NO331732B1

NO331732B1 - Fremgangsmate for syntese av nukleinsyre

Info

Publication number: NO331732B1
Application number: NO20022171A
Authority: NO
Inventors: Tsugunori Notomi; Tetsu Hase
Original assignee: Eiken Chemical
Priority date: 1999-11-08
Filing date: 2002-05-07
Publication date: 2012-03-12
Also published as: IL149446A0; CA2390309A1; BR0015382A; RU2002115268A; CN100393875C; NO20022171L; CA2390309C; CN1420928A; ZA200203293B; NO20022171D0; KR100612551B1; CN1876843B; CN1876843A; RU2252964C2; KR20020064896A; BR0015382B1; WO2001034790A1

Abstract

Foreliggende oppfinnelse gjelder et oligonukleotid med en ny struktur og en fremgangsmåte for syntese av en nukleinsyre ved anvendelse av oligonukleotidet som primer. I sin 5'-ende er oligonukleotidet utstyrt med en basesekvens som i det vesentlige er identisk med området som skal syntetiseres ved anvendelse av primeren som utgangspunkt for syntesen. Således kan en nukleinsyre syntetiseres i en isoterm reaksjon ved anvendelse av en enkel reagensblanding. Videre tilveiebringes en fremgangsmåte for syntese av en nukleinsyre med høy spesifisitet, basert på den ovenfor beskrevne fremgangsmåte for syntese av en nukleinsyre.

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for syntese av nukleinsyre som består av en spesifikk nukleotidsekvens, som er anvendbar som en fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyre.

Teknikkens stand

En analysefremgangsmåte basert på komplementariteten til nukleotidsekvensen i en nukleinsyre kan analysere genetiske trekk direkte. Følgelig er denne analysen et meget kraftig verk-tøy for identifisering av genetiske sykdommer, kreftdannelse, mikroorganismer osv. Videre er et gen i seg selv påvisnings-gjenstanden, og således kan tidkrevende og arbeidskrevende fremgangsmåter, f.eks. i kultur, unngås i noen tilfeller.

Ikke desto mindre er påvisning av et målgen som foreligger i en svært lav mengde i en prøve, generelt ikke lett, slik at amplifisering av målgenet selv eller et påvisningssignal er nødvendig. Som en fremgangsmåte for amplifisering av et målgen er PCR(polymerasekjedereaksjon)-fremgangsmåten kjent (Science, 230, 1350-1354, 1985) . I dag er PCR-fremgangsmåten den mest populære fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyrer in vitro. Denne fremgangsmåten ble fast etablert som en frem-ragende påvisningsfremgangsmåte grunnet høy sensitivitet, basert på virkningen av eksponentiell amplifisering. Siden amplifiseringsproduktet kan gjenvinnes som DNA, anvendes denne fremgangsmåten videre som et viktig verktøy for understøttelse av genetiske modifiseringsteknikker, f.eks. genkloning og struktur-bestemmelse. I PCR-fremgangsmåten opptrer imidlertid følgende merkbare problemer: et spesielt instrument for temperaturkontroll er nødvendig for utførelsen, amplifiseringsreaksjonens eksponentielle forløp gir problemer når det gjelder kvantifiser-ing, og prøver og reaksjonsløsninger vil lett kontamineres fra det ytre miljø, slik at nukleinsyrer som foreligger i prøven grunnet en feil fungerer som templat.

Etter hvert som genomisk informasjon har samlet seg opp, har analyse av enkeltnukleotidpolymorfi (SNP) tiltrukket seg oppmerksomhet. Påvisning a SNP ved hjelp av PCR kan utføres ved å utforme en primer, slik at nukleotidsekvensen omfatter SNP. Det vil si at hvorvidt en nukleotidsekvens som er komplementær til primeren foreligger eller ikke, kan utledes ved å fastslå hvorvidt et reaksjonsprodukt foreligger eller ikke. Imidlertid er det slik at dersom først en feilaktig komplementær kjede er syntetisert i PCR-reaksjonen ved tilfeldigheter, fungerer dette produkt som templat i påfølgende reaksjoner, noe som gir et feilaktig resultat. I praksis sies det at nøye kontroll av PCR-reaksjoner er vanskelig dersom forskjellen er bare én base som foreligger i enden av primeren. Følgelig er det nødvendig å forbedre spesifisiteten for å benytte PCR til påvisning av SNP.

En fremgangsmåte for syntese av nukleinsyrer ved hjelp av en ligase benyttes også i praksis. LCR-fremgangsmåten (ligasekjedereaksjonen, Laffler, T.G., Garrino, J.J., Marshall, R.L., Ann. Biol. Clin. (Paris), 51:9, 821-6, 1993) bygger på en reaksjon hvori to naboprober hybridiseres til en målsekvens og ligeres til hverandre med en ligase. De to probene kan ikke ligeres sammen i fravær av målnukleotidsekvensen, og således viser nærvær av ligeringsproduktet at målnukleotidsekvensen foreligger. Siden LCR-fremgangsmåten også krever temperaturkontroll for separasjon av en komplementær kjede fra et templat, oppstår samme problem som i PCR-fremgangsmåten. For LCR er det også blitt rapportert en fremgangsmåte med forbedret spesifisitet ved å innføre et trinn hvor det foreligger et gap mellom naboprobene, og hvor gapet gjenfylles med en DNA-polymerase. Imidlertid er det som kan forventes i denne modifiserte fremgangsmåten kun spesifisitet, og det foreligger fortsatt et problem i og med at temperaturkontroll er nødvendig. Videre fører anvendelse av ytterligere et enzym til økte kostnader.

En fremgangsmåte som betegnes SDA-fremgangsmåten (tråd-forskyvningsamplifisering) [Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89, 392-396, 1992], er også kjent som en fremgangsmåte for amplifisering av DNA med en sekvens som er komplementær til en målsekvens som templat. I SDA-fremgangsmåten anvendes en spesiell DNA-polymerase for syntese av en komplementær kjede med ugangspunkt i en primer som er komplementær til 3'-siden av en gitt nukleotidsekvens, samtidig som en eventuelt dobbelttrådet kjede forskyves fra sekvensens 5'-side. I den foreliggende beskrivelse viser det enkle uttrykket "5'-side" eller "3'-side" til de to sidene av en kjede som fungerer som templat. Siden en dobbelttrådet kjede på 5'-siden forskyves av en nysyntetisert komplementær tråd, betegnes denne teknikken SDA-fremgangsmåten. Temperaturendrings-trinnet som er nødvendig i PCR-fremgangsmåten, kan unngås i SDA-fremgangsmåten ved på forhånd å innføre en gjenkjenningssekvens for et restriksjonsenzym i en hybridisert sekvens som primer. Det vil si at et enkeltkjedebrudd som dannes av et restriksjonsenzym, gir en 3'-OH-gruppe som fungerer som utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede, og den tidligere syntetiserte komplementære kjede frigjøres som en enkelttrådet kjede ved trådforskyvningssyntese og anvendes så igjen som templat for på-følgende syntese av komplementær kjede. På denne måten er den kompliserte kontroll av temperaturen som er essensiell i PCR-fremgangsmåten ikke nødvendig i SDA-fremgangsmåten.

I SDA-fremgangsmåten er det imidlertid nødvendig å anvende et restriksjonsenzym som gir et kjedebrudd i tillegg til DNA-polymerasen av trådforskyvningstype. Dette kravet for ytterligere et enzym er en hovedårsak til høyere kostnader. Siden restriksjonsenzymet ikke skal anvendes for kutting av begge kjedene i dobbelttråden, men for innføring av et kjedebrudd (det vil si kutting av bare én av kjedene), må et dNTP-derivat, f.eks. a-tio-dNTP, anvendes som substrat for syntesen for å gjøre den andre kjeden resistent for kutting med enzymet. Følge-lig har amplifiseringsproduktet ved SDA en struktur som er forskjellig fra strukturen til en naturlig nukleinsyre, og det er begrensninger når det gjelder kutting med restriksjonsenzymer eller anvendelse av amplifiseringsproduktet til genkloning. Også i denne sammenheng er dette en hovedkilde til høyere kostnader. Dersom SDA-fremgangsmåten anvendes på en ukjent sekvens, er det i tillegg mulig at den samme nukleotidsekvens som gjenkjenningssekvensen til restriksjonsenzymet som anvendes for innføring av et kjedebrudd, kan foreligge i et område som skal syntetiseres. I dette tilfellet er det mulig at syntese av en fullstendig komplementær kjede forhindres.

NASBA (nukleinsyresekvensbasert amplifisering, også betegnet TMA/transkripsjonsformidlet amplifiseringsfremgangsmåte) er kjent som en fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyrer hvori den kompliserte temperaturkontroll ikke er nødvendig. NASBA er et reaksjonssystem hvori DNA syntetiseres av DNA-polymerase i nærvær av mål-RNA som templat med en probe med en T7-promoter innført, og produktet overføres til en dobbelttrådet kjede med en andre probe, etterfulgt av transkripsjon ved T7-RNA-polymerase med den dannede dobbelttrådede kjede som templat for amplifisering av en stor mengde RNA (Nature, 350, 91-92, 1991). NASBA krever noen varmedenatureringstrinn før syntesen av dobbelttrådet DNA er fullført, men den påfølgende transkripsjonsreaksjon med T7-RNA-polymerase forløper under isoterme betingelser. En kombinasjon av flere enzymer, f.eks. reverstranskriptase, RNase H, DNA-polymerase og T7-RNA-polymerase, er imidlertid nødvendig, og dette er ugunstig når det gjelder kostnadene, på samme måte som for SDA. Siden det er komplisert å sette opp betingelser for en rekke enzymreaksjoner, er denne fremgangsmåten ikke særlig utbredt som en generell analytisk fremgangsmåte. I de kjente reaksjoner for amplifisering av nukleinsyrer foreligger det fortsatt problemer, f.eks. komplisert temperaturkontroll, og behov for flere enzymer, som beskrevet ovenfor.

For disse kjente reaksjonene for syntese av nukleinsyrer foreligger det få rapporter vedrørende forsøk på ytterligere forbedring av synteseeffektiviteten for nukleinsyren uten at det går på bekostning av spesifisitet eller kostnader. I en fremgangsmåte betegnet RCA (rullende sirkel-amplifisering) ble det f.eks. vist at enkelttrådet DNA med en serie nukleotidsekvenser komplementære til en "hengelås"-probe kan syntetiseres kontinuerlig i nærvær av en målnukleotidsekvens (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225-232, juli 1998). I RCA anvendes en "hengelås"-probe med en spesiell struktur hvori både 5'- og

3'-enden av ett enkelt oligonukleotid utgjør naboprober i LCR. Deretter utløses en kontinuerlig reaksjon hvor komplementær kjede syntetiseres med "hengelås"-proben, som ble ligert og syklisert i nærvær av en målnukleotidsekvens, som templat ved en kombinasjon av en polymerase som katalyserer en reaksjon av trådforskyvningstype, hvor den komplementære kjede syntetiseres. Enkelttrådet nukleinsyre med en struktur bestående av en serie av områder som alle består av samme nukleotidsekvens, dannes således. En primer hybridiseres videre til denne enkelttrådede nukleinsyre for syntese av den komplementære tråd, og en høy grad av amplifisering oppnås således. Fortsatt foreligger

imidlertid problemet med at det er nødvendig med flere enzymer. Videre avhenger utløsning av syntesen av den komplementære tråd av reaksjonen hvor to naboområder ligeres sammen, og spesifisiteten er således i bunn og grunn den samme som for LCR.

For tilveiebringelse av 3'-0H finnes en kjent fremgangsmåte hvori en nukleotidsekvens utstyres i 3'-enden med en sekvens som er komplementær til denne, slik at en hårnålsløkke dannes i enden (Gene, 71, 29-40, 1988). Syntese av den komplementære tråd med målsekvensen selv som templat starter ved hår-nålsløkken, slik at det dannes enkelttrådet nukleinsyre som består av den komplementære nukleotidsekvens. For eksempel realiseres en struktur hvori hybridisering opptrer innen samme kjede i enden hvor en komplementær nukleotidsekvens er blitt tilkoblet, i PCT/FR95/00891. I denne fremgangsmåten er imidlertid trinnet hvori enden hindrer baseparing med den komplementære kjede, og baseparingen igjen opprettes i samme kjede, avgjør-ende. Det antas at dette trinnet hovedsakelig forløper som en fin likevektstilstand i enden mellom gjensidig komplementære nukleotidsekvenser som omfatter baseparing. Det vil si at det utnyttes en likevektstilstand som opprettholdes mellom baseparing med en komplementærkjede og baseparing innen samme kjede, og hvor bare kjede som er hybridisert til nukleotidsekvensen i samme kjede fungerer som utgangspunkt for syntese av en komplementær tråd. Følgelig anses det at strenge reaksjonsbetingelser bør benyttes for å oppnå høy reaksjonseffektivitet. I denne kjente teknikken danner videre primeren selv en løkkestruktur. Følgelig vil en amplifiseringsreaksjon automatisk initieres når først en primer-dimer er dannet, uavhengig av hvorvidt en målnukleotidsekvens foreligger eller ikke, og et uspesifikt synteseprodukt dannes således. Dette kan være et alvorlig problem. Videre fører dannelse av primer-dimeren og påfølgende forbruk av primeren ved uspesifikke syntesereaksjoner til en reduksjon av amplifiseringseffektiviteten for den ønskede reaksj on.

Videre foreligger det en rapport hvor et område som ikke fungerer som templat for DNA-polymerase, anvendes for dannelse av en 3'-endestruktur som hybridiserer til samme kjede (EP 713922). Denne rapporten hadde også det samme problem som i PCT/FR95/00891 ovenfor når det gjelder utnyttelse av en dynamisk likevekt i enden eller muligheten for uspesifikke syntesereaksjoner grunnet dannelse av en primer-dimer. Videre må et spesielt område som ikke fungerer som templat for DNA-polymerase, fremstilles som primer.

Videre beskriver EP 549107 Al og WO 97/04131 Al single primer amplifiseringsmetode med primersekvenser som inngår i hårnålsstruktur. De hårnålsdannende primerene benyttes i amplifiseringsmetoder som er avhengig av temperaturkontroll for trådseparasjon etter amplifisering.

Videre anvendes ofte i forskjellige signalamplifiser-ingsreaksjoner, hvori NASBA-prinsippet beskrevet ovenfor benyttes, et oligonukleotid med en hårnålsstruktur i enden for tilveiebringelse av et dobbelttrådet promoterområde (JP-A5-211873). Disse teknikkene tillater imidlertid ikke påfølgende tilførsel av 3'-OH for syntese av en komplementær kjede. Videre utnyttes en hårnålsløkkestruktur med en 3'-ende hybridisert til samme kjede for det formål å erholde et DNA-templat som kan trans-kriberes av RNA-polymerase i JP-A 10-510161 (WO 96/17079). I denne fremgangsmåten amplifiseres templatet ved transkripsjon til RNA og reverstranskripsjon fra RNA til DNA. I denne fremgangsmåten kan imidlertid reaksjonssystemet ikke oppbygges uten en kombinasjon av en rekke forskjellige enzymer.

Beskrivelse av oppfinnelsen

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for syntese av nukleinsyrer basert på et nytt prinsipp. Et mer spesifikt formål er å tilveiebringe en fremgangsmåte som kan realisere effektiv og kostnadsgunstig syntese av nukleinsyrer basert på sekvensen. Det vil si at et formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte som kan oppnå syntese og amplifisering av nukleinsyrer med ett enkelt enzym, selv under isoterme reaksjonsbetingelser. Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for syntese av nukleinsyrer som kan realisere den høye spesifisitet som er vanskelig å oppnå i kjente reaksjonsprinsipper for nukleinsyresyntese, så vel som en fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyrer ved anvendelse av denne syntesefremgangsmåten.

De foreliggende oppfinnere fokuserte sin oppmerksomhet på det faktum at anvendelse av en polymerase som katalyserer syntese av trådforskyvningstype av den komplementære tråd, er anvendbar for nukleinsyresyntese som ikke avhenger av komplisert temperaturkontroll. Slike DNA-polymeraser utnyttes i SDA og RCA. Selv om et slikt enzym anvendes, er det imidlertid alltid nød-vendig med en annen enzymreaksjon for tilveiebringelse av 3'-0H som utgangspunkt for syntese på den kjente måten basert på primere, f.eks. SDA.

Under disse omstendigheter undersøkte de foreliggende oppfinnere tilførsel av 3'-0H fra et fullstendig forskjellig synspunkt, sammenlignet med den kjente tilnærming. Resultatet var at de foreliggende oppfinnere fant at ved å benytte et oligonukleotid med en spesiell struktur, kan 3'-0H tilveiebringes uten ytterligere en enzymreaksjon, hvorved foreliggende oppfinnelse ble fullført. Det vil si at foreliggende oppfinnelse gjelder en fremgangsmåte for syntese av nukleinsyrer, en fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyrer ved anvendelse av fremgangsmåten for syntese av nukleinsyrer, og et nytt oligonukleotid som muliggjør disse fremgangsmåtene, som følger: 1. En fremgangsmåte for syntese av nukleinsyrer med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, som omfatter: a) tilførsel av nukleinsyre som i 3'-enden er utstyrt med et område Fl, som kan hybridisere til et område Flc i samme kjede, og som etter hybridisering av området Fl til området Flc kan danne en løkke som inneholder et område F2c som kan delta i baseparing, b) syntese av en komplementær kjede hvori 3'-enden av Fl hybridisert til Flc fungerer som utgangspunkt for syntesen, c) hybridisering til et område F2c av et oligonukleotid som i sin 3'-ende er utstyrt med F2, som består av en sekvens som er komplementær til området F2c, etterfulgt av syntese med dette oligonukleotid som utgangspunkt for syntesen av en komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av en komplementær kjede med samtidig trådforskyvningsreaksjon, slik at den komplementære kjede syntetisert i trinn b) forskyves, og d) hybridisering til den komplementære kjede forskjøvet i trinn c), slik at den er klar for baseparing av et polynukleotid som i sin 3'-ende er utstyrt med en sekvens som er komplementær til et tilfeldig område i kjeden syntetisert i trinn c), etterfulgt av syntese med denne 3'-ende som utgangspunkt for syntesen av en komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av en komplementær kjede med samtidig tråd-forskyvningsreaks jon, slik at den komplementære kjede syntetisert i trinn c) forskyves. 2. Fremgangsmåten ifølge punkt 1, hvori i trinn d) utgangspunktet for syntesen er et område RI, som foreligger i 3'-enden av samme kjede, og som kan hybridisere til et område Rlc, og hvor en løkke som inneholder området R2c i stand til baseparing dannes ved hybridisering av RI til Rlc. 3. Fremgangsmåten ifølge punkt 1, hvori nukleinsyren i trinn a) er en andre nukleinsyre som tilveiebringes ved følgende trinn: i) hybridisering til et område F2c i nukleinsyren som fungerer som templat av et område F2 i et oligonukleotid bestående av minst to områder, F2 og Flc nedenfor, og Flc er bundet til 5'-siden av F2, F2: et område med en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område F2c i templatnukleinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, og Flc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Flc lokalisert i 5'-side av område F2c i templatnukleinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, ii) syntese av en første nukleinsyre med en nukleotidsekvens som er komplementær til templatet, hvori F2 i oligonukleotidet fungerer som utgangspunkt for syntesen, iii) klargjøring av et tilfeldig område i den første nukleinsyre syntetisert i trinn ii) for baseparing, og iv) hybridisering av et oligonukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til området som er klargjort for baseparing i den første nukleinsyre i trinn iii), etterfulgt av syntese av en andre nukleinsyre med oligonukleotidet som utgangspunkt for syntesen, og klargjøring av Fl i dennes 3'-ende for baseparing. 4. Fremgangsmåten ifølge punkt 3, hvori området som tillater baseparing i trinn iii) er R2c, og oligonukleotidet i trinn iv) er et oligonukleotid bestående av minst to områder, R2 og Rlc nedenfor, og Rlc er bundet til 5'-siden av R2,

R2: et område med en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område R2c i den første nuklinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, og

Rlc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Rlc lokalisert i 5'-side av område R2c i den første nukleinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens. 5. Fremgangsmåten ifølge punkt 3 eller 4, hvori klar-gjøringen for baseparing i trinnene iii) og iv) utføres ved syntese med trådforskyvning av komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning, hvori en ytre primer som hybridiserer til 3'-siden av F2c i templatet og en ytre primer som hybridiserer til 3'-siden av området som anvendes som utgangspunkt for syntesen i trinn iv) for den første nukleinsyre, fungerer som utgangspunkt for syntesen. 6. Fremgangsmåten ifølge punkt 5, hvori smeltetemperaturen for hvert oligonukleotid og det komplementære området i templatet som anvendes i reaksjonen står i følgende forhold til hverandre under samme stringens: (ytre primer/område på 3'-siden i templatet) < (F2c/F2 og R2c/R2) < (Flc/Fl og Rlc/Rl). 7. Fremgangsmåten ifølge ethvert av punktene 3-6, hvori nukleinsyren som fungerer som templat er RNA, og syntesen av komplementær kjede i trinn ii) utføres av et enzym med reverstranskriptaseaktivitet. 8. Fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyrer med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede ved gjentatt utførelse av følgende trinn: A) tilveiebringelse av et templat som i sin 3'- og 5'-ende er utstyrt med et område som består av en nukleotidsekvens som er komplementær til hvert av endeområdene i samme kjede, og som etter hybridisering av disse gjensidig komplementære nukleotidsekvensene til hverandre danner en løkke som er i stand til baseparing, B) syntese av en komplementær kjede hvori 3'-enden av templatet hybridisert til samme kjede fungerer som syntese-utgangspunkt, C) hybridisering til løkkeområdet av et oligonukleotid som i sin 3'-ende er utstyrt med en nukleotidsekvens som er komplementær til en løkke blant de nevnte løkker som er lokalisert i 3'-enden, etterfulgt av syntese med oligonukleotidet som utgangspunkt for syntesen av en komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning, slik at den komplementære kjede syntetisert i trinn B) forskyves, slik at dennes 3'-ende klar-gjøres for baseparing, og D) anvendelse av kjeden med 3'-enden klargjort for baseparing i trinn C) som nytt templat. 9. Fremgangsmåten ifølge punkt 8, hvori oligonukleotidet i trinn C) i sin 5'-ende er utstyrt med en nukleotidsekvens som er komplementær til 3'-enden som fungerer som utgangspunkt for syntesen i trinn B). 10. Fremgangsmåten ifølge punkt 9, videre omfattende et trinn hvori en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i trinn C) som utgangspunkt for syntesen anvendes som templat i trinn A). 11. Fremgangsmåten ifølge punkt 8, hvori templatet i trinn A) syntetiseres ved fremgangsmåten beskrevet i punkt 4. 12. Fremgangsmåten ifølge punkt 1 eller 8, hvori syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning utføres i nærvær av en smeltetemperaturregulator. 13. Fremgangsmåten ifølge punkt 12, hvori smelte-temperaturregulatoren er betain. 14. Fremgangsmåten ifølge punkt 13, hvori 0,2-3,0 M betain foreligger i reaksjonsløsningen. 15. En fremgangsmåte for påvisning av en målnukleotidsekvens i en prøve, som omfatter utførelse av en amplifiseringsfremgangsmåte beskrevet i ethvert av punktene 8-14, og observasjon av hvorvidt et amplifiseringsreaksjonsprodukt dannes eller ikke. 16. Fremgangsmåten ifølge punkt 15, hvori en probe som inneholder en nukleotidsekvens som er komplementær til løkken, tilsettes til amplifiseringsreaksjonsproduktet, og hybridisering mellom disse observeres. 17. Fremgangsmåten ifølge punkt 16, hvori proben er partikkelbundet, og en aggregeringsreaksjon som opptrer ved hybridisering observeres. 18. Fremgangsmåten ifølge punkt 15, hvori en amplifiseringsfremgangsmåte beskrevet i ethvert av punktene 8-14 ut-føres i nærvær av en nukleinsyredetektor, og at hvorvidt et amplifiseringsreaksjonsprodukt dannes eller ikke observeres, basert på et endret signal fra detektoren. 19. En fremgangsmåte for påvisning av en mutasjon i en målnukleotidsekvens ved påvisningsfremgangsmåten beskrevet i punkt 16, hvori en mutasjon i en nukleotidsekvens som amplifiseres, forhindrer syntese av de komplementære kjedene som utgjør amplifiseringsfremgangsmåten. 20. Et sett for syntese av nukleinsyrer med komplementære kjeder sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, som omfatter følgende elementer: i) et oligonukleotid bestående av minst to områder, F2 og Flc nedenfor, og Flc er bundet til 5'-siden av F2, F2: et område med en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område F2c i en templatnukleinsyre som har en spesifikk nukleotidsekvens, og Flc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Flc lokalisert i 5'-side av område F2c i templatnukleinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, ii) et oligonukleotid som inneholder en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område i en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som primer, iii) et oligonukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til et område F3c, lokalisert på 3'-siden av området F2c i nukleinsyren som fungerer som templat, iv) en DNA-polymerase som katalyserer syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning, og v) et nukleotid som fungerer som substrat for DNA-polymerasen i iv). 21. Settet ifølge punkt 20, hvori oligonukleotidet i ii) er et oligonukleotid bestående av minst to områder, R2 og Rlc nedenfor, og Rlc er bundet til 5'-siden av R2,

R2: et område som har en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område R2c i en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som utgangspunkt for syntesen, og

Rlc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Rlc lokalisert i 5'-side av område R2c i den komplementære kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som utgangspunkt for syntesen.

22. Settet ifølge punkt 21, videre omfattende:

vi) et oligonukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til et område R3c, plassert på 3'-siden av det tilfeldige området R2c i en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som utgangspunkt for syntesen. 23. Et sett for påvisning av en målnukleotidsekvens, omfattende en detektor for påvisning av et produkt fra en nukleinsyresyntesereaksjon som ekstra bestanddel i et sett beskrevet i ethvert av punktene 20-22.

Nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede som synteseformålet i foreliggende oppfinnelse betyr en nukleinsyre med gjensidig komplementære nukleotidsekvenser koblet ved siden av hverandre i en enkelttrådet kjede. I foreliggende oppfinnelse bør den i tillegg inneholde en nukleotidsekvens for dannelse av en løkke mellom de komplementære kjedene. I foreliggende oppfinnelse betegnes denne sekvens som den løkkedannende sekvens. Nukleinsyren som syntetiseres ifølge foreliggende oppfinnelse, består i det vesentlige av gjensidig komplementære kjeder sammenkoblet via den løkkedannende sekvens. Generelt betegnes en tråd som ikke separeres i to eller flere molekyler etter bryting av baseparing en enkelttrådet kjede, uavhengig av hvorvidt den omfatter delvis baseparing eller ikke. Den komplementære nukleotidsekvens kan danne baseparing i samme kjede. Et intramole-kylært, baseparet produkt som kan erholdes ved å tillate baseparing innen nukleinsyren med de komplementære nukleotidsekvensene sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede ifølge foreliggende oppfinnelse, gir et område som består av en til-synelatende dobbelttrådet kjede og en løkke som ikke omfatter baseparing.

Det vil si at nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder komplementære nukleotidsekvenser som kan hybridisere med hverandre innen samme kjede, og hybridiseringsproduktet kan defineres som en enkelttrådet nukleinsyre som omfatter en løkke som ikke deltar i baseparing i et bøyd hengselområde. Et nukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til denne, kan hybridisere til løkken som ikke deltar i baseparing. Den løkkedannende sekvens kan være en tilfeldig nukleotidsekvens. Den løkkedannende sekvens kan delta i baseparing for initiering av syntese av en komplementær kjede for trådforskyvning, og den er fortrinnsvis utstyrt med en sekvens som er forskjellig fra en nukleotidsekvens som foreligger i det andre området, slik at spesifikk hybridisering oppnås. I en foretrukket utførelse inneholder f.eks. den løkkedannende sekvens i det vesentlige samme nukleotidsekvens som et område F2c (eller R2c) som ligger på 3'-siden av et område (det vil si Flc eller Rlc) avledet fra templatnukleinsyren og hybridisert til samme kjede.

I foreliggende oppfinnelse er begrepet "i det vesentlige samme nukleotidsekvens" definert som følger: dersom en komplementær kjede syntetisert med en viss sekvens som templat hybridiserer til en målnukleotidsekvens, slik at det dannes et utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede, er denne sekvens i det vesentlige den samme som målnukleotidsekvensen. For eksempel omfatter i det vesentlige samme sekvens som F2 ikke bare nøyaktig den samme nukleotidsekvens som F2, men også en nukleotidsekvens som kan fungere som templat og gi en nukleotidsekvens som kan hybridisere til F2 og fungere som utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede. Begrepet "hybridisere" i foreliggende oppfinnelse betyr dannelse av en dobbelttrådet nukleinsyrestruktur via baseparing basert på Watson-Crick-prinsipper. Følgelig oppstår hybridisering selv om en nuklein-syrekjede som deltar i baseparingen er en enkelttrådet kjede, dersom intramolekylære, komplementære nukleotidsekvenser danner basepar. I foreliggende oppfinnelse har baseparing og hybridisering samme betydning, i og med at nukleinsyren danner en dobbelttrådet struktur via baseparing.

Antall par av komplementære nukleotidsekvenser som ut-gjør nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse, er minst ett. Ifølge en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse kan antallet være to eller flere. I dette tilfellet er det teoretisk ingen øvre grense for antall par med komplementære nukleotidsekvenser som utgjør nukleinsyren. Dersom nukleinsyren som synteseproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse består av flere sett med komplementære nukleotidsekvenser, består denne nukleinsyren av flere gangers gjentakelse av identiske nukleotidsekvenser .

Nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, syntetisert ifølge foreliggende oppfinnelse, har ikke nødvendigvis samme struktur som en naturlig forekommende nukleinsyre. Det er kjent at dersom et nukleotidderivat anvendes som substrat ved syntese av nukleinsyre ved hjelp av en DNA-polymerase, kan et nukleinsyrederivat syntetiseres. Nukleotidderivatet som anvendes, omfatter nukleotider merket med en radioaktiv isotop eller nukleotidderivater merket med en bindingsligand, f.eks. biotin eller digoksin. Disse nukleotidderivatene kan anvendes for merking av nukleinsyrederivater som dannes som produkt. Dersom fluorescerende nukleotider anvendes som substrat, kan nukleinsyren som dannes som produkt alternativt være et fluorescerende derivat. Videre kan dette produkt være enten DNA eller RNA. Hvilket av disse som dannes, bestemmes av en kombinasjon av primerens struktur, substratet som benyttes for polymerisering og polymeriseringsreagensene som benyttes for polymerisering av nukleinsyren.

Syntese av nukleinsyren med strukturen beskrevet ovenfor kan innledes ved anvendelse av en DNA-polymerase med trådforskyvningsaktivitet og en nukleinsyre som i sin 3'-ende er utstyrt med et område Fl som kan hybridisere til et område Flc i samme kjede, og som etter hybridisering av området Fl til Flc kan danne en løkke som inneholder et område F2c som kan delta i baseparing. Det foreligger mange rapporter vedrørende syntese av komplementære kjeder hvori en hårnålsløkke dannes og en prøve-sekvens selv anvendes som templat, mens området med hårnåls-løkken i foreliggende oppfinnelse tilveiebringes med et område som kan delta i baseparing, og det nye er at dette området anvendes for syntese av komplementær kjede. Ved anvendelse av dette området som utgangspunkt for syntesen forskyves en komplementær kjede som allerede er syntetisert med prøvesekvensen selv som templat. Da er et område Rlc (et tilfeldig område) plassert i 3'-enden av den forskjøvne kjede i en tilstand hvor den er klar for baseparing. Et område med en sekvens som er komplementær til Rlc hybridiseres til dette, noe som fører til dannelse av nukleinsyren (to molekyler) med en nukleotidsekvens som strekker seg fra Fl til Rlc og den komplementære kjede, sammenkoblet via den løkkedannende sekvens. I foreliggende oppfinnelse kan det tilfeldige området, f.eks. Rlc ovenfor, utvelges tilfeldig, forutsatt at det kan hybridisere til et polynukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til området, og at en komplementær kjede syntetisert med polynukleotidet som utgangspunkt for syntesen har de nødvendige funksjoner ifølge foreliggende oppfinnelse.

I foreliggende oppfinnelse benyttes begrepet "nukleinsyre". Nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter generelt både DNA og RNA. Nukleinsyre hvis nukleotider er erstattet med et kunstig derivat eller en modifisert nukleinsyre dannet fra naturlig DNA eller RNA, inngår også i nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse, så lenge som den kan fungere som templat for syntese av en komplementær kjede. Nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse inngår generelt i en biologisk prøve. Den biologiske prøve omfatter vev, celler, kulturer og utskilt materiale fra dyr, planter og mikrober, eller ekstrakter av disse. Den biologiske prøve ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter genomisk DNA eller RNA fra intracellulære parasitter, f.eks. virus eller mykoplasma. Nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse kan være avledet fra nukleinsyrer som inngår i den biologiske prøve. For eksempel er cDNA syntetisert fra mRNA eller nukleinsyre amplifisert på basis av nukleinsyre avledet fra den biologiske prøve typiske eksempler på nukleinsyren ifølge foreliggende oppfinnelse.

Nukleinsyren som særpreger foreliggende oppfinnelse, og som i sin 3'-ende er utstyrt med et område Fl som kan hybridisere til et område Flc innen samme kjede, og som etter hybridisering av området Fl til Flc kan danne en løkke som inneholder et område F2c som kan delta i baseparing, kan erholdes ved for skjellige fremgangsmåter. I den mest foretrukne utførelse kan reaksjonen for syntese av komplementær kjede som utnytter et oligonukleotid med følgende struktur, anvendes for dannelse av den ønskede struktur.

Det vil si at det anvendbare oligonukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse består av minst to områder, F2/R2 og Flc/Rlc nedenfor, og Flc/Rlc er bundet til 5'-siden av F2/R2,

F2/R2: et område med en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område F2c i templatnukleinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, og

Flc/Rlc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Flc/Rlc lokalisert i 5'-side av område F2c/R2c i templatnukleinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens.

Heri viser begrepet "nukleinsyren med en spesifikk nukleotidsekvens som bestemmer strukturen av oligonukleotidet ifølge oppfinnelsen" til en nukleinsyre som fungerer som et templat dersom oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes som primer. Når det gjelder påvisning av nukleinsyrer basert på syntesefremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, er nukleinsyren med en spesifikk nukleotidsekvens et påvisnings-mål eller nukleinsyre avledet fra påvisningsmålet. Nukleinsyren med en spesifikk nukleotidsekvens viser til en nukleinsyre hvori i det minste en del av nukleotidsekvensen er kjent eller forut-sigbar. Den kjente del av nukleotidsekvensen er området F2c/R2c og området Flc/Rlc, som ligger 5' for F2c/2c. Disse to områdene kan være sammenhengende, eller de kan ligge et stykke fra hverandre. Ut fra den relative plassering av disse to bestemmes tilstanden for en løkke som dannes ved selvhybridisering innen nukleinsyreproduktet. Avstanden mellom disse to er fortrinnsvis ikke svært stor, slik at nukleinsyreproduktet fortrinnsvis deltar i selvhybridisering, snarere enn intermolekylær hybridisering. Følgelig foretrekkes det at disse to områdene ligger etter hverandre med en avstand som vanligvis er fra 0 til 100 baser. Ved dannelse av en løkke ved selvhybridisering, som beskrevet nedenfor, kan det imidlertid forekomme tilfeller hvor det vil være ufordelaktig for dannelse av en løkke i en ønsket tilstand at de to ligger for nær hverandre. I løkken er det behov for en struktur som kan hybridisere til et nytt oligonukleotid, og som lett kan innlede trådforskyvningsreaksjonen for syntese av en komplementær kjede med oligonukleotidet som utgangspunkt for syntesen. Mer foretrukket er avstanden mellom området F2c/R2c og området Flc/Rlc, som ligger på 5'-siden av F2c/F2c, utformet til å være fra 0 til 100 baser, mer foretrukket fra 10 til 70 baser. Denne tallverdi viser en lengde hvor Flc/Rlc og F2/R2 ikke medregnes. Antall baser som utgjør løkkedelen, er denne lengden pluss et område som tilsvarer F2/R2.

De to begrepene "samme" og "komplementær", som anvendes for karakterisering av nukleotidsekvensen som utgjør oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse, betyr ikke absolutt samme eller absolutt komplementær. Det vil si at den samme sekvens som en gitt sekvens omfatter sekvenser som er komplementære til nukleotidsekvenser som kan hybridisere til en gitt sekvens. På den annen side betyr den komplementære sekvens en sekvens som kan hybridisere under stringente betingelser, slik at det tilveiebringes en 3'-ende som kan fungere som utgangspunkt for syntese av komplementær kjede.

Vanligvis ligger områdene F2/R2 og Flc/Rlc, som utgjør oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse, for nukleinsyren med en spesifikk nukleotidsekvens kontinuerlig etter hverandre uten at de overlapper. Dersom de to områdene har en felles sekvens, kan de delvis overlappe hverandre. Siden F2/R2 skal fungere som primer, bør denne alltid ligge i 3'-enden. Flc/Rlc skal derimot fungere som primer, som beskrevet nedenfor, for 3'-enden av en komplementær kjede syntetisert med nukleinsyren som templat, og bør således ligge i 5'-enden. Den komplementære kjede erholdt med dette oligonukleotid som utgangspunkt for syntesen fungerer som templat for syntese av komplementær kjede i motsatt retning i neste trinn, og endelig kopieres oligonukleotiddelen ifølge foreliggende oppfinnelse som templat til en komplementær kjede. 3'-enden som dannes ved kopieringen, har nukleotidsekvensen Fl/Rl, som hybridiseres til Flc/Rlc i samme kjede, slik at det dannes en løkke.

I foreliggende oppfinnelse betyr oligonukleotid et oligonukleotid som oppfyller de to krav, det vil si at det må kunne gi komplementær baseparing og gi en -OH-gruppe som kan fungere som utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede i 3'-enden. Følgelig er oligonukleotidets ryggrad ikke nødvendig-vis begrenset til en ryggrad med fosfodiesterbindinger. Oligonukleotidet kan f.eks. ha et fosfotioatderivat med S i stedet for 0 som ryggrad, eller være en peptidnukleinsyre basert på peptidbindinger. Basene må være baser som kan delta i komplementær baseparing. I naturen er det fem baser, det vil si A, C, T, G og U, men basen kan være en baseanalog, f.eks. bromdeoksy-uridin. Oligonukleotidet som anvendes i foreliggende oppfinnelse, fungerer fortrinnsvis ikke bare som utgangspunkt for syntese, men også som templat for syntese av komplementær kjede. Begrepet polynukleotid i foreliggende oppfinnelse omfatter oligonukleotider. Begrepet "polynukleotid" anvendes dersom kjedelengden ikke er begrenset, mens begrepet "oligonukleotid" anvendes for å vise til en polynukleotidpolymer med relativt kort kjedelengde.

Oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse har en kjedelengde som gjør det i stand til baseparing med en komplementær kjede, og til å opprettholde nødvendig spesifisitet i det gitte miljø i de forskjellige reaksjonene for syntese av nukleinsyre, beskrevet nedenfor. Nærmere bestemt består det av 5-200 basepar, mer foretrukket fra 10 til 50 basepar. Kjedelengden for en primer som gjenkjenner den kjente polymerase som katalyserer den sekvensavhengige nukleinsyresyntese, er minst ca. 5 baser, slik at kjedelengden av den hybridiserende del bør være lenger enn dette. I tillegg er en lengde på 10 baser mer ønskelig av statistiske grunner, slik at en spesifisitet når det gjelder nukleotidsekvenser kan forventes. På den annen side er fremstilling av en for lang nukleotidsekvens ved kjemisk syntese vanskelig, og kjedelengden beskrevet ovenfor gis derfor som et eksempel på et ønsket størrelsesområde. Kjedelengden som gis som eksempel her, viser til kjedelengden av den del som hybridiserer til en komplementær kjede. Som beskrevet nedenfor, kan oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse til sjuende og sist hybridisere til minst to områder enkeltvis. Følgelig bør det forstås at kjedelengden som gis som eksempel her, er kjedelengden for hvert av områdene som utgjør oligonukleotidet.

Videre kan oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse være merket med en kjent merkingsgruppe. Merkings- gruppen omfatter bindingsligander som digoksin og biotin, enzymer, fluorescerende forbindelser og luminescerende forbindelser, samt radioaktive isotoper. Teknikker for å erstatte en base som inngår i et oligonukleotid med en fluorescerende analog, er også kjent (WO 95/05391, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 91, 6644-6648, 1994).

Andre oligonukleotider ifølge foreliggende oppfinnelse kan også være bundet til en fast fase. Alternativt kan en tilfeldig del av oligonukleotidet være merket med en bindingsligand, f.eks. biotin, og det kan være immobilisert indirekte via en bindingspartner, f.eks. immobilisert avidin. Dersom det immobiliserte oligonukleotid anvendes som utgangspunkt for syntesen, vil nukleinsyren, som er syntesereaksjonsproduktet, være innfanget av den faste fase, noe som forenkler separasjonen av denne. Det separerte produkt kan påvises ved en nukleinsyre-spesifikk indikator eller ved hybridisering med en merket probe. Fragmenter av målnukleinsyren kan også gjenvinnes ved å kutte produktet med tilfeldige restriksjonsenzymer.

Begrepet "templat" som anvendt i foreliggende oppfinnelse betyr nukleinsyre som fungerer som templat for syntese av en komplementær kjede. En komplementær kjede med en nukleotidsekvens som er komplementær til templatet, har en betydning som en kjede som tilsvarer templatet, men forholdet mellom disse to er kun relativt. Det vil si at en kjede som syntetiseres som en komplementær kjede, igjen kan fungere som templat. Det vil si at den komplementære kjede kan bli et templat.

Oligonukleotidet som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse, er ikke begrenset til de to områdene beskrevet ovenfor, og det kan inneholde ytterligere et område. Mens F2/R2 og Flc/Rlc er plassert i 3'- henholdsvis 5'-enden, kan en tilfeldig sekvens ligge mellom disse. Denne kan f.eks. være gjenkjennings-setet for et restriksjonsenzym, en promoter som gjenkjennes av RNA-polymerase eller DNA som koder for et ribozym. Ved å anvende gjenkjenningssekvensen til et restriksjonsenzym kan nukleinsyren, som har komplementære sekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, som synteseproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse kuttes til dobbelttrådede nukleinsyrer av samme lengde. Ved å innføre en promotersekvens som gjenkjennes av RNA-polymerase, fungerer synteseproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse som templat for videre transkripsjon til RNA. Ved innføring av DNA som koder for et ribozym, dannes et system hvor transkripsjonsproduktet er selvkuttende. Disse ekstra nukleotidsekvensene er sekvenser som fungerer etter at det er dannet en dobbelttrådet kjede. Følgelig er disse sekvensene ikke funksjonelle når den enkelttrådede nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse har dannet en løkke. De fungerer ikke før nukleinsyren er blitt forlenget og hybridisert i fravær av en løkke til en kjede med komplementær nukleotidsekvens.

Dersom en promoter inngår i oligonukleotidet ifølge

foreliggende oppfinnelse i en retning som tillater transkripsjon av det syntetiserte området, utgjør reaksjonsproduktet basert på foreliggende oppfinnelse, hvori den samme nukleotidsekvens gjen-tas, et svært effektivt transkripsjonssystem. Ved å kombinere

dette system med et egnet ekspresjonssystem, er translasjon til et protein også mulig. Det vil si at systemet kan anvendes for transkripsjon og translasjon til protein i bakterier eller dyre-celler eller in vitro.

Oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse med strukturen beskrevet ovenfor kan syntetiseres kjemisk. Alternativt kan naturlig nukleinsyre kuttes med f.eks. restriksjonsenzymer og modifiseres, slik at det består av eller ligeres inn i nukleotidsekvensen beskrevet ovenfor.

Det grunnleggende prinsipp for syntesereaksjonen ved anvendelse av det anvendbare oligonukleotid, beskrevet ovenfor, i kombinasjon med en DNA-polymerase med trådforskyvningsaktivitet i nukleinsyresyntesereaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse beskrives ved henvisning til figurene 5-6. Oligonukleotidet beskrevet ovenfor (FA i figur 5) hybridiserer til F2 i templatnukleinsyren, slik at det tilveiebringes et utgangspunkt for syntese av komplementær kjede. I figur 5 forskyves en komplementær kjede syntetisert fra FA som utgangspunkt for syntesen ved syntese av komplementær kjede (beskrevet nedenfor) fra en ytre primer (F3), slik at det dannes en enkelttrådet kjede (figur 5-A). Når videre syntese av komplementær kjede til den resulterende komplementære kjede utføres, har 3'-enden av nukleinsyren som syntetiseres som komplementær kjede i figur 5-A, en nukleotidsekvens som er komplementær til oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse. Det vil si at siden 5'-enden av oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse har samme sekvens som et område Flc, har 3'-enden av den således syntetiserte nukleinsyre en komplementær sekvens Fl. Figur 5 viser at den komplementære kjede syntetisert fra RI som utgangspunkt for syntesen forskyves ved syntese av komplementær kjede med primer R3 som utgangspunkt for syntesen. Når først 3'-delen er klargjort for baseparing ved denne forskyvningen, hybridiserer Fl i 3'-enden til Flc i samme kjede, og en forlengelsesreaksjon med kjeden selv som templat forløper (figur 5-B). Etter dette foreligger F2c i 3'-enden som en løkke som ikke deltar i baseparing. F2 i oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse hybridiserer til denne løkken, og en komplementær kjede syntetiseres med oligonukleotidet som utgangspunkt for syntesen (figur 5-B). Et produkt fra syntesen av komplementær kjede med det tidligere syntetiserte produkt som templat forskyves ved trådforskyvningsreaksjonen, slik at det klargjøres for baseparing.

Med den grunnleggende anvendelse av en type oligonukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse og en tilfeldig reversprimer som kan delta i nukleinsyresyntese når den komplementære kjede syntetisert med oligonukleotidet som primer anvendes som templat, kan en stor mengde nukleinsyresynteseprodukter erholdes, som vist i figur 6. Som vist i figur 6 er (D) det ønskede nukleinsyreprodukt ifølge oppfinnelsen med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede. Når det først er overført til en enkelttrådet kjede ved f.eks. varmedenaturering, fungerer det andre produktet

(E) igjen som templat for dannelse av (D). Dersom produktet (D) som nukleinsyre i form av en dobbelttrådet kjede overføres til

en enkelttrådet kjede ved varmedenaturering, skjer hybridisering innen samme kjede med høy sannsynlighet, uten at den opprinnelige dobbelttrådede kjede gjendannes. Dette skyldes at en komplementær kjede med samme smeltetemperatur (Tm) fortrinnsvis inngår i intramolekylær reaksjon fremfor intermolekylær reaksjon. Alle enkelttrådede kjeder avledet fra produktet (D) vil danne intrakjedehybrider og vende tilbake til tilstanden

(B), og hver kjede gir videre opphav til et molekyl (D) og et molekyl (E). Ved å gjenta disse trinnene, er det mulig å gradvis

syntetisere nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede. Templatet

og produktet som dannes i én syklus, amplifiseres eksponentielt, noe som gjør reaksjonen svært effektiv.

For å oppnå tilstanden i figur 5(A) bør den opprinnelig syntetiserte komplementære kjede, i det minste den del hvor reversprimeren hybridiserer, være klar for baseparing. Dette trinnet kan oppnås ved en tilfeldig valgt fremgangsmåte. Det vil si at en ytre primer (F3), som hybridiserer til det første templat i et område F3c på 3'-siden av området F2c, som oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse hybridiserer til, fremstilles separat. Dersom denne ytre primer anvendes som utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av en komplementær kjede ved trådforskyvning, forskyves den komplementære tråd som ble syntetisert med F2c som utgangspunkt for syntesen i oppfinnelsen, og resultatet er at området Rlc som skal hybridisere til RI, klargjøres for baseparing (figur 5). Ved å utnytte trådforskyvningsreaksjonen kan reaksjonen opp til nå forløpe under isoterme betingelser.

Dersom en ytre primer anvendes, bør syntesen fra den ytre primer (F3) innledes etter syntese fra F2c. I den enkleste fremgangsmåten gjøres konsentrasjonen av den indre primer høyere enn konsentrasjonen av den ytre primer. Nærmere bestemt har de anvendte primere vanligvis 2-50 ganger og fortrinnsvis 4-10 ganger forskjellige konsentrasjoner, hvorved reaksjonen kan forløpe som forventet. Videre settes smeltetemperaturen (Tm) for den ytre primer til å være lavere enn Tm for Fl og RI i den indre primer, hvorved syntesetidspunktene kan kontrolleres. Det vil si: (ytre primer (F3:F3c < F2c/F2) < Flc/Fl) eller (ytre primer/område på 3'-siden i templatet) < F2c:F2) < (Flc:Fl). Hensikten med (F2c/F2) < (Flc/Fl) er således å oppnå hybridisering mellom Flc og Fl før hybridisering av F2 til løkken. Hybridiseringen mellom Flc og Fl er en intramolekylær reaksjon, og den kan således forløpe fortrinnsvis med høy sannsynlighet. Det er imidlertid meningsfylt å betrakte Tm for å oppnå mer ønskelige reaksjonsbetingelser. I praksis bør lignende betingelser tas i betraktning også ved utforming av en reversprimer. Ved anvendelse av et slikt forhold kan statistisk sett ideelle reaksjonsbetingelser oppnås. Dersom andre betingelser holdes konstante, kan smeltetemperaturen (Tm) beregnes teoretisk ved en kombinasjon av lengden på en hybridiserende komplementær kjede og basene som inngår i baseparingen. Følgelig kan fagfolk utlede foretrukne betingelser basert på den foreliggende beskrivelse.

Videre kan begrepet betegnet tilgrensende stabling også anvendes for kontroll av tidspunktet for hybridisering av den ytre primer. Tilgrensende stabling er et fenomen hvori et oligonukleotid som ikke er i stand til å hybridisere i seg selv, gjøres i stand til hybridisering ved at det ligger tilgrensende til en del av en dobbelttrådet kjede (Chiara Borghesi-Nicoletti et al., Bio Techniques, 12, 414- 411 (1992)). Det vil si at den ytre primer er utformet slik at den grenser opp mot F2c og ikke er i stand til å hybridisere alene. Ved å innrette seg slik, vil hybridisering av den ytre primer ikke skje før F2c hybridiserer, og således vil hybridisering av F2c fortrinnsvis skje. Basert på dette prinsipp viser eksemplene innstilling av nukleotidsekvensen til et oligonukleotid som er nødvendig som primer for en serie med reaksjoner. Dette trinn kan også oppnås ved denaturering under oppvarming eller med en DNA-helikase.

Dersom templatnukleinsyren med F2c er RNA, kan tilstanden i figur 5-A også oppnås ved en annen fremgangsmåte. Dersom f.eks. denne RNA-kjeden dekomponeres, gjøres RI tilgjengelig for baseparing. Det vil si at F2 hybridiseres til F2c i RNA, og at en komplementær kjede syntetiseres som DNA ved hjelp av en reverstranskriptase. RNA som fungerer som templat, dekomponeres ved alkalidenaturering eller ved enzymatisk behandling med en ribonuklease som virker på RNA i en dobbelttrådet kjede av DNA/RNA, hvorved DNA syntetisert fra F2 vil danne en enkelttrådet kjede. Som enzymet som selektivt dekomponerer RNA i en dobbelttrådet kjede av DNA/RNA, kan ribonukleaseaktiviteten til RNase H eller visse reverstranskriptaser anvendes. På denne måten kan reversprimeren hybridiseres til Rlc, som er gjort tilgjengelig for baseparing. Følgelig blir den ytre primer for å gjøre Rlc klar for baseparing unødvendig.

Alternativt kan trådforskyvningsaktiviteten til reverstranskriptase anvendes for trådforskyvningen ved en ytre primer, som beskrevet ovenfor. I dette tilfellet kan et reaksjonssystem utgjøres av en reverstranskriptase alene. Det vil si at ved anvendelse av RNA som templat gjøres det mulig ved hjelp av en reverstranskriptase å syntetisere en komplementær kjede fra F2 hybridisert til F2c i templatet, og å syntetisere en komplementær kjede med den ytre primer F3 som utgangspunkt for syntesen, hybridisert til F3c lokalisert på 3'-siden av F2c, og å samtidig forskyve den tidligere syntetiserte komplementære kjede. Når reverstranskriptasen utfører syntesen av en komplementær kjede med DNA som templat, skjer alle syntesereaksjonene av komplementære kjeder, innbefattet syntesen av en komplementær kjede med RI som utgangspunkt for syntesen, hybridisert til Rlc i den forskjøvne komplementære kjede som templat, syntesen av en komplementær kjede med R3 som utgangspunkt for syntesen, hybridisert til R3c lokalisert på 3'-siden av Rlc, og den samtidige forskyvningsreaksjon, ved reverstranskriptasen. Dersom man ikke kan forvente at reverstranskriptasen viser DNA/RNA-trådforskyvningsaktivitet under gitte reaksjonsbetingelser, kan en DNA-polymerase med trådforskyvningsaktiviteten beskrevet ovenfor tilsettes i tillegg. Måten beskrevet ovenfor for erholdelse av en første enkelttrådet nukleinsyre med RNA som templat, utgjør en foretrukket måte å utføre foreliggende oppfinnelse på. Hvis derimot en DNA-polymerase som Bca-DNA-polymerase, som har både trådforskyvningsaktivitet og reverstranskriptaseaktivitet, benyttes, kan ikke bare syntese av en første enkelttrådet nukleinsyre fra RNA, men også den påfølgende reaksjon med DNA som templat, forløpe ved hjelp av samme enzym.

Reaksjonssystemet som beskrives ovenfor, innfører forskjellige varianter som er iboende i foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av reversprimeren med en spesifikk struktur. Den mest effektive variant beskrives nedenfor. Det vil si at oligonukleotidet oppbygd som beskrevet i [5], anvendes som reversprimer i den mest fordelaktige utførelse av foreliggende oppfinnelse. Oligonukleotidet i [5] er oligonukleotidet syntetisert på grunnlag av det tilfeldige området R2c i en komplementær kjede syntetisert med F2 som primer og sekvensen av området Rlc lokalisert ved 5'-siden sammenlignet med R2c. Ved anvendelse av en slik reversprimer skjer en serie av reaksjoner for dannelse av en løkke og for syntese og forskyvning av en komplementær kjede fra denne løkke i både "sense"- og "antisense"-kjeden ("forward"-siden og "reverse"-siden). Som et resultat forbedres reaksjonseffektiviteten for syntesen av nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser koblet etter hverandre i en enkelt trådet kjede ifølge foreliggende oppfinnelse i stor grad, samtidig som en serie av disse reaksjonene er utførbare under isoterme betingelser. I det påfølgende beskrives denne utførelse mer detaljert ved henvisning til figurene 1-3, hvor denne ut-førelse er oppsummert.

I den påfølgende utførelse fremstilles to typer oligonukleotider basert på foreliggende oppfinnelse. For en for-klaring betegnes disse FA og RA. Områdene som utgjør FA og RA, er som følger:

FA F2 Flc

RA R2 Rlc

Her er F2 en nukleotidsekvens som er komplementær til et område F2c i templatnukleinsyren. R2 er en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område R2c, som inngår i en komplementær kjede syntetisert med F2 som primer. Flc og Rlc er tilfeldige nukleotidsekvenser som er lokalisert nedstrøms for F2c henholdsvis R2c. Avstanden mellom F2 og R2 kan være tilfeldig valgt. Selv om lengden er ca. 1 kbp, er tilstrekkelig syntese oppnåelig under egnede betingelser, selv om dette vil avhenge av synteseaktiviteten til DNA-polymerasen som utfører syntesen av den komplementære kjede. Nærmere bestemt syntetiseres det ønskede produkt sikkert dersom Bst-DNA-polymerase anvendes, hvis avstanden mellom F2 og R2c er 800 bp, fortrinnsvis 500 bp eller mindre. I PCR som omfatter temperatursykluser, forventes reduksjonen i enzymaktivitet grunnet påkjenningen ved temperaturendring å redusere synteseeffektiviteten for en lang nukleotidsekvens. I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse er temperatursykluser i trinnet for amplifisering av nukleinsyrer ikke nødvendig, og syntese og amplifisering av selv en lang nukleotidsekvens kan således med sikkerhet oppnås.

Først hybridiseres F2 i FA til templatnukleinsyren og anvendes som utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede. De påfølgende reaksjonstrinn inntil figur 1(4) er de samme som i den tidligere beskrevne basale utførelse (figur 5) i foreliggende oppfinnelse. Sekvensen som hybridiserer som F3 i figur 1(2), er den ytre primer beskrevet ovenfor. En DNA-polymerase for syntese av en komplementær kjede med trådforskyvning med denne primer som utgangspunkt for syntesen anvendes slik at den komplementære tråd som syntetiseres fra FA, forskyves og klar-gjøres for baseparing.

Når R2c er klargjort for baseparing i (4), hybridiserer RA som reversprimer til dette området i kombinasjonen R2c/R2. Syntese av en komplementær kjede med dette setet som utgangspunkt for syntesen forløper inntil kjeden når Flc i 5'-enden av FA. Etter denne syntese av en komplementær kjede hybridiserer den ytre forskyvningsprimer R3 til denne for syntese for en komplementær kjede, under hvilken trådforskyvning også forløper slik at den komplementære kjede som er syntetisert med RA som utgangspunkt for syntesen, forskyves. I den således forskjøvne komplementære kjede er RA plassert i 5'-enden, og en sekvens som er komplementær til FA i 3'-enden.

I 3'-enden av den således forskjøvne enkelttrådede nukleinsyre foreligger en sekvens Fl som er komplementær til Flc i samme kjede. Fl vil hurtig hybridisere til Flc i samme molekyl, slik at syntese av en komplementær kjede innledes. Når 3'-enden (Fl) hybridiserer til Flc i samme kjede, dannes en løkke som inneholder F2c. Som figur 2-(7) også viser, er en del av denne løkken klar for baseparing. Oligonukleotidet FA ifølge oppfinnelsen med en nukleotidsekvens som er komplementær til F2c, hybridiserer til denne del av løkken og fungerer som utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede (7). Syntese av en komplementær kjede fra løkken forløper mens reaksjonsproduktet fra den tidligere initierte syntese av en komplementær kjede fra Fl forskyves. Resultatet er at den komplementære kjede syntetisert med seg selv som templat, igjen klargjøres for baseparing i 3'-enden. Denne 3'-ende er utstyrt med et område RI som kan hybridisere til Rlc i samme kjede, og disse to vil hybridisere fortrinnsvis grunnet den hurtige intramolekylære reaksjon. Den samme reaksjon som beskrevet ovenfor med utgangspunkt i 3'-enden syntetisert med FA som templat, forløper i dette området også. Resultatet er at nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser, sammenkoblet etter hverandre i samme enkelttrådede kjede ifølge foreliggende oppfinnelse, fortsetter å forlenges med Ri som utgangspunkt i 3'-enden ved på hverandre følgende synteser av en komplementær kjede og påfølgende forskyvning av denne. Siden R2c alltid inngår i løkken som dannes ved intramolekylær hybridisering av RI i 3'-enden, vil oligonukleotidet

(RA) utstyrt med R2 hybridisere til løkken i 3'-enden i den på-følgende reaksjon.

Når det gjelder nukleinsyren som syntetiseres som en komplementær kjede fra oligonukleotidet som hybridiserer til løkken i den enkelttrådede nukleinsyre som er forlenget med seg selv som templat, vil syntese av en nukleinsyre med komplementære nukleotidsekvenser, sammenkoblet etter hverandre i samme enkelttrådede kjede ifølge foreliggende oppfinnelse, også for-løpe her. Det vil si at syntese av en komplementær kjede fra løkken fullføres når den når RA i f.eks. figur 2-(7) . Når nukleinsyren som forskyves av denne nukleinsyresyntese innleder syntese av en komplementær kjede (figur 3-(8)), når så reaksjonen løkken som en gang var utgangspunkt for syntesen, og forskyvningen innledes igjen. På denne måten forskyves også nukleinsyren hvis syntese ble innledet i løkken, og resultatet er atR<1>i 3'-enden, i stand til å hybridisere til samme kjede, erholdes (figur 3-(10)). Denne RI i 3'-enden hybridiserer til Rlc i samme kjede, slik at syntese av en komplementær kjede innledes. Denne reaksjonen er den samme som i figur 2-(7), bortsett fra at F anvendes i stedet for R. Følgelig kan strukturen vist i figur 3-(10) fungere som en ny nukleinsyre som fortsetter selvforlengelse og dannelse av ny nukleinsyre.

Nukleinsyresyntesereaksjonen som innledes fra nukleinsyren vist i figur 3-(10), gir forlengelse med Fl i 3'-enden som utgangspunkt for syntesen, i motsetning til reaksjonen beskrevet ovenfor. Det vil si at i foreliggende oppfinnelse forløper reaksjonen for kontinuerlig tilførsel av en ny nukleinsyre som selv kan innlede forlenging etter hvert som en nukleinsyre forlenges. Etter hvert som kjeden forlenges, dannes videre et større antall løkkedannende sekvenser, ikke bare i enden, men også i samme kjede. Når disse løkkedannende sekvenser klargjøres for baseparing ved trådforskyvningsreaksjonen, vil et oligonukleotid hybridisere til disse og fungere som utgangspunkt for reaksjonen hvor en ny nukleinsyre dannes. Videre oppnås effektiv amplifisering ved syntesereaksjoner som ikke bare starter i enden, men også inne i kjeden. Oligonukleotidet RA ifølge foreliggende oppfinnelse inngår som reversprimer som beskrevet ovenfor, hvorved kjedeforlengelse og påfølgende dannelse av en ny nukleinsyre skjer. Videre vil i foreliggende oppfinnelse denne nydannede nukleinsyre selv forlenges og gi påfølgende dannelse av en ny nukleinsyre. En serie av disse reaksjonene fortsetter i teorien kontinuerlig, slik at det oppnås svært effektiv amplifisering av nukleinsyre. I tillegg kan reaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse utføres under isoterme betingelser.

Reaksjonsproduktene som akkumuleres på denne måten, har en struktur hvor nukleotidsekvensen mellom Fl og RI og den komplementære sekvens er sammenkoblet alternerende. Begge endene av den repeterende enhet har imidlertid et område som består av de på hverandre følgende nukleotidsekvensene F2-F1 (F2c-Flc) og R2-R1 (R2c-Rlc). I figur 3-(9) er f.eks. sekvensene (R2-F2c)-(Fl-R2c)-(Rl-Flc)-(F2-R2c) sammenkoblet i denne rekkefølgen fra 5'-enden. Dette skyldes at amplifiseringsreaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse forløper basert på det prinsipp at reaksjonen innledes fra F2 (eller R2) med et oligonukleotid som utgangspunkt for syntesen, hvoretter en komplementær kjede forlenges ved syntesereaksjonen fra Fl (eller RI) med 3'-enden som utgangspunkt for syntesen.

Her i den mest foretrukne utførelse ble oligonukleotidene FA og RA ifølge foreliggende oppfinnelse anvendt som oligonukleotider som hybridiserer til en del av en løkke. Selv om disse oligonukleotidene med en begrenset struktur ikke anvendes, kan imidlertid amplifiseringsreaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse utføres ved anvendelse av et oligonukleotid som kan innlede syntesen av en komplementær kjede fra løkken. Det vil si at 3'-enden som skal forlenges når den først er for-skjøvet av en komplementær kjede som syntetiseres fra løkken, gir opphav til en ny løkke. Siden nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede alltid anvendes som templat i syntese av den komplementære kjede med utgangspunkt i løkken, er det åpenbart at nukleinsyren som er ønsket i foreliggende oppfinnelse, kan syntetiseres. Den således syntetiserte nukleinsyre utfører imidlertid syntese av en komplementær kjede ved dannelse av en løkke etter forskyvningen, men det er ingen 3'-ende tilgjengelig for påfølgende dannelse av en løkke, og den kan således ikke fungere som et nytt templat. Følgelig kan produktet i dette tilfellet ikke forventes å amplifiseres eksponentielt, i motsetning til nukleinsyre hvor syntesen innledes fra FA eller RA. Av denne grunn er et oligonukleotid med strukturen til FA eller RA nyttig for svært effektiv syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse.

En serie av disse reaksjonene forløper ved tilsetning av følgende bestanddeler til en enkelttrådet nukleinsyre som templat og inkubering av blandingen ved en temperatur hvor nukleotidsekvensen som omfatter FA og RA, kan danne stabil baseparing med den komplementære nukleotidsekvens, samtidig som enzymaktiviteten opprettholdes.

Fire typer oligonukleotider:

FA,

RA,

den ytre primer F3, og

den ytre primer R3,

DNA-polymerase for utførelse av syntese av

komplementær kjede under trådforskyvning,

et oligonukleotid som fungerer som substrat for

DNA-polymerase.

Følgelig er temperatursykluser som i PCR ikke nødven-dig. Den stabile baseparing det vises til heri, betyr en tilstand hvor i det minste en del av et oligonukleotid som foreligger i reaksjonssystemet kan danne utgangspunkt for syntese av en komplementær kjede. For eksempel kan den ønskede tilstand hvor stabile basepar dannes, oppnås ved å benytte en temperatur som er lavere enn smeltetemperaturen (Tm). Generelt anses smeltetemperaturen (Tm) som den temperatur hvor 50 % av nukleinsyrer med gjensidig komplementære nukleotidsekvenser danner basepar. Det å sette reaksjonstemperaturen til smeltetemperaturen (Tm) eller lavere, er ikke en avgjørende betingelse i foreliggende oppfinnelse, men er en av reaksjonsbetingelsene som bør tas i betraktning for å oppnå høy synteseeffektivitet. Dersom nukleinsyren som skal anvendes som templat er en dobbelttrådet kjede, må nukleinsyren gjøres klar for baseparing, i det minste i det området hvor oligonukleotidet hybridiserer. For dette utføres generelt varmedenaturering, og dette må kun gjøres én gang som en forbehandling før reaksjonen innledes.

Denne reaksjonen utføres i nærvær av en buffer som gir egnet pH for enzymreaksjonen, salter som er nødvendige for hybridisering eller for opprettholdelse av enzymets katalytiske aktivitet, et beskyttelsesmiddel for enzymet og om nødvendig en regulator av smeltetemperaturen (Tm). Som buffer anvendes f.eks. Tris-HCl med bufrende virkning i det nøytrale til det svakt alkaliske området. pH justeres avhengig av DNA-polymerasen som anvendes. Som salter tilsettes med fordel KC1, NaCl, (NH4)2S04osv. for opprettholdelse av enzymaktiviteten og for regulering av nukleinsyrens smeltetemperatur (Tm). Beskyttelsesmidlet for enzymet kan være bovint serumalbumin eller sukkere. Videre anvendes generelt dimetylsulfoksid (DMSO) eller formamid som regulator for smeltetemperaturen (Tm). Ved anvendelse av denne regulatoren for smeltetemperaturen (Tm) kan hybridisering av oligonukleotidet reguleres under begrensede temperaturbetingelser. Videre er betain (N,N,N-trimetylglysin) eller et tetra-alkylammoniumsalt også effektive for å forbedre effektiviteten av trådforskyvningen, grunnet den isostabiliserende evne. Ved å tilsette betain i en mengde på fra 0,2 til 3,0 M, fortrinnsvis fra 0,5 til 1,5 M, til reaksjonsblandingen kan en fremmende virkning på nukleinsyreamplifiseringen ifølge foreliggende oppfinnelse forventes. Siden disse regulatorene av smeltetemperaturen fungerer ved å redusere smeltetemperaturen, bestemmes betingelser som gir egnet stringens og reaktivitet empirisk, idet det tas hensyn til saltkonsentrasjoner, reaksjonstemperatur osv.

En viktig egenskap ved foreliggende oppfinnelse er at en serie av reaksjoner ikke vil forløpe med mindre den relative plassering av et stort antall områder er opprettholdt. Grunnet dette forhindres effektivt uspesifikke syntesereaksjoner som ledsages av uspesifikk syntese av komplementær kjede. Det vil si at selv om en viss uspesifikk reaksjon opptrer, er muligheten for at produktet kan fungere som utgangsmateriale for det på-følgende amplifiseringstrinn minimal. Videre kan det at reaksjonsforløpet reguleres av mange områder, gjøre det mulig å oppbygge et tilfeldig deteksjonssystem som kan gi en nøyaktig påvisning av det ønskede produkt i analoge nukleotidsekvenser.

Denne egenskapen kan utnyttes for påvisning av mutasjoner i et gen. I utførelsen av oppfinnelsen hvori den ytre primer anvendes, benyttes fire primere, det vil si to ytre primere og to primere som består av oligonukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Det vil si at med mindre de seks om rådene som inngår i de fire oligonukleotidene fungerer som beregnet, vil syntesereaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse ikke forløpe. Særlig er sekvensene i 3'-enden av hvert oligonukleotid, som fungerer som utgangspunkt for syntese av komplementær kjede, og i 5'-enden av Flc/Rlc-området, hvor den komplementære kjede fungerer som utgangspunkt for syntesen, viktige. Disse viktige sekvensene er følgelig utformet slik at de tilsvarer en mutasjon som skal påvises, og syntesereaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse observeres hvorved nærvær eller fravær av en mutasjon, f.eks. en basedelesjon eller -insersjon, eller en genetisk polymorfi, f.eks. en SNP, kan analyseres i detalj. Nærmere bestemt utformes oligonukleotidene slik at baser hvor en mutasjon eller polymorfi kan forventes, tilsvarer naboposisjonene til 3'-enden av et oligonukleotid som skal fungere som utgangspunkt for syntese av komplementær kjede, eller til 5'-enden, hvor en komplementær kjede er utgangspunkt for syntesen. Dersom et feiltilpasset basepar foreligger i 3'-enden som fungerer som utgangspunkt for syntese av komplementær kjede eller i nærheten av enden, vil syntesen av den komplementære kjede til nukleinsyren inhiberes signifikant. I foreliggende oppfinnelse oppnås ikke en høy grad av amplifisering med mindre endestrukturene i et produkt fra utgangsreaksjonen gir gjentatte reaksjoner. Selv om en feilaktig syntese skulle skje, vil følgelig alltid syntesen av komplementær kjede som utgjør amplifiseringsreaksjonen, forstyrres i noen av trinnene, og således vil en høy grad av amplifisering ikke skje i nærvær av et mistilpasset basepar. Resultatet er at det mistilpassede basepar effektivt inhiberer amplifiseringsreaksjonen, og til slutt vil et nøyaktig resultat oppnås. Følgelig kan det sies at amplifiseringsreaksjonen for nukleinsyrer ifølge foreliggende oppfinnelse har en svært fullstendig mekanisme for kontroll av nukleotidsekvensen. Disse egenskapene er en fordel som neppe kan forventes i f.eks. PCR-fremgangsmåten, hvor amplifiseringsreaksjonen utføres i kun to områder.

Området Flc/Rlc, som særpreger oligonukleotidet som anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, kan fungere som utgangspunkt for syntese etter syntese av en komplementær sekvens, og denne komplementære sekvens hybridiserer til sekvensen Fl/Rl i den samme nysyntetiserte kjede, hvorved syntesereaksjonen med kjeden selv som templat forløper. Selv om den såkalte primer-dimer, som ofte er et problem innen teknikkens stand, dannes, vil følgelig dette oligonukleotid ikke danne en løkke. Følgelig kan teoretisk sett uspesifikk amplifisering grunnet primer-dimeren ikke skje, og således bidrar det foreliggende oligonukleotid til forbedret spesifisitet i reaksjonen.

Ifølge foreliggende oppfinnelse kan videre de ytre primere vist som F3 (figur l-(2)) eller R3 (figur 2-(5)) inn-føres i reaksjonen, hvorved en serie av reaksjonene beskrevet ovenfor kan utføres under isoterme betingelser. Det vil si at foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyrer med komplementære sekvenser, sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede som omfatter trinnene vist i punkt 9 ovenfor. I denne fremgangsmåten utvelges temperaturbetingelser hvor stabil hybridisering opptrer mellom F2c og F2, mellom R2c og R2, mellom Flc og Fl og mellom Rlc og RI, og F3c/F3 og R3c/R3 justeres fortrinnsvis slik at de hybridiserer ved fenomenet tilgrensende stabling, gjort lettere ved hybridisering av F2c/F2 henholdsvis R2c/R2.

I foreliggende oppfinnelse anvendes begrepene "syntese" og "amplifisering" av nukleinsyre. Syntese av nukleinsyre i foreliggende oppfinnelse betyr forlengelse av nukleinsyre fra et oligonukleotid som fungerer som utgangspunkt for syntesen. Dersom ikke bare denne syntesen, men også dannelse av andre nukleinsyrer og forlengelsesreaksjonen av denne nydannede nukleinsyre, foregår kontinuerlig, kalles en serie av disse reaksjoner under ett amplifisering.

Den enkelttrådede nukleinsyre som i sin 3'-ende er utstyrt med et område Fl som kan hybridisere til et område Flc i samme kjede, og som etter hybridisering av området Fl til Flc i samme kjede kan danne en løkke som inneholder et område F2c som kan delta i baseparing, er et viktig element ved foreliggende oppfinnelse. En slik enkelttrådet nukleinsyre kan også tilveiebringes ved følgende prinsipp: syntese av en komplementær kjede tillates å forløpe basert på en primer med følgende struktur: 5'-[område Fl/Ri, som hybridiserer til område Flc/Rlc som foreligger i primeren]-[løkkedannende sekvens klargjort for baseparing]-[område Flc/Rlc]-[område med en sekvens som er komplementær til et templat]-3'.

Som området med en sekvens som er komplementær til et templat, fremstilles to nukleotidsekvenser, det vil si én nukleotidsekvens (primer FA) som er komplementær til Fl, og én nukleotidsekvens (primer RA) som er komplementær til Rlc. Nukleotidsekvensen som utgjør nukleinsyren som skal syntetiseres, omfatter en nukleotidsekvens som strekker seg fra området Fl til området Rlc, og en nukleotidsekvens som strekker seg fra området RI til området Flc, og som er komplementær til den første sekvensen. Flc/Rlc og Fl/Rl, som kan hybridiseres til hverandre innen primeren, kan være tilfeldige sekvenser. I et område mellom primerne FA og RA gjøres sekvensen i området Flc/Fl, eventuelt Rlc/Rl, fortrinnsvis forskjellig.

Først utføres syntese av en komplementær kjede ved hjelp av primeren FA fra området Fl i templatnukleinsyren. Deretter klargjøres området Rlc i den syntetiserte komplementære kjede for baseparing, hvoretter den andre primeren hybridiseres her for dannelse av et utgangspunkt for syntese av komplementær kjede. 3'-enden av den komplementære kjede som syntetiseres i dette trinn, har en nukleotidsekvens som er komplementær til primeren FA, som utgjør 5'-enden av den opprinnelig syntetiserte kjede, så denne er utstyrt i sin 3'-ende med området Fl/Rl som hybridiserer til området Flc/Rlc i samme kjede, slik at det dannes en løkke. Den karakteristiske struktur i 3'-enden ifølge foreliggende oppfinnelse dannes således, og den påfølgende reaksjon danner reaksjonssystemet som tidligere er vist som den mest foretrukne utførelse. Oligonukleotidet som hybridiserer til en del av løkken, er i 3'-enden utstyrt med området F2/R2, som er komplementært til området F2c/R2c, som ligger i løkken, og i 5'-enden med området Fl. I det tidligere beskrevne reaksjonssystem ble primerne FA og RA anvendt for syntese av en kjede som er komplementær til templatnukleinsyren, hvorved det dannes en løkkestruktur i 3'-enden av nukleinsyren. I denne fremgangsmåten tilveiebringes endestrukturen som er karakteristisk for foreliggende oppfinnelse ved hjelp av de korte primerne. I denne ut-førelse tilveiebringes på den annen side hele nukleotidsekvensen som utgjør en løkke som en primer, og syntese av denne lengre primeren er nødvendig.

Dersom en nukleotidsekvens som inneholder gjenkjenningsseter for restriksjonsenzymer anvendes som reversprimer, kan en annen utførelse av foreliggende oppfinnelse oppnås. Reaksjonen med en reversprimer som inneholder en gjenkjenningssekvens for et restriksjonsenzym, beskrives spesifikt ved henvisning til figur 6. Når figur 6-(D) er fullført, dannes et kjedebrudd ved et restriksjonsenzym hvis gjenkjenningssete foreligger i reversprimeren. Syntese av komplementær kjede og trådforskyvning innledes med dette kjedebrudd som utgangspunkt for syntesen. Siden reversprimeren foreligger i begge ender av en dobbelttrådet nukleinsyre som utgjør (D), innledes også syntesen av komplementær kjede fra begge ender. Selv om denne utførelsen i bunn og grunn er basert på SDA-fremgangsmåten beskrevet innen teknikkens stand, har nukleotidsekvensen som fungerer som templat en struktur hvor komplementære nukleotidsekvenser er sammenkoblet etter hverandre ifølge foreliggende oppfinnelse, slik at nukleinsyresysternet som særpreger foreliggende oppfinnelse dannes. Et område som fungerer som komplementær kjede til reversprimeren som skal kuttes av restriksjonsenzymet, bør utformes slik at det er innført et dNTP-derivat som gjør den nukleaseresistent, slik at kutting av den dobbelttrådede kjede av restriksjonsenzymet forhindres.

Det er også mulig å innføre en promoter for RNA-polymerase i reversprimeren. Transkripsjon fra begge endene i figur 6-(D) utføres av en RNA-polymerase som gjenkjenner denne pro-moteren, i likhet med den tidligere beskrevne fremgangsmåte hvor SDA-fremgangsmåten ble benyttet.

Nukleinsyren som syntetiseres i foreliggende oppfinnelse, er en enkelttrådet kjede, men den består av delvis komplementære sekvenser, og således foreligger de fleste av disse sekvensene i basepar. Ved anvendelse av denne egenskapen kan det syntetiserte produkt påvises. Ved å utføre fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse i nærvær av et fluorescerende fargestoff, f.eks. et interkalerende stoff spesifikt for dobbelttrådet kjede, slik som etidiumbromid, SYBR Green I eller Pico Green, observeres økende fluorescens etter hvert som mengden produkt øker. Ved å følge fluorescensen er det mulig å følge syntesereaksjonen i sanntid i et lukket system. Anvendelse av denne type deteksjonssystem i PCR-fremgangsmåten omfattes også, men det antas at det vil foreligge mange problemer siden signalet fra produktet ikke kan skilles fra signaler fra primer-dimerer osv. Dersom dette systemet anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse, er imidlertid sannsynligheten for økende mengde uspesifikk baseparing svært lav, og således kan man samtidig forvente både høy følsomhet og lav støy. På tilsvarende måte som for anvendelse av en interkalator spesifikk for dobbelttrådet kjede kan overføring av fluorescensenergi anvendes for en fremgangsmåte for å oppnå et deteksjonssystem i et homogent system.

Fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse understøttes av DNA-polymerasen som utfører syntese av komplementær kjede forbundet med trådforskyvning. I reaksjonen beskrevet ovenfor inngår også et reaksjonstrinn som ikke nødvendigvis krever en polymerase av trådforskyvningstype. For å forenkle systemet og ut fra et økonomisk synspunkt er det imidlertid fordelaktig å anvende én type DNA-polymerase. Som denne DNA-polymerasetypen er følgende enzymer kjent. Videre kan forskjellige mutanter av disse enzymene anvendes i foreliggende oppfinnelse, så lenge de har aktivitet for sekvensavhengig syntese av komplementær kjede og trådforskyvningsaktivitet. Mutantene det vises til heri, omfatter mutanter som kun har en struktur som gir den katalytiske aktivitet som kreves av enzymet, og mutanter med modifisert katalytisk aktivitet, stabilitet eller termostabilitet, f.eks. grunnet mutasjoner av aminosyrene.

Bst-DNA-polymerase,

Bca(ekso)-DNA-polymerase,

DNA-polymerase I-Klenow-fragment,

Vent-DNA-polymerase,

Vent(ekso)-DNA-polymerase (Vent-DNA-polymerase uten eksonukleaseaktivitet),

Deep Vent-DNA-polymerase,

Deep Vent(ekso)-DNA-polymerase (Deep Vent-DNA-polymerase uten eksonukleaseaktivitet),

bakteriofag <I>29-DNA-polymerase,

bakteriofag MS-2-DNA-polymerase,

Z-Taq-DNA-polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.), KOD-DNA-polymerase (Toyobo Co., Ltd.).

Blant disse enzymene er Bst-DNA-polymerase og Bca-(ekso)-DNA-polymerase spesielt foretrukne enzymer, siden de har en viss grad av termostabilitet og høy katalytisk aktivitet. Reaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse kan i en foretrukket utførelse utføres isotermisk, men grunnet justeringen av smeltetemperatur (Tm) osv. er det ikke alltid mulig å anvende temperaturbetingelser som er ønskelige av hensyn til enzymets stabilitet. Følgelig er det en av de ønskede forutsetninger at enzymet er varmestabilt. Selv om den isoterme reaksjon er mulig, kan varmedenaturering utføres for tilveiebringelse av nukleinsyre som det første templat, og også i denne sammenheng utvider anvendelse av et termostabilt enzym mulighetene når det gjelder analysefremgangsmåter.

Vent(ekso)-DNA-polymerase er et enzym som har både trådforskyvningsaktivitet og høy grad av varmestabilitet. Det er kjent at syntese av komplementær kjede som omfatter trådforskyvning ved hjelp av en DNA-polymerase, fremmes ved tilsetning av et enkelttrådbindende protein (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225-232, juli 1998). Dette gjelder for foreliggende oppfinnelse, og ved å tilsette det enkelttrådbindende protein kan økt effektivitet av syntesen av den komplementære tråd forventes. For eksempel er T4-gen 32 effektivt som enkelttrådbindende protein for Vent(ekso)-DNA-polymerase.

For DNA-polymerase uten 3'-5'-eksonukleaseaktivitet er det et kjent fenomen at syntesen av komplementær kjede ikke stopper ved templatets 5'-ende, noe som fører til dannelse av et enbasers overheng. I foreliggende oppfinnelse er dette fenomen ikke å foretrekke, siden sekvensen i 3'-enden fører til innled-ning av neste syntese av komplementær kjede når syntesen av den komplementære kjede når enden. Siden det er svært sannsynlig at basen "A" adderes til 3'-enden av DNA-polymerasen, kan imidlertid sekvensen utvelges slik at syntesen fra 3'-enden starter ved "A", slik at det ikke vil være noe problem dersom ytterligere en base feilaktig innføres med dATP. Videre kan, selv om 3'-enden stikker ut under syntesen av komplementær kjede, 3' —>5'-ekso-nukleaseaktiviteten anvendes for å fjerne den utstikkende ende, slik at enden blir buttendet. Siden f.eks. naturlig Vent-DNA-polymerase har denne aktiviteten, kan dette enzym benyttes i blanding med Vent(ekso)-DNA-polymerase for å løse dette problemet.

Forskjellige reagenser som er nødvendige for fremgangsmåten for syntese eller amplifisering av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse, kan pakkes på forhånd og tilveiebringes som et sett. Nærmere bestemt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et sett som omfatter forskjellige typer oligonukleotider som er nødvendige som primere for syntese av komplementær kjede og som ytre forskyvningsprimere, dNTP som substrat for syntese av komplementær kjede, en DNA-polymerase for utførelse av syntese av komplementær kjede med trådforskyvning, en buffer som gir egnede betingelser for enzymreaksjonen, og etter behov reagenser som er nødvendige for påvisning av synteseprodukter. Nærmere bestemt er tilsetning av reagenser nødvendig under reaksjonen i en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse, og således tilføres reagensene som er nødvendige for én reaksjon etter utpipettering i reaksjonsrør, hvorved reaksjonen kan startes ved kun tilsetning av en prøve. Ved å bygge opp et system hvori reaksjonsproduktet kan påvises in situ i et reaksjonsrør ved å anvende et luminescenssignal eller et fluor-escenssignal, er det ikke nødvendig å åpne og lukke røret etter reaksjonen. Dette er svært gunstig for å forhindre kontaminer-ing.

Nukleinsyren som har komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, syntetisert ifølge foreliggende oppfinnelse, har f.eks. følgende anven-delsesområder. Den første egenskapen er utnyttelse av en fordel som skyldes den spesielle struktur med komplementære sekvenser i et molekyl. Denne egenskapen kan forventes å forenkle påvis-ningen. Det vil si at det finnes et kjent system for påvisning av nukleinsyre hvori signalet varierer, avhengig av baseparing med en komplementær nukleotidsekvens. Med f.eks. kombinasjon med fremgangsmåten for anvendelse av en interkalator spesifikk for dobbelttrådet kjede som detektor, som beskrevet ovenfor, kan et deteksjonssystem som fullt ut utnytter egenskapene til synteseproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse realiseres. Dersom synteseproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse én gang varme-denatureres i deteksjonssystemet og får vende tilbake til den opprinnelige temperatur, vil intramolekylær hybridisering fortrinnsvis opptre, noe som tillater hurtig baseparing mellom komplementære sekvenser. Dersom det foreligger uspesifikke reaksjonsprodukter, vil disse ikke ha komplementære sekvenser i molekylet, slik at de etter varmedenaturering separeres i to eller flere molekyler, disse kan ikke umiddelbart vende tilbake til den opprinnelige dobbelttrådede kjede. Ved å innføre et trinn med varmedenaturering før deteksjonen, kan støy som skyldes den uspesifikke reaksjon reduseres. Dersom det benyttes en DNA-polymerase som ikke er varmeresistent, vil varmedenatu-reringstrinnet stanse reaksjonen, noe som er fordelaktig for kontroll av reaksjonstemperaturen.

Den andre egenskapen er at det alltid dannes en løkke som er i stand til baseparing. Strukturen til en løkke i stand til baseparing er vist i figur 4. Som vist i figur 4, består løkken av nukleotidsekvensen F2c , som kan hybridisere til primeren, og en nukleotidsekvens som ligger mellom F2c og Flc. Sekvensen mellom F2c og Flc er en nukleotidsekvens avledet fra templatet. Dersom en probe med en komplementær nukleotidsekvens hybridiseres til dette området, er følgelig templatspesifikk påvisning mulig. I tillegg er dette området alltid tilgjengelig for baseparing, og varmedenaturering før hybridiseringen er således ikke nødvendig. Nukleotidsekvensen som danner en løkke i amplifiseringsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse, kan ha en tilfeldig valgt lengde. Dersom hybridisering med en probe er ønskelig, arrangeres følgelig et område som skal hybridisere til primeren og et område som skal hybridisere til proben separat fra hverandre for å hindre konkurranse mellom disse, hvorved ideelle reaksjonsbetingelser kan oppnås.

Ifølge en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse foreligger et stort antall løkker som er i stand til baseparing i en enkelt nukleinsyretråd. Dette betyr at et stort antall prober kan hybridiseres til ett nukleinsyremolekyl, noe som tillater svært følsom påvisning. Det er således mulig ikke bare å realisere forbedret følsomhet, men også en fremgangsmåte for påvisning av nukleinsyre basert på et spesielt reaksjons-prinsipp, f.eks. aggregering. For eksempel tilsettes en probe immobilisert til fine partikler, f.eks. polystyrenlateks, til reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse, og aggregering av latekspartiklene observeres etter hvert som hybridisering av produktet til proben skjer. Svært følsom og kvantitativ observasjon er mulig ved optisk måling av aggregeringsgraden. Siden aggregeringen også kan observeres med det blotte øyet, kan et reaksjonssystem som ikke benytter et optisk måleinstrument, også fremstilles.

Videre muliggjør reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse som tillater binding av mange merkede grupper pr. nukleinsyremolekyl, kromatografisk påvisning. Innen feltet immunanalyse, benyttes en analytisk fremgangsmåte (immunkromato-grafi) som anvender et kromatografimedium og synlig påvisbar merking i praksis. Denne fremgangsmåten bygger på prinsippet at en forbindelse som skal analyseres, bindes mellom et antistoff immobilisert til et kromatografimedium og et merket antistoff, og ikke-reagert, merket bestanddel vaskes bort. Reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse gjør dette prinsipp anvendbart for analyse av nukleinsyrer. Det vil si at en merket probe rettet mot en del av en løkke fremstilles og immobiliseres til et kromatografimedium for fremstilling av en innfangingsprobe for innfanging, noe som tillater analyse i kromatografi-mediet. Som innfangingsprobe kan en sekvens som er komplementær til en del av løkken benyttes. Siden reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse har et stort antall løkker, bindes produktet til et stort antall merkede prober, noe som gir et signal som kan observeres med øyet.

Reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse, som alltid har et område som foreligger som en løkke i stand til baseparing, muliggjør et bredt utvalg av andre deteksjons-systerner. For eksempel er et deteksjonssystem som benytter over-flateplasmonresonans og anvendelse av en immobilisert probe for dette løkkeområdet, mulig. Dersom en probe for løkkeområdet er merket med en interkalator spesifikk for dobbeltkjede, kan videre en mer følsom fluorescensanalyse utføres. Alternativt er det også mulig å positivt utnytte evnen til nukleinsyren syntetisert ifølge foreliggende oppfinnelse til å danne en løkke i stand til baseparing i både 3'- og 5'-ende. For eksempel utformes en løkke slik at den har en felles nukleotidsekvens mellom en normal type og en unormal type, mens den andre løkken utformes slik at det dannes en forskjell mellom disse. Det er mulig å oppbygge et spesielt analysesystem hvori nærvær av et gen bekreftes med proben for den felles del, mens nærvær av en unormalitet bekreftes i det andre området. Siden reaksjonen for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse også kan forløpe isotermisk, er det en svært viktig fordel at sanntids-analyse kan oppnås med et vanlig fluorescensfotometer. For dette formål er en nukleinsyrestruktur med hybridisering innen samme kjede kjent. Imidlertid er nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, erholdt ifølge foreliggende oppfinnelse, ny i og med at den inneholder et stort antall løkker som er i stand til baseparing med andre oligonukleotider.

På den annen side kan det store antall løkker som dannes av reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse, i seg selv anvendes som prober. I f.eks. en DNA-brikke bør prober oppsamles i høy tetthet i et begrenset område. Innen teknikkens stand er imidlertid antall oligonukleotider som kan immobiliseres til et gitt område, begrenset. Ved anvendelse av reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse kan således et stort antall prober i stand til hybridisering immobiliseres med høy tetthet. Følgelig kan reaksjonsproduktet ifølge foreliggende oppfinnelse immobiliseres som prober på en DNA-brikke. Etter amplifiseringen kan reaksjonsproduktet immobiliseres ved enhver teknikk kjent innen faget, eller det immobiliserte oligonukleotid anvendes som oligonukleotid i amplifiseringsreaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, noe som fører til dannelse av immobilisert reaksjonsprodukt. Ved anvendelse av den således immobiliserte probe kan et stort antall prøve-DNA hybridiseres innen et begrenset område, og som et resultat av dette kan kraftige signaler forventes.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er en illustrasjon av punktene (l)-(4) i reaksjonsprinsippet i en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse. Figur 2 er en illustrasjon av punktene (5)-(7) i reaksjonsprinsippet i en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse. Figur 3 er en illustrasjon av punktene (8)-(10) i reaksjonsprinsippet i en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse. Figur 4 er en illustrasjon av strukturen til en løkke dannet av den enkelttrådede nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse . Figur 5 er en illustrasjon av punktene (A)-(B) i en basal utførelse av foreliggende oppfinnelse. Figur 6 er en illustrasjon av punktene (C)-(D) i en basal utførelse av foreliggende oppfinnelse. Figur 7 er en figur som viser den relative plassering av nukleotidsekvensene som utgjør et oligonukleotid i målnukleotidsekvensen i M13mpl8. Figur 8 er et fotografi som viser resultatet av agarosegelelektroforese av et produkt erholdt ved fremgangsmåten for syntese av enkelttrådet nukleinsyre med M13mpl8 som templat ifølge foreliggende oppfinnelse.

Spor 1: XIV-størrelsesmarkør.

Spor 2: 1 fmol M13mpl8-dsDNA.

Spor 3: intet templat.

Figur 9 er et fotografi som viser resultatet av agarosegelelektroforese av et restriksjonsenzymkuttet erholdt i eksempel 1 ved nukleinsyresyntesereaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Spor 1: XIV-størrelsesmarkør.

Spor 2: BamHI-kuttet, renset produkt.

Spor 3: PvuII-kuttet, renset produkt.

Spor 4: Hindlll-kuttet, renset produkt.

Figur 10 er et fotografi som viser resultatet av agarosegelelektroforese av et produkt erholdt ved fremgangsmåten for syntese av enkelttrådet nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse, ved anvendelse av M13mpl8 som templat i nærvær av betain. 0, 0,5, 1 og 2 angir konsentrasjonen (M) av betain tilsatt til reaksjonsblandingen. N angir den negative kontroll, og

-21 angir konsentrasjonen IO<-21>mol av templat-DNA.

Figur 11 er en figur som viser den relative plassering av nukleotidsekvensene som utgjør et oligonukleotid i en målnukleotidsekvens avledet fra HVB. Figur 12 er et fotografi som viser resultatet av agarosegelelektroforese av et produkt erholdt ved fremgangsmåten for syntese av enkelttrådet nukleinsyre ifølge foreliggende opp finnelse, hvori HBV-M13mpl8 integrert i M13mpl8 ble anvendt som templat.

Spor 1: XIV-størrelsesmarkør.

Spor 2: 1 fmol HBV-M13mpl8-dsDNA.

Spor 3: ingen målsekvens.

Figur 13 er et fotografi som viser resultatet av gel-elektroforese av et alkalidenaturert produkt erholdt ifølge fremgangsmåten for syntese av enkelttrådet nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse.

Spor 1: Hindlll-kuttet bakteriofag lambda.

Spor 2: Reaksjonsproduktet fra eksempel 1.

Spor 3: Reaksjonsproduktet fra eksempel 3.

Figur 14 er et fotografi som viser resultatet av agarosegelelektroforese av et produkt erholdt ved fremgangsmåten for syntese av enkelttrådet nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori konsentrasjonen av M13mpl8 som målsekvens ble variert. Øvre og nedre fotografi viser reaksjonsproduktet etter 1 henholdsvis 3 timer.

Spor 1: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-15>mol/rør.

Spor 2: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-16>mol/rør.

Spor 3: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-17>mol/rør.

Spor 4: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-18>mol/rør.

Spor 5: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-19>mol/rør.

Spor 6: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-20>mol/rør.

Spor 7: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-21>mol/rør.

Spor 8: M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-22>mol/rør.

Spor 9: ingen målsekvens.

Spor 10: XIV-størrelsesmarkør.

Figur 15 er en figur som viser posisjonen til en mutasjon og plasseringen av de forskjellige områdene relativt til en målnukleotidsekvens (mål). Understreket guanin er erstattet med adenin i mutanten. Figur 16 er et fotografi som viser resultatet av agarosegelelektroforese av et produkt erholdt ved amplifiseringsreaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse.

M: 100 bp stige (New England Biolabs).

N: intet templat (rent vann) .

WT: 1 fmol villtypetemplat M13mpl8.

MT: 1 fmol mutanttemplat M13mpl8FM.

Figur 17 er en figur som viser den relative plassering av nukleotidsekvensene som utgjør et oligonukleotid i en nukleotidsekvens som koder for mål-mRNA. Figur 18 er et fotografi som viser resultatet av agarosegelelektroforese av et produkt erholdt ved fremgangsmåten for syntese av enkelttrådet nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av mRNA som målsekvens.

Den beste utførelse av oppfinnelsen

Eksempel 1

Amplifisering av et område i M13mpl8

Fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre med komplementære kjeder sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede ifølge foreliggende oppfinnelse ble forsøkt ved anvendelse av M13mpl8 som templat. Fire typer primere, nemlig M13FA, M13RA, M13F3 og M13R3, ble anvendt i eksperimentet. M13F3 og M13R3 var ytre primere for forskyvning av den første nukleinsyre erholdt med M13FA henholdsvis M13RA som utgangspunkt for syntesen. Siden de ytre primere er primere som fungerer som utgangspunkt for syntese av komplementær kjede etter syntese med M13FA (eller M13RA), ble disse utformet slik at de hybridiserer til et område som støter opp mot M13FA (eller M13RA) ved hjelp av fenomenet tilgrensende stabling. Videre ble det benyttet høy konsentrasjon av disse primere, slik at hybridisering av M13FA (eller M13RA) fortrinnsvis skjedde.

Nukleotidsekvensen som utgjør hver primer, er som vist i sekvenslisten. Primernes strukturelle egenskaper er oppsummert nedenfor. Videre er plasseringen av de forskjellige områdene relativ til målnukleotidsekvensen (målet) vist i figur 7.

Primer: område i 5'-ende/område i 3'-ende.

M13FA: det samme som område Flc i komplementær kjede syntetisert fra Ml3FA/komplementært til området F2c i M13mpl8.

M13RA: det samme som område Rlc i komplementær kjede syntetisert fra Ml3RA/komplementært til området R2c i komplementær kjede syntetisert fra Ml3FA.

M13F3: komplementært til F3c, som støter opp mot 3'-enden av området F2c i M13mpl8.

M13R3: komplementært til R3c, som støter opp mot 3'-enden av området F2c i den komplementære kjede syntetisert fra M13FA.

Ved hjelp av slike primere syntetiseres nukleinsyre hvori et område som strekker seg fra Flc til Rlc i M13mpl8 og den komplementære nukleotidsekvens er sammenkoblet etter hverandre, ved hjelp av en løkkedannende sekvens som inneholder F2c i en enkelttrådet kjede. Sammensetningen av en reaksjonsblanding for fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ved hjelp av disse primere ifølge foreliggende oppfinnelse er vist nedenfor.

Sammensetning av reaksjonsblandingen ( i 25 u. 1) :

20 mM Tris-HCl, pH 8,8

10 mM KC1

10 mM (NH4)2S04

6 mm MgS04

0,1 % Triton X-100

5 % dimetylsulfoksid (DMSO)

0,4 mM dNTP.

Primere:

800 nM M13FA/SEQ ID NO: 1.

800 nM M13RA/SEQ ID NO: 2.

200 nM M13F3/SEQ ID NO: 3.

200 nM M13R3/SEQ ID NO: 4.

Målsekvens:

M13mpl8-dsDNA/SEQ ID NO: 5.

Reaksjon: Den ovenfor beskrevne reaksjonsblanding ble oppvarmet til 95 °C i 5 minutter, og målsekvensen ble denaturert til en enkelttrådet kjede. Reaksjonsblandingen ble overført til iskaldt vann, og 4 U Bst-DNA-polymerase (New England Biolabs) ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 65 °C i 1 time. Etter reaksjonen ble reaksjonen stanset ved 80 °C i 10 minutter og igjen overført til iskaldt vann.

Bekreftelse av reaksjonen: 1 u.1 påsetningsbuf f er ble tilsatt til 5 u.1 av reaksjonsblandingen ovenfor, og prøven ble fraksjonert ved elektroforese i 1 time ved 80 mV i 2 % agarosegel (0,5 % TBE). Som molekylvektmarkør ble XIV (100 bp stige, Boehringer Mannheim) anvendt. Etter elektroforesen ble gelen farget med SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) for å bekrefte nærvær av nukleinsyren. Resultatene er vist i figur 8. Sporene tilsvarer følgende prøver:

1. XIV-størrelsesmarkør.

2. 1 fmol M13mpl8-dsDNA.

3. Ingen målsekvens.

I spor 3 kunne intet bånd observeres, bortsett fra at de ikke-reagerte primere ble farget. I spor 2 i nærvær av målsekvensen ble produktene observert som en stige av bånd med liten størrelse, som utstrukket farging ved høy størrelse og som et bånd som knapt nok gikk inn i gelen. Blant båndene med liten størrelse stemmer båndene i området 290 bp og 450 bp med det forventede produkt i syntesereaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, det vil si dobbelttrådede kjeder av SEQ ID NO: 11 og 12 (tilsvarende dobbelttrådede kjeder dannet som vist i figurene 2-(7) og 2-(10)), og en enkelttrådet kjede av SEQ ID NO: 13 (tilsvarende den lange enkelttrådede kjede i figur 3-(9)), og det ble således bekreftet at reaksjonen forløper som forventet. Det ble beregnet at elektroforeseresultatene når det gjaldt det utstrukne mønster ved høy størrelse og båndet som ikke gikk inn i gelen skyldtes at denne reaksjonen i bunn og grunn var en kontinuerlig reaksjon som tillot varierende molekylvekt av reaksjonsproduktet, og videre siden produktet har en komplisert struktur med en delvis enkelttrådet kjede og et dobbelttrådet kompleks.

Eksempel 2

Bekreftelse av reaksjonsproduktene ved kutting med restriksjonsenzymer

For å klargjøre strukturen til nukleinsyren med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, erholdt i eksempel 1 ifølge foreliggende oppfinnelse, ble produktene kuttet med restriksjonsenzymer. Dersom de teoretisk forventede produkter dannes ved kutting med restriksjonsenzymer, og samtidig det utstrukne mønster ved høy størrelse og båndet som ikke gikk inn i gelen, som observert i eksempel 1, forsvinner, kan det antas at alle disse produkter er nukleinsyren med komplementære sekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, syntetisert ifølge foreliggende oppfinnelse.

Reaksjonsblandingen (200 u.1) fra 8 rør i eksempel 1 ble slått sammen og renset ved behandling med fenol og utfelling med etanol. Det utfelte materialet ble gjenvunnet og igjen løst i 200 ul TE-buffer, og uttak på 10 ul ble kuttet ved 37 °C i 2 timer med restriksjonsenzymene BamHI, PvuII henholdsvis Hindlll. Reaksjonsproduktet ble fraksjonert ved elektroforese i 1 time ved 80 mV i en 2 % agarosegel (0,5 % TBE). Som molekylvektmarkør ble Super Ladder-Low (100 bp stige) (Gensura Laboratories, Inc.) anvendt. Etter elektroforese ble gelen farget med SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) for påvisning av nukleinsyrer. Resultatene er vist i figur 9. Sporene tilsvarer følgende prøver:

1. XIV-størrelsesmarkør.

2. Renset produkt kuttet med BamHI.

3. Renset produkt kuttet med PvuII.

4. Renset produkt kuttet med Hindlll.

Det antas at nukleotidsekvenser som utgjør relativt korte amplifiseringsprodukter, er sekvensene ifølge SEQ ID

NO: 13, 14, 15 og 16. Fra disse nukleotidsekvensene er den forventede størrelse av fragmentene erholdt med restriksjonsenzymene som vist i tabell 1. "L" i tabellen angir at posisjonen etter elektroforese ikke er fastslått, siden L er et fragment som inneholder en løkke (enkelttrådet kjede).

(11, 15: ikke bekreftet)

Siden nesten alle båndene som forelå før kuttingen ble overført til bånd med forventet størrelse, ble det bekreftet at de ønskede reaksjonsprodukter var dannet. Det ble videre vist at det forelå ingen eller bare små mengder uspesifikke produkter.

Eksempel 3

Fremming av amplifiseringsreaksjonen ved tilsetning av betain

Et eksperiment for å undersøke virkningen av betain (N,N,N-trimetylglysin, Sigma) tilsatt til amplifiserings-reaks j onsblandingen for amplifisering av nukleinsyre ble utført. Syntese av nukleinsyren med komplementære kjeder sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede ifølge foreliggende oppfinnelse ble utført ved anvendelse av M13mpl8 som templat, på tilsvarende måte som i eksempel 1, men i nærvær av betain i forskjellige konsentrasjoner. Primerne som ble anvendt i eksperimentet, var identiske med primerne anvendt i eksempel 1. Mengden templat-DNA var IO<-21>mol (M13mpl8) og vann ble anvendt som negativ kontroll. Betain ble tilsatt i konsentrasjoner på 0, 0,5, 1 og 2 M til reaksjonsblandingen. Sammensetningen av reaksjonsblandingen er vist nedenfor.

Sammensetning av reaks jonsblandingen ( i 25 u. 1) :

20 mM Tris-HCl, pH 8,8

4 mm MgS04

0,4 mM dNTP

10 mM KC1

10 mM (NH4)2S04

0,1 % Triton X-100.

Primere:

800 nM M13FA/SEQ ID NO: 1.

800 nM M13RA/SEQ ID NO: 2.

200 nM M13F3/SEQ ID NO: 3.

200 nM M13R3/SEQ ID NO: 4.

Målsekvens:

M13mpl8-dsDNA/SEQ ID NO: 5.

Polymerase, reaksjonsbetingelser og betingelser for elektroforese etter reaksjonen var som beskrevet i eksempel 1.

Resultatene er vist i figur 10. I reaksjonen i nærvær av betain i en konsentrasjon på 0,5 eller 1,0 M ble mengden amplifiseringsprodukt forhøyet. Dersom konsentrasjonen ble økt til 2,0 M, ble videre ingen amplifisering observert. Det ble således vist at amplifiseringsreaksjonen ble fremmet i nærvær av betain i egnet konsentrasjon. Den antatte grunn til at mengden amplifiseringsprodukt avtok når konsentrasjonen av betain var 2 M, er at Tm ble redusert for mye.

Eksempel 4

Amplifisering av HBV- gensekvens

Fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse ble forsøkt med M13mpl8-dsDNA med en delsekvens fra HBV-genet integrert som templat. Fire typer primere, HB65FA (SEQ ID NO: 6), HB65RA (SEQ ID NO: 7), HBF3 (SEQ ID NO: 8) og HBR3 (SEQ ID NO: 9), ble anvendt i eksperimentet. HBF3 og HBR3 var ytre primere for forskyvning av den første nukleinsyre erholdt med HB65FA henholdsvis HB65RA som utgangspunkt for syntese. Siden de ytre primere er primere som fungerer som utgangspunkt for syntese av komplementær kjede etter syntese med HB65FA (eller HB65RA), ble disse utformet slik at de hybridi-serte til et område som støter opp mot HB65FA (eller HB65RA) ved hjelp av fenomenet tilgrensende stabling. Videre ble det benyttet høye konsentrasjoner av disse primere, slik at hybridisering av HB65FA (eller HB65RA) fortrinnsvis skjedde. Målsekvensen (430 bp) i dette eksempel, avledet fra HBV integrert i M13mpl8, er vist i SEQ ID NO: 10.

Nukleotidsekvensen som utgjorde hver primer, er vist i sekvenslisten. De strukturelle egenskaper til hver av primerne er oppsummert nedenfor. Videre er plasseringen av områdene relativt til målnukleotidsekvensen (målet) vist i figur 11.

Primer: område i 5'-ende/område i 3'-ende.

HB65FA: det samme som område Flc i komplementær kjede syntetisert fra HB65FA/komplementært til området F2c i HBV-M13mpl8.

HB65RA: det samme som område Rlc i komplementær kjede syntetisert fra HB65RA/komplementært til om-

rådet R2c i komplementær kjede syntetisert fra HB65FA.

HBF3: komplementært til F3c, som støter opp mot 3'-enden av området F2c i HBV-M13mpl8.

HBR3: komplementært til R3c, som støter opp mot 3'-enden av området F2c i komplementær kjede syntetisert fra HB65FA.

Ved anvendelse av slike primere syntetiseres nukleinsyre hvori et området som strekker seg fra Flc til Rlc i M13mpl8 (HBV-M13mpl8), med en delsekvens fra HBV-genet integrert deri, og den komplementære nukleotidsekvens er sammenkoblet etter hverandre via en løkkedannende sekvens som inneholder F2c i en enkelttrådet kjede. Reaksjonen ble utført under samme betingelser som i eksempel 1, bortsett fra at primerne beskrevet ovenfor ble anvendt, og reaksjonsproduktet ble analysert ved agarosegel-elektrof orese . Resultatene er vist i figur 12. Sporene tilsvarer følgende prøver:

1. XIV-størrelsesmarkør.

2. 1 fmol HBV-M13mpl8-dsDNA.

3. Ingen målsekvens.

På samme måte som i eksempel 1 ble produkter kun observert i nærvær av målsekvensen som en stige av bånd med lav størrelse, som utstrakt farging ved høy størrelse og som et bånd som knapt nok vandret inn i gelen (spor 2). Blant båndene med lav størrelse stemmer båndene i området 310 bp og 480 bp med de forventede produkter fra syntesereaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse, det vil si dobbelttrådede kjeder av SEQ ID NO: 17 og 18, og det ble således bekreftet at reaksjonen forløper som forventet. Som beskrevet i resultatene i eksempel 1, ble det antatt at det utstrakte mønster ved høy størrelse og båndet som ikke vandret inn i gelen skyldtes strukturen av synteseproduktet som særpreger foreliggende oppfinnelse. Fra dette eksperiment ble det bekreftet at foreliggende oppfinnelse kan utføres selv om en annen sekvens (målsekvens) anvendes for amplifiseringen.

Eksempel 5

Bekreftelse av størrelsene av syntesereaksjonsproduktene

For å bekrefte strukturen av nukleinsyren syntetisert ifølge foreliggende oppfinnelse ble lengden analysert ved elek troforese under alkalidenaturerende betingelser. 1 u.1 alkalisk påsetningsbuf f er ble tilsatt til 5 u.1 av hver reaks jonsblanding i nærvær av målsekvensen i eksempel 1 eller 4 og fraksjonert ved elektroforese ved 50 mA i 0,7 % agarosegel (50 mM NaOH, 1 mM EDTA) i 14 timer. Som molekylvektstørrelsesmarkør ble Hindlll-kuttet bakteriofag lambda anvendt. Etter elektroforesen ble gelen nøytralisert med 1 M Tris, pH 8, og farget med SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) for å påvise nukleinsyren. Resultatene er vist i figur 13. Sporene tilsvarer følgende prøver:

1. Hindlll-kuttet bakteriofag lambda.

2. Reaksjonsproduktet fra eksempel 1.

3. Reaksjonsproduktet fra eksempel 4.

Ved elektroforese av reaksjonsproduktet under alkalidenaturerende betingelser kunne størrelsen i enkelttrådet tilstand bekreftes. Det ble bekreftet at størrelsen av hovedproduk-tene i både eksempel 1 (spor 2) og eksempel 4 (spor 3) var på rundt 2 kbaser. Det viste seg videre at produktet ifølge foreliggende oppfinnelse var forlenget til en størrelse på opptil minst 6 kilobaser eller mer, innenfor området som kunne bekreftes ved denne analysen. I tillegg ble det igjen bekreftet at bånd som ikke vandret inn i gelen under ikke-denaturerende betingelser i eksemplene 1 og 4 ble separert i separate enkelttrådede kjeder med mindre størrelse i denaturert tilstand.

Eksempel 6

Bekreftelse av amplifisering avhengig av konsentrasjonen av målsekvens ved amplifisering av et område i M13mpl8

Virkningen av å variere konsentrasjonen av målsekvensen på fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse ble undersøkt. Fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse ble utført under samme betingelser som i eksempel 1, bortsett fra at mengden M13mpl8-dsDNA som målsekvens var fra 0 til 1 fmol, og at reaksjonstiden var 1 time eller 3 timer. På tilsvarende måte som i eksempel 1 ble produktet fraksjonert ved elektroforese i 2 % agarosegel (0,5 % TBE) og farget med SYBR Green I (Molecular Probes, Inc.) for påvisning av nukleinsyren. Som molekylvekt-markør ble XIV (100 bp stige, Boehringer Mannheim) anvendt. Resultatene er vist i figur 14 (øvre fotografi: 1 times reaksjon, nedre fotografi: 3 timers reaksjon). Sporene tilsvarer følgende prøver:

1. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-15>mol/rør.

2. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-16>mol/rør.

3. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-17>mol/rør.

4. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-18>mol/rør.

5. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-19>mol/rør.

6. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-20>mol/rør.

7. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-21>mol/rør.

8. M13mpl8-dsDNA 1 x IO<-22>mol/rør.

9. Ingen målsekvens.

10. XIV-størrelsesmarkør.

Et bånd som er felles for sporene, opptrer i den nedre del av elektroforeseprofilen og viser ikke-reagerte, fargede primere. Uavhengig av reaksjonstiden kunne ingen amplifiseringsprodukter observeres i fravær av målsekvens. Et fargingsmønster for amplifiseringsproduktet som varierte med konsentrasjonen av målsekvens, ble kun erholdt i nærvær av målsekvensen. Videre kunne amplifiseringsproduktet observeres ved lavere konsentrasjoner når reaksjonstiden ble forlenget.

Eksempel 7

Påvisning av en punktmutasjon

(1) Fremstilling av M13mpl8FM ( mutant)

Det anvendte mål-DNA var M13mpl8 (villtype) og M13mpl8FM (mutant). For konstruksjon av mutanten M13mpl8FM ble "LA-PCR" in vitro-mutagenesesett (Takara Shuzo Co., Ltd.) anvendt for å erstatte et nukleotid med et annet. Deretter ble sekvensen bekreftet ved sekvensering. Sekvensen av Fl-området er vist nedenfor:

Villtype: CCGGGGATCCTCTAGAGTCG (SEQ ID NO:19)

Mutant: CCGGGGATCCTCTAGAGTCA (SEQ ID NO:20)

(2) Utforming av primere

FA-primerne som ble anvendt for villtype og mutant, forelå i 5'-enden av Flc-områdene med forskjellige nukleotid sekvenser. Plasseringen av mutasjonen og plasseringen av de forskjellige områdene relativt til målnukleotidsekvensen (målet) er vist i figur 15.

(3) Amplifiseringsreaksjon

Et eksperiment ble utført for å undersøke hvorvidt templatspesifikk amplifiseringsreaksjon skjer ved anvendelse av en kombinasjon av de spesifikke primere vist nedenfor og anvendelse av M13mpl8 (villtype) og M13mpl8FM (mutant) som målsekven-ser.

Primere benyttet for villtypeamplifisering: FAd4, RAd4, F3, R3

Primersett for amplifisering av mutant: FAMd4, RAd4, F3, R3

Primernes nukleotidsekvens er som følger:

(4) Påvisning av punktmutasjonen i M13mpl8 Reaksjonsblandingens sammensetning er som følger: SluttkonsentrasjonD2W3,75 ul 10 x Thermo pol buffer (NEB) 2,5 u.1 20 mM Tris-HCl, pH 8,8

10 mM KC1

10 mm (NH4)2S04

6 mM MgS04

0,1 % Triton X-100

2,5 mM dNTP 4 ul 400 uM

100 mM MgS040,5 ul

4 M betain 6,25 u.1 IM

Ml3FAd4-primer (10 pmol/u.1)

eller

M13FAMd4-primer (10 pmol/u.1) 2 u.1 800 nM

Ml3RAd4-primer (10 pmol/u.1) 2 u.1 800 nM

M13F3-primer (10 pmol/u.1) 0,5 u.1 200 nM

M13R3-primer (10 pmol/u.1) 0,5 u.1 200 nM

Totalvolum 22 u.1

1 fmol (2 u.1) av målsekvensen M13mpl8 eller M13mpl8FM ble tilsatt til reaksjonsblandingen og oppvarmet til 95 °C i 5 minutter, hvorved målsekvensen ble denaturert til en enkelttrådet kjede. Reaksjonsblandingen ble overført til iskaldt vann, og 1 u.1 (8 U) Bst-DNA-polymerase (New England Biolabs) ble tilsatt og inkubert i 1 time ved 68 °C eller 68,5 °C. Etter reaksjonen ble reaksjonen stanset ved 80 °C i 10 minutter, og reaksjonsblandingen ble igjen overført til iskaldt vann.

Som vist i figur 16, ble effektiv amplifisering når FAd4 for villtype ble anvendt som FA-primer kun observert i nærvær av villtypetemplat. Dersom derimot FAMd4 for mutant ble anvendt som FA-primer, ble effektiv amplifisering kun observert i nærvær av mutant templat.

Fra resultatene beskrevet ovenfor ble det vist at punktmutasjonen kunne påvises effektivt ved anvendelse av amplifiseringsreaksjonen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 8

Amplifiseringsreaksjon med mRNA som målsekvens

Fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse ble forsøkt ved anvendelse av mRNA som mål-nukleinsyre. For fremstilling av mål-mRNA ble prostatacancer-cellelinjen LNCaP (ATCC nr. CRL-1740), som uttrykker prostata-spesifikt antigen (PSA), blandet med den kroniske myeloid-leukemicellelinjen K562 (ATCC nr. CCL-243) som ikke-uttrykkende celler i forhold fra 1:10<6>til 100:IO<6>, etterfulgt av ekstraksjon av total-RNA ved anvendelse av RNeasy Mini-sett fra Qiagen

(Tyskland). Fire typer primere, nemlig PSAFA, PSARA, PSAF3 og PSAR3, ble anvendt i eksperimentet. PSAF3 og PSAR3 er ytre primere for forskyvning av den første nukleinsyre som erholdes med PSAFA henholdsvis PSARA som utgangspunkt for syntesen. Videre ble det benyttet høye konsentrasjoner av disse primere, slik at hybridisering av PSAFA (eller PSARA) fortrinnsvis skjedde. De forskjellige primeres nukleotidsekvens er som følger:

Primer:

Primernes strukturelle egenskaper er oppsummert nedenfor. Videre er plasseringen av hver primer relativ til DNA-nukleotidsekvensen som koder for mål-mRNA og gjenkjenningsseter for restriksjonsenzymet Sau3AI vist i figur 17.

Primer: område i 5'-ende/område i 3'-ende.

PSAFA: det samme som område Flc i komplementær kjede syntetisert fra PSAFA/komplementært til området F2c i målnukleotidsekvensen.

PSARA: det samme som område Rlc i komplementær kjede syntetisert fra PSARA/komplementært til området R2c i komplementær kjede syntetisert fra PSAFA.

PSAF3: komplementært til F3c, som støter opp mot 3'-enden av området F2c i målnukleotidsekvensen.

PSAR3: komplementært til R3c, som støter opp mot 3'-enden av området R2c i den komplementære

kjede syntetisert fra PSAFA.

Sammensetningen av en reaksjonsblanding for fremgangs-åten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse er som følger:

Sammensetning av reaks jonsblandingen ( i 25 u. 1) :

20 mM Tris-HCl, pH 8,8

4 mM MgS04

0,4 mM dNTP

10 mM KC1

10 mM (NH4) 2S04

0,1 % Triton X-100

0,8 M betain

5 mM DTT

1600 nM PSAFA- & PSARA-primer

200 nM PSAF3- & PSAR3-primer

8 U Bst-DNA-polymerase

100 U Rever Tra Ace (Toyobo Co., Ltd., Japan)

5 u.g total-RNA.

Alle bestanddeler ble sammenblandet på is. I dette eksperimentet anvendes mRNA (enkelttrådet kjede) som målsekvens, og trinnet for dannelse av enkelttrådet kjede ved varmedenaturering er således ikke nødvendig. Reaksjonen ble utført ved 65 °C i 45 minutter, og reaksjonen ble stanset ved 85 °C i 5 minutter. Etter reaksjonen ble 5 u.1 av reaks jonsblandingen fraksjonert ved elektroforese i 2 % agarose og påvist med SYBR Green I.

Resultatene er vist i tabell 18. Sporene tilsvarer følgende prøver: 9 Sau3AI-kutting av et uttak på 1 u.1 av reaks jonsblandingen i spor 7

10 Størrelsesmarkør, 100 bp sstige (New England Biolabs)

I fravær av enten Bst-DNA-polymerase eller Rever Tra Ace kunne intet amplifiseringsprodukt erholdes (sporene 1-4). I nærvær av begge enzymer ble et amplifiseringsprodukt påvist (sporene 5-7) dersom RNA avledet fra LNCaP forelå. RNA ekstra-hert fra én LNCaP-celle/1 million K562-celler kunne påvises (spor 6). Ved kutting av amplifiseringsproduktet i gjenkjen-ningssetet for restriksjonsenzymet Sau3AI inne i målsekvensen ble produktet kuttet til et fragment av forventet størrelse (sporene 8 og 9).

Fra resultatene beskrevet ovenfor ble det bekreftet at det ønskede reaksjonsprodukt kan erholdes i fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse, selv dersom RNA anvendes som målsekvens.

Industriell anvendbarhet

Ved hjelp av det nye oligonukleotid ifølge foreliggende oppfinnelse og fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ved anvendelse av oligonukleotidet tilveiebringes en fremgangsmåte for syntese av nukleinsyre med komplementære nukleotidsekvenser, sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede uten at det kreves komplisert temperaturkontroll. En komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse som primer fungerer som utgangspunkt for syntese av en ny komplementær kjede med 3'-enden av den syntetiserte kjede som templat. Dette oppnås ved dannelse av en løkke som gir hybridisering av en ny primer, og et produkt fra syntesen av komplementær kjede med den tidligere syntetiserte kjede som templat forskyves igjen ved syntese av en komplementær kjede fra løkken og klargjøres for baseparing. Den således erholdte nukleinsyre, syntetisert med seg selv som templat, kombineres med f.eks. en kjent fremgangsmåte for syntese av nukleinsyrer, f.eks. SDA, for å gi forbedret effektivitet av nukleinsyresyntesen.

Ifølge ytterligere en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en ny fremgangsmåte for syntese av nukleinsyre som gir forbedret effektivitet relativt til kjente fremgangsmåter for syntese av nukleinsyrer, som ikke krever komplisert temperaturkontroll, som kan forventes å gi høy amplifiseringseffektivitet, og som kan oppnå høy spesifisitet. Det vil si at oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes på en templatkjede på den komplementære kjede, hvorved nukleinsyre med komplementære sekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede kan syntetiseres suksessivt. Denne reaksjonen fortsetter teoretisk inntil utgangsmaterialet som er nødvendig for syntesen er oppbrukt, og i løpet av reaksjonen fortsetter ny nukleinsyre hvor syntesen innledes fra løkken å dannes. Forlengelse av oligonukleotidet som har hybridisert til løkken, gir en trådforskyvning for erholdelse av 3'-0H for forlengelse av lang enkelttrådet nukleinsyre (det vil si nukleinsyre med flere par komplementære sekvenser tilkoblet). På den annen side utfører 3'-0H i den lange enkelttrådede kjede syntese av komplementær kjede med seg selv som templat, hvorved for-lengelsen oppnås, og i løpet av hvilken en ny komplementær kjede hvis syntese er innledet fra løkken forskyves. Et slikt ampli-fiseringsreaksjonstrinn forløper under isoterme betingelser samtidig som spesifisiteten er høy.

Oligonukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan, dersom to naboområder er arrangert som beskrevet, fungere som primere for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse. Dette bidrar i vesentlig grad til opprettholdt spesifisitet. Ved sammenligning med f.eks. PCR, hvor uspesifikke ampli-fiseringsreaksjoner innledes ved uspesifikk feilhybridisering uavhengig av den påtenkte relative plassering av to primere, kan det lett forklares hvorfor høy spesifisitet kan forventes i foreliggende oppfinnelse. Denne egenskapen kan utnyttes for svært sensitiv og nøyaktig påvisning av SNP.

Den karakteristiske egenskap ved foreliggende oppfinnelse ligger i at denne reaksjonen lett kan oppnås med en svært enkel blanding av reagenser. For eksempel har oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse en spesiell struktur, men dette er et spørsmål om seleksjon av nukleotidsekvenser, og primeren er et enkelt oligonukleotid. I en foretrukket utførelse kan videre reaksjonen forløpe ved at bare én DNA-polymerase katalyserer syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning. Dersom foreliggende oppfinnelse utføres med RNA som templat, kan videre en DNA-polymerase, f.eks. Bca-DNA-polymerase, som har både reverstranskriptaseaktivitet og DNA-poly-meraseaktivitet med trådforskyvning, anvendes slik at alle enzymreaksjoner kan utføres med ett enkelt enzym. Et reaksjons-prinsipp hvor en høy grad av nukleinsyreamplifisering oppnås ved en slik enkel enzymreaksjon, er tidligere ikke kjent. Selv for anvendelse av foreliggende oppfinnelse i en kjent nukleinsyresyntesereaksjon, f.eks. SDA, er det ikke nødvendig med noe til-leggsenzym i kombinasjonen, og en slik enkel kombinasjon med oligonukleotidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes i forskjellige reaksjonssystemer. Følgelig kan det sies at fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse også er fordelaktig når det gjelder kostnader.

Som beskrevet ovenfor, tilveiebringer fremgangsmåten for syntese av nukleinsyre ifølge foreliggende oppfinnelse, og oligonukleotidet som anvendes for dette, et nytt prinsipp som samtidig løser en rekke vanskelige problemer, f.eks. enkel utførelse (temperaturkontroll er ikke nødvendig), forbedret synteseeffektivitet, økonomisk reaksjon og høy spesifisitet.

Claims

1. Fremgangsmåte for syntese av nukleinsyre med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, karakterisert vedat den omfatter: a) tilsetning av nukleinsyre som i sin 3'-ende er utstyrt med et område Fl, som kan hybridisere til et område Flc i samme kjede, og som etter hybridisering av området Fl til Flc kan danne en løkke som inneholder et område F2c som kan delta i baseparing, b) syntese av en komplementær kjede hvori 3'-enden av Fl hybridisert til Flc fungerer som utgangspunkt for syntesen, c) hybridisering til et område F2c av et oligonukleotid som i sin 3'-ende er utstyrt med F2, som består av en sekvens som er komplementær til området F2c, etterfulgt av syntese med dette oligonukleotid som utgangspunkt for syntesen av en komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av en komplementær kjede med samtidig trådforskyvningsreaksjon, slik at den komplementære kjede syntetisert i trinn b) forskyves, og d) hybridisering til den komplementære kjede som er forskjøvet i trinn c), slik at den er klar for baseparing av et polynukleotid som i sin 3'-ende er utstyrt med en sekvens som er komplementær til et tilfeldig område i kjeden syntetisert i trinn c), etterfulgt av syntese med denne 3'-ende som utgangspunkt for syntesen av en komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av en komplementær kjede med samtidig trådforskyvning, slik at den komplementære kjede syntetisert i trinn c) forskyves.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat utgangspunktet for syntesen i trinn d) er et område RI, som foreligger i 3'-enden av samme kjede, og som kan hybridisere til et område Rlc, og at en løkke som inneholder området R2c som er i stand til baseparing dannes ved hybridisering av RI til Rlc.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat nukleinsyren i trinn a) er en andre nukleinsyre som er erholdt ved følgende trinn: i) hybridisering til et område F2c i nukleinsyren som fungerer som templat av et område F2 i et oligonukleotid bestående av minst to områder, F2 og Flc nedenfor, og Flc er bundet til 5'-siden av F2, F2: et område med en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område F2c i templatnuklinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, og Flc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Flc lokalisert i 5'-side av område F2c i templatnuklinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, ii) syntese av en første nukleinsyre med en nukleotidsekvens som er komplementær til templatet, hvori F2 i oligonukleotidet fungerer som utgangspunkt for syntesen, iii) klargjøring av et tilfeldig område i den første nukleinsyre syntetisert i trinn ii) for baseparing, og iv) hybridisering av et oligonukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til området som er klargjort for baseparing i den første nukleinsyre i trinn iii), etterfulgt av syntese av en andre nukleinsyre med oligonukleotidet som utgangspunkt for syntesen, og klargjøring av Fl i dennes 3'-ende for baseparing.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat området som tillater baseparing i trinn iii) er R2c, og at oligonukleotidet i trinn iv) er et oligonukleotid bestående av minst to områder, R2 og Rlc nedenfor, og Rlc er bundet til 5'-siden av R2, R2: et område med en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område R2c i den første nuklinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens, og Rlc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Rlc lokalisert i 5'-side av område R2c i den første nuklinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4,karakterisert vedat klargjøringen for baseparing i trinnene iii) og iv) utføres ved syntese med trådforskyvning av komplementær kjede ved hjelp av en polymerase som katalyserer syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning, hvori en ytre primer som hybridiserer til 3'-siden av F2c i templatet og en ytre primer som hybridiserer til 3'-siden av området som anvendes som utgangspunkt for syntesen i trinn iv) for den første nukleinsyre, fungerer som utgangspunkt for syntesen.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat smeltetemperaturen for hvert oligonukleotid og det komplementære området i templatet som anvendes i reaksjonen står i følgende forhold til hverandre under samme stringens: (ytre primer/område i 3'-enden av templatet) < (F2c/F2 og R2c/R2) < (Flc/Fl og Rlc/Rl).

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av 3-6,karakterisert vedat nukleinsyren som fungerer som templat er RNA, og at syntese av komplementær kjede i trinn ii) utføres av et enzym med reverstranskriptaseaktivitet.

8. Fremgangsmåte for amplifisering av nukleinsyre med komplementære nukleotidsekvenser sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede, karakterisert vedat den omfatter gjentatt ut-førelse av følgende trinn: A) tilveiebringelse av et templat som i sin 3'- og 5'-ende er utstyrt med et område som består av en nukleotidsekvens som er komplementær til hvert av endeområdene i samme kjede, og som etter hybridisering av disse gjensidig komplementære nukleotidsekvensene til hverandre danner en løkke som er i stand til baseparing, B) syntese av komplementær kjede, hvori 3'-enden av templatet hybridisert til samme kjede fungerer som utgangspunkt for syntesen, C) hybridisering til løkkeområdet av et oligonukleotid som i sin 3'-ende er utstyrt med en nukleotidsekvens som er komplementær til en løkke blant de nevnte løkker som er lokalisert i 3'-enden, etterfulgt av syntese med oligonukleotidet som utgangspunkt for syntesen av en komplementær kjede ved en polymerase som katalyserer syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning, slik at den komplementære kjede syntetisert i trinn B) forskyves, slik at dennes 3'-ende klargjøres for baseparing, og D) anvendelse av kjeden med 3'-enden klargjort for baseparing i trinn C) som nytt templat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat oligonukleotidet i trinn C) i sin 5'-ende er utstyrt med en nukleotidsekvens som er komplementær til 3'-enden som fungerer som utgangspunkt for syntesen i trinn B).

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat den videre omfatter anvendelse av en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i trinn C) som utgangspunkt for syntesen som templat i trinn A).

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat templatet i trinn A) syntetiseres ifølge fremgangsmåten beskrevet i krav 4.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 8,karakterisert vedat syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning utføres i nærvær av en smeltetemperaturregulator.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat smeltetemperaturregu-latoren er betain.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisert vedat 0,2-3,0 M betain foreligger i reaksjonsblandingen.

15. Fremgangsmåte for påvisning av en målnukleotidsekvens i en prøve, karakterisert vedat den omfatter utførelse av en amplifiseringsfremgangsmåte ifølge ethvert av 8-14, og observasjon av hvorvidt et amplifiseringsreaksjonsprodukt dannes eller ikke.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat en probe som inneholder en nukleotidsekvens som er komplementær til løkken, tilsettes til amplifiseringsreaksjonsproduktet, og at hybridiseringen mellom produkt og probe observeres.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16,karakterisert vedat proben er partikkelbundet og at en aggregeringsreaksjon som opptrer ved hybridisering observeres.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisert vedat en amplifiseringsfremgangsmåte ifølge ethvert av 8-14 utføres i nærvær av en nukleinsyredetektor, og at hvorvidt et amplifiseringsreaksjonsprodukt dannes eller ikke observeres, basert på et endret signal fra detektoren.

19. Fremgangsmåte for påvisning av en mutasjon i en målnukleotidsekvens ved påvisningsfremgangsmåten ifølge krav 15,karakterisert vedat en mutasjon i en nukleotidsekvens som amplifiseres, forhindrer syntese av en av de komplementære kjeder som utgjør amplifiseringsfremgangsmåten.

20. Sett for syntese av nukleinsyre med komplementære kjeder sammenkoblet etter hverandre i en enkelttrådet kjede,karakterisert vedat det omfatter følgende bestanddeler: i) et oligonukleotid bestående av minst to områder, F2 og Flc nedenfor, og Flc er bundet til 5'-siden av F2, F2: et område med en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område F2c i en templatnuklinsyre som har en spesifikk nukleotidsekvens, og Flc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Flc lokalisert i 5'-side av område F2c i templatnuklinsyren som har en spesifikk nukleotidsekvens ii) et oligonukleotid som omfatter en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig valgt område i en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som primer, iii) et oligonukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til et område F3c, lokalisert på 3'-siden av området F2c i nukleinsyren som fungerer som templat, iv) en DNA-polymerase som katalyserer syntese av komplementær kjede med samtidig trådforskyvning, og v) et nukleotid som fungerer som substrat for DNA-polymerasen i iv).

21. Sett ifølge krav 20, karakterisert vedat oligonukleotidet i ii) er et oligonukleotid bestående av minst to områder, R2 og Rlc nedenfor, og Rlc er bundet til 5'-siden av R2, R2: et område som har en nukleotidsekvens som er komplementær til et tilfeldig område R2c i en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som utgangspunkt for syntesen, og Rlc: et område som i det vesentlige har samme nukleotidsekvens som et område Rlc lokalisert i 5'-side av område R2c i den komplementære kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som utgangspunkt for syntesen.

22. Sett ifølge krav 21, karakterisert vedat det videre omfatter: vi) et oligonukleotid med en nukleotidsekvens som er komplementær til et område R3c, lokalisert på 3'-siden av det tilfeldig valgte området R2c i en komplementær kjede syntetisert med oligonukleotidet i i) som utgangspunkt for syntesen.

23. Sett for påvisning av en målnukleotidsekvens,karakterisert vedat det omfatter en detektor for påvisning av et produkt fra en nukleinsyresyntesereaksjon som ekstra bestanddel i et sett ifølge ethvert av kravene 20-22.