilisierenden Nukleinsäure durch das Verfahren zum Amplifizieren einer Nukleotidsequenz oder zum Herstellen einer Nukleinsäure in großen Mengen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32 und (b) Anordnen und Immobilisieren der in Schritt (a) amplifizierten Nukleinsäure in einem vorbestimmten Bereich auf einem Substrat.
Verfahren gemäß Anspruch 36, wobei eine einzelsträngige Nukleinsäure, die im Wesentlichen frei von einem dazu komplementären Strang ist, amplifiziert wird und in dem vorbestimmten Bereich auf dem Substrat angeordnet und immobilisiert wird.
Verfahren zum Bestimmen einer Basensequenz einer Nukleinsäure, dadurch charakterisiert, dass das Verfahren ein Amplifizieren einer Nukleotidsequenz gemäß dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32 umfasst.
Verfahren zum Nachweisen einer Mutation einer Zielnukleinsäure, dadurch charakterisiert, dass das Verfahren ein Amplifizieren einer Nukleotidsequenz gemäß der Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 32 umfasst.