JPWO2010061922A1 - 新規ＭｕｔＳタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法 - Google Patents

新規ＭｕｔＳタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法 Download PDF

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Abstract

増幅の有無により、優れた信頼性で変異の有無を判定する方法を提供する。配列番号２のアミノ酸配列からなる新規ＭｕｔＳの存在下、被検核酸における標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅し、増幅の有無によって前記標的部位における変異の有無を判定する。新規ＭｕｔＳは、フルマッチ塩基対と比較してミスマッチ塩基対により特異的に結合するため、ミスマッチ結合した前記プライマーからの伸長反応が抑制されるため、本発明によれば、優れた信頼性で変異の有無を判断できる。

Description

本発明は、新規ＭｕｔＳタンパク質およびそれを用いた変異の判定方法に関する。
種々の疾患を診断、治療および予防する方法として、近年、遺伝子変異の検出が行われている。遺伝子変異は、疾患罹患性や薬剤代謝能力等に深く関与しているため、遺伝子変異の検出は医療において大きな意義を有する。
遺伝子変異の検出方法としては、例えば、種々の核酸増幅法により、目的遺伝子における検出目的の変異が生じる標的部位を含む標的配列を増幅し、増幅の有無によって変異の有無を判断する方法が開発されている。この方法においては、例えば、前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーが使用されている。前記プライマーを、例えば、前記標的部位が変異型である配列に完全に相補的な配列とした場合、増幅が確認されれば、前記標的部位が変異型である目的遺伝子に前記プライマーがアニーリングしたため増幅されたとして、前記目的遺伝子は変異型と判断できる。一方、前記プライマーを、例えば、前記標的部位が野生型である配列に完全に相補的な配列とした場合、増幅が確認されれば、前記標的部位が野生型である目的遺伝子に前記プライマーがアニーリングしたため増幅されたとして、目的遺伝子は野生型と判断できる。
しかしながら、このような方法において、前記プライマーが鋳型と相補的でない場合にも、前記プライマーが前記鋳型にアニーリングして、前記標的配列が増幅される場合がある。すなわち、例えば、前述のように前記標的部位が変異型である配列に完全に相補的なプライマーを使用した際、前記標的部位が野生型である鋳型に前記プライマーがアニーリングし、野生型の標的配列が増幅され、これによって、変異検出の精度が低下するという問題がある。
そこで、このような問題を回避すべく、いわゆるＭｕｔＳタンパク質等のミスマッチ結合タンパク質を併用する方法が提案されている。前記ミスマッチ結合タンパク質は、一般に、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対を認識して、前記ミスマッチ塩基対に結合するタンパク質である。このミスマッチ結合タンパク質の存在下、前述の遺伝子変異の検出を行えば、プライマーがミスマッチ塩基対を形成しても、前記ミスマッチ塩基対に前記ミスマッチ結合タンパク質が結合することにより、前記プライマーからの伸長が抑制される。このため、変異検出の精度の低下を回避可能となる（特許文献１参照）。このようなミスマッチ結合タンパク質としては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＭｕｔＳタンパク質が使用されている。
特許第３９４２６２７号
しかしながら、さらなる検出精度の向上を実現するため、より特異的にミスマッチ塩基対を認識し、それに結合可能なミスマッチ結合タンパク質が望まれている。そこで、本発明は、特異的にミスマッチ塩基対を認識し、それに結合可能な新たなミスマッチ結合タンパク質、および、それを用いた信頼性に優れる変異の判定方法の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の新規ＭｕｔＳタンパク質は、下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列であり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質のアミノ酸配列
本発明の判定方法は、被検核酸の標的部位における変異の有無を判定する方法であって、下記（Ｉ）工程または（Ｉ’）工程と、下記（ＩＩ）工程とを含むことを特徴とする。
（Ｉ）本発明の新規ＭｕｔＳタンパク質の存在下、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅する工程
（Ｉ’）本発明の新規ＭｕｔＳタンパク質と、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブとの存在下、前記被検核酸を増幅するためのプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む前記標的配列を増幅する工程
（ＩＩ）増幅の有無を確認する工程
本発明者らは、鋭意研究の結果、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＭｕｔＳタンパク質の新規遺伝子をクローニングし、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来の新規ＭｕｔＳタンパク質を得た。以下、新規ＭｕｔＳタンパク質を「Ａａｃ ＭｕｔＳ」という。本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、例えば、いわゆるミスマッチ塩基対（不適正塩基対）を有する二本鎖核酸を特異的に認識して結合できる。このため、標的部位を含む標的配列の増幅において、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを使用すれば、前記Ａａｃ ＭｕｔＳがミスマッチ塩基対に特異的に結合するため、プライマーからの伸長を効果的に抑制できる。したがって、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを使用する本発明の判定方法によれば、増幅の有無から、優れた精度で変異の有無を判定できる。このため、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳおよび判定方法は、例えば、遺伝子解析の分野において、極めて有用なツールと言える。
図１は、本発明の実施例２における、Ａａｃ ＭｕｔＳ存在下での核酸結合アッセイの結果を示すグラフである。 図２は、本発明の実施例３−１における、Ａａｃ ＭｕｔＳおよびＡＤＰの存在下での核酸結合アッセイの結果を示すグラフである。 図３は、本発明の実施例３−２における、Ａａｃ ＭｕｔＳおよびＡＴＰの存在下での核酸結合アッセイの結果を示すグラフである。 図４は、本発明の実施例４における、Ａａｃ ＭｕｔＳ存在下でのゲルシフトアッセイの結果を示す電気泳動写真である。 図５は、本発明の実施例５における、Ａａｃ ＭｕｔＳ存在下で等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。 図６は、比較例４における、Ｔａｑ ＭｕｔＳ存在下で等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。 図７は、本発明の実施例６−１における、Ａａｃ ＭｕｔＳおよびＴａｑ ＭｕｔＳ存在下で等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。 図８は、本発明の実施例６−２における、Ａａｃ ＭｕｔＳおよびＴａｑ ＭｕｔＳ存在下で等温増幅反応を行った際の増幅プロフィールを示すグラフである。 図９は、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ法における第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を示す模式図である。 図１０は、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ法における第二のプライマーの一例を示す模式図である。 図１１は、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ法の作用機序を示す模式図である。 図１２は、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ法の作用機序を示す模式図である。
＜Ａａｃ ＭｕｔＳ＞
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、前述のように、下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなることを特徴とする。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列であり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質のアミノ酸配列
ＭｕｔＳタンパク質（以下、「ＭｕｔＳ」という）とは、例えば、ミスマッチ結合タンパク質またはミスマッチ認識タンパク質ともいう。ＭｕｔＳは、一般に、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対を認識し、前記ミスマッチ塩基対に結合可能なタンパク質である。本発明において「ミスマッチ塩基対」とは、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの組合せおよびグアニンとシトシンとの組合せのような、相補的な正常塩基対ではなく、非相補的な塩基対を意味し、さらに、二本鎖核酸において、一方の鎖が、他方の鎖の所定塩基に対応する部位において塩基を欠失し、その部分で塩基対が欠失している意味も含む。以下、ミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を「ミスマッチ二本鎖またはヘテロ二本鎖」といい、ミスマッチ塩基対を形成する結合を「ミスマッチ結合」という。本発明において、前記ミスマッチ二本鎖は、例えば、実質的には相補的な二本鎖核酸であって、１または２以上のミスマッチ塩基対を有することにより、非相補的な領域を含む二本鎖を意味する。他方、以下、ミスマッチ塩基対に対して、完全に相補的な塩基対を「フルマッチ塩基対」、完全に相補的な二本鎖核酸を「フルマッチ二本鎖」といい、完全に相補的な結合を「フルマッチ結合」という。
また、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、前述のように、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有する。本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、例えば、さらに、完全に相補的な塩基対からなる二本鎖核酸（フルマッチ二本鎖核酸）への結合活性を有さない、前記フルマッチ二本鎖核酸への結合活性が検出限界以下である、または、前記フルマッチ二本鎖核酸への結合活性が、例えば、ミスマッチ二本鎖核酸への結合活性の１／１.２５以下（４／５以下）であることが好ましく、より好ましくは１／４以下、１／１２０以下、１／２００以下、１／２０５以下である。
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、例えば、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌から単離でき、好ましくは、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓから、さらに好ましくは、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． Ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＪＣＭ５２６０から単離できる。本菌株は、例えば、独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター微生物材料開発室より分譲可能である(http://www.jcm.riken.jp/JCM/Ordering_J.shtml)。また、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、例えば、後述するＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子を用いた遺伝子工学的手法により製造することもできる。
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、前記（Ｂ）に示すように、配列番号２に示すアミノ酸配列において、例えば、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質を含む。「数個のアミノ酸」とは、例えば、全長アミノ酸残基数の約５〜１０％程度のアミノ酸残基数をいい、例えば、１〜８６個程度、好ましくは１〜４３個程度、より好ましくは１〜２１個程度、最も好ましくは１〜１０個程度である。
また、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳとしては、例えば、前記（Ａ）のタンパク質と５０％、好ましくは７０％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質を含む。タンパク質の相同性（ホモロジー）は、通常、２つのタンパク質のアミノ酸配列同士を適切に整列（アライメント）したときの同一性のパーセント値で表わすことができ、一般に、前記両アミノ酸配列間の正確な一致の出現率を意味する。同一性比較のための配列間での適切な整列は、種々のアルゴリズム、例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて決定できる（Altschul SF J Mol Biol 1990 Oct 5; 215(3):403-10）。
ＭｕｔＳの活性測定方法は、制限されず、当業者に周知の種々の方法により測定することができる。具体例としては、The Journal of Biological Chemistry 276, 34339-34347, 2001; doi: 10.1074/jbc.M104256200等の文献に記載されている方法が使用できる。
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの分子量は、例えば、８６，０００〜１０５，５００Ｄａであり、好ましくは９１，０００〜１００，８００Ｄａであり、前記配列番号２に示すアミノ酸配列からなるＡａｃ ＭｕｔＳの分子量は、９５，９８４Ｄａである。
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの化学的性質は、例えば、特に６５℃までの安定性に優れ、至適温度が、例えば、約５０〜６０℃、至適ｐＨが、例えば、ｐＨ７〜９の範囲である。
なお、本発明において、例えば、分子生物学、微生物学および組換え技術等の一般的方法は、当該技術分野の標準的な参考書籍を参照して実施できる。これらには、例えば、以下の文献等が含まれる。
・Molecular Cloning：A Laboratory Manual 第３版（Sambrook & Russell、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001）
・Current Protocols in Molecular biology（Ausubelら編、John Wiley & Sons、1987）
・Methods in Enzymologyシリーズ（Academic Press）；PCR Protocols: Methods in Molecular Biology（Bartlett & Stirling編、Humana Press、2003）
・Antibodies：A Laboratory Manual（Harlow & Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1987
また、本明細書において参照される試薬およびキット類等は、例えば、Sigma社、Aldrich社、Invitrogen/GIBCO社、Clontech社、Stratagene社、Qiagen社、Promega社、Roche Diagnostics社、Becton-Dickinson社、TaKaRa社（タカラバイオ株式会社）等の市販業者から入手可能である。
＜Ａａｃ ＭｕｔＳ遺伝子＞
本発明の新規核酸は、前記本発明の新規Ａａｃ ＭｕｔＳをコードする核酸であり、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかの核酸からなることを特徴とする。
（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列との相同性が８０％以上の塩基配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
（ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
以下、本発明の新規核酸を「Ａａｃ ＭｕｔＳ遺伝子」という。本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子は、前述のように、（ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる核酸の他に、前記（ｂ）〜（ｆ）の核酸の意味を含む。また、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子は、例えば、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基配列の縮重変異体、前記（ａ）〜（ｆ）の塩基配列に相補的な塩基配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸も含む。さらに、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子は、例えば、ＤＮＡの他に、前記ＤＮＡに対応するＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等も含む。
前記（ｂ）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定することができる条件をいう。なお、１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。ストリンジェンシーの選択のため、例えば、洗浄工程における塩濃度や温度を適宜最適化することができる。また、当業者であれば、ストリンジェンシーを上げるために、例えば、ホルムアミドやＳＤＳ等を添加することも技術常識である。
前記（ｃ）において、前記相同性は、例えば、８０％以上であり、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより求めることができる。
前記（ｄ）において、「数個の塩基」とは、例えば、配列番号１に表される塩基配列における全塩基数の約１０〜２０％程度の塩基数をいい、例えば、１〜５２０個程度、好ましくは１〜２６０個程度、より好ましくは１〜１３０個程度、最も好ましくは１〜６５個程度である。
前記（ｆ）において、「１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列」とは、例えば、前記本発明のＡａｃ ＭｕｔＳにおける説明と同様である。
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子は、例えば、前述のようなＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属菌体から抽出してもよいし、遺伝子工学の手法により合成してもよいし、化学的手法により合成してもよい。
＜組換えベクター＞
本発明の組換えベクターは、前述のように、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子を含むことを特徴とする。本発明の組換えベクターは、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子を含んでいればよく、その他の構成等は何ら制限されない。
本発明の組換えベクターは、例えば、適当なベクターに本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子を連結（挿入）することにより得られる。本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子を挿入するためのベクターは、例えば、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等があげられる。前記プラスミドＤＮＡとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等の大腸菌由来プラスミド；ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等の枯草菌由来プラスミド；ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等の酵母由来プラスミド等があげられる。前記ファージＤＮＡとしては、例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等のλファージ等があげられる。さらに、レトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等を用いることもできる。
前記ベクターに本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子を挿入する方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、精製したＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、両者を連結する方法等があげられる。本発明のＡａｃ ＭｕｔＳ遺伝子は、例えば、それがコードするタンパク質を発現するような条件で前記ベクターに組み込まれることが好ましい。このため、前記ベクターは、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター等のプロモーターの他に、所望により、エンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列、ＫＯＺＡＫ配列等）等を連結することもできる。前記選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子等があげられる。
＜形質転換体＞
本発明の形質転換体は、前述のように、本発明の組換えベクターを含むことを特徴とする。本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを含んでいればよく、その他の構成については何ら制限されない。
本発明の形質転換体は、例えば、本発明の組換えベクターを宿主に導入することにより得られる。前記宿主としては、本発明の組換えベクターにより本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを発現できるものであれば、特に制限されず、例えば、前記組換えベクターの種類に応じて、宿主−ベクター系を考慮して選択できる。前記宿主の具体例としては、例えば、大腸菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)等のエッシェリシア属、バシラス・ズブチリス(Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ)等のバシラス属、シュードモナス・プチダ(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ)等のシュードモナス属、リゾビウム・メリロティ(Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ)等のリゾビウム属に属する細菌等があげられる。この他に、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）等の酵母、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、Ｓｆ９、Ｓｆ２１等の昆虫細胞を用いることもできる。形質転換の方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。具体例としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法(Cohen, S.N. et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 69, 2110-2114)、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法等があげられる。
＜Ａａｃ ＭｕｔＳの製造方法＞
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、例えば、前記本発明の形質転換体を培養することによって調製できる。本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの製造方法は、例えば、前述のように、前記本発明の形質転換体を培養することを特徴とする。また、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの製造方法は、例えば、さらに、得られた培養液からＡａｃ ＭｕｔＳタンパク質を単離してもよい。前記「培養物」とは、例えば、培養した形質転換体を含む培養液の他に、培養液の上清、培養細胞もしくは培養菌体、または、培養細胞もしくは培養菌体の破砕物等を含む意味でもよい。また、「本発明の形質転換体を培養する方法」は、例えば、宿主の培養に適用される通常の方法に従って行われ、その条件等は、例えば、宿主の種類等に応じて適宜決定できる。
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳが、例えば、菌体内または細胞内に生産される場合、培養後、菌体または細胞を破砕することにより単離できる。また、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳが、例えば、菌体外または細胞外に生産される場合、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により前記培養液から菌体または細胞を除去することで単離できる。その後、タンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法を、単独で、または、適宜組み合わせることによって、前記培養物から本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを精製することもできる。前記精製の方法としては、特に制限されず、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があげられる。また、例えば、精製のために、タグ配列を付加したタンパク質を発現させる場合には、精製工程の間または後に、プロテアーゼ処理等により、前記タグ配列を除去することもできる。
＜変異の判定方法＞
本発明の変異の判定方法は、以下に示す第一の判定方法および第二の判定方法があげられる。
本発明の変異の第一の判定方法は、前述のように、被検核酸の標的部位における変異の有無を判定する方法であって、下記（Ｉ）工程と下記（ＩＩ）工程とを含むことを特徴とする。
（Ｉ）本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの存在下、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅する工程
（ＩＩ）増幅の有無を確認する工程
本発明において、以下、標的部位が標準的な塩基である核酸配列、例えば、前記標的部位が標準的な遺伝子型（正常型または野生型）である核酸配列を、「正常型配列または野生型配列」という。これに対して、前記核酸配列において、前記標的部位が前記正常型配列と比較して異なる塩基である核酸配列を、「変異型配列」という。前記「標的部位」とは、例えば、前記野生型配列と前記変異型配列との間で異なる塩基を示す特定部位を意味し、１塩基でもよいし、２塩基以上の配列でもよい。前記「被検核酸」とは、前記標的部位における変異の有無を判定する対象となる核酸、すなわち、前記標的部位が野生型であるか変異型であるか否か、または、前記標的部位以外が野生型配列と同一の配列であるか否かを判定する対象となる核酸を意味する。前記被検核酸としては、例えば、本発明の判定方法に供する試料に含まれる核酸および増幅反応開始時の核酸だけでなく、前記増幅反応により合成された核酸を含んでもよく、「鋳型核酸」ともいう。前記「標的配列」とは、例えば、前記被検核酸における増幅目的の核酸配列だけでなく、前記増幅目的の核酸配列を含む配列や、これらに相補的な核酸配列の意味も含む。また、前記プライマーは、標的部位を含む領域にハイブリダイズ（アニーリング）可能であることから、「標的プライマー」ともいい、前記「前記標的部位を含む領域」は、前記標的プライマーがハイブリダイズ可能であることから、以下、ハイブリッド領域ともいう。また、本発明において、「変異」とは、例えば、置換、欠失、付加および挿入のいずれであってもよい。
本発明の判定方法で使用するＡａｃ ＭｕｔＳは、前述のように、ミスマッチ塩基対を特異的に認識して結合でき、例えば、相補的な塩基対、いわゆるフルマッチ塩基対よりもミスマッチ塩基対に対する特異性が高い。このため、本発明の第一の判定方法によれば、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能な標的プライマーが、前記被検核酸にミスマッチ結合した場合、そのミスマッチ部位に特異的にＡａｃ ＭｕｔＳが結合するため、前記標的プライマーからの伸長反応が特異的に抑制される。この結果、ミスマッチした標的プライマーからの誤った増幅を回避できるため、増幅の有無による変異の有無の判断を、優れた信頼性で行うことができる。
本発明の判定方法は、例えば、各種疾患のかかり易さ、前記疾患か否か、前記疾患用の医薬への感受性および耐性を判断する際に有用である。例えば、疾患のかかり易さを、目的遺伝子の標的部位における変異の有無によって判定する場合、健常者の配列が正常型配列となり、前記疾患患者の配列が変異型配列となる。そして、被検核酸として被検者の遺伝子を使用し、その標的部位が正常型か変異型かを判定する。その結果、前記標的部位が正常型であれば、前記被検核酸は正常型配列であり、被検者は、疾患にかかる可能性が低い、または、健常者と判断できる。一方、前記標的部位が変異型であれば、前記被検核酸は変異型配列であり、被検者は、疾患にかかる可能性が高い、または、前記疾患患者と判断できる。
前記被検核酸における前記標的部位は、例えば、１塩基（モノヌクレオチド）でもよいし、２塩基（ジヌクレオチド）以上でもよく、後者の場合、連続してもよいし、非連続であってもよい。中でも、判定目的の標的部位が、１塩基またはモノヌクレオチドである場合に、本発明の判定方法を適用することが好ましい。前記標的プライマーと前記被検核酸におけるハイブリッド領域とが一塩基のみ異なる場合、他の配列は完全に相同であるため、前記被検核酸が前記標的プライマーに対してミスマッチとなる塩基を有していても、前記標的プライマーは前記被検核酸にハイブリダイズし易い。しかしながら、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳによれば、例えば、前記両者が一塩基のみ異なり、前記プライマーが前記被検核酸にハイブリダイズする場合でも、Ａａｃ ＭｕｔＳが特異的に結合して、誤った伸長反応を抑制できる。このため、本発明の判定方法は、例えば、一塩基多型の判定に適している。
前記被検核酸に前記プライマーがハイブリダイズした際に生じるミスマッチは、例えば、１塩基でもよいし、連続した複数塩基でもよいし、非連続の複数塩基であってもよい。複数塩基の上限は、特に制限されないが、例えば、前記被検核酸と前記プライマーとの二本鎖の状態を維持し得る数が好ましい。具体例としては、例えば、ハイブリダイズする両者の長さ（塩基数）に依存するが、前記上限は、例えば、５塩基以下であり、より好ましくは３塩基以下であり、特に好ましくは２塩基以下である。
本発明の第一の判定方法では、前記（Ｉ）工程において、増幅のためのプライマーとして、例えば、前記標的部位の塩基が変異型である前記領域にハイブリダイズ可能な標的プライマーを使用できる。これにより、前記（ＩＩ）工程において、増幅が確認された場合は、前記標的部位の塩基が変異型であると判定し、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位の塩基が正常型であると判定できる。他方、前記（Ｉ）工程において、増幅のためのプライマーとして、例えば、前記標的部位の塩基が正常型である前記領域にハイブリダイズ可能な標的プライマーを使用することもできる。これにより、前記（ＩＩ）工程において、増幅が確認された場合は、前記標的部位の塩基が正常型であると判定し、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位の塩基が変異型であると判定できる。
従来、ミスマッチ結合したプライマーからの伸長反応を抑制するために、例えば、Ｔａｑ ＭｕｔＳ等のＭｕｔＳが使用されていた。しかしながら、従来のＭｕｔＳは、基質特異性も低いため、例えば、ミスマッチ二本鎖だけでなくフルマッチ二本鎖にも、前記ＭｕｔＳが結合したり、ミスマッチ二本鎖に前記ＭｕｔＳが結合しても、結合した前記ＭｕｔＳがミスマッチ二本鎖から解離し易いという問題があり、所望の増幅が確認できないおそれがあった。これに対して、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、例えば、ミスマッチ二本鎖に対する基質特異性に優れることから、フルマッチ二本鎖への結合を、従来のＭｕｔＳよりも抑制でき、また、ミスマッチ二本鎖から解離し難いことから、信頼性に優れる判定が可能となる。
前記増幅反応の反応液におけるＡａｃ ＭｕｔＳの添加量は、特に制限されず、例えば、反応開始時の被検核酸の量および各種プライマーの量等に応じて適宜決定できる。具体例として、前記反応液２５μＬあたり、反応開始時の被検核酸量は、例えば、０．１〜１０００ｎｇであり、好ましくは０．５〜５００ｎｇであり、より好ましくは１〜１００ｎｇであり、全プライマーのトータル量は、例えば、０．０１〜１０００μｍｏｌであり、好ましくは０．０５〜５００μｍｏｌであり、より好ましくは０．１〜１００μｍｏｌであり、Ａａｃ ＭｕｔＳ量は、例えば、０．０１〜１０００μｇであり、好ましくは０．０５〜５００μｇであり、より好ましくは０．１〜１００μｇである（以下、同様）。
本発明の第一の判定方法において、例えば、前記Ａａｃ ＭｕｔＳと、ＡＤＰ(アデノシン５’−二リン酸)、ＡＴＰ(アデノシン５’−三リン酸)およびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも一つの添加剤との共存下、前記標的配列の増幅を行うことが好ましい。前記添加剤の存在下で核酸増幅を行えば、例えば、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳのミスマッチ塩基対に対する結合率を向上できる。中でも、ＡＤＰまたはその誘導体の共存下で前記標的配列の増幅を行えば、さらに、ミスマッチ塩基対と本発明のＡａｃ ＭｕｔＳとの結合の解離を抑制することもできる。このため、ミスマッチ塩基対を形成した標的プライマーからの伸長反応をさらに効率よく抑制でき、これによって、さらに信頼性に優れる変異の判定結果を得ることができる。前記誘導体としては、例えば、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５’−Ｏ−(３−チオ三リン酸))、ＡＭＰ−ＰＮＰ(アデノシン５’−[β，γ−イミド]三リン酸)等が使用できる。前記添加剤は、例えば、いずれか１種類を用いてもよいし、２種類以上を併用してもよい。前記添加剤は、中でも、ＡＤＰまたはその誘導体を含むことが好ましく、より好ましくはＡＤＰである。
前記増幅反応の反応液における前記添加剤の添加量は、特に制限されず、例えば、Ａａｃ ＭｕｔＳの量、反応開始時の被検核酸の量および各種プライマーの量等に応じて適宜決定できる。具体例として、前記反応液における前記添加剤の濃度は、例えば、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましく、より好ましくは０．０５〜５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。この際、前記反応液におけるＡａｃ ＭｕｔＳ等の濃度は、前述の範囲であることが好ましい。
本発明の第一の判定方法において、前記本発明のＡａｃ ＭｕｔＳとＡｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来以外の他のＭｕｔＳとの共存下、前記標的配列の増幅を行うことが好ましい。前記Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来以外のＭｕｔＳとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＭｕｔＳがあげられ、具体的には、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＭｕｔＳ（以下、「Ｔａｑ ＭｕｔＳ」という）があげられる。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のＭｕｔＳ等も使用できる。
本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、例えば、他のＭｕｔＳとの併用が可能である。本発明のＡａｃ ＭｕｔＳと他のＭｕｔＳとの併用により、例えば、Ａａｃ ＭｕｔＳを単独で使用するよりも、ＭｕｔＳのトータル量を低減でき、且つ、従来のＴａｑ ＭｕｔＳ等を単独で使用するよりも、有効濃度の幅を広くできる。具体例として、前記反応液２５μＬあたり、例えば、Ａａｃ ＭｕｔＳ量が０．０１〜１０００μｇであり、前記他のＭｕｔＳ量が０．０１〜１０００μｇであり、前記ＭｕｔＳと前記他のＭｕｔＳとの合計量が０．０２〜２０００μｇであることが好ましく、より好ましくは、Ａａｃ ＭｕｔＳ量が０．０５〜５００μｇであり、前記他のＭｕｔＳ量が０．０５〜５００μｇであり、合計量０．１〜１０００μｇであり、特に好ましくは、Ａａｃ ＭｕｔＳ量が０．１〜１００μｇであり、前記他のＭｕｔＳ量が０．１〜１００μｇ／Ｌであり、合計量が０.２〜２００μｇである。この際、前記反応液における反応開始時の被検核酸等の量は、前述の範囲であることが好ましい。また、Ａａｃ ＭｕｔＳ（Ａ）に対する他のＭｕｔＳ（Ｔ）の添加割合（重量比Ａ：Ｔ）は、例えば、１：０．０５〜１：５０が好ましく、より好ましくは１：０．２５〜１：２５であり、特に好ましくは１：０．５〜１：５である。
前記Ａａｃ ＭｕｔＳおよび他のＭｕｔＳは、例えば、フルマッチ二本鎖核酸への結合をさらに回避するため、例えば、活性化剤により活性化されてもよい。前記活性化剤は、特に限定されないが、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ(アデノシン５’−Ｏ−(３−チオ三リン酸))、ＡＭＰ−ＰＮＰ(アデノシン５’−[β，γ−イミド]三リン酸)等があげられ、この他に、ＭｕｔＳに結合できるヌクレオチドがあげられる。活性化は、例えば、前記ＭｕｔＳと前記活性化剤とを、室温で、数秒間から数分間インキュベートすることで行える。
本発明の第一の判定方法において、さらに、一本鎖結合タンパク質（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＳＳＢ）の共存下、前記標的配列の増幅を行ってもよい。ＳＳＢを併用することで、例えば、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳが一本鎖核酸に結合することを、より一層回避できる。前記ＳＳＢとしては、特に制限されず、従来公知のタンパク質が使用できる。ＳＳＢの具体例としては、例えば、大腸菌、ショウジョウバエ、およびアフリカツメガエルに由来する一本鎖結合タンパク質、Ｔ４バクテリオファージ由来の遺伝子３２タンパク質、この他に、他の種に由来するこれらのタンパク質があげられる。
本発明において、反応開始時における被検核酸の種類は、何ら制限されず、例えば、天然物由来の核酸でもよいし、合成等による非天然物の核酸であってもよい。前記被検核酸としては、例えば、ＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドがあげられる。なお、ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの意味も含む。前記ポリヌクレオチドは、例えば、非修飾ヌクレオチドを含んでもよいし、修飾ヌクレオチドを含んでもよく、天然ヌクレオチドを含んでもよいし、非天然ヌクレオチドを含んでもよい。前記非天然ヌクレオチドとは、例えば、天然ヌクレオチドの塩基以外の塩基を含み、前記塩基としては、例えば、キサントシン類、ジアミノピリミジン類、ｉｓｏＧ、ｉｓｏＣ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 6329-6333, 1995）等があげられる。また、前記ポリヌクレオチドは、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ−オリゴ核酸等の人工合成核酸を含んでもよく、これらのキメラ分子であってもよい。前記ＤＮＡとしては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ等があげられ、ＲＮＡは、例えば、全ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、合成ＲＮＡ、スプライスドＲＮＡ、アンスプライスドＲＮＡ等があげられる。前記被検核酸がＲＮＡの場合、例えば、逆転写反応によりＲＮＡからＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し、得られたＤＮＡを鋳型として、さらに増幅反応を行ってもよい。前記反応開始時の被検核酸は、例えば、血液、臓器、組織、細胞等の生体由来試料や、食品、土壌、排水等の微生物含有試料等から調製できる。前記生体としては、例えば、ヒトおよび非ヒトを含む動物、ならびに植物等があげられる。試料に含まれるＲＮＡとしては、例えば、核および細胞質等に存在するＲＮＡ、感染したウイルスおよび細菌由来のＲＮＡ等があげられる。なお、試料からの被検核酸の回収は、特に制限されず、従来公知の方法が採用でき、また、必要に応じて回収した核酸の精製や断片化を行うことができる。
本発明の第一の判定方法において、前記被検核酸は、例えば、二本鎖核酸でも一本鎖核酸でもよい。前記二本鎖核酸としては、例えば、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖等のいずれであってもよい。前記二本鎖核酸は、そのまま鋳型核酸として使用してもよいし、例えば、ファージやプラスミド等のベクターで増幅されたものを、鋳型核酸として使用することもできる。前記被検核酸が二本鎖核酸の場合、そのまま増幅反応を開始してもよいし、必要に応じて、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性する工程を含んでもよい。変性方法は、特に制限されないが、例えば、反応液の温度を変化させる方法、および、反応液のｐＨを変動させる方法がある。前者の場合、例えば、温度を４０〜１２０℃、好ましくは約９５℃に上昇させることで、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性し、続いて、温度を０〜６５℃に降下させることで、前記一本鎖核酸へのプライマーのアニーリングを行うことが好ましい。後者の場合、例えば、反応液のｐＨを約７〜１４に上げることで、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性し、続いて、反応液のｐＨを約６〜９に下げることで、前記一本鎖核酸へのプライマーのアニーリングを行うことが好ましい。
本発明の第一の判定方法において、使用するプライマーの種類は、特に制限されず、例えば、被検核酸の種類、標的配列の種類、核酸増幅法の種類等に応じて適宜決定できる。本発明の第一の判定方法において、例えば、２種類以上のプライマーを使用する場合には、例えば、少なくとも１種類が、前述のような、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能な標的プライマーであることが好ましい。所定の標的配列を増幅するためのプライマーとしては、例えば、センス鎖にハイブリダイズするプライマーとアンチセンス鎖にハイブリダイズするプライマーとを、一対のプライマーセットとして使用することが好ましい。前記プライマーセットは、例えば、１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。また、対となるプライマーセットと、その他のプライマーとを組み合わせて使用してもよい。また、本発明の第一の判定方法においては、例えば、同一の反応液において、２種類以上の標的配列を増幅してもよい。この場合、各標的配列を増幅するためのプライマーとして、少なくとも１種類ずつ、前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能な標的プライマーを使用することが好ましい。
本発明におけるプライマーは、特に制限されず、例えば、被検核酸、標的配列、後述する核酸増幅方法の種類等に応じて、適宜決定できる。前記プライマーは、例えば、天然物由来のポリヌクレオチドでもよいし、合成等による非天然物のポリヌクレオチドであってもよい。前記ポリヌクレオチドとしては、例えば、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、これらの誘導体を含むポリヌクレオチドまたはキメラポリヌクレオチド等のいずれであってもよい。前記リボヌクレオチド誘導体としては、例えば、α位の酸素原子を硫黄原子に置き換えたリボヌクレオチド等があげられる。前記プライマーは、例えば、ＬＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、モルホリノ核酸、メチルフォスフォネート核酸、Ｓ−オリゴ核酸等の人工合成核酸を含んでもよく、これらのキメラポリヌクレオチドであってもよい。なお、前記ポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの意味も含む。
本発明において、プライマーは、例えば、ストリンジェントな条件下、被検核酸における所定領域（ハイブリッド領域）にハイブリダイズ（アニーリング）することが好ましく、より好ましくは、ストリンジェントな条件下、前記所定領域のみにハイブリダイズすることが好ましい。ストリンジェントな条件は、例えば、プライマーとその相補鎖との二本鎖の融解温度Ｔｍ（℃）およびハイブリダイゼーション溶液の塩濃度等に依存して決定でき、例えば、J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis; Molecular Cloning 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)等を参照できる。具体例として、前記プライマーの融解温度よりわずかに低い温度条件下、被検核酸とプライマーとのハイブリダイゼーションを行うと、前記プライマーを前記所定領域に特異的にハイブリダイズさせることができる。このようなプライマーは、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ３（Whitehead Institute for Biomedical Research社製）等の市販のプライマー構築ソフト等により設計できる。
本発明の第一の判定方法において、前記標的配列の増幅には、一般にポリメラーゼが使用できる。前記ポリメラーゼとしては、特に制限されず、従来公知のポリメラーゼが使用できる。前記ポリメラーゼは、例えば、天然由来でもよいし、遺伝子工学的手法により得られた酵素でもよいし、また、人工的に変異を加えた変異体であってもよい。前記ポリメラーゼの具体例としては、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のポリメラーゼ等があげられる。前記Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のポリメラーゼが好ましく、具体的には、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． Ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＪＣＭ５２６０由来のポリメラーゼがあげられる。前記Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ）等があげられ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼとしては、例えば、好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼが好ましく、具体例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ：登録商標）があげられる。また、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等もあげられる。Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ由来のポリメラーゼが好ましく、具体例として、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ１２０４１由来のポリメラーゼがあげられる。この他にも、例えば、Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（登録商標）（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）（Ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ф２９ファージＤＮＡポリメラーゼ、ＭＳ−２ファージＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ−Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、９゜Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ ＤＮＡポリメラーゼ等があげられる。また、鋳型核酸が前述のように非天然ヌクレオチドを含む場合、例えば、取り込み効率の観点から、Ｙ１８８Ｌ／Ｅ４７８Ｑ変異型ＨＩＶ Ｉ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント、９゜Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、ＨｏｔＴｕｂ ＤＮＡポリメラーゼ等を使用することが好ましい（Michael Sismour. 1 et al., Biochemistry, 42, No.28, 8598, 2003、米国特許第６６１７１０６号明細書、Michael J. Lutz et al., Bioorganic & Medical Chemistry letters 8, 1149-1152, 1998等）。この場合、前記反応液に、さらに、トレハロース等の酵素の耐熱性を向上させる物質を添加してもよい。これによって、さらに効率的に非天然ヌクレオチドを含む標的核酸の増幅を行うことができる。これらのＤＮＡポリメラーゼの中でも、例えば、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のポリメラーゼが好ましく、より好ましくは、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼであり、特に、Ａａｃ ＭｕｔＳと同じ由来である前記Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼ、具体的には、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のポリメラーゼ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． Ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＪＣＭ５２６０由来のポリメラーゼが好ましい。
本発明の第一の判定方法において、後述するような等温増幅法により核酸増幅を行う場合、前記ポリメラーゼとしては、例えば、鎖置換活性（鎖置換能）を有するものが好ましく、常温性、中温性および耐熱性のものが好適に使用できる。前記ポリメラーゼとしては、さらに、実質的に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが好ましい。このようなポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント、前述した好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体等があげられる。後者の具体例としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼおよびＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性欠失変異体等があげられる。
本発明の第一の判定方法において、前述のように逆転写反応を行う場合、前記反応に使用する酵素としては、例えば、ＲＮＡを鋳型とするｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば、特に限定されない。具体例としては、トリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）、モロニーマウス白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）等があげられる。前記逆転写反応においては、この他に、例えば、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもでき、具体例としては、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等のＴｈｅｒｍｕｓ属由来のポリメラーゼや、好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼ等も使用できる。前記好熱性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼとしては、例えば、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等もあげられる。前記Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、反応にマンガンイオンが不要であり、高温条件下、鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成できる。
また、逆転写活性を併せ持つポリメラーゼとして、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ等を使うことにより、全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡを鋳型とする逆転写反応と、逆転写反応により得られるｃＤＮＡを鋳型とするＤＮＡポリメラーゼ反応とを、１種類のポリメラーゼで行うことができる。なお、これには制限されず、例えば、前述のような各種ＤＮＡポリメラーゼと、ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ等の前述の逆転写酵素とを組み合わせて用いてもよい。
なお、前記増幅反応において、ＭｕｔＳを使用する場合、前記Ａａｃ ＭｕｔＳに関わらず、同じ由来のＭｕｔＳとポリメラーゼとを使用することが好ましい。具体的には、例えば、同じ属由来のＭｕｔＳとポリメラーゼであり、好ましくは同じ種由来であり、より好ましくは同じ株由来である。
本発明の第一の判定方法において、前記反応液における酵素（例えば、ポリメラーゼ）の量は、特に制限されないが、前記反応液２５μＬあたり、例えば、０．０１〜１０００Ｕであり、好ましくは０．０５〜５００Ｕであり、より好ましくは０．１〜１００Ｕである。
なお、本発明の第一の判定方法によれば、さらに、真核生物のゲノムに含まれるイントロン配列を、欠失、挿入または付加に係る標的部位をとして、被検核酸に前記イントロン配列が存在するか否かを判定することもできる。前記イントロン配列の有無を判定し、存在しないと判定した場合には、標的遺伝子のｍＲＮＡが存在する、すなわち、標的遺伝子が発現していると判定することができる。この場合、標的配列は、ｍＲＮＡであることが好ましい。
本発明の第一の判定方法において、核酸の増幅方法としては、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。核酸の増幅反応は、例えば、温度を変動させて行ってもよいし、一定温度で行ってもよい。前者としては、例えば、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法（例えば、特許第２５０２０４１号、第２５４６５７６号および第２７０３１９４号公報等参照）、ＲＴ−ＰＣＲ法（例えば、Trends in Biothechnology， Vol.10, pp.146-153, 1992等参照）等があげられる。前記ＰＣＲは、通常、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性する変性工程、前記一本鎖核酸にプライマーをハイブリダイズさせるアニーリング工程、ハイブリダイズした前記プライマーからの伸長を行う伸長工程を含む。後者は、いわゆる等温増幅法であり、前記一定温度とは、例えば、設定した温度を正確に維持するだけでなく、ほぼ一定温度の条件も含む。「ほぼ一定温度」とは、例えば、増幅反応に使用される各種成分の機能を損なわない程度の温度変化の意味を含む。前記等温増幅法としては、例えば、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ法（国際公開ＷＯ０１／０３０９９３号パンフレット、国際公開ＷＯ２００４／０４００１９号パンフレット、国際公開ＷＯ２００５／０６３９７７号パンフレット、Mitani, Y. et al., Nature Methods, 2007, Vol. 4, No. 3, 257-262参照）、ＳＤＡ法（strand displacement amplification）法（特開平１０−３１３９００号公報参照）、改良ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ（nucleic acid sequence based amplification）法（特許第２６５０１５９号公報参照）、ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法（Notomi, T. et al., Nucleic Acids Research, 2000, Vol. 28, No. 12, e63参照）、ＩＣＡＮ（登録商標、Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids）法（国際公開ＷＯ００／５６８７７号パンフレット参照）、自立複製（３ＳＲ；self-sustained sequence replication）法、ＴＭＡ(transcription-mediated amplification)法、Ｑベータレプリカーゼ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法およびＲＣＡ(rolling circle amplification)法等があげられる。
以下に、具体例として、等温増幅法であるSmart Amplification Process法およびＬＡＭＰ法、ならびに、ＰＣＲ法について説明するが、本発明は、これらに何ら制限されない。
（等温増幅法）
等温増幅法は、一般に、等温（一定温度）で核酸の増幅反応を行う方法である。本発明において、増幅反応の条件は、特に制限されず、当業者であれば適宜決定できる。反応温度は、例えば、プライマーの融解温度（Ｔｍ）付近の温度、または、それ以下に設定することが好ましく、さらには、プライマーの融解温度（Ｔｍ）を考慮し、ストリンジェンシーのレベルを設定することが好ましい。反応温度の具体例としては、例えば、約２０℃〜約７５℃であり、好ましくは、約３５℃〜約６５℃である。
等温増幅方法について、非対称型プライマーセットを用いる方法と、対称型プライマーセットを用いる方法とを例にあげて説明する。前者は、例えば、一対のプライマーが、一方のプライマーの形態と他方のプライマーの形態とが異なるプライマーセットであり、以下、「非対称型プライマーセット」という。また、後者は、例えば、一対のプライマーが、一方の形態と他方のプライマーの形態とが同じであるプライマーセットであり、以下、「対称型プライマーセット」という。前記非対称型プライマーセットは、例えば、前記Smart Amplification Process法に適しており、前記対称型プライマーセットは、例えば、前記ＬＡＭＰ法に適している。なお、本発明は、これには制限されない。
Smart Amplification Process法
増幅方法の中でもSmart Amplification Process法は、例えば、優れた特異性で標的配列を増幅できる。このため、核酸増幅によって、例えば、遺伝子における変異、すなわち、塩基の欠失、置換、挿入または付加の有無を判断でき、特に、一塩基の変異の有無（一塩基多型）等の判断に適している。
前記非対称型のプライマーセットは、前述のように、対になる一方のプライマーの形態と他方のプライマーの形態とが異なる非対称型のプライマーセットであり、中でも、前記Smart Amplification Process法に適用することが好ましい。このプライマーセットを、以下、「Smart Amplification Process用プライマーセット」ともいう。
前記Smart Amplification Process用プライマーセットの具体例としては、例えば、非対称型である一対のプライマーが、第一のプライマーと第二のプライマーとを含み、
前記第一のプライマーが、標的配列の３’末端部分の配列（A）にハイブリダイズする配列（Ac'）を３’末端部分に含んでなり、かつ前記標的配列において前記配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズする配列（B'）を前記配列（Ac'）の５’側に含むものであり、
前記第二のプライマーが、前記標的配列の相補配列の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含むものである。
第一のプライマーによる核酸合成の作用機序を図９に模式的に示す。まず、鋳型となる核酸中の標的配列を決定し、その標的配列の３’末端部分の配列（A）、および配列（A）よりも５’側に存在する配列（B）を決定する。第一のプライマーは、配列（Ac'）を含み、さらにその５’側に配列（B'）を含む。配列（Ac'）は、配列（A）にハイブリダイズするものであり、配列（B'）は、配列（B）の相補配列（Bc）にハイブリダイズするものである。ここで、第一のプライマーは、前記配列（Ac'）と前記配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を含んでいてもよい。このようなプライマーを鋳型核酸にアニーリングさせると、プライマー中の配列（Ac'）が標的配列の配列（A）にハイブリダイズした状態となる（図９(a)）。この状態でプライマー伸長反応が起こると、標的配列の相補配列を含む核酸が合成される。そして、合成された核酸の５’側に存在する配列（B'）が、同核酸中に存在する配列（Bc）にハイブリダイズし、これにより、合成された核酸の５’側においてステム−ループ構造が形成される。その結果、鋳型核酸上の配列（A）が一本鎖となり、この部分に先の第一のプライマーと同一の配列を有する他のプライマーがハイブリダイズする（図９(b)）。その後、鎖置換反応により、新たにハイブリダイズした第一のプライマーからの伸長反応が起こると同時に、先に合成された核酸が鋳型核酸から分離される（図９(c)）。
上記の作用機序において、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズする現象は、典型的には、同一鎖上に相補領域が存在することにより起こる。一般に、二本鎖核酸が一本鎖に解離するときは、その末端あるいはそれ以外の比較的不安定な部分から部分的な解離が始まる。上記第一のプライマーによる伸長反応で生成した二本鎖核酸は、比較的高温では末端部分の塩基対は解離と結合の平衡状態にあり、全体としては二本鎖を保っている。そのような状態で末端の解離した部分に相補的な配列が同一鎖上に存在すると、準安定な状態としてステム−ループ構造を形成することができる。このステム−ループ構造は安定的には存在しないが、その構造の形成により剥き出しとなった相補鎖部分（鋳型核酸上の配列（A））に同一の他のプライマーが結合し、すぐさまポリメラーゼが伸長反応を行うことにより、先に合成された鎖が置換されて遊離すると同時に、新たな二本鎖核酸を生成することができる。
本発明の好ましい態様における第一のプライマーの設計基準は次のとおりである。まず、プライマーの伸長により鋳型核酸の相補鎖が合成された後に新たなプライマーが効率よく同鋳型核酸にアニーリングするためには、合成された相補鎖の５’側におけるステム−ループ構造形成により、鋳型核酸上の前記配列（A）の部分を一本鎖とする必要がある。そのためには、配列（Ac’）の塩基数Ｘと、標的配列中における前記配列（A）と前記配列（B）に挟まれた領域の塩基数Ｙとの差（Ｘ−Ｙ）の、Ｘに対する割合（Ｘ−Ｙ）／Ｘが重要となる。ただし、鋳型核酸上において配列（A）よりも５’側に存在する、プライマーのハイブリダイズとは関係無い部分まで一本鎖とする必要はない。また、新たなプライマーが効率よく鋳型核酸にアニーリングするためには、上述のステム−ループ構造形成を効率よく行うことも必要となる。そして、効率の良いステム−ループ構造形成、すなわち、配列（B'）と配列（Bc）との効率のよいハイブリダイゼーションには、前記配列（B'）と前記配列（Bc）との間の距離（Ｘ＋Ｙ）が重要となる。一般に、プライマー伸長反応のための最適温度は、例えば、最高でも７２℃付近であり、そのような低い温度では、伸長鎖が長い領域にわたって解離することは困難である。従って、配列（B'）が配列（Bc）に効率よくハイブリダイズするためには、両配列の間の塩基数は少ないほうが好ましいと考えられる。一方で、配列（B'）が配列（Bc）にハイブリダイズして、鋳型核酸の前記配列（A）の部分を一本鎖とするためには、配列（B'）の塩基数は多い方が好ましいと考えられる。
以上のような観点から、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、プライマーを構成する配列（Ac）と配列（B'）の間に介在配列が存在しない場合において、（Ｘ−Ｙ）／Ｘが、例えば、−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、例えば、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは５０以下、さらに好ましくは４８以下、さらに好ましくは４２以下とされる。
また、プライマーを構成する配列（Ac）と配列（B'）の間に介在配列（塩基数はＹ’）が存在する場合には、本発明の好ましい実施態様による前記第一のプライマーは、｛Ｘ−（Ｙ−Ｙ’）｝／Ｘが、例えば、−１．００以上、好ましくは０．００以上、さらに好ましくは０．０５以上、さらに好ましくは０．１０以上となり、また、例えば、１．００以下、好ましくは０．７５以下、さらに好ましくは０．５０以下、さらに好ましくは０．２５以下となるように設計される。さらに、（Ｘ＋Ｙ＋Ｙ’）は、好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上、さらに好ましくは３０以上とされ、また、好ましくは１００以下、さらに好ましくは７５以下、さらに好ましくは５０以下とされる。
前記第一のプライマーは、例えば、与えられた条件下で、必要な特異性を維持しながら、標的核酸との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長を有するものである。このプライマーの鎖長は、好ましくは１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは２０〜６０ヌクレオチドとする。また、前記第一のプライマーを構成する配列（Ac）と配列（B'）の長さは、それぞれ、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。また、必要に応じて、配列（Ac）と配列（B'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
本発明によるプライマーセットに含まれる第二のプライマーは、上述のように、前記標的配列の相補配列（第一のプライマーがハイブリダイズする鎖に対して反対側の鎖）の３’末端部分の配列（C）にハイブリダイズする配列（Cc'）を３’末端部分に含み、かつ相互にハイブリダイズする２つの核酸配列を同一鎖上に含む折返し配列（D-Dc'）を前記配列（Cc'）の５’側に含むものである。このような第二のプライマーの構造は、例えば、図１０に示すようなものであるが、図１０に示される配列やヌクレオチド数に限定されるものではない。第二のプライマーを構成する配列（Cc'）の長さは、好ましくは５〜５０ヌクレオチド、より好ましくは１０〜３０ヌクレオチドである。また、前記折返し配列（D-Dc'）の長さは、好ましくは２〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは２〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは４〜６０ヌクレオチド、さらに好ましくは６〜４０ヌクレオチドである。前記折返し配列（D-Dc'）の内部におけるハイブリダイゼーションによって形成される塩基対のヌクレオチド数は、好ましくは２〜５００ｂｐ、より好ましくは２〜５０ｂｐ、さらに好ましくは２〜３０ｂｐ、さらに好ましくは３〜２０ｂｐである。前記折返し配列（D-Dc'）のヌクレオチド配列は、いかなる配列であってもよく、特に限定されるものではないが、好ましくは標的配列にハイブリダイズしない配列とされる。また、必要に応じて、配列（Cc'）と折返し配列（D-Dc'）の間に、反応に影響を与えない介在配列を挿入してもよい。
これら第一のプライマーおよび第二のプライマーによる核酸増幅反応について考えられる作用機序を、図１１および図１２を用いて説明する。なお、図１１および図１２では、説明を簡略化するため、ハイブリダイズする２つの配列を相互に相補的な配列としているが、これにより本発明が限定されるものではない。まず、第一のプライマーが標的核酸のセンス鎖にハイブリダイズし、前記プライマーの伸長反応が起きる（図１１(a)）。次いで、伸長鎖（−）上においてステム−ループ構造が形成され、これにより一本鎖となった前記センス鎖の配列（A）に、新たな第一のプライマーがハイブリダイズし（図１１(b)）、該プライマーの伸長反応が起きて、先に合成された伸長鎖（−）が脱離する。次に、脱離した伸長鎖（−）の配列（C）に第二のプライマーがハイブリダイズし（図１１(c)）、前記プライマーの伸長反応が起き、伸長鎖（＋）が合成される（図１１(d)）。生成した伸長鎖（＋）の３’末端と伸長鎖（−）の５’末端ではステム−ループ構造が形成され（図１１(e)）、遊離型の３’末端である伸長鎖（＋）のループ先端から伸長反応が起こると同時に、前記伸長鎖（−）が脱離する（図１１(f)）。ループ先端からの前記伸長反応により、伸長鎖（＋）の３’側に配列（A）および配列（Bc）を介して伸長鎖（−）が結合したヘアピン型の二本鎖核酸が生成し、その配列（A）および配列（Bc）に第一のプライマーがハイブリダイズし（図１１(g)）、その伸長反応により伸長鎖（−）が生成する（図１１(h)および図１２(i)）。また、前記ヘアピン型二本鎖核酸の３’末端に存在する折返し配列によって遊離型の３’末端が提供され（図１１(h)）、そこからの伸長反応により（図１２(i)）、両端に折返し配列を有し、第一および第二のプライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図１２(j)）。この一本鎖核酸では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図１２(k)）、同様の伸長反応が繰り返され、１回の伸長反応あたり２倍の鎖長となる（図１２(l)および(m)）。また、図１２(i)において脱離した第一のプライマーからの伸長鎖（−）では、その３’末端に存在する折返し配列により遊離型の３’末端（相補鎖合成起点）が提供されるため（図１２(n)）、そこからの伸長反応により、両端にステム−ループ構造が形成され、プライマーに由来する配列を介して伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）とを交互に含む一本鎖核酸が生成する（図１２(o)）。この一本鎖核酸においても、３’末端におけるループ形成によって相補鎖合成起点が順次提供されるため、そこからの伸長反応が次々に起こる。このようにして自動的に延長される一本鎖核酸には、第一のプライマーおよび第二のプライマーに由来する配列が伸長鎖（＋）と伸長鎖（−）との間に含まれているため、各プライマーがハイブリダイズして伸長反応を起こすことが可能であり、これにより標的核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖が顕著に増幅される。
また、Smart Amplification Process用プライマーセットは、第一のプライマーおよび第二のプライマー以外に、第三のプライマーを含んでもよい。前記第三のプライマーは、例えば、前記標的配列またはその相補配列にハイブリダイズするものであって、標的配列またはその相補配列へのハイブリダイゼーションについて他のプライマーと競合しないプライマーである。本発明において「競合しない」とは、例えば、そのプライマーが標的配列にハイブリダイズすることによって、他のプライマーによる相補鎖合成起点の付与が妨げられないことを意味する。
第一のプライマーおよび第二のプライマーにより標的配列が増幅された場合には、前述のように、増幅産物は、標的配列とその相補配列とを交互に有するものとなる。前記増幅産物の３’側には、折返し配列またはループ構造が存在し、これにより提供される相補鎖合成起点から、次々に伸長反応が起こっている。第三のプライマーは、このような増幅産物が部分的に一本鎖の状態になった時に、その一本鎖部分に存在する標的配列にアニ−リングできるプライマーであることが好ましい。これにより、増幅産物の標的配列内に新たな相補鎖合成起点が提供され、そこからの伸長反応が起こるため、核酸増幅反応がより迅速に行われるようになる。
前記第三のプライマーは、制限されず、１種類でもよいし、例えば、増幅反応の迅速性および特異性を向上させるため、２種類以上の第三のプライマーを同時に用いてもよい。これらの第三のプライマーは、例えば、典型的には第一のプライマーおよび第二のプライマーとは異なる配列からなるが、これらのプライマーと競合しない限りにおいて、部分的に重なる領域にハイブリダイズしてもよい。第三のプライマーの鎖長は、好ましくは２〜１００ヌクレオチド、より好ましくは５〜５０ヌクレオチド、さらに好ましくは７〜３０ヌクレオチドである。
前記第三のプライマーは、例えば、第一のプライマーおよび第二のプライマーによる増幅反応をより迅速に進めるための補助的な働きを、その主目的とする。従って、前記第三のプライマーは、第一のプライマーおよび第二のプライマーの各３’末端のＴｍよりも低いＴｍを有することが好ましい。また、第三のプライマーの増幅反応液への添加量は、例えば、第一のプライマーおよび第二のプライマーのそれぞれの添加量よりも少ない方が好ましい。
前記第三のプライマーとしては、例えば、国際公開第０２／２４９０２号パンフレットに記載のような、ループを形成できる構造をもつものを鋳型として、そのループ部分に相補鎖合成の起点を付与するものをあげることができるが、これに限定されない。すなわち、例えば、標的配列内であれば、いかなる部位に相補鎖合成起点を付与するものであってもよい。
前記Smart Amplification Process用プライマーセットにおいては、例えば、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーのいずれか一方、または、前記両方のプライマーが、例えば、蛍光色素等の標識物質で標識化された標識プライマーであってもよいし、前記第三のプライマーが、例えば、前記標識プライマーであってもよい。また、第一のプライマーおよび第二のプライマーのいずれか一方もしくは両方と、第三のプライマーとが、全て前記標識プライマーであってもよい。
また、前記Smart Amplification Process法を、例えば、変異の判定方法に適用する場合、前記Smart Amplification Process用プライマーを、以下のように設計することが好ましい。すなわち、前記Smart Amplification Process用プライマーセットは、標的部位（検出部位）に変異を有する核酸配列（変異型配列）または前記標的部位に変異を有さない核酸配列（野生型配列）を、標的配列とし、目的の変異を生じる前記標的部位が、配列（A）、配列（B）もしくは配列（C）に含まれるか、または、配列（A）と配列（B）との間もしくは配列（A）と配列（C）との間に配置されるように、プライマーセットを設計することが好ましい。
前記プライマーセットとして、標的部位に変異を有する変異型配列を標的配列として設計したプライマーセットを用いる場合、例えば、増幅反応後における増幅産物の存在が、変異型配列の存在を示し、増幅産物の不在または減少が、変異型配列の不在を示す。一方、標的部位に変異を有さない核酸配列（野生型配列）を標的配列として設計したプライマーセットを用いる場合、例えば、増幅反応後における増幅産物の存在が、変異型配列の不在を示し、増幅産物の不在または減少が、変異型配列の存在を示す。ここで、「増幅産物の減少」とは、例えば、得られた増幅産物の量が、被検核酸に標的配列が存在する場合に得られる増幅産物の量と比較して、減少していることを意味する。
前記プライマーセットとしては、例えば、標的部位が、前記配列（A）に含まれるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットであれば、例えば、被検核酸に標的配列（例えば、野生型配列）が含まれる場合、増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。一方、被検核酸に前記標的配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれる場合、増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングし難い。このため、増幅産物が得られないか、または、得られる増幅産物の量が著しく減少する。第一のプライマーに含まれる配列（Ac）は、前記配列（A）に相補的な配列とすることが好ましい。
また、前記プライマーセットとしては、例えば、標的部位が、前記配列（C）に含まれるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットによれば、例えば、被検核酸に標的配列（例えば、野生型配列）が含まれる場合、増幅反応において、第二のプライマーが配列（C）にアニーリングするため、増幅産物が得られる。一方、被検核酸に前記標的配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれる場合、増幅反応において、第二のプライマーが配列（C）にアニーリングし難い。このため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。第二のプライマーに含まれる配列（Cc'）は、前記配列（C）に相補的な配列とすることが好ましい。
また、前記プライマーとしては、例えば、標的部位が、前記配列（B）に含まれるように設計されたプライマーセットであることが好ましい。このようなプライマーセットによれば、例えば、被検核酸に標的配列（例えば、野生型配列）が含まれる場合、増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行われた後、前記プライマーに含まれる配列（B'）が、伸長鎖の配列（Bc）にハイブリダイズする。このため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、前述の図９に示した作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方、被検核酸に前記標的配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれる場合、増幅反応における前記ステム−ループ構造の形成が困難となるため、前記図９に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、第一のプライマーに含まれる配列（B'）は、前記配列（B）と同一の配列とすることが好ましい。
また、前記プライマーセットしては、例えば、標的部位が、前記配列（A）と前記配列（B）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットによれば、被検核酸に標的配列（例えば、野生型配列）が含まれる場合、増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行われた後、前記プライマーに含まれる配列（B'）が、伸長鎖の配列（Bc）にハイブリダイズする。このため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、前記図９に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方、被検核酸に前記標的配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれる場合、第一のプライマーに含まれる配列（B'）と伸長鎖上の配列（Bc）とが適切な距離を維持していないため、増幅反応における前記ステム−ループ構造の形成が困難となる。配列（A）と配列（B）との間に、長い配列の挿入や欠失がある場合等である。従って、この場合、前記図９に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。
また、前記プライマーセットとしては、例えば、標的部位が、前記配列（A）と前記配列（C）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットによれば、被検核酸に標的配列が含まれている場合（例えば、野生型配列）、増幅反応において、第一のプライマーが配列（A）にアニーリングして伸長反応が行なわれた後、前記プライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上の配列（Bc）にハイブリダイズするため、ステム−ループ構造が効率的に形成される。この効率的なステム−ループ構造の形成により、他の第一のプライマーが鋳型にアニーリングすることが可能となり、前記図９、図１１および図１２に示される作用機序が効率的に進行するため、増幅産物が得られる。一方、被検核酸に前記標的配列とは異なる核酸配列（例えば、変異型配列）が含まれる場合、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。例えば、配列（A）と配列（C）との間における長い配列の挿入により、被検核酸に標的配列とは異なる核酸配列が含まれる場合、増幅の速度（効率）が著しく低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。また、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により、被検核酸に標的配列とは異なる核酸配列が含まれており、かつ、この欠失により配列（B）の一部または全部が失われている場合、第一のプライマーに含まれる配列（B'）が伸長鎖上にハイブリダイズできないため、ステム−ループ構造の形成が不可能となるか、または困難となる。このため、前記図９、図１１および図１２に示される作用機序が妨げられ、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。さらに、配列（A）と配列（C）との間における配列の欠失により、被検核酸に標的配列とは異なる核酸配列が含まれており、かつこの前記欠失による配列（B）の部分的欠失が生じない場合にも、増幅の速度（効率）が低減されるため、増幅産物が得られないか、または得られる増幅産物の量が著しく減少する。
また、本発明においては、前述のように、欠失、挿入または付加に係る標的部位が、真核生物のゲノムに含まれるイントロン配列であってもよい。この場合、例えば、標的遺伝子のイントロンを欠失するｍＲＮＡを被検核酸とし、前記イントロン配列の欠失に係る標的部位が、前記配列（A）と前記配列（B）との間に配置されるように設計されたプライマーセットが好ましい。このようなプライマーセットによれば、まず、第一のプライマーの３’側に存在する配列（Ac'）が、鋳型核酸（被検核酸）にアニーリングして伸長反応が起こる。そして、さらに、前記第一のプライマーからの伸長鎖が目的領域を合成していた場合にのみ、前記第一プライマーの５’側に存在する配列（B'）が、自己伸長産鎖上の隣のエクソンに対応する配列（Bc）にハイブリダイズできる。すなわち、前記伸長鎖が、二つのエクソンを順番通りに連結させた配列を有するｍＲＮＡの目的領域を合成しているときに、はじめて前記図９に示すステム−ループ構造が形成され、一本鎖となった鋳型核酸の配列（A）に、新たな第一のプライマーがアニーリング可能となる。この第一のプライマーの５’側におけるステム−ループ構造の形成は、前述のように、鋳型核酸の配列（A）と配列（B）とが適切な間隔で存在するときに、効率よく繰り返される。このため、イントロン配列を含まないｍＲＮＡを鋳型にする時のみ、増幅が起き、イントロン配列を含むようなゲノムＤＮＡでは、増幅は起きないこととなる。この反応を等温で繰り返すことによって、正確に標的配列の増幅を行うことができ、また、このステム−ループ構造の形成がサイクルごとに正確に繰り返されるため、目的の配列のみを正確に増幅することが可能となる。特に、このようなSmart Amplification Process法によると、特異性が高いために、非特異増幅を抑制して、標的とするｍＲＮＡのみを特異的に増幅できるため、その定量性も向上する。本発明によれば、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを共存させることから、その定量性はさらに向上できる。また、この原理により、例えば、煩雑で時間のかかるＤＮａｓｅ処理等を行い、試料中のＤＮＡを壊してＲＮＡを獲得する工程を省略可能となり、ｍＲＮＡの自然崩壊を低減でき、より迅速な定性または定量の診断が行えるようになる。
ＬＡＭＰ法
前記対称型のプライマーセットは、前述のように、対になる一方のプライマーの形態と他方のプライマーの形態とが同じである対称型のプライマーセットであり、中でも、前記ＬＡＭＰ法に適用することが好ましい。このプライマーセットを、以下、「ＬＡＭＰ用プライマーセット」ともいう。
ＬＡＭＰ法は、例えば、４種類のプライマーが必要とされ、それらが６個所の領域を認識することにより、目的遺伝子の増幅が可能となる。すなわち、この方法では、まず、第一のプライマーが鋳型鎖にアニーリングして伸長反応が起こる。次に、第一のプライマーよりも上流側に設計された第二のプライマーによる鎖置換反応によって、第一のプライマーによる伸長鎖が鋳型鎖から分離する。この時、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長鎖の構成に起因して、伸長鎖の５’側でステム−ループ構造が形成される。これと同様の反応が二本鎖核酸のもう一方の鎖、もしくは、剥ぎ取られた第一のプライマー伸長鎖の３’側についても行なわれる。そして、これらの反応が繰り返されることにより、標的配列が増幅される。ＬＡＭＰ法における鋳型は、例えば、３’側と５’側において、それぞれ末端領域に相補的な塩基配列からなる領域を同一鎖上に備え、この互いに相補的な塩基配列がアニーリングしたときに両者の間に塩基対結合が可能となるループが形成される鋳型である（「ダンベル型鋳型核酸」ともいう）。ＬＡＭＰ法は、例えば、国際公開第００／２８０８２号パンフレット、国際公開第０１／０３４８３８号パンフレット等に従って行うことができる。
（非等温増幅法）
ＰＣＲ法
ＰＣＲ法は、前述のように、反応温度を変化させることにより、例えば、二本鎖核酸の解離、解離した一本鎖へのプライマーのアニーリング、プライマーからの核酸合成により、標的配列の増幅を行うことができる。ＰＣＲ法の条件は、特に制限されず、当業者であれば適宜設定できる。
本発明の第一の判定方法について、以下に、二本鎖ＤＮＡを被検核酸（鋳型核酸）とする例をあげて説明する。
まず、被検核酸である二本鎖ＤＮＡ、プライマー、Ａａｃ ＭｕｔＳ、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを含む反応液を準備する。なお、使用する前記プライマーの種類は、特に制限されず、例えば、核酸増幅反応の種類や、増幅目的の標的配列の種類に応じて設定でき、１種類または２種類以上を使用してもよく、また、対となるプライマーセットを、１種類または２種類以上を使用してもよい。
前記反応液における各成分の濃度は、特に制限されないが、例えば、前述の通りである。また、前記反応液におけるｄＮＴＰの濃度は、例えば、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌである。ｄＮＴＰは、例えば、ＡＴＰ、ＴＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰを含み、さらに、ＴＴＰに代えて、または加えてＵＴＰを含んでもよい。
前記反応液は、さらに、例えば、緩衝液、界面活性剤、触媒、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ベタイン、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＥＤＴＡ等のキレート剤、グリセロール等を含んでもよい。前記緩衝液としては、例えば、トリス塩酸緩衝液、トライシン緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液等があげられ、前記反応液における濃度は、例えば、０．００１〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌであり、ｐＨは、例えば、５〜１０である。前記界面活性剤としては、例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０等のＴｗｅｅｎ系、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００等のＴｒｉｔｏｎ系等があげられる。前記触媒としては、例えば、酢酸カリウム等のカリウム塩、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩、硫酸マグネシウム等のマグネシウム塩等があげられる。また、例えば、核酸増幅の効率を向上するための融解温度調整剤として、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミド、グリセロール等、酵素の安定化を図るための酵素安定化剤として、グリセロール、ウシ血清アルブミン、糖類等を含んでもよい。前記糖類としては、例えば、単糖、オリゴ糖があげられ、具体的には、トレハロース、ソルビトール、マンニトール等が使用できる。また、前記反応液は、例えば、国際公開第９９／５４４５５号パンフレットに記載されている酸性物質や、陽イオン錯体等を含んでもよい。これらの各種成分は、例えば、いずれか１種類でもよいし、２種類以上を併用してもよい。
そして、前述のように、前記反応液にＡａｃ ＭｕｔＳを共存させた状態で、核酸の増幅反応を行う。前記増幅反応の条件は、特に制限されず、その種類に応じて適宜設定できる。
さらに、前記増幅反応により得られる増幅産物を検出し、増幅の有無を確認する。増幅産物の検出は、例えば、反応中において経時的に行ってもよいし、反応開始から一定時間経過後に行ってもよい。前者は、いわゆるリアルタイムでの検出であり、例えば、連続的な検出であってもよいし、断続的な検出であってもよい。後者の場合、例えば、反応開始時と一定時間経過時に増幅産物の検出を行い、その変動から増幅の有無を確認することが好ましい。
増幅産物の検出方法は、特に制限されず、以下に示すような従来公知の方法が使用できる。
前記増幅産物の検出方法としては、例えば、一般的なゲル電気泳動により、特定のサイズの増幅産物を検出する方法があげられ、例えば、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ等の蛍光物質により検出できる。また、標識化物質で標識化されたプローブを用い、これを前記増幅産物にハイブリダイズさせて、検出することもできる。前記標識物質としては、例えば、ビオチンがあげられる。前記ビオチンは、例えば、蛍光標識されたアビジン、ペルオキシダーゼ等の酵素が結合されたアビジン等との結合によって検出可能である。さらに、免疫クロマトグラフを用いる方法があり、例えば、肉眼で検出可能な標識を利用したクロマトグラフ媒体を使用する方法（イムノクロマトグラフィー法）があげられる。具体的には、例えば、前記増幅産物と標識プローブとをハイブリダイズさせ、これを、前記プローブとは異なる部位で前記増幅産物にハイブリダイズ可能な捕捉プローブを固定化したクロマト媒体に接触させる。すると、前記クロマト媒体に固定した前記捕捉プローブにより、前記増幅産物と前記標識プローブとのハイブリッド体をトラップできる。その結果、例えば、肉眼により、前記増幅産物を容易に検出することが可能となる。さらに、本発明においては、例えば、増幅の副産物であるピロリン酸を検出することで、間接的に増幅産物を検出することも可能である。特に、前述のSmart Amplification Process法は、増幅効率が非常に高いため、ピロリン酸による間接的な検出も好ましい。このような方法では、例えば、反応液中のマグネシウムと生成したピロリン酸とが結合して、ピロリン酸マグネシウムの白色沈澱が生じることを利用し、前記反応液の白濁を目視または光学的手法で観察することにより、増幅の有無を検出できる。また、ピロリン酸がマグネシウム等の金属イオンと強く結合して不溶性塩を形成し、前記反応液中のマグネシウムイオン濃度が著しく減少することを利用する方法もある。このような方法では、例えば、マグネシウムイオン濃度に応じて色調が変化する金属指示薬（例えば、Eriochrome Black T、Hydroxy Naphthol Blue等）を、前記反応液に添加しておき、前記反応液の色の変化を目視または光学的手法で観察することにより、増幅の有無を検出できる。さらに、例えば、Calcein等の蛍光色素を用いることによっても、増幅反応に伴う蛍光の増大を目視や光学的手法で観察できるため、リアルタイムでの増幅産物の検出が可能となる。
本発明においては、例えば、増幅産物の生成に起因する固相担体の凝集を観察することで、増幅産物の有無を検出することもできる。このような方法においては、例えば、本発明で使用する少なくとも１種類のプライマーが、例えば、固相担体と結合していること、または、固相担体と結合可能な部位または基を含むことが好ましい。前記プライマーにおいて、前記固相担体、または、固相担体と結合可能な部位もしくは基は、例えば、前記プライマーの３’末端領域、５’末端領域および中央領域等、いずれの領域に導入されてもよく、好ましくは、５’末端領域である。また、増幅反応において使用されるデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ）等の基質が、例えば、固相担体と結合していてもよいし、または固相担体と結合可能な部位もしくは基を含んでもよい。
前記固相担体としては、特に制限されず、例えば、増幅反応に使用する反応液に不溶性の担体、増幅の前後において液相から固相（ゲル相）に性状が変化する相転移性担体、または、増幅の前後において固相（ゲル相）から液相に性状が変化する相転移性担体等が使用できる。好ましい固相担体としては、例えば、水不溶性有機高分子担体、水不溶性無機高分子担体、合成高分子担体、相転移性担体、金属コロイド、磁性粒子、溶媒不溶性有機高分子担体、溶媒不溶性無機高分子担体、溶媒可溶性高分子担体、ゲル高分子担体等があげられる。前記水不溶性有機高分子としては、例えば、多孔質シリカ、多孔質ガラス、珪藻土、セライト等の珪素含有物質；ニトロセルロース、ヒドロキシアパタイト、アガロース、デキストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等の多糖類の架橋体；メチル化アルブミン、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン等のタンパク質の架橋体；ゲル状粒子、染料ゾル等があげられる。前記水不溶性無機高分子としては、例えば、酸化アルミニウム、酸化チタン、セラミック粒子等があげられる。前記合成高分子としては、例えば、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリビニルアルコール、ポリアクリロニトリルまたはこれらの共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル共重合体等があげられる。前記金属コロイドとしては、例えば、金コロイド等があげられる。前記磁性粒子としては、例えば、磁性酸化鉄のビーズ、磁性酸化鉄の微粉砕粒子を表面にコーティングした粒子単体、超常磁性粒子（特表平４−５０１９５９号公報）、重合性シラン被膜で覆われた超常磁性酸化鉄を有する磁気応答粒子（特公平７−６９８６号公報）、有機ポリマー中に封入された微粉末状の磁化可能な粒子等があげられる。磁性化された固相担体は、例えば、固体と液体との分離を、磁力を利用して簡単に行うことができる。前記固相担体の形状としては、特に制限されないが、例えば、粒子、膜、繊維状、フィルター等があげられ、中でも粒子が好ましく、その表面は、例えば、多孔質または非多孔質のいずれであってもよい。特に好ましい固相担体としては、例えば、合成高分子担体が水等に均一に分散されたラテックス、金コロイド等の金属コロイド粒子、マグネットビーズ等の磁性粒子等があげられる。
前記固相担体への前記プライマーまたは前記基質の固定化方法は、特に制限されない。前記固定化は、例えば、当業者に公知の方法により行うことができ、物理的な結合または化学的な結合のいずれによる方法であってもよい。前記固定化は、例えば、一般的に、プライマーやプローブ等のオリゴヌクレオチドを標識化しうる物質と、これに結合可能な物質を結合させた固相担体とを、組み合わせて使用することにより行える。前記物質の組み合わせとしては、特に制限されず、当該技術分野において公知のものを使用でき、例えば、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの組み合わせ、抗原とこれに結合しうる抗体との組み合わせ、リガンドとこれに結合しうるレセプターとの組み合わせ、相互にハイブリダイズする２つの核酸の組み合わせ等があげられる。具体的には、例えば、ビオチンで標識したプライマーまたは基質を、アビジンもしくはストレプトアビジンで表面をコートした固相担体に結合させることにより、プライマーまたは基質を固相担体に固定化できる。前記抗原としては、例えば、ＦＩＴＣ、ＤＩＧ、ＤＮＰ等のハプテンがあげられ、これらと結合しうる抗体としては、例えば、抗ＦＩＴＣ抗体、抗ＤＩＧ抗体、抗ＤＮＰ抗体等の抗体があげられる。また、これらの抗体は、例えば、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれであってもよい。特に、ビオチンとストレプトアビジンとの結合は、例えば、特異性が高く結合効率も良好であるため、特に好ましい。ビオチン、ハプテン、リガンド等の標識物質は、例えば、いずれも単独で、あるいは必要に応じて複数の組み合わせで、公知の手段（例えば、特開昭５９−９３０９９号公報、特開昭５９−１４８７９８号公報、および特開昭５９−２０４２００号公報を参照）により、プライマーの５’末端領域等に導入できる。
前記固相担体と結合可能な部位または基は、例えば、前述した前記固相担体へのプライマーまたは基質の固定化方法に応じて、適宜選択可能である。このため、前記部位または基は、例えば、前記固相担体との物理的な結合を可能とするもの、および化学的な結合を可能とするもののいずれであってもよいが、特異的結合を可能とするものが好ましい。前記固相担体と結合可能な部位としては、例えば、前述のように、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗原、抗体、リガンド、レセプター、核酸、タンパク質などがあげられ、好ましくは、ビオチンまたはストレプトアビジンであり、より好ましくは、ビオチンである。このような部位を有するプライマーまたは基質を用いることにより、例えば、増幅反応後、生成した増幅産物に前記固相担体を結合させることが可能となる。この場合、前記固相担体は、例えば、必要に応じて、前記プライマーまたは基質に含まれる前記部位の結合相手を含むことが好ましい。前記固相担体における前記結合相手は、例えば、プライマーまたは基質における前記部位に対して結合可能な状態で存在すればよく、好ましくは、前記固相担体の表面上に存在するものであり、より好ましくは、前記固相担体の表面上に塗布されたものである。
本発明においては、例えば、複数の標的配列のそれぞれに対して、前述のようなプライマーセットを用意し、これらの複数のプライマーセットを、相互に識別可能な形で前記固相担体にそれぞれ固定化し、前記複数の固定化プライマーセットを用いて増幅反応を行ってもよい。このような方法によれば、複数の標的配列を同時に増幅し、各標的配列の増幅産物を、識別して検出可能である。前記増幅産物の検出は、例えば、インターカレーター等を用いて行うことができる。具体的には、例えば、前記複数のプライマーを、平面状の固相担体上の特定の位置にそれぞれ固定化しておけば、増幅反応および増幅産物の検出の後、前記増幅産物が検出された位置によって、増幅された標的配列を特定できる。このような方法において、前記固相担体としては、前記平面状の固相担体だけでなく、例えば、相互に識別可能なビーズ表面（米国特許第６０４６８０７号明細書および米国特許第６０５７１０７号明細書）、繊維状担体に各プライマーセットを固相化したものを束ね、それを薄片に切断して作製された準平板担体（特開２０００−２４５４６０号公報）等、当該技術分野において公知のものを使用できる。
これらの他に、増幅産物の検出方法としては、例えば、インターカレーター法があげられる。この方法は、例えば、二本鎖核酸にインターカレートするインターカレーターを使用し、励起光照射により発生する蛍光により、増幅の有無を判断する方法である。また、蛍光物質とクエンチャーとを利用する方法も採用でき、例えば、TaqMan（商標）プローブ法、サイクリングプローブ法等があげられる。また、国際公開第ＷＯ２００８／１１１４８５号パンフレットに開示されている化合物を有するプローブやプライマーを用いて、増幅の有無を判断することも好ましい。この方法によれば、前記プローブまたはプライマーと増幅産物とが二本鎖核酸を形成すると、励起光の照射により蛍光を発するため、前記蛍光の検出により増幅の有無を判断することができる。この方法によれば、例えば、未精製の核酸試料や精製度の低い核酸試料であっても、バックグラウンドの上昇を軽減できることから、特に好ましい。これらの方法は、例えば、いわゆるリアルタイムでの検出に適用することが好ましい。
また、プライマーの５’末端をチップ等の固相に固定化しておき、前記固相上で増幅反応を行ってもよい。この場合、例えば、前記プライマーに、二本鎖形成により発光する蛍光物質を付加しておいてもよいし、前記蛍光物質を付加したプローブの存在下で、増幅反応を行ってもよい。これにより、例えば、前記チップ等の固相上で増幅反応を行いながら、リアルタイムで増幅産物の検出を行うことが可能である。
そして、増幅の有無から、被検核酸配列における標的部位が野生型であるか変異型であるかを判断する。プライマーとして、例えば、野生型配列における前記標的部位を含む領域に対して完全に相補的なプライマーを使用すれば、増幅が確認された場合は、前記標的部位は野生型であり、変異は存在しないと判断できる。また、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位は変異型であり、変異が存在すると判断できる。他方、プライマーとして、例えば、変異型配列における前記標的部位を含む領域に対して完全に相補的なプライマーを使用すれば、増幅が確認された場合には、前記標的部位は変異型であり、変異が存在すると判断できる。また、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位は野生型であり、変異は存在しないと判断できる。
つぎに、本発明の第二の判定方法について説明する。
本発明の第二の判定方法は、前述のように、被検核酸の標的部位における変異の有無を判定する方法であって、下記（Ｉ’）工程と下記（ＩＩ）工程とを含むことを特徴とする。
（Ｉ’）本発明のＡａｃ ＭｕｔＳと、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブとの存在下、前記被検核酸を増幅するためのプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅する工程
（ＩＩ）増幅の有無を確認する工程
本発明の判定方法で使用するＡａｃ ＭｕｔＳは、前述のように、ミスマッチ塩基対を特異的に認識して結合でき、例えば、相補的な塩基対、いわゆるフルマッチ塩基対よりもミスマッチ塩基対に対する特異性が高い。このため、本発明の第二の判定方法によれば、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブが、前記被検核酸にミスマッチ結合した場合、そのミスマッチ部位に特異的にＡａｃ ＭｕｔＳが結合する。この場合、前記被検核酸において前記プローブとは別の領域にハイブリダイズしたプライマーからの伸長鎖が、前記ミスマッチ部位付近に到達しても、結合したＡａｃ ＭｕｔＳの存在により、伸長反応が抑制される。この結果、前記プローブとミスマッチ結合する標的配列の誤った増幅を回避できるため、増幅の有無による変異の有無の判断を、優れた信頼性で行うことができる。
なお、前記プローブは、標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能であることから、「標的プローブ」ともいい、前記「前記標的部位を含む領域」は、前記標的プローブがハイブリダイズ可能であることから、前記第一の判定方法と同様に、ハイブリッド領域ともいう。
本発明の第二の判定方法は、特に示さない限り、本発明の第一の判定方法と同様に行うことができる。具体的には、本発明の第一の判定方法における「標的プライマー」に代えて、前記標的プローブを使用し、さらに、前記標的配列を増幅するためのプライマーを使用する以外は、第一の判定方法と同様に行うことができる。
前記標的プローブは、例えば、前記プローブを構成する核酸や塩基の種類等、前記第一の判定方法における前記標的プライマーと同様にすることができる。前記プローブの長さは、特に制限されないが、例えば、５〜４０塩基であり、より好ましくは１５〜２５塩基である。また、前記プローブの被検核酸に対するアニーリング条件は、特に制限されないが、例えば、２０〜８０℃の範囲でハイブリダイズすることが好ましい。また、前記プローブは、例えば、一方もしくは両方の末端に、標識やアミノ基等の活性基等を有してもよい。
本発明の第二の判定方法では、例えば、前記（I’）工程において、前記標的部位が変異型である前記領域にハイブリダイズ可能な標的プローブを使用すれば、前記（ＩＩ）工程において、増幅が確認された場合は、前記標的部位が変異型であると判定し、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位が正常型であると判定できる。他方、例えば、前記（I’）工程において、前記標的部位が野生型である前記領域にハイブリダイズ可能な標的プローブを使用すれば、前記（ＩＩ）工程において、増幅が確認された場合は、前記標的部位が正常型であると判定し、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位が変異型であると判定できる。
＜伸長反応の抑制方法および核酸増幅方法＞
本発明の抑制方法は、被検核酸にミスマッチ結合したプライマーからの伸長反応を抑制する方法であって、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの存在下、前記被検核酸における標的配列を増幅するためのプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的配列の増幅を行うことを特徴とする。
また、本発明の核酸の増幅方法は、被検核酸における標的配列を増幅する方法であって、前記標的配列を増幅するためのプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的配列の増幅を行う工程を有し、前記工程において、前記本発明の抑制方法により、前記被検核酸にミスマッチ結合したプライマーからの伸長反応を抑制することを特徴とする。
前述のように、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対に特異的に結合する。このため、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの存在下で標的配列の増幅を行えば、例えば、前記被検核酸にプライマーがミスマッチ結合した場合、前記Ａａｃ ＭｕｔＳがミスマッチ塩基対を認識して結合するため、前記プライマーからの伸長反応を抑制できる。他方、後述するように、プライマーを用いた増幅の有無によって、標的部位の変異の有無を判断する方法がある。このような場合に、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを共存させることによって、前記被検核酸と前記プライマーとの間にミスマッチ塩基対が形成されれば、前記Ａａｃ ＭｕｔＳがこれを認識して結合するため、前記プライマーからの伸長は抑制される。そして、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳは、前述のように、特にミスマッチ塩基対に対する特異性が高いことから、従来よりも優れた信頼性で変異の有無を判定することが可能となる。
前記被検核酸の標的配列において、変異が生じている可能性がある部位が既知の場合がある。例えば、前記部位を標的部位とし、前記標的部位が野生型であるか変異型であるかによって、標的配列の増幅をコントロールする場合、または、プライマーからの伸長を抑制する場合、本発明の核酸増幅方法および抑制方法は、例えば、下記（Ｉ）工程または下記（Ｉ’）工程を含むことが好ましい。なお、これらの工程については、前述した本発明の判定方法と同様である。
（Ｉ）本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの存在下、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅する工程
（Ｉ’）本発明のＡａｃ ＭｕｔＳと、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブとの存在下、前記被検核酸を増幅するためのプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅する工程
なお、本発明の抑制方法および核酸増幅方法は、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳの存在下で増幅反応を行うことが特徴であり、その他の条件は、特に制限されない。これらの具体的な手法については、前述した本発明の変異の判定方法と同様である。
＜各種試薬＞
本発明の判定試薬は、本発明の判定方法に使用する試薬であって、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを含むことを特徴とする。本発明の判定試薬は、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。
本発明の判定試薬は、さらに、前述したＡＤＰ等の添加剤、他のＭｕｔＳ、プライマー、ポリメラーゼ等の酵素、ｄＮＴＰ、緩衝液、融解温度調整剤、酵素安定剤等の試薬類を含んでもよい。本発明の判定試薬における各成分の添加割合は、特に制限されないが、例えば、増幅反応の反応液に添加した際、前述のような濃度となるような割合が好ましい。また、本発明の判定試薬は、例えば、本発明の判定方法に使用するための判定キットであってもよい。この場合、例えば、さらに使用説明書を含むことが好ましい。また、本発明の判定試薬および判定キットにおいて、各成分は、例えば、それぞれ単独で容器に収容されてもよいし、適宜組み合わせて、各容器に収容されてもよい。前記容器の形態や材質等も、特に制限されない。
また、本発明の増幅試薬は、本発明の増幅反応に使用する試薬であり、本発明の抑制試薬は、本発明の抑制方法に使用する試薬であり、それぞれ、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを含むことを特徴とする。本発明の増幅試薬および抑制試薬は、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。また、その構成は、特に制限されず、前述の判定試薬と同様である。
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、以下の実施例により制限されない。
[実施例１]
Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ｓｕｂｓｐ． Ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＪＣＭ５２６０からＤＮＡをクローニングし、Ａａｃ ＭｕｔＳの発現および精製を行った。
Ａａｃ ＭｕｔＳの発現
Ａａｃ ＭｕｔＳをコードする配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲクローニングキット（タカラバイオ社製）により、ｐＥＴ１７ｂベクター（Novagen社製）のＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Ａａｃ ＭｕｔＳ発現ベクターｐＥＴＡａｃｍｕｔＳを構築した。前記ｐＥＴＡａｃｍｕｔＳを大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)RIL（Stratagene社製）に導入し、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地１００ｍＬを用いて終夜３７℃で振盪培養し、前培養液とした。前記前培養液５ｍＬを、１００μｇ／ｍＬアンピシリンおよび３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地５００ｍＬに植菌し、３３℃、２００ｒｐｍで振盪培養した。この培養液のＯＤ６００が１付近に達した際、前記培養液にＩＰＴＧを終濃度０.１ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、さらに３３℃、２００ｒｐｍで３時間振盪培養した。この培養液を遠沈管に移し、３９,２００ｍ／ｓ２、４分間の遠心分離を行い、菌体を回収した。前記回収菌体をＰＢＳ５０ｍＬで懸濁し、再度、３９,２００ｍ／ｓ２、４分間の遠心分離を行い、菌体を洗浄した。前記菌体１ｇ当たり５ｍＬのリシスバッファーを用いて前記菌体を懸濁し、フレンチプレスにより６.２ＭＰａの条件下、前記菌体を破砕した。前記リシスバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、２５％（ｗ／ｖ）ショ糖、プロテアーゼ阻害剤タブレット（１タブレット／Ｌ、商品名Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ ｔａｂｌｅｔｓ、Ｒｏｃｈｅ社製）とした。この菌体破砕液に１０％Ｂｒｉｊ−５８を終濃度０.５％（ｗ／ｖ）となるように添加し、前記菌体破砕液を４℃で３０分間穏やかに混和した。この混合液を、４℃、１５,０００ｒｐｍで４０分間遠心分離を行い、上清を得た。前記上清を３０ｍＬずつ５０ｍＬ容量のチューブ（ファルコン社製）に移し、６０℃、１０分間の熱処理を行った。熱処理後の前記上清を、４℃、１８,０００ｒｐｍで４０分間遠心分離し、上清を得た。この上清を、４Ｌのランニングバッファーを用いて２回透析を行い、粗抽出液を得た。前記ランニングバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノールとした。
Ａａｃ ＭｕｔＳの精製
各種クロマトグラフィーを用いて、Ａａｃ ＭｕｔＳの精製を行った。
（１）強陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
強陰イオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（５０ｍＬ）、ＧＥヘルスケア社製）および高速液体クロマトグラフィーシステム（AKTA explorer 100、ＧＥヘルスケア社製）を使用した。第１のランニングバッファーを用いて、流速２ｍＬ／分の条件で前記強陰イオン交換カラムを平衡化した。前記第１のランニングバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールとした。そして、前記粗抽出液を前記強陰イオン交換カラムに流速３ｍＬ／分でアプライした後、同条件で前記第１のランニングバッファー１２０ｍＬを流して、前記カラムを洗浄し、非吸着画分を除去した。つぎに、前記カラムに、塩化ナトリウム０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度勾配をかけた前記第１のランニングバッファー５４０ｍＬ、続いて、塩化ナトリウム３００〜１０００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度勾配をかけた前記第１のランニングバッファー５４０ｍＬを流して、吸着画分を溶出し、１０ｍＬずつ分画した。各画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供し、目的の分子量（ＭＷ約９６，０００Ｄａ）のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。これらの回収画分をまとめ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、４℃、４９,０００ｍ／ｓ２で１５分間遠心分離を行い、約２０ｍＬまで濃縮した。この濃縮液に、等量の前記第１のランニングバッファー（塩化ナトリウム無添加）を添加し、再度、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５を用いて同様に遠心分離を行い、得られた濃縮液に、前記第１のランニングバッファーを添加して全体を５０ｍＬとした。
（２）ヘパリンアフィニティーカラムクロマトグラフィー
つぎに、ヘパリンアフィニティーカラム（ヘパリンセファロースＨＰ（５０ｍＬ）、ＧＥヘルスケア社製）および前記高速液体クロマトグラフィーシステムを使用した。前記第１のランニングバッファーを用いて、流速２ｍＬ／分の条件で前記ヘパリンアフィニティーカラムを平衡化した。そして、前述のイオン交換カラムクロマトグラフィーにより得た溶液を、前記ヘパリンアフィニティーカラムに流速１ｍＬ／分でアプライした後、同条件で前記第１のランニングバッファー２５ｍＬを流して前記カラムを洗浄し、非吸着画分を除去した。つぎに、前記カラムに塩化ナトリウム０〜４５０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度勾配をかけた前記第１のランニングバッファー４００ｍＬを流して吸着画分を溶出し、１０ｍＬずつ分画した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して目的の分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。これらの回収画分をまとめ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、４℃、４９,０００ｍ／ｓ２で１５分間遠心分離を行い、約２０ｍＬまで濃縮した。この濃縮液に、等量の第２のランニングバッファーを添加し、再度、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５を用いて同様に遠心分離を行い、得られた濃縮液に、前記第２のランニングバッファーを添加して全体を２０ｍＬとした。前記第２のランニングバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）、１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、５ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、１０％（ｗ／ｖ）グリセロールとした。
（３）ゲルろ過カラムクロマトグラフィー
つぎに、ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ200 prep grade XK50-65、ＧＥヘルスケア社製）および前記高速液体クロマトグラフィーシステムを使用した。前記第２のランニングバッファーを用いて、流速５ｍＬ／分の条件で前記ゲルろ過カラムを平衡化した。そして、前述のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより得た溶液を、前記ゲルろ過カラムに流速１ｍＬ／分でアプライした後、同条件で前記第２のランニングバッファーを流して、ろ過画分を１５ｍＬずつ分画した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、目的の分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。これらの回収画分をまとめ、前記第２のランニングバッファーを添加して全体を２５０ｍＬとした。
（４）強陰イオン交換カラムクロマトグラフィー
最後に、強陰イオン交換カラム（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ（２０ｍＬ）、ＧＥヘルスケア社製）および前記高速液体クロマトグラフィーシステムを使用した。前記第２のランニングバッファーを用いて、流速４ｍＬ／分の条件で前記強陰イオン交換カラムを平衡化した。そして、前述のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより得た溶液を、前記強陰イオン交換カラムに流速１ｍＬ／分でアプライした後、同条件で前記第２のランニングバッファー１２０ｍＬを流して、前記カラムを洗浄し、非吸着画分を除去した。つぎに、前記カラムに塩化ナトリウム０〜３００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度勾配をかけた前記第２のランニングバッファー４２０ｍＬを流して、吸着画分を溶出し、１０ｍＬずつ分画した。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して目的の分子量のタンパク質バンドを確認した後、同バンドを有する画分を回収した。これらの回収画分をまとめ、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて、４℃、４９,０００ｍ／ｓ２で１５分間遠心分離を行い、約２０ｍＬまで濃縮した。この濃縮液に、１２ｍＬの２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）を添加し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ−１５を用いた同様の遠心分離を３回くり返し行った。得られた濃縮液に、２０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.５）を添加して全体を５ｍＬとした。このようにして、精製Ａａｃ ＭｕｔＳが得られた。なお、得られたタンパク質が分子量約９６，０００Ｄａの二量体Ａａｃ ＭｕｔＳであることは、確認済みである。
[実施例２]
Ａａｃ ＭｕｔＳと各種二本鎖ＤＮＡとの相互作用の解析を行った。
相互作用の解析は、ＢＩＡＣＯＲＥ ３０００（ＧＥヘルスケア社製）およびＢＩＡＣＯＲＥ ＳＡセンサーチップ（ＧＥヘルスケア社製）を使用し、その使用説明書に従って行った。なお、ランニングバッファーの組成は、５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７.６）、５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化カリウム、０.１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０.００５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０とし、前記チップを洗浄するための再生緩衝液の組成は、１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、５０ｍｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウムとした。
まず、下記表１に示す４種類の一本鎖ＤＮＡを準備した。下記表１において、Ｃ−鎖ＤＮＡとＧ−鎖ＤＮＡとは、完全に相補的な配列である。Ｔ−鎖ＤＮＡは、前記Ｃ−鎖ＤＮＡの２１番目の塩基ＣがＴである以外は、前記Ｃ−鎖ＤＮＡと同じ配列である。Ｄｅｌ−鎖ＤＮＡは、前記Ｃ−鎖ＤＮＡの２１番目の塩基Ｃが欠失している以外は、前記Ｃ−鎖ＤＮＡと同じ配列である。前記Ｃ−鎖ＤＮＡは、前述のように前記Ｇ−鎖ＤＮＡと完全に相補（フルマッチ）であるのに対して、前記Ｔ−鎖ＤＮＡと前記Ｄｅｌ−鎖ＤＮＡは、前記Ｃ−鎖ＤＮＡにおける２１番目の塩基が置換または欠失していることから、前記Ｇ−鎖ＤＮＡと一塩基のみミスマッチとなる。本実施例において、以下、完全に相補的な前記Ｃ−鎖ＤＮＡと前記Ｇ−鎖ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを「フルマッチ」といい、前記Ｇ−鎖ＤＮＡと１塩基のみミスマッチする前記Ｔ−鎖ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを「ミスマッチ」といい、前記Ｇ−鎖ＤＮＡと１塩基欠失した前記Ｄｅｌ−鎖ＤＮＡとからなる二本鎖ＤＮＡを「欠失」という。
つぎに、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００に前記チップをセットしてから、前記チップの流路に前記ランニングバッファーを流速１０μＬ／ｍｉｎで流し、以下のように実験を開始した。まず、前記チップにおける３つのフローセルに、それぞれ、リガンドとして５μｍｏｌ／ＬのＣ−鎖ＤＮＡ、Ｔ−鎖ＤＮＡおよびＤｅｌ−鎖ＤＮＡを流速１０μＬ／ｍｉｎで流し、約１５０ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）になるまで結合させた。続いて、５μｍｏｌ／ＬのＧ−鎖ＤＮＡを、前記各フローセルに流速２０μＬ／ｍｉｎで２分間インジェクションした後、前記ランニングバッファーで１０分間洗浄した。これにより、前記Ｃ−鎖ＤＮＡ、Ｔ−鎖ＤＮＡおよびＤｅｌ−鎖ＤＮＡとＧ−鎖ＤＮＡとの二本鎖ＤＮＡが形成された。つぎに、所定濃度（０．１、０．２、０．５、１、２または４μｍｏｌ／Ｌ）のＡａｃ ＭｕｔＳ溶液を、前記各フローセルに流速２０μＬ／ｍｉｎで１０分間インジェクションした後、前記ランニングバッファーで２０分間フローセルを洗浄した。そして、インジェクションと洗浄とに並行して、前記Ａａｃ ＭｕｔＳのインジェクション開始から、シグナル強度の測定を行った。また、比較例１として、Ａａｃ ＭｕｔＳに代えて、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＴａｑ ＭｕｔＳを用いて、同様に処理し、シグナル強度の測定を行った。
これらの核酸結合アッセイの結果を図１に示す。同図の各グラフにおいて、縦軸は、ＢＩＡＣＯＲＥで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。０〜６００秒が、Ａａｃ ＭｕｔＳのインジェクション期間の結果であり、６００秒以降が、洗浄期間の結果である。同図において、左列のグラフは、Ａａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例２の結果であり、右列のグラフは、Ｔａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例１の結果である。また、左列および右列において、上のグラフはフルマッチ、中央のグラフはミスマッチ、下のグラフは欠失のデータを示す。また各グラフには、６種類の濃度のＭｕｔＳを使用した結果をあわせて示す。
同図の右列のグラフに示すように、Ｔａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例１では、ミスマッチの二本鎖ＤＮＡと欠失の二本鎖ＤＮＡについて、Ｔａｑ ＭｕｔＳとの結合が確認されたが、フルマッチの二本鎖ＤＮＡについても、Ｔａｑ ＭｕｔＳとの結合が確認された。これに対して、同図の左列のグラフに示すように、Ａａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例２では、ミスマッチの二本鎖ＤＮＡと欠失の二本鎖ＤＮＡについて、Ａａｃ ＭｕｔＳとの結合が確認され、且つ、フルマッチの二本鎖ＤＮＡについては、Ａａｃ ＭｕｔＳとの結合は確認されなかった。また、比較例１では、洗浄期間中（６００秒以後）、シグナルが急速に減少し、各種二本鎖ＤＮＡとＴａｑ ＭｕｔＳとの解離速度が速いことが確認された。これに対して、実施例２では、洗浄期間中（６００秒以後）、急激なシグナルの減少は確認されず、各種二本鎖とＡａｃ ＭｕｔＳとが、比較例１に比べて解離し難いことがわかった。以上の結果より、Ａａｃ ＭｕｔＳは、Ｔａｑ ＭｕｔＳと比較して、フルマッチの二本鎖ＤＮＡに結合し難く、ミスマッチまたは欠失の二本鎖ＤＮＡに特異的に結合でき、また、その結合も解離し難く安定に結合を保持できるといえる。
［実施例３］
ＡＤＰまたはＡＴＰの存在下、Ａａｃ ＭｕｔＳと各種二本鎖ＤＮＡとの相互作用の解析を行った。
実施例２の前記ランニングバッファーに、１ｍｍｏｌ／ＬのＡＤＰまたはＡＴＰを添加した以外は、前記実施例２と同様にしてシグナル強度の測定を行った。ＡＤＰ存在下での実施例を実施例３−１、ＡＴＰ存在下での実施例を実施例３−２とする。また、比較例２として、Ｔａｑ ＭｕｔＳを用いて、同様にシグナル強度の測定を行った。ＡＤＰ存在下での比較例を比較例２−１、ＡＴＰ存在下の比較例を比較例２−２とした。
これらの核酸結合アッセイの結果を図２および図３に示す。両図の各グラフにおいて、縦軸は、ＢＩＡＣＯＲＥで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。０〜６００秒が、Ａａｃ ＭｕｔＳのインジェクション期間の結果であり、６００秒以降が、洗浄期間の結果である。図２は、ＡＤＰ存在下の結果を示すグラフであり、左列のグラフは、Ａａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例３−１の結果であり、右列のグラフは、Ｔａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例２−１の結果である。また、図３は、ＡＴＰ存在下の実施例３−２および比較例２−２の結果であり、左列のグラフは、Ａａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例３−２の結果であり、右列のグラフは、Ｔａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例２−２の結果である。また、両図の左列および右列において、上のグラフはフルマッチ、中央のグラフはミスマッチ、下のグラフは欠失のデータを示す。また各グラフには、６種類の濃度のＭｕｔＳを使用した結果をあわせて示す。
図２の右列のグラフに示すように、ＡＤＰ存在下でＴａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例２−１は、前述した図１の右列のグラフに示す、ＡＤＰ非存在下でＴａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例１とほぼ同様の結果であった。これに対して、図２の左列のグラフに示すように、ＡＤＰ存在下でＡａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例３−１は、インジェクション期間中（０〜６００秒）、ミスマッチおよび欠失の二本鎖ＤＮＡのシグナル増加が確認された。これは、前述した図１左列のグラフに示す、ＡＤＰ非存在下でＡａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例２の結果と比較して著しい増加であった。また、洗浄期間中（６００秒以降）、前記実施例３−１におけるミスマッチおよび欠失の二本鎖ＤＮＡのシグナル減少は、前記実施例２におけるミスマッチおよび欠失の二本鎖ＤＮＡのシグナル減少と比較して、非常に遅くなった。これらの結果から、ＡＤＰ存在下であれば、ミスマッチおよび欠失の二本鎖ＤＮＡに対するＡａｃ ＭｕｔＳの結合が促進され、且つ、前記二本鎖ＤＮＡからのＡａｃ ＭｕｔＳの解離が抑制されることがわかった。なお、ＡＤＰ存在下においても、フルマッチの二本鎖ＤＮＡに対するＡａｃ ＭｕｔＳの結合は、実施例２と同様に十分に抑制された。
図３の右列のグラフに示すように、ＡＴＰ存在下でＴａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例２−２は、前述した図１の右列のグラフに示す、ＡＴＰ非存在下でＴａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例１とほぼ同様の結果であった。これに対して、図３の左列のグラフに示すように、ＡＴＰ存在下でＡａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例３−２は、インジェクション期間中（０〜６００秒）、ミスマッチおよび欠失の二本鎖ＤＮＡのシグナル増加が確認された。これは、前述した図１の左列のグラフに示す、ＡＴＰ非存在下でＡａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例２の結果と比較して著しい増加であった。これらの結果から、ＡＴＰ存在下であれば、ミスマッチおよび欠失の二本鎖ＤＮＡに対するＡａｃ ＭｕｔＳの結合が促進されることがわかった。なお、ＡＴＰ存在下においても、フルマッチの二本鎖ＤＮＡに対するＡａｃ ＭｕｔＳの結合は、実施例２と同様に十分に抑制された。
これらの核酸結合アッセイの結果より、各ＭｕｔＳと各二本鎖ＤＮＡとの解離定数を求めた。これらの結果を下記表２に示す。下記表２において、ＫＤ（ｆｕｌｌ）は、各ＭｕｔＳとフルマッチの二本鎖ＤＮＡとの間の解離定数、ＫＤ（ｍｉｓ）は、各ＭｕｔＳとミスマッチの二本鎖ＤＮＡとの間の解離定数、ＫＤ（ｆｕｌｌ）／ＫＤ（ｍｉｓ）はそれらの比を示す。
前記表２に示すように、Ｔａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例１および比較例２−１では、ＡＤＰ添加によって、ＫＤ（ｆｕｌｌ）／ＫＤ（ｍｉｓ）は、ほとんど変化しなかった。これに対して、Ａａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例２および実施例３−１では、ＡＤＰの添加によって、ＫＤ（ｆｕｌｌ）／ＫＤ（ｍｉｓ）は、約４５倍から約６０倍に増加した。したがって、ＡＤＰが、Ａａｃ ＭｕｔＳとミスマッチの二本鎖ＤＮＡとの解離を抑制することが、反応速度論的にも確認された。
［実施例４］
電気泳動によるゲルシフトアッセイを行い、Ａａｃ ＭｕｔＳと各種二本鎖ＤＮＡとの相互作用を解析した。
まず、実施例２と同じ一本鎖ＤＮＡを使用し、以下の方法により、Ｃ−鎖ＤＮＡとＧ−鎖ＤＮＡとのフルマッチ二本鎖ＤＮＡ、および、Ｔ−鎖ＤＮＡとＧ−鎖ＤＮＡとのミスマッチ二本鎖ＤＮＡを作製した。まず、前述の組合せに応じて、２μｍｏｌ／Ｌの各一本鎖ＤＮＡを混合し、前記ＤＮＡ溶液を９５℃で１０分間加熱して完全に変性させた。加熱後のＤＮＡ溶液を０．１℃／秒の速度で３０℃まで冷却し、前記各二本鎖ＤＮＡを生成した。冷却後のＤＮＡ溶液２.５μＬを、４×結合緩衝液２.５μＬと混合し、さらに、Ａａｃ ＭｕｔＳを添加した。そして、この混合液に、インキュベート直前に、ＡＤＰまたはＡＴＰと滅菌水とを添加して、全量１０μＬとし、６０℃で３０分間インキュベートを行った。Ａａｃ ＭｕｔＳの終濃度は、０、１、２または４μｍｏｌ／Ｌとし、ＡＤＰまたはＡＴＰの終濃度は、０または１ｍｍｏｌ／Ｌとした。前記４×結合緩衝液の組成は、２００ｍｍｏｌ／Ｌトリス塩酸緩衝液（６０℃でｐＨ７.６）、２００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸カリウム、８０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、０.４ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５ｍｍｏｌ／Ｌ ２−メルカプトエタノール、４０％グリセロールとした。この溶液を６０℃で３０分間インキュベートした後、６×ローディング色素を２μＬ添加し、６％ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に供した。前記電気泳動は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸マグネシウムを含む１×ＴＡＥ緩衝液中、４℃、４５ｍＡ、１００Ｖで１００分間行った。前記電気泳動後のゲルを染色液（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉ、Ｌｏｎｚａ社製）に３０分間浸漬して前記ゲルを染色した後、透過紫外光でＤＮＡを検出した。また、比較例３として、Ａａｃ ＭｕｔＳに代えてＴａｑ ＭｕｔＳを使用した以外は同様にしてゲルシフトアッセイを行った。なおＴａｑ ＭｕｔＳの終濃度は、１μｍｏｌ／Ｌとした。
これらの結果を図４に示す。同図において、（ａ）は、ＡＴＰ、ＡＤＰ非存在下、（ｂ）は、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＤＰ存在下、（ｃ）は、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ存在下でのゲルシフトアッセイの結果を示す電気泳動写真である。同図（ａ）および（ｃ）において、レーン０は電気泳動のマーカー（製品名100bp DNA Ladder、TAKARA社製）である。同図（ａ）、（ｂ）および（ｃ）において、レーン１〜５はフルマッチ二本鎖ＤＮＡ、レーン６〜１０はミスマッチ二本鎖ＤＮＡの結果を示す。レーン１〜４および６〜９は、それぞれ０、１、２および４μｍｏｌ／ＬのＡａｃ ＭｕｔＳを用いた実施例４の結果を示し、レーン５および１０は、１μｍｏｌ／ＬのＴａｑ ＭｕｔＳを用いた比較例３の結果を示す。矢印は、実施例４において、Ａａｃ ＭｕｔＳと二本鎖ＤＮＡとの結合によって生じたゲルシフトのバンドを示す。＊印は、比較例３において、Ｔａｑ ＭｕｔＳと二本鎖ＤＮＡとの結合によって生じたゲルシフトのバンドを示す。
同図（ａ）〜（ｃ）のＬａｎｅ５および１０に示すように、Ｔａｑ ＭｕｔＳを使用した比較例３では、ＡＴＰもしくはＡＤＰの非存在下または存在下のいずれにおいても、＊の位置にバンドが見られることから、Ｔａｑ ＭｕｔＳは、フルマッチ、ミスマッチの全てに同程度に結合した。そして、ＡＴＰもしくはＡＤＰの添加によってもその結合程度に大きな変化は見られなかった。これに対して、同図（ａ）のレーン１〜４および６〜９に示すように、Ａａｃ ＭｕｔＳを使用した実施例４では、ＡＴＰ、ＡＤＰ非存在下、矢印の位置にバンドが見られることから、ミスマッチ二本鎖ＤＮＡに結合するが、矢印にバンドが見られないことから、フルマッチ二本鎖ＤＮＡにはほとんど結合しなかった。さらに、同図（ｂ）および（ｃ）のレーン６〜９に示すように、ＡＤＰまたはＡＴＰの存在下で、矢印のバンドが濃くなっていることから、Ａａｃ ＭｕｔＳとミスマッチ二本鎖ＤＮＡとの結合が顕著に促進されることが分かった。
［実施例５］
Ａａｃ ＭｕｔＳ存在下で、Smart Amplification Process法によるＤＮＡの増幅反応を行い、増幅の有無により、ＵＣＰ１遺伝子の一塩基変異（−３８２６位）を解析した。
前記反応液組成におけるＭｕｔＳ溶液は、所定濃度（０、１０、１１、１２μｇ／μＬ）となるように、下記ＭｕｔＳ調製用緩衝液を用いて調製した。なお、前記反応液２５μＬ中におけるＭｕｔＳの含有量は、０、１０、１１、１２μｇとなる。
前記反応液組成におけるプライマー混合液は、以下に示す１００μｍｏｌ／Ｌの各プライマーを、体積比ＴＰ：ＦＰ：ＢＰ：ＯＰＦ：ＯＰＲが８：８：４：１：１となるように混合して調製した。なお、ＴＰは、ＴＰ ＷＴおよびＴＰ ＭＴのいずれかを使用した。なお、ＴＰ ＷＴおよびＴＰ ＭＴが、ＵＣＰ１遺伝子の検出部位を含む領域にハイブリダイズ可能な標的プライマーであり、ＴＰ ＷＴは、下線部Ａが野生型であり、ＴＰ ＭＴは、下線部Ｇが変異型である。以下、ＴＰ ＷＴを含む下記プライマーセットを野生型プライマーセット、ＴＰ ＭＴを含む下記プライマーセットを変異型プライマーセットという。
ＵＣＰ１ ＴＰ ＷＴ（配列番号７）
5'-CAAGTGCATTTATGTAACAAATTCTCCTTTCCTTT-3'
ＵＣＰ１ ＴＰ ＭＴ（配列番号８）
5'-CGAGTGCATTTATGTAACAAATTCTCCTTTCCTTT-3'
ＵＣＰ１ ＦＰ（配列番号９）
5'-TTTATATATATATAAAGCAGCGATTTCTGATTGACCA-3'
ＵＣＰ１ ＢＰ（配列番号１０）
5'-TAATGTGTTCTACATTTT-3'
ＵＣＰ１ ＯＰＦ（配列番号１１）
5'-GATTTTTATTTAATAGGAAGACATT-3'
ＵＣＰ１ ＯＰＲ（配列番号１２）
5'-GACGTAGCAAAGGAGTGGCAGCAAG-3'
鋳型ＤＮＡとして、ＵＣＰ１遺伝子の配列が野生型（−３８２６位がＡ）または変異型（−３８２６位がＧ）であるヒトゲノムＤＮＡを使用した。前記ゲノムＤＮＡを１３.３ｎｇ／μＬとなるようにＴＥ緩衝液で希釈し、このゲノムＤＮＡ溶液を９８℃で３分間熱処理した後、氷上で急速冷却した。氷上で前記組成の増幅反応液を調製し、この反応液を６０℃で１２０分間インキュベートした。増幅産物の生成はリアルタイム蛍光検出装置（商品名Ｍｘ３０００Ｐ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてモニタリングした。実施例５は、ＭｕｔＳとして、Ａａｃ ＭｕｔＳを使用した。
一方、比較例４としては、ＭｕｔＳとしてＴａｑ ＭｕｔＳを使用し、前記反応液組成において、ＡＤＰ溶液無添加とし、滅菌水を８．２５μＬとした以外は、前記実施例５と同様にモニタリングを行った。なお、ＭｕｔＳ溶液におけるＭｕｔＳは、所定濃度（４、５、６または７μｇ／μＬ）とした。このため、前記反応液２５μＬ中のＴａｑ ＭｕｔＳの含有量は、４、５、６または７μｇとなる。
これらの結果を図５および図６に示す。各図は、増幅をリアルタイムでモニタリングした、反応時間（分）と蛍光強度との関係を示すグラフであり、各グラフには、反応液２５μＬ中のＭｕｔＳ含有量を付している。図５は、Ａａｃ ＭｕｔＳを使用した実施例５の結果であり、図６は、Ｔａｑ ＭｕｔＳを使用した比較例４の結果である。両図において、縦軸は、蛍光強度（ＦＵ：Fluorescence Unit）を示し、横軸は、反応時間（分）を示す。また、両図の各グラフには、野生型ゲノムＤＮＡと野生型プライマーセット（●）、野生型ゲノムと変異型プライマーセット（■）、変異型ゲノムＤＮＡと変異型プライマーセット（□）、変異型ゲノムＤＮＡと野生型プライマーセット（○）を組み合わせて使用した結果を、併せて示す。なお、野生型ゲノムＤＮＡと野生型プライマーセット、および変異型ゲノムＤＮＡと変異型プライマーセットは、フルマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組合せであり、野生型ゲノムＤＮＡと変異型プライマーセット、および変異型ゲノムＤＮＡと野生型プライマーセットとが、ミスマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせである。
図６に示すように、Ｔａｑ ＭｕｔＳを使用した比較例４によると、反応液２５μＬ中のＴａｑ ＭｕｔＳ量が６〜７μｇの条件においてのみ、ミスマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせ（○、■）については増幅が抑制され、且つ、フルマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせ（●、□）については増幅が阻害されなかった。しかし、この条件の範囲外である４μｇでは、ミスマッチ二本鎖を形成する組み合わせ（○、■）において、増幅が確認され、５μｇでは、野生型プライマーセットと変異型ゲノムＤＮＡとのミスマッチ二本鎖を形成する組み合わせ（○）において、増幅が確認された。この結果から、Ｔａｑ ＭｕｔＳは、有効濃度が非常に狭いことがわかった。これに対して、図５に示すように、Ａａｃ ＭｕｔＳを使用した実施例５によると、反応液２５μＬ中のＡａｃ ＭｕｔＳが１０〜１２μｇの条件であっても、ミスマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせ（○、■）については増幅が抑制され、且つ、フルマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせ（●、□）については増幅が阻害されなかった。この結果から、Ａａｃ ＭｕｔＳは、Ｔａｑ ＭｕｔＳと比較して、有効濃度が広いことが確認された。
［実施例６］
Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳの共存下で、Smart Amplification Process法によるＤＮＡの増幅反応を行い、増幅の有無により、ＵＣＰ１遺伝子の一塩基変異（−３８２６位）を解析した。
Ａａｃ ＭｕｔＳのみを含むＭｕｔＳ溶液に代えて、Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとを含むＭｕｔＳ溶液を使用した以外は、前記実施例５と同様にして、増幅をモニタリングした。以下に、反応液２５μＬ中に含まれるＡａｃ ＭｕｔＳおよびＴａｑ Ｍｕｔタンパク質の含有量を示す。下記実施例６−１は、反応液２５μＬ中のＡａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとの合計を７μｇとし、下記実施例６−２は、反応液２５μＬ中、Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとを等量とした。
これらの結果を図７および図８に示す。各図は、増幅をリアルタイムでモニタリングした、反応時間（分）と蛍光強度との関係を示すグラフであり、各グラフには、反応液２５μＬ中の各ＭｕｔＳ含有量を付している。図７は、Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとを合計７μｇ含有する前記実施例６−１の結果であり、図８は、Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとを等量含有する前記実施例６−２の結果である。なお、両図のグラフの説明は、前記図５および図６と同様である。
図７に示すように、実施例６−１によると、前記反応液２５μＬ中の合計ＭｕｔＳ含有量を７μｇとして、Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとの比率を２：５〜５：２に変動させても、ミスマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせについては増幅が抑制され、且つ、フルマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせについては増幅が阻害されなかった。この結果から、Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとを併用可能であることがわかった。また、Ａａｃ ＭｕｔＳをＴａｑ ＭｕｔＳと併用することによって、Ａａｃ ＭｕｔＳの使用量を低減し、且つ、両ＭｕｔＳを広い有効範囲で使用できることがわかった。
また、図８に示すように、実施例６−２によると、前記反応液２５μＬ中のＴａｑ ＭｕｔＳとＡａｃ ＭｕｔＳの含有量を等量とした場合、合計含有量が８μｇ〜１０μｇであっても、ミスマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせについては増幅が抑制され、且つ、フルマッチ二本鎖ＤＮＡを形成する組み合わせについては増幅が阻害されなかった。この結果から、Ａａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとを併用可能であることがわかった。また、Ａａｃ ＭｕｔＳをＴａｑ ＭｕｔＳと併用することによって、Ａａｃ ＭｕｔＳの使用量を低減し、且つ、両ＭｕｔＳを広い有効範囲で使用できることがわかった。
以上の結果から、反応液におけるＡａｃ ＭｕｔＳとＴａｑ ＭｕｔＳとの比率ならびに総量を変化させることによって、広い濃度範囲で、ＭｕｔＳの機能を発揮できることがわかった。
以上のように、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳタンパク質は、例えば、いわゆるミスマッチ塩基対を有する二本鎖核酸を特異的に認識して結合できる。このため、標的部位を含む標的配列の増幅において、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを使用すれば、前記Ａａｃ ＭｕｔＳがミスマッチ塩基対へ特異的に結合するため、プライマーからの伸長を効果的に抑制できる。したがって、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳを使用する本発明の判定方法によれば、増幅の有無から、優れた精度で変異の有無を判定できる。このため、本発明のＡａｃ ＭｕｔＳおよび判定方法は、例えば、遺伝子解析の分野において、極めて有用なツールと言える。

Claims (24)

  1. 下記（Ａ）または（Ｂ）のアミノ酸配列からなる新規ＭｕｔＳタンパク質。
    （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列
    （Ｂ）前記（Ａ）のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列であり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質のアミノ酸配列
  2. 前記タンパク質が、Alicyclobacillus属由来である、請求の範囲１記載の新規ＭｕｔＳタンパク質。
  3. 前記タンパク質が、Alicyclobacillus acidocaldarius由来である、請求の範囲２記載の新規ＭｕｔＳタンパク質。
  4. 下記（ａ）〜（ｆ）のいずれかの核酸からなる、新規ＭｕｔＳタンパク質をコードする核酸。
    （ａ）配列番号１に示す塩基配列からなる核酸
    （ｂ）前記（ａ）の核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
    （ｃ）前記（ａ）の塩基配列との相同性が８０％以上の塩基配列からなる核酸であり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
    （ｄ）前記（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が欠失、置換、挿入または付加された塩基配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
    （ｅ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸
    （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入または付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、二本鎖核酸におけるミスマッチ塩基対への結合活性を有するタンパク質をコードする核酸
  5. 請求の範囲４記載の核酸を含む組換えベクター。
  6. 請求の範囲５記載の組換えベクターを含む形質転換体。
  7. 請求の範囲１記載の新規ＭｕｔＳタンパク質の製造方法であって、
    請求の範囲６記載の形質転換体を培養することを特徴とする製造方法。
  8. 被検核酸の標的部位における変異の有無を判定する方法であって、
    下記（Ｉ）工程または（Ｉ’）工程と、下記（ＩＩ）工程とを含むことを特徴とする判定方法。
    （Ｉ）請求の範囲１記載の新規ＭｕｔＳタンパク質の存在下、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅する工程
    （I’）請求の範囲１記載の新規ＭｕｔＳタンパク質と、前記被検核酸における前記標的部位を含む領域にハイブリダイズ可能なプローブとの存在下、前記被検核酸を増幅するためのプライマーを用いて、前記被検核酸における前記標的部位を含む標的配列を増幅する工程
    （ＩＩ）増幅の有無を確認する工程
  9. 前記（Ｉ）工程または（Ｉ’）工程において、
    前記新規ＭｕｔＳタンパク質と、ＡＤＰ、ＡＴＰおよびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも一つの添加剤との共存下、前記標的配列の増幅を行う、請求の範囲８記載の判定方法。
  10. 前記増幅反応の反応液における前記添加剤の濃度が、０．０１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの範囲である、請求の範囲９記載の判定方法。
  11. 前記増幅反応の反応液２５μＬあたりの前記新規ＭｕｔＳタンパク質量が、０．０１〜１０００μｇの範囲である、請求の範囲８記載の判定方法。
  12. 前記新規ＭｕｔＳタンパク質とＴｈｅｒｍｕｓ属由来のＭｕｔＳタンパク質との共存下、前記標的配列の増幅を行う、請求の範囲８記載の判定方法。
  13. 前記Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＭｕｔＳタンパク質が、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＭｕｔＳタンパク質である、請求の範囲１２記載の判定方法。
  14. 前記新規ＭｕｔＳタンパク質（Ａ）に対する前記Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＭｕｔＳタンパク質（Ｔ）の添加割合（重量比Ａ：Ｔ）が、１：０．０５〜１：５０の範囲である、請求の範囲１２記載の判定方法。
  15. 前記増幅反応の反応液２５μＬあたりの前記新規ＭｕｔＳタンパク質量が、０．０１〜１０００μｇの範囲であり、前記Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＭｕｔＳタンパク質量が、０．０１〜１０００μｇの範囲であり、前記新規ＭｕｔＳタンパク質と前記Ｔｈｅｒｍｕｓ属由来のＭｕｔＳタンパク質とをあわせた量が、０．０２〜２０００μｇの範囲である、請求の範囲１２記載の判定方法。
  16. 前記（Ｉ）工程において、前記標的部位の塩基が変異型である前記領域にハイブリダイズ可能なプライマーを使用し、または、
    前記（Ｉ’）工程において、前記標的部位の塩基が変異型である前記領域にハイブリダイズ可能なプローブを使用し、
    前記（ＩＩ）工程において、増幅が確認された場合は、前記標的部位の塩基が変異型であると判定し、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位の塩基が野生型であると判定する、請求の範囲８記載の判定方法。
  17. 前記（Ｉ）工程において、前記標的部位の塩基が野生型である前記領域にハイブリダイズ可能なプライマーを使用し、または、
    前記（Ｉ’）工程において、前記標的部位の塩基が野生型である前記領域にハイブリダイズ可能なプローブを使用し、
    前記（ＩＩ）工程において、増幅が確認された場合は、前記標的部位の塩基が野生型であると判定し、増幅が確認されなかった場合は、前記標的部位の塩基が変異型であると判定する、請求の範囲８記載の判定方法。
  18. 前記標的配列の増幅にポリメラーゼを使用し、前記ポリメラーゼが、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ属由来のポリメラーゼである、請求の範囲８記載の判定方法。
  19. 前記ポリメラーゼが、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ由来のポリメラーゼである、請求の範囲１８記載の判定方法。
  20. 前記ポリメラーゼが、鎖置換能を有するポリメラーゼである、請求の範囲１８記載の判定方法。
  21. 前記増幅反応を、温度を変動させて行う、請求の範囲８記載の判定方法。
  22. 前記増幅反応が、ポリメラーゼチェーンリアクションである、請求の範囲２１記載の判定方法。
  23. 前記増幅反応を、一定温度で行う、請求の範囲８記載の判定方法。
  24. 前記増幅反応が、ＳＤＡ法、改良ＳＤＡ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法、ＩＣＡＮ法、自立複製法、ＴＭＡ法、Ｑベータレプリカーゼ法、Ｓｍａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法およびＲＣＡ法からなる群から選択された少なくとも一つである、請求の範囲２３記載の判定方法。
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