KR100806680B1

KR100806680B1 - Ｐｃｒ용 열순환 반응기의 성능시험용 다중 ｐｃｒ 조성물

Info

Publication number: KR100806680B1
Application number: KR1020030083109A
Authority: KR
Inventors: 박상열; 양인철; 김영호; 김용규
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2008-02-26
Also published as: KR20050049203A

Abstract

본 발명은 PCR용 열순환 반응기(Thermocycler)의 성능시험용 다중 PCR 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 논란이 되고 있는 PCR용 열순환 반응기의 성능과 관련하여 고가의 측정장비 없이도 1.0 ℃ 이내의 범위에서 열순환 반응기의 온도조절의 정확성을 판단할 수 있도록 하는 PCR용 열순환 반응기의 온도 조절 성능을 검증하는 방법 및 PCR용 열순환 반응기(Thermocycler)의 성능시험용 다중 PCR 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물을 대량으로 생산, 보급함으로써 각 바이오 실험실에서 사용되고 있는 PCR용 열순환 반응기 장비들의 정확한 동작여부를 손쉽게 판단하여 필요할 경우 수리 또는 교정과 같이 적절한 후속 조취를 취하게 할 수 있다.

PCR용 열순환 반응기, 다중 PCR 조성물

Description

ＰＣＲ용 열순환 반응기의 성능시험용 다중 ＰＣＲ 조성물{Multiplex PCR mixtures for Testing the Performance of Thermocyclers}

도 1은 온도에 따른 PCR 반응물의 생산이 급격하게 변화하는 프라이머 쌍의 선정 및 PCR 수행 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 선정된 프라이머 쌍을 혼합하여, 다중 PCR 반응이 1 ℃ 정도의 온도 변화에서 반응 산물의 생성 양상이 달라지는 최적의 조건을 알아내는 실험을 예시한 것이다.

도 3은 PCR 열반응 순환기의 온도 검증용 4중 PCR 조성물의 온도 의존적 반응 특성을 나타낸 것이다.

도 4는 본 발명에서 제조된 다중 PCR 조성물을 이용하여 다양한 종류의 PCR 열순환 반응기의 온도 조절 능력을 예측, 검증하고 그 결과를 교정된 전자식 온도계로 각 열순환 반응기의 실제 온도를 측정한 결과와 비교, 예시한 것이다.

PCR(Polymerase Chain Reaction)은 특정염기서열의 핵산을 지수곡선으로 증폭시키는 생명공학의 기본조작의 하나이다. 이러한 PCR을 의도대로 진행시키는 장치로서 열순환 반응기(Thermocycler)가 광범위하게 사용되고 있다. PCR이 점차 공식적인 측정기술 또는 공식적인 바이오공정의 절차로서 자리잡아감에 따라 열순환 반응기의 온도조절의 정확성이 매우 중요한 품질관리 요소로 대두되고 있다. 종래에는 극소수의 바이오 실험실에서만 숙련된 기술자에 의해 정교한 온도 측정장치를 사용한 열순환 반응기의 성능검증 및 교정이 이루어져 왔다.

따라서, 간편하고 신속하게 열순환 반응기의 온도 조절 성능을 평가할 수 있는 기술이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 연구한 결과, 숙련된 기술과 정교한 온도 측정장치 없이도 PCR 및 PCR 결과의 판독을 통해 열순환 반응기의 온도조절의 정확성을 검증하는 다중 PCR 조성물을 개발함으로써 본 발 명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 PCR용 열순환 반응기의 온도조절의 정확성을 검증하는 방법 및 다중 PCR 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 PCR용 열순환 반응기(Thermocycler)의 온도 조절 성능을 검증하는 방법 및 PCR용 열순환 반응기의 성능시험을 위한 다중 PCR 조성물을 그 특징으로 한다.

먼저, 본 발명의 PCR용 열순환 반응기(Thermocycler)의 온도 조절 성능을 검증하는 과정을 단계별로 설명하면 다음과 같다.

1) 지속적인 입수 또는 제조가 가능하며, 품질관리가 잘 이루어지는 물질을 PCR 반응의 DNA 주형으로 선정하는 단계;

2) PCR의 온도 조건 중 접합(annealing) 온도 조절 성능을 체크포인트로 하여 PCR의 증폭도가 특정 접합온도 이상에서 급격히 저하되는 프라이머 쌍을 복수로 선정하는 단계;

3) 상기 프라이머 쌍들 중 프라이머 쌍의 각 PCR 온도의존곡선이 1℃ 이내의차이를 보이는 두 종 이상의 프라이머 쌍을 혼합하되 각 PCR 산물의 길이가 달라 젤 상에서 구분이 가능하며 프라이머 간의 강한 다이머 결합을 보이지 않으면서 둘 이상의 PCR 반응물이 효과적으로 생산되도록 반응 조건을 선별하는 단계.

4) PCR이 재현성있게 일어날 수 있도록 중합효소 및 다른 조성성분의 조건을 최적화하고, 상기 프라이머를 이용하여 다중 PCR을 수행하는 단계로 이루어지며,이를 상세히 설명하면, 상기 1) 단계에서는 PCR 반응에 DNA 주형으로서 지속적인 입수 또는 제조가 가능하며, 또한 품질관리가 잘 이루어지는 물질을 사용하여야 하므로 인간 플라센타 게놈 DNA(Human Placenta Genomic DNA), 순도 및 양이 정확히 알려진 플라스미드(plasmid) DNA 등이 바람직하다.

PCR용 열순환 반응기의 온도조절 정확성을 체크포인트하기 위하여, PCR의 녹임온도(melting temp., 90 ∼ 95 ℃), 접합온도(annealing temp., 45 ∼ 65 ℃), 중합반응온도(elongation temp., 72 ℃) 중 PCR의 증폭결과에 결정적인 영향을 미치는 접합온도를 사용하며, 이 체크포인트로 정한 접합온도 이상에서 PCR의 증폭도가 급격히 저하되는 프라이머 쌍을 상업용 프라이머 설계 프로그램을 사용하여 복수로 선정하고 실제 PCR 결과로부터 최적인 프라이머쌍을 선정한다. 이 프라이머 쌍들은 예상증폭 핵산 이외의 비특이적 증폭이 최소한인 것이어야 한다.

상기 프라이머쌍들 중 프라이머쌍의 각 PCR-온도의존곡선이 1 ℃ 이내의 차이를 보이는 두 종 이상의 프라이머 쌍을 혼합한다. 추가로 온도의존성이 없이 고르게 증폭이 일어나는 프라이머 쌍을 가하여 이 결과를 증폭의 기준으로 한다. 혼합된 프라이머쌍들은 프라이머 간의 강한 다이머 결합을 보이지 않아야 한다. 또한, 각 프라이머 쌍의 PCR 결과물들은 전기영동에 의해 잘 구분될 수 있도록 그 길이에 있어서 충분한 간격이 있는 것을 선별한다. 이와 같이 온도 의존적인 프라이머 쌍은, 실시예 1, 2의 경우 각각 50, 55, 60, 65℃에서 최적의 반응 조건을 갖는 프라이머 쌍을 우선 3배수로 선정하였으며 전기영동 상에서의 반응물 구분을 위 하여 반응물의 크기는 각각 200, 300, 400, 480 bp가 되도록 선정하였다. 이후, 각각의 선정된 프라이머 쌍에 대해 50 ∼ 65℃ 범위에서 PCR 반응을 수행하여 특정 온도 이상에서 반응물의 생산이 급격히 감소하는 쌍을 선정하였다. 다시 이렇게 선정된 PCR 프라이머 쌍들은 다양한 조합으로 다중 PCR 반응을 실시하여 다중 PCR 반응에서도 동일한 온도 의존적 특성을 갖는 프라이머 쌍의 조합을 최종 선정하였다.

그리고 다중 PCR이 강하고 재현성있게 일어날 수 있도록 중합효소 및 다른 조성성분의 종류 및 함량을 최적화하고, 상기 프라이머를 이용하여 다중 PCR을 수행함으로써 PCR용 열순환 반응기의 온도 조절 성능을 검증할 수 있다. 상기 선정된 다중 PCR 조성물의 반응을 최적화하고 재현성 있게 수행하기 위하여, PCR 반응 완충용액(PCR buffer)의 농도를 1 ∼ 3배, dNTP 혼합물(mixture)을 1 ∼ 3배까지 변화시키면서 반응 조건을 탐색하였으며, 추가로 베타인, DMSO, TMAC, BSA 등을 반응물에 첨가하여 반응을 수행함으로써 온도 의존적 다중 PCR 반응에 대한 최적 조건을 선정하였다.

한편, 본 발명에 따른 다중 PCR 조성물을 제조하는 과정은 다음과 같다.

1. 특정 온도에서 PCR 산물의 양이 감소하는 개별 프라이머 쌍을 2쌍 이상 준비한다. 각각은 서로 다른 온도에서 반응 산물의 양이 감소하여야 하며, 구분을 위해 각각 서로 다른 길이를 가져야 한다. 예를 들어 55 ℃에서 양이 감소하는 것은 200 bp의 길이를 갖고 60 ℃에서 감소하는 것은 300 bp를 갖게 만든다.

2. 상기 1에서 선정된 둘 이상의 프라이머 쌍을 혼합한다.

3. PCR 반응에 필요한 주형 DNA(template DNA, 본 발명의 실시 예에서는 human placental genomic DNA)를 10 ng/반응 이 되도록 첨가한다.

4. 상기에서 혼합된 다중 PCR 조성물에 대해 특정 온도 구간에서 1℃ 정도의 온도 차이만 나도 PCR 산물의 생성 양상이 달라질 수 있는 온도검증용 다중 PCR 반응의 최적 조건에 맞추어, PCR 완충용액, dNTP 혼합물, 기타 첨가물을 첨가한다.

5. 반응에 필요한 Taq 중합효소(Polymerase)를 첨가하고 반응을 실시한다.

이렇게 제조된 조성물과 PCR용 Taq 중합효소로 이루어진 PCR 혼합액을 사용하여 PCR을 수행하고, PCR 결과물을 전기영동하고 그 결과를 조성물에 포함된 기준 결과와 비교하여 정상, 온도 하향조정 필요, 또는 온도 상향조정 필요 중의 하나로 판정결과를 내린다. 더욱 분명한 결과를 얻고자 할 경우, 기준 온도보다 각각 1 ℃ 높은 접합온도와 1 ℃ 낮은 접합온도에서 PCR을 수행하여 그 결과를 분명한 판정의 기준으로 삼는다. 또한, 온도조절 블록 상에서의 균질도 여부를 판단하고자 할 경우에는 PCR 용액을 블록 상에서 적절하게 분산 분포시켜 PCR을 수행하고 그 결과를 비교한다. 본 발명의 다중 PCR 조성물을 이용해 온도 검증용 PCR을 수행한 결과는 도 3과 도 4에 예시하였다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서 개발된 PCR용 열순환 반응기의 온도 조절성능 검증조성물을 사용하면 전문적 온도측정 기술이나 장비없이 열순환 반응기의 온도조절 성능을 1 ℃ 범위 내에서 간편하게 확인할 수 있다[도 3]. 이러한 방법으로 열순환 반응기의 주기적인 성능검증이 이루어질 수 있을 뿐 아니라 새로 구입하고자하는 장비의 성능에 대한 판단도 직접할 수 있다. 이 조성물이 널리 보급되어 활발히 사용될 경우, 정해진 실험절차를 따라야하는 공식적인 PCR 조작절차에 있어서 품질관리가 원활히 이루어질 수 있다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

참고예: PCR 열순환 반응기의 온도 조절 능력 검증용 다중 PCR 조성물의 제조

PCR 열순환 반응기의 접합온도 조절 능력을 검증하기 위하여 첫 번째 과정은 특정 온도 구간을 벗어나면 PCR 산물의 생성이 급격하게 변화하는 프라이머 쌍을 선정하는 것이다. 프라이머 쌍은 20,000 bp의 사람 p16 유전자 부위에 대하여 공용 프라이머 생성 프로그램을 이용하여 선정하였다. 선정 기준은 50 ℃의 접합 온도를 갖는 프라이머 쌍은 약 200 bp의 PCR 산물을 증폭하도록 하고, 55 ℃는 300 bp, 60 ℃는 400 bp, 65 ℃는 500 bp의 산물을 증폭하도록 고안하였다. 각각의 프라이머 쌍은 접합 온도가 다를 경우, 차후 다중 PCR 반응 후 결과물을 아가로즈 젤에서 확인할 때 길이에 따라 구분이 가능하도록 서로 다른 길이를 갖도록 하였다. 도 1은 이렇게 제작된 각각의 프라이머 쌍의 온도에 따르는 PCR 산물의 증폭 양상을 예시한 것이다. 각각의 프라이머 쌍은 처음 선정한 접합 온도에 따라 특정한 온도(화살표로 표시) 구간을 벗어나면 그 증폭 양이 현저하게 감소하는 양상을 보여 주고 있다. 다음 과정은 과정 1에서 선정한 온도 의존도가 높은(특정 온도 구간을 벗어나면 PCR 산물의 생성량의 변화가 큰) 여러 종의 프라이머 쌍을 혼합하여 다중 PCR을 수행하는 것이다. 다중 PCR에 필요한 프라이머 쌍들은 서로 다른 접합온도 구간에서 온도 의존적인 PCR 증폭 효율을 가져야 하며, 또 PCR 산물의 길이가 서로 달라 구분이 가능해야 한다는 전제 조건 하에서 선정이 되었다. 도 2는 이렇게 선정된 다중 PCR 프라이머 쌍들의 반응을 1 ℃ 정도의 온도 편차를 명확하게 판단할 수 있고, 재현성 있는 결과를 얻도록 반응 조건을 최적화하는 과정을 보여 준다. 다중 PCR 반응에 참여하는 프라이머 쌍들은, 단일 PCR 반응과는 달리 Taq 중합효소, dNTP, 주형 DNA에 대해 경쟁적인 반응을 보이게 되므로 이러한 요소들의 농도를 변화시키는 것에 초점을 맞추어 반응 조건을 최적화하였다. 도 2에서 보듯이, 반응 완충용액의 농도가 높아지면, 200 bp 산물의 생성량이 늘고, 반대로 400 bp 산물의 생성량이 감소한다. 이런 과정을 거쳐 본 실시예에서는 59.5 ℃를 기준 온도로 하여 약 1 ℃의 온도 편차가 생기면 다중 PCR 반응의 각 PCR 산물의 생성 패턴이 구분 가능하도록 변화하는 조건을 최적화하였다. 이러한 열순환 반응기 온도 검증용 다중 PCR 반응을 최적화하기 위해서는 반응 완충용액의 농도뿐만 아니라, dNTP의 농도, DMSO, TMAC, 소 혈청 단백질(BSA) 같은 첨가물의 농도를 변화시키는 것도 유효한 방법이 된다.

실시예 1: 접합온도 59.5 ℃를 체크포인트로 하는 4중 PCR

본 실시예에서는 4중 PCR을 수행하여 59.5 ℃의 접합온도를 조절하는 PCR용 열순환 반응기의 온도 조절 성능을 확인하기 위하여 PCR 반응의 주형 DNA로 인간 플라센타 게놈 DNA[Sigma D-4642] 10 ng을 사용하였고 59.5 ℃를 기준으로 하여 1 ℃의 온도 조절 부정확도를 검증할 수 있는 다중 PCR 조성물로 다음 프라이머 쌍을 선정하여 사용하였다. Tag DNA 중합효소[(주)바이오니아사 premix-Bioneer K-2012에 포함] 2 Unit, dNTP 혼합물 0.375 mM, 반응완충용액으론 PCR Premix(Bioneer K-2012)에 포함된 완충용액과 10X PCR buffer((주)바이오니아)를 추가적으로 사용하였다. 표준적인 1배(1X)PCR 완충용액은 10 mM 트리스-HCl(pH 8.0), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl₂를 포함하고 소량의 소혈청알부민(BSA)과 Tween20 등의 계면활성제를 포함할 수 있다. 이 밖에 PCR 반응을 증진시키거나 조건을 변화시키기 위해 1 ∼ 5%의 DMSO, 1 ∼ 3%의 TMAC(Tetramethylammonium chloride), 0.1 ∼ 1 mg/ml의 BSA 등을 추가하였다.

200 bp 증폭 산물의 정방향 프라이머: 5'-CACACTTCATATTTACCCAT-3' (서열번호 1)

200 bp 증폭 산물의 역방향 프라이머: 5'-TTGTTTAATAGAGACGAAGG-3' (서열번호 2)

300 bp 증폭 산물의 정방향 프라이머: 5'-ATGGACATTTACGGTAGTGG-3' (서열번호 3)

300 bp 증폭 산물의 역방향 프라이머: 5'-AAGTATTTCAATGCCGGTAG-3' (서열번호 4)

400 bp 증폭 산물의 정방향 프라이머: 5'-GCTAGCTGTAACTGGAGCCG-3' (서열번호 5)

400 bp 증폭 산물의 역방향 프라이머: 5'-GTCTGCTGAAACTGCCAACA-3' (서열번호 6)

482 bp 증폭 산물의 정방향 프라이머: 5'-GGCCTGCTGAAAATGACTGA-3' (서열번호 7)

482 bp 증폭 산물의 역방향 프라이머: 5'-TAGAAGGCATCATCAACACC-3' (서열번호 8)

상기 반응 혼합물을 충분히 변성시키기 위하여 95 ℃에서 5분간 열처리한 후 95 ℃에서 30초, 59.5 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초씩 30회 반응시키고, 마지막으로 72 ℃에서 5분간 연장하였다. 반응 후 2% 아가로즈 젤(6 cm ㅧ11 cm)을 이용하여 7 V/cm에서 30 분간 전기영동한 다음, 에틸브로마이드로 염색하여 증폭된 DNA의 존재 여부를 확인하였고 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 59.1 ∼ 59.6 ℃의 온도 범위에서는 전형적으로 위로부터 480, 400, 300 bp의 PCR 산물이 선명하게 생성이 되고 200 bp의 산물은 아주 희미하게 나타난다. 반면 59.5 ℃에서 아래쪽으로 1 ℃ 벗어난 58.5 ℃로 반응이 되면, 희미하던 200 bp 산물이 비교적 선명하게 나타난다. 반대로 위쪽으로 1 ℃ 벗어난 60.5 ℃가 되면 200 bp의 산물은 완전히 없어지고, 480 bp의 산물의 양이 줄어든 결과를 얻게 된다. 따라서, 기준 반응 수행 온도를 59.5℃로 설정하였을 때, 본 발명의 다중 PCR 조성물을 이용하게 되면, 온도가 아래쪽으로 1 ℃ 이상 벗어난 경우는 200 bp 산물의 증가, 위쪽으로 1 ℃ 벗어난 경우는 200 bp 산물이 사라지고 480 bp 산물이 감소한다는 사실을 확인함으로써 각 열 순환 반응기의 온도 조절 능력을 1 ℃ 수준에서 검증할 수 있게 된다. 본 발명의 다중 PCR 조성물을 약 12종의 열순환 반응기에 대해 적용하여, 각 순환반응기의 온도를 예측하고 한국표준과학연구원에서 교정 받은 전자식 온도감지기를 이용해, 실제 순환반응기의 온도를 실측한 결과를 도 4에 비교, 예시하였다. 도 4에서 볼 수 있듯이, 특정한 한 두 개의 열 순환 반응기를 제외하고는 다중 PCR 조성물을 통해 예측한 각 반응기의 온도와 전자식 온도 감지기를 이용해 실측한 온도가 잘 일치한다는 사실을 알 수 있었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 논란이 되고 있는 PCR 열순환 반응기의 성능과 관련하여 고가의 측정장비 없이도 1.0 ℃ 이내의 범위에서 열순환 반응기의 온도조절의 정확성을 판단할 수 있도록 하는 다중 PCR 조성물의 제조 및 활용에 관한 것이다. 이 조성물을 대량으로 생산, 보급함으로써 각 바이오실험실들에서 사용되고 있는 PCR 열순환 반응기 장비들의 정확한 동작여부를 손쉽게 판단, 필요할 경우 수리 또는 교정과 같이 적절한 후속조치를 취하게 할 수 있게 한다.

<110> Korea Research Institute of Standards Science <120> Multiplex PCR Kits for Testing the Performance of Thermocyclers <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 cacacttcat atttacccat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 ttgtttaata gagacgaagg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 atggacattt acggtagtgg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 aagtatttca atgccggtag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 gctagctgta actggagccg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 gtctgctgaa actgccaaca 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 ggcctgctga aaatgactga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 tagaaggcat catcaacacc 20

Claims

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인간 플라센타 게놈 DNA(Human Placenta Genomic DNA)의 DNA 주형, 서열번호 1 내지 8의 프라이머 쌍, 트리스-HCl, Taq DNA 중합효소, dNTP 혼합물(mixture), KCl 및 MgCl₂를 포함하는 것을 특징으로 하는 기준반응 수행 온도의 1.0 ℃ 이내의 범위에서 PCR 열순환 반응기의 성능시험이 가능한 다중 PCR 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 조성물에 추가로 디메틸 술폭사이드(DMSO), 테트라메틸암모늄 클로라이드(TMAC) 및 소 혈청 알부민(BSA) 중에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 PCR용 열순환 반응기의 성능시험용 다중 PCR 조성물.